Полисахариды растений как перспективный источник получения лекарственных средств. Структура, физико-химические свойства, методы анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Курсовая работа

Полисахариды растений как перспективный источник получения лекарственных средств. Структура, физико-химические свойства, методы анализа



Введение

полисахарид химический лекарственный

Актуальность:

Актуальность данной темы подтверждает тот факт, что в природе 80% органических веществ составляют полисахариды. Они играют различную биологическую роль для растений и животных[5].

Полисахариды - это выcoкомолекулярные продукты конденсации более 5 моносахаридов и их производных, связанных друг с другом О-гликозидными связями и образующие линейные или разветвленные цепи [1.]

Pазнообрaзие в строении полисахаридов мoжет быть обуслoвлено не тoлько характером моносахаридов и спoсобом их соединения, нo также тем, что гидрoксильные и карбоксильные группы моносахаридов и их производных могут быть мeтилированы, этерифицированы органическими и неорганическими кислотами (например, серной кислотой - агар-агар); водороды карбоксильных групп замещены на ионы металлов (пектиновые вещества, камеди) [2.].

Проведено исследование влияния полисахаридных комплексов из сырья 10 видов высших растений на развитие экспериментальной опухоли и её цитостатическое лечение. Впервые выявлено, что:

- полисахаридные комплексы из цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей;

- полисахариды аира оказывают самостоятельное противоопухолевое действие, а полисахариды липы, багульника и солодки проявляют самостоятельный антиметастатический эффект;

- полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника потенцируют противоопухолевую и не влияют на антиметастатическую активность циклофосфана [3.].

Ученые Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии на основе оригинального полисахарида создали ранозаживляющую губку - аубазипор, а НИИ вакцин и сывороток - новый антисептический препарат катацел (полимерная соль на основе целлюлозы и аммонийного основания).

B медицине они и модифицированные различными способами их производные могут быть использованы как наполнители, кровезаменители, обладают способностью пролонгировать действие лекарств, повышают резистентность слизистой оболочки желудка, оказывая противовоспалительное, обволакивающее и ранозаживляющее действие.

Используются материалы Патента №2308285 от 14.12.2005 г. «Средство, на основе полисахаридов аира болотного, пoвышающее противoопухолевую и пpотивометастатическую активность цитостатических препаратов» компанией «Инноком» (г. Томск) для разработки нового лекарственного препарата Полистан. Предполагается, что оно будет увеличивать противоопухолевую и противометастатическую активность широко используемых цитостатических препаратов - циклофосфан и 5-фторурацил. Будет использовано в целях повышения эффективности цитостатического лечения больных со злокачественными опухолями[6].



1. Классификация полисахаридов

Классификация полисахаридов

Существует несколько видов классификации:

- по типу моносахаридов, входящих в полисахарид;

- по источникам выделения полисахаридов;

- по функциональному назначению.

По источникам выделения полисахариды делятся на три группы:

- фитосахариды (инулин, пектин, целлюлоза, амилоза, амилопектин, ламинарин и т.д.);

- полисахариды микроорганизмов (мананниты и др.);

- зоополисахариды (гликоген, хитин, хондроитинсульфаты, гепарин и т.д.).

С точки зрения функционального назначения полисахариды делятся на структурные, резервные и полисахариды с иными функциями. Важнейшими структурными полисахаридами являются целлюлоза (растения), хитин (насекомые), гиалуроновая кислота и хондроитинсульфаты (животные). Главными резервными полисахаридами являются крахмал (амилопектин + амилоза) и гликоген. Иные функции - камеди, слизи и друг [7].

по кислотности:

- нейтральные;

- кислые

по характеру скелета:

- линейные;

- разветвленные

В зависимости от функций полисахариды делятся на:

- каркасные (конструктивные) - клетчатка, хитин;

- энергетические (резeрвные, зaпасные) - крахмал, гликоген, инулин, слизи, альгиновые кислоты;

- защитные - cлизи, камеди.

Полисахариды подвергaются фeрментативному и кислотному гидролизу с образованием моно- или олигосахаридов, сoдeржащих от 2 до 4 моносахаридных единиц. Каждая из групп полисахаридов обладает своими специфическими свойствами [8].

2. Медико-биологическое значение полисахаридов и механизмы их действия

В последнее время интерес к растительным полисахаридам возрос в связи с тем, что эти соединения, ранее считавшиеся инертными, обладают широким спектром фармакологической активности. Была установлена многообразная биологическая активность полисахаридов растительного происхождения: антибиотическая, противовирусная, противоопухолевая. Полисахариды растительного происхождения выполняют большую роль в уменьшении атероматоза сосудов благодаря способности давать комплексы с белками и липопротеидами плазмы крови[9].

Aрабиногалактан (АГ)

Рассмотрены медико-биологические свойства важнейших БАВ древесины лиственницы - полисахарида арабиногалактана. Обоснована перспективность создания на основе экстрактивных веществ биомассы лиственницы комплексной биологически активной добавки к комбикормам и использования комбикормов, модифицированных этой добавкой, в животноводстве при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных, повышения их иммунного статуса[10].

В одном новом плацебо-контролируемое, двойном слепом, рандомизированном клиническом исследований, исследователи измерили влияние добавок с ResistAid ™, патентованного препарата лиственница арабиногалактановой на насморк и его влияние на симптомы простуды сравнивали с плацебо. Как отмечается в исследовании, восприимчивость к простуде часто связано со слабым иммунным статусом или отсутствие сильной иммунной защиты. В эксперименте, простуду, использовали в качестве модельной системы для определения влияния лиственницы арабиногалактана на системе человека против вторжения патогенных микроорганизмов.

В исследовании, 199 здоровых взрослых людей в возрасте 18-70 были разделены на две группы, принимая либо ежедневно лиственницы арабиногалактана добавку 4,5 г или плацебо в течение 12 недель. Каждое простудное заболевание было подтверждено врачами.

Это исследование потвердило взаимосвязь между потреблением ResistAid ™ и последовавшим сокращением числа сезонных простудных эпизодов [41].

Исследования медико-биологических свойств арабиногалактана, показали, что АГ способен стимулировать важный фактор неспецифической резистентности - фагоцитоз. У животных с иммунодепрессией, вызванной эмоциональным стрессом, внутрижелудочное введение субстанции в дозе 500 мг/кг в течение 10 дней предотвращало нарушение развития гуморального иммунного ответа и снижение функциональной активности макрофагов. Арабиногалактан положительно влияет на состояние желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и не оказывает негативного действия на репродуктивную функцию экспериментальных животных, не обладает раздражающим действием на слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта и не провоцирует развития аллергических реакций. Арабиногалактан является идеальным дополнительным средством при раке. Экспериментально установлено, что он стимулирует цитотоксичность клеток натуральных киллеров, увеличивает другие функциональные аспекты иммунной системы и ингибирует проникновение метастазов опухоли в печень [10, 11]. Установлено также, что АГ оказывает заметное гастропротекторное и умеренное антимикробное действие в отношении некоторых бактерий [12]. Клинические исследования продемонстрировали также значительное сокращение уровня хoлестерина у людeй с гиперлипидемией, принимающих АГ [10]. Использование АГ при гипотиреозе приводит к уменьшению массы щитовидной железы и активизирует ее гормoнпродуцирующую функцию, а также процессы перекисного окисления липидов, повышает антиокислительную активность крови, нормализует количество эритроцитов и их осмотическую резистентность.

Также важны пребиотические свойства арабиногалактана. Пребиотики - это пищевые вещества, в том числе биоактивные пищевые волокна, которые избирательно стимулируют рост и активность нормальной микрофлоры кишечника, являясь пищей для бифидо- и лактобактерий (пробиотиков). Эти бактерии исключительно важны для здоровья пищеварительной и иммунной систем, детоксикационных и гормонорегулирующих свойств организма, всасывания и переработки пищи [10,13]. С клинической точки зрения это очень привлекательный продукт; регулярный прием его может поддерживать нормальный иммунитет не только через прямое воздействие, но и через эффекты на бифидо- и лактобактерии кишечника, которые, в свою очередь, помогают сложной иммунной системе человека функционировать более надежно.

Благодаря высокой мембранотропности АГ его можно использовать для повышения всасываемости других лекарственных средств, характеризующихся низкой биодоступностью. В связи с этим открываются перспективы использования полисахарида для синтеза новых физиологически активных соединений и адресной доставки лекарственных средств к определенным органам и тканям живого организма. Это свойство используется в рентгеновской томографий.

Существует изобретение, которое доставляет рентгеновского агента к определенной популяции клеток или органа. Это может быть осуществлено путем образования комплекса рентгеноконтрастного агента с сахаридом, способный взаимодействовать с клеточным рецептором. Этот комплекс, попадая в организм может быть усвоены в определенной популяции клеток или органа путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. В одном из вариантов осуществления изобретения, рентгеноконтрастный агент может включать в себя соединение, содержащее йод, и сахариды могут включать в себя арабиногалактан, галактан или их производных. Изобретение позволяет к определить метаболической жизнеспособность или болезненное состояние клеток-мишеней или органа визуализацией степени, способ поглощения и выделения целевого рентгеновского контрастного агента, рентгеновским или компьютерной томографии. Перспектива подобных изобретении заключается в создании комплексов, которые могут быть направлены на конкретные без клеток-мишеней таким образом, что воздействию подвергнутся только селективно отобранные клетки-мишени, не задевая других клеток [14, 15].

Установлено, что совместное использование известных лекарственных веществ (ЛВ) с арабиногалактаном позволяет значительно снизить действующую дозу ЛВ с сохранением высокой базовой активности, а также уменьшить степень выраженности побочных эффектов, характерных для некоторых лекарств, например, ульцерогенности нестероидных противовоспалительных препаратов

Эффективность применения АГ выражается в следующем:

- Ускоряет рост полезных бактерий (собственная микрофлора ЖКТ животного, улучшающая пищеварение);

- Уменьшает содержание вредных бактерий в ЖКТ;

- Поддерживает нормальную функцию кишечника;

- Повышает иммунитет;

- Является источником природных противовоспалительных антиоксидантов;

- Помогает поддерживать вес тела в период стресса [10,12].

Перспективы использования арабиногалактана

По анализам крови бычков, получавших арабиногалактан, определяли динамику активности антиоксидантной системы, концентрации триацилглицеридов, общего холестерина и его фракций, показатели, характеризующие белковый и углеводный обмен веществ[16].

Для объективной оценки адаптационных резервов организма на молекулярном уровне, состояния систем антиоксидантной защиты, активности механизмов неспецифической резистентности, как уже отмечалось, информативен показатель ТДС (тиол-дисульфидная система), характеризующий буферную емкость антиоксидантной системы. Ранее мы выявили, что при большинстве патологий инфекционной и неинфекционной природы (в том числе при аллергических состояниях и радиационном поражении) содержание SH-групп снижается, SS-групп - повышается (24,). Восстановленная форма глутатиона служит основным сульфгидрильным «буфером», за счет которого поддерживаются в восстановленном состоянии цистеиновые остатки во всех белках, включая гемоглобин (при этом он сохраняется в ферроформе), ферменты и гормоны. Глутатион способен самостоятельно участвовать в процессах детоксикации, реагируя как с перекисью водорода, так и с органическими перекисями. Иными словами, глутатион представляет собой важнейший тиоловый антиоксидант. Следовательно, сохраняя восстановленные тиоловые эквиваленты, мы повышаем адаптационную способность и устойчивость организма к неблагоприятным факторам. Тяжесть заболевания, периоды его обострения, воздействие стрессоров коррелируют со степенью снижения показателя ТДС. Повышение содержания SH- и снижение количества SS-групп связывают с активным извлечением резерва низкомолекулярных тиолов из печени в ответ на истощение редокс-системы крови и мобилизацией резервов организма на восстановление окисленных тиолов.

Исследователи предположили, что арабиногалактаны проявят глутатионсберегающий эффект. Действительно, в плазме крови животных II группы отмечался прогрессирующий существенный рост количества SH-групп при снижении соответствующего значения по SS-группам. Таким образом, буферная емкость антиоксидантной системы (и, как следствие, неспецифическая резистентность и адаптивность) у животных опытной группы возросли по сравнению с контрольными.

Содержание МДА (продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида - МДА)) служит простой и стандартной характеристикой состояния процессов перекисного окисления липидов. Не являясь, как известно, природным метаболитом, МДА отсутствует в организме и образуется in vitro при кипячении в кислой среде в результате взаимодействия природных метаболитов липопероксидации с тиобарбитуровой кислотой. Чем выше концентрация МДА, тем больше вредных продуктов липоперок-сидации содержится в исследуемом образце.

Было отмечено благоприятное влияние арабиногалактанов на обмен липидов и получены прямые экспериментальные доказательства антиатеро-генных свойств рационов с арабиногалактанами[16].

Свойства пектиновых веществ

Пектин обладает уникальными физико-химическими и биологическими свойствами, что делает его незаменимым во многих областяхпромышленнос-ти и медицины. Студнеобразующие свойства пектинов используются в кондитерской промышленности при изготовлении желейно - пастильных изделий; в масложировой промышленности он используется как эмульгатор. Пектины применяют в качестве низкокалорийных углеводов, стабилизаторов и загустителей в производстве безалкагольных напитков, мороженого, шербетов. Пектины обладают иммуномодулирующей, гастропротекторной, антиканцерогенной, антиметастатической активностью. Показана возможность использования пектина в качестве матрицы - носителя биологически активных компонентов[48].

Пектин выводит из организма цезий-137, а также заметно ингибирует рост раковых клеток саркомы 180. Показана возможность применения его в кондитерском производстве в качестве желирующего агента при изготовлении мармелада[17].

Mеханизм действия пектина

Пектины и пектинсодержащие продукты, попав в пищеварительный тракт, образуют клейкую субстанцию, очень легко связывающуюся со многими металлами, прежде всего со свинцом, стронцием, кальцием, кобальтом, а также другими тяжелыми металлами, радиоактивными веществами, которые не способны всосаться в ток крови. Этим пектины защищают организм от радиоактивных веществ и солей тяжелых металлов, проникающих с пищей и водой в организм человека.

Полисахариды активизируют печеночно-кишечную циркуляцию и выводят из организма излишнее количество холестерина. Поэтому полисахариды играют важную роль в профилактике атеросклероза.

Слизистые вещества состава некоторых растений после приема внутрь образуют защитные покровы на поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и этим защищают их от раздражения токсинами, лекарственными веществами и др.

Пектины усиливают моторную функцию кишечника, предупреждают возникновение запоров.

Терапевтический эффект слизей обусловлен предохранением нервных окончаний слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта от раздражающего влияния других веществ.

Полисахариды усиливают активность ресничек мерцательного эпителия дыхательных путей, что приводит к усилению секреции бронхиальной слизи, вследствие чего мокрота разжижается и облегчается ее отделение при кашле[18].

Пектины винограда, смородины и черники обладают значительной антифибринолитической активностью. Выраженный гемостатический эффект дают также альгинаты[19].

Растительные полисахариды, в частности пектины, проявляют биологическую активность в отношении основных функций пищеварительной системы и могут применяться в виде натуральных комплексов, на основе которых был создан ряд препаратов: «Плантаглюцид» из листьев подорожника большого, включающий низкомолекулярные пектины; «Ламинарид» из морской капусты как слабительное средство; пектин из свеклы, вошедший в комплексный противоязвенный препарат «Флакарбин» [19].

В качестве перспективных лекарственных средств противоязвенного действия предложены полисахаридные препараты соцветий ромашки и пижмы. Полисахариды из стеблей видов шток-роза по противоязвенной активности в эксперименте превосходят действие препарата «Плантаглюцид» [19].

Пектины, благодаря кислотному характеру проявляют антимикробное действие в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Пектины используются в качестве кровоостанавливающего средства. В настоящее время гемостатические свойства пектинов с успехом используют за рубежом при легочных кровотечениях, при кровотечениях из пищевода, желудка и кишечника, а также при желтухе, циррозе печени, тромбофлебите, гинекологических заболеваниях, в стоматологии и при гемофилии.

В технологии лекарственных средств полисахариды природного и синтетического происхождения применяются преимущественно в качестве формообразователей, загустителей и стабилизаторов в мазях и линиментах.

Пектины (от греч. Pectos - сгущенный, свернувшийся) близки к камедям и слизям, входят в состав межклеточного склеивающего вещества. Широко распространены в растительном мире. Особую ценность представляют растворимые в воде пектины. Их водные растворы с сахаром в присутствии органических кислот образуют студни, обладающие адсорбирующим и противовоспалительным действием[20].

Пектины улучшают пищеварение, снижают процессы гниения в кишечнике и выводят ядовитые продукты обмена, образующиеся в самом организме; способствуют выработке в кишечнике витаминов группы В, особенно В12, жизнедеятельности и росту полезных бактерий в кишечнике, выведению излишнего количества холестерина. Пектиновые вещества нашли широкое применение при лечении поносов.

Пектин яблок задерживает размножение гриппозного вируса «А», уменьшает последствия ртутного и свинцового отравления, способствует выведению свинца из костной ткани[20].

Пектиновые вещества - это группа высокомолекулярных соединений, входящих в состав клеточных стенок и межуточного вещества высших растений. Максимальное количество пектинов содержится в плодах и корнеплодах[21].

C 1970-х гг. многие зарубежные ученые на основании проведенных исследований сделали вывод, что пектиновые вещества являются комплек-сной группой кислых полисахаридов, которые могут содержать значительное количество нейтральных сахарных компонентов (L-арабинозу, D-галактозу, L-рамнозу).

Пектины широко применяются в различных отраслях народного хозяйства, особенно в пищевой промышленности, где они используются в качестве загущающих веществ для производства джемов, желе, мармелада; в хлебопечении - для предотвращения черствления хлебобулочных изделий; при производстве соусов и мороженного - в качестве эмульгирующего агента; при консервировании - для предотвращения коррозии оловянных консервных банок и т.д.

Применение пектинов в медицине является чрезвычайно перспективным. Пектиновые (студенистые вещества растений) связывают стронций, кобальт, радиоактивные изотопы. Большая часть пектинов не переваривается и не всасывается организмом, а выводится из него вместе с вредными веществами. Особенно богаты пектинами ягоды земляники, шиповника, клюк-вы, черной смородины, яблоки, лимоны, апельсины, калины и др.

Инулин

Инулин - это вещество стимулирует лимфоциты, благодаря чему они становятся подвижными. Это позволяет им быстро распознать очаг инфекции и устранить болезнетворные бактерии.

Инулин служит запасным углеводом, встречается во многих растениях, главным образом семейства сложноцветных, а также колокольчиковых, лилейных, фиалковых.

Инулин снижает уровень сахара, предотвращает осложнения при сахарном диабете, также применяется при ожирении, болезнях почек, артрите и других видах заболеваний. Он положительным образом влияет на обмен веществ. Инулин выводит из организма массу вредных веществ (тяжелые металлы, токсины), снижает риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, укрепляет иммунную систему[22].

Часть инулина расщепляется в организме, нерасщепленная часть выводится из организма, увлекая за собой массу ненужных организму веществ - от тяжелых металлов и холестерина до различных токсинов. При этом инулин способствует усвоению витаминов и минералов в организме.

Kроме того, инулин оказывает иммуномодулирующее и гепатопротек-торное действие, противодействуя возникновению онкологических заболеваний. Для усиления действия инулина в биодобавках его сочетают с соками других природных целителей, таких как сельдерей, петрушка, облепиха, шиповник, калина, женьшень, солодка, элеутерококк.

У растений есть масса преимуществ по сравнению с химическими медикаментозными препаратами. Основные плюсы их применения - отсутствие побочных эффектов и комплексное воздействие на организм[22].

3. Структура полисахаридов

К полисахаридам относятся камеди, слизи, пектиновые вещества, инулин, крахмал, клетчатка.

Камеди - это густой слизистый сок, выступающий или произвольно или из надрезов и поранений на коре многих деревьев. В живом растении камеди образуются путем особого слизевого перерождения клетчатки оболочек клеток паренхимы, а также и крахмала, находящегося внутри клеток.

Во многих растениях камеди в небольших количествах образуются нормально, физиологически, но обильное образование камеди рассматривается уже как процесс патологический, возникающий вследствие поранения и ведущий к заполнению слизью образовавшейся раны [20].

В общий обмен веществ растений образовавшиеся камеди не вовлекаются. По внешнему виду препараты камеди представляют обычно округлые или плоские куски, для некоторых видов камеди весьма характерные, прозрачные или только просвечивающие, бесцветные или окрашенные до бурого цвета; запаха не имеют, без вкуса или слабого сладковато-слизистого.

В воде некоторые камеди растворяются, образуя коллоидные растворы, другие лишь набухают. В спирте, эфире и других органических раствори-телях нерастворимы. Химически исследованы недостаточно. Аравийская камедь в эксперименте на крысах не только потенцирует в 3,5 раза действие АКТГ при добавлении 10% ее к гормону при подкожном или внутривенном введении, но и сама обладает активностью, подобной АКТГ. Механизм их действия различен.

В медицине камеди используются как эмульгаторы, обволакивающие и клейкие вещества для приготовления пилюль и таблеток (пилюльная масса) [20].

Слизи - это безазотистые вещества, близкие по химическому составу к пектинам и целлюлозе. Это вязкая жидкость, продуцируемая слизистыми железами растений и представляющая собой раствор гликопротеинов. Слизи образуются в растениях в результате физиологических нарушений или при различных болезнях, вследствие чего оболочки и клеточное содержимое отмирают. К ослизнению способны наружные слои клеток водорослей, семена подорожника, айвы, льна, горчицы, а также внутренние слои подземных органов - алтея, ятрышника (салеп). Полезное действие слизей состоит в том, что они предохраняют растение от пересыхания, способствуют прорастанию семян и их распространению[20].

Слизи (Mucilagines) - природные гликопротеиды, углеводная часть которых состоит на 90% из пентозанов и на 10% из гексозанов. В воде они образуют густые слизистые растворы. От крахмала слизи отличаются отсутствием характерных зерен (это серые аморфные вещества), а также негативной реакцией с раствором йода. В отличие от камедей слизи осаждаются нейтральным раствором ацетата свинца [23].

Слизи имеют полужидкую консистенцию, извлекаются из сырья водой. Они относятся к группе нейтральных полисахаридов и представляют собой сложную смесь различного химического состава. Основу их составляют производные сахаров и частично калиевые, магниевые, кальциевые соли уроновых кислот.

Слизи и камеди настолько похожи, что не всегда удается их разграничить. Слизи в отличие от камеди получают не в твердом виде, а путем извлечения водой. Слизистые вещества способствуют замедлению всасывания лекарственных средств и более длительному действию их в организме, что имеет большое значение в терапии[20].

Инулин - полисахарид, образованный остатками фруктозы. Является запасным углеводом многих растений, главным образом сложноцветных (цикория, артишока и др.). Используется как заменитель крахмала и сахара при сахарном диабете, природный компонент, который получают из корней растений.

Молекула инулина цикория состоит из 20-40 остатков Dфрукто-фуранозы, связанных между собой линейно в - (12) - связями[24].

Инулин применяется в виде биологически активных добавок (капли, таблетки) для профилактики и лечения различных заболеваний. Он не имеет противопоказаний. Особенно ценны препараты с содержанием инулина для диабетиков. Природная фруктоза, которую содержит инулин, является уникальным сахаром, который полностью заменяет глюкозу в случаях, когда глюкоза не усваивается. Поэтому диетическая ценность инулина велика[20].

Крахмал - конечный продукт ассимиляции углекислоты растениями. Откладывается преимущественно в клубнях, плодах, семенах и сердцевине стебля. В организме из крахмала образуется глюкоза. Мы получаем крахмал из растений, где он находится в виде крошечных крупинок.

Крахмал представляет собой смесь 2 гомополисахаридов: линейного - амилозы и разветвленного - амилопектина, общая формула которых (С6Н10О5) n. Как правило, содержание амилозы в крахмале составляет 10-30%, амилопектина - 70-90%. Полисахариды крахмала построены из остат-ков D-глюкозы, соединенных в амилозе и линейных цепях амило-пектина б-1->4-связями, а в точках ветвления амилопектина - межцепочечными б-1-6-связями[25].

Растения накапливают крахмал маленькими крупинками в стволах и стеблях, корнях, листьях, плодах и семенах. Картофель, маис, рис и пшеница содержат большие количества крахмала. Растения вырабатывают крахмал для того, чтобы он служил пищей для молодых побегов и отростков, пока они не в состоянии самостоятельно вырабатывать себе питание[20].

Для людей и животных крахмал представляет энергоемкое питание. Как и сахар, он состоит из углерода, водорода и кислорода. Крахмал несладкий: обычно он безвкусен. Определенные химические вещества во рту, желудке и кишечнике преобразуют крахмалистую пищу в виноградный сахар, который легко усваивается. Человек получает крахмал из растений, измельчая те их части, где он накапливается. Затем крахмал вымывается водой и оседает на дно больших емкостей, после чего вода выжимается из сырого крахмала, масса высушивается и перетирается в порошок, в виде которого обычно и изготавливается крахмал. Крахмал не растворяется в холодной воде, а в горячей - образует вязкий раствор, при охлаждении превращающийся в вещество студенобразной констистенции. В разведенном виде применяется как обволакивающее средство при желудочно-кишечных заболеваниях (картофельный сырой сок, кисели). Крахмалом богаты клубни, корни, корневища, кора, где он накапливается как депо питательного вещества. Поскольку в корнях цикория, одуванчика и в клубнях девясила, кроме крахмала, содержится инулин, эти растения применяются для лечения диабета[25].

Установлено, что крахмал снижает содержание холестерина в печени и сыворотке крови, способствует синтезу рибофлавина кишечными бактериями. Рибофлавин же, входя в ферменты и коферменты, способствует превращению холестерина в желчные кислоты и выведению их из организма, что имеет большое значение для предотвращения атеросклероза. Крахмал способствует интенсификации обмена жирных кислот. В эксперименте показано, что за счет усиления секреции инсулина крахмал снижает гипергликемию[20].

Целлюлоза. Целлюлоза состоит из остатков глюкозы, связанных между собой в-1,4 - гликозидньши связями[26].

Клетчатка или целлюлоза, является основной составной частью оболочек растительных клеток и представляет собой сложный углевод из группы несахароподобных полисахаридов. Прежде считалось, что клетчатка не переваривается в кишечнике. В последнее время установлено, что некоторые виды клетчатки частично усваиваются. Клетчатка - это самая грубая часть растения. Это сплетение растительных волокон, из которых состоят листья капусты, кожура бобовых, фруктов, овощей, а также семян. Диетическая клетчатка - сложная форма углеводов, расщепить которую наша пищеварительная система не в состоянии. Но это один из важнейших элементов питания человека. Диетическая клетчатка сокращает время пребывания пищи в желудочно-кишечном тракте. Чем дольше пища задерживается в пищеводе, тем больше времени требуется для ее выведения. Диетическая клетчатка ускоряет этот процесс и одновременно способствует очищению организма. Потребление достаточного количества клетчатки нормализует работу кишечника.

Клетчатка, механически действуя на нервные окончания стенок кишечника, стимулирует его моторную функцию, стимулирует секрецию пищеварительных соков, придает пористость пищевой массе, обеспечивая более полный доступ к ним пищеварительных соков, повышает биологическую ценность пищевых продуктов, нормализует жизнедеятельность полезных кишечных микробов, способствует выведению из организма токсических продуктов экзо- и эндогенного происхождения. И, таким образом, способствует предупреждению и лечению заболеваний печени, гипертонии, атеросклероза, нормализации бактериальной флоры кишечника, стимулирует синтез витаминов группы В, особенно В2, и витамина К[20].

Физико-химические свойства полисахаридов:

Физические свойства:

Полисахариды - аморфные вещества, не растворяются в спирте и неполярных растворителях; растворимость в воде варьирует: некоторые растворяются в воде с образованием коллоидных растворов (амилоза, слизи, пектовые кислоты, арабин), могут образовывать гели (пектины, альгиновые кислоты, агар-агар) или вообще не растворяться в воде (клетчатка, хитин).

Вязкость водных растворов фитосахаридов зависит от типов и молекулярной массы полисахарида, присутствия некоторых ионов и температуры. Подобно растворам других полиэлектролитов, вязкость растворов полисахаридов уменьшается при повышении температуры и увеличении ионной силы раствора.

Способность полисахаридов, подобно другим фикоколлоидам, образовывать в водных растворах гели является наиболее важным их физико-химическим свойством. По способности образовывать гели полиуглеводы делятся на желирующие и нежелирующие.

Гелеобразующие свойства полимерных углеводов зависят не только от их химической структуры, но и концентрации полимера, природы добавляемого катиона, температуры раствора. Для каррагинанов характерна высокая специфичность взаимодействия с катионами, поэтому в присутствии даже близких по химическим характеристикам ионов свойства полимеров резко изменяются. К-Каррагинан специфичен к ионам К+, а й-каррагинан - к ионам Са2+. Катионы нейтрализуют отрицательно заряженные сульфатные группы, что уменьшает электростатическое отталкивание между полимерными цепями и способствует стабилизации гелей[10]. Однако для каждого типа каррагинана существует своя критическая концентрация добавляемого катиона и температура гелеобразования. Кроме того, для каждого типа каррагинана характерна определенная концентрация полимера, необходимая для формирования геля. Так, й-каррагинан образует эластичные и сухие гели при довольно низкой, порядка 0,3%, концентрации полисахарида, а к - каррагинан формирует крепкие и ломкие гели при концентрации 0,5%.

В зависимости от типа каррагинана конформация его молекул в растворе может быть разной. Нежелирующие полисахариды имеют конфор-мацию хаотичного клубка (random coil), желирующие - конформацию двойной спирали, которая при определенных условиях может переходить в более сложно организованную структуру геля. Переход раствора в гель происходит за счет межмолекулярных взаимодействии, при которых каждая молекула полимера кооперативно ассоциирует с несколькими другими. В результате происходит образование единой трехмерной сетки, состоящей из молекул растворенного полимера и заключенного в ней большого количества растворителя. Природа узлов этой сетки. Это могут быть ковалентные связи между цепями, и в таком случае сетка представляет собой одну гигантскую трехмерную молекулу. Из искусственных образований - сефа-декс, полусинтетический материал для гель-хроматографии. Более типичны полисахаридные гели, в которых связи цепей в узлах нековалентны е[39].

Одним из наиболее важных свойств полисахаридов как желирующих, так и нежелирующих является взаимодействие с белками, которое осуществляется за счет ионного взаимодействия, например сульфатных групп каррагинана с заряженными группами белка. Реакция зависит от соотношения заряда белок: каррагинан, изоэлектрической точки белка, Ph и соотношения масс полисахарид: белок[39].

Некоторые полиуглеводы обладают способностью формировать гели с молочными белками. При охлаждении горячего молока, содержащего полимерные углеводы, гель образуется благодаря присутствию в молоке ионов К+ и Са2+ и взаимодействию сульфатных групп каррагинана с аминокислотными остатками молочных белков. Эта его особенность каррагинана находит широкое применение в молочной и кондитерской промышленностях как альтернатива желатина растительного происхождения.

В полисахаридах наиболее прочные гели дает несульфатированные. Считают, что гелеобразование происходит за счет перехода вытянутой спиральной конформации молекулы в растворе к жесткой упорядоченной двойной спиральной структуре, образующей зоны связывания гелевой сетки. Процесс гелеобразования можно условно разделить на две стадии: уплотнение и удвоение спиралей, называемое переходом «неупорядоченный клубок-спираль», и агрегация спиралей. Образование агарозного геля происходит при нагревании раствора полисахарида до температуры выше температуры гелеобразования и последующем охлаждении. При этом гели наилучшего качества получаются при медленном охлаждении[38].

Растворимость полиуглеводов, как и других полимеров, зависит от способности растворителя разрушать образующиеся спирали. Высокое содержание метоксильных групп и 3,6 - ангидрогалактозы увеличивает гидрофобные свойства полимерного углевода, вследствие чего он способен растворяться в горячих водно-этанольных растворах. Напротив, агар, содержащий заряженные группы способен растворяться в полярных растворителях при относительно невысоких температурах.

Химические свойства:

Полисахариды подвергаются ферментативному и кислотному гидролизу с образованием моно- или олигосахаридов, содержащих от 2 до 4 моносахаридных единиц. Каждая из групп полисахаридов обладает своими специфическими свойствами[26].

4. Методы выделения и анализа полисахаридов

Выделение полисахаридов клеточной стенки.

Обработка ксилеммы. Первое - механическое растирание на мельнице для того что бы получит муку, так как так лучше будет удаляться не прочно связанные вещества с целлюлозой и лучше растворяться. Второе - экстракция пектина и гемицеллюлозы с хелатирующими и щёлочными растворами[29].

Вначале идет отчистка клеточной стенки от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.

Удаление пектиновых веществ осуществляется с помощью оксалата аммония, как известно пектиновые вещества связаны между собой ионами Са, а оксалат аммония является хелатирующим веществом, которое связывается с ионами Са и пектиновые вещества отделяются от целлюлозы. Для удаления оксалата аммония и пектиновых веществ из колбы осуществляется центрифугирование их 3 раза с водой.

Обработка клеточной стенки ксилемы 4% NaOH позволяет извлекать гемицеллюлозные вещества, которые не извлекаются оксалатом аммония. Таким образом, с помощью 4% NaOH отделяем целлюлозу от гемицеллюлозных веществ. Затем снова удаляется щелочь и гемицеллюлозные вещества с помощью метода центрифугирования при этом проверяется Рн универсальной лакмусовой бумажкой, промыванием до нейтрального [28,29].

Выдерживание в воде «отчищенной» ксилемы необходимо для так называемой активации, без этого этапа целлюлоза не растворяется. Выдерживание в ацетоне и ДМА необходимо для полного удаления воды, так как при наличие воды целлюлоза выпадает в осадок. Клеточную стенку волокна растворяют в 8% растворе LiCl в ДМА, и заново осаждают целлюлозу путём добавления воды. Осаждение в воде необходимо для того что бы фермент полностью расщепил целлюлозу, если опустить этот этап то целлюлоза плохо будет подвергаться гидролизу. 8% раствор LiCl в ДМА используются так как они вместе являются хорошими растворителями целлюлозы и не реагируют с ней, к тому от них легко избавиться с помощью хроматографии. Раствор отделяют от целлюлозы (Фильтрат 1). Целлюлозу суспензируют в содержащем целлюлoзу ацетатном буфере. В течение 1-2 суток фермент растворяют осаждённую целлюлoзу (Фильтрат 2). Получают раствор прочно связанных полисахаридов с целлюлозой. Далее с помощью ТФУ разрушаются все гликозидные связи и при высушивaнии весь ТФУ испаряется, и остаются мономеры сахаров. Dionex эта ионно-обменная хроматография, на ней определяют моносахаридный состав, заранее вкалываются стандарты моносахаров по которым, опознается конкретный моносахарид.

В дальнейшем планируется провести ЯМР анализ и определить тип связующих гликанов.

Таким образом, отчистив клеточную стенку от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.

- Получают раствор прочносвязанных с целлюлозой полисахаридов.

- Разделяют его на фракции по молекулярным массам.

- Определяют моносахаридный состав во фракциях [28,29].

Общая методология выделения и очистки полисахаридов

При выделении отдельных полисахаридов нужно рeшaть три задачи разной степени сложности (следует отметить, что они редко являются последовательными этапами выделения):

1) разделение от низкомолекулярных веществ;

2) отделение биополимеров неуглеводной природы.

3) разделение смесей полисахаридов[29].

При выборе метода для решения очередной задачи следует учитывать те свойства целевого биополимера, по которым он отличается от других компонентов исходной смеси; эти различия и должны выявляться посредством применения искомого метода. Описан ряд параметров, на основании которых возможно произвести разделение веществ: молекулярный вес, растворимость, температуры плавления и кипения, способность вступать в качественные реакции с определёнными соединениями и т.п.; большинство из них зависит от химической структуры веществ [29,30].

Основной функциональной группировкой полисахаридов является гидроксильная группа, превращения которой (прежде всего, окисление и образование простых и сложных эфиров) оказывают значительное влияние на условия процесса выделения полисахарида. Другие функциональные группы также подвержены различным модификациям: карбоксильные группы уроновых кислот могут быть этерифицированы или восстановлены, аминогруппы аминосахаров - ацилированы, и др[29].

Полисахариды высокополярны ввиду наличия большого количества гидроксильных групп. Соответственно, растворимость полисахарида должна быть прямо пропорциональна полярности растворителя. Все полисахариды плохо растворимы в формамиде и диметилсульфоксиде и практически нерастворимы в спиртах, однако растворимость в воде определяется не только полярностью, но и степенью упорядоченности строения макромолекулы[30].Некоторые внеклеточные полисахариды с регулярной структурой и линейной конформацией обладают высокой энергией межмолекулярного взаимодействия, превосходящей энергию гидратации; поэтому эти соединения всего лишь слабо набухают в воде [31].Полисахарид разветвлённого строения (например, разветвлённые пектиновые кислоты) существует в водных растворах в виде беспорядочно свёрнутого рыхлого клубка и, благодаря большим размерам и гибкости макромолекул, связывает огромное количество растворителя (объём такого клубка во много раз превышает изначальный объём макромолекулы). Кроме того, полисахариды склонны к образованию ассоциаций в растворах за счёт межмолекулярных водородных связей; при малых объёмах жидкости это может привести к возникновению нерастворимых форм.

Вне зависимости от природы целевого соединения процесс должен быть максимально эффективным, т.е. обеспечивать максимальный выход продукта; полисахарид не должен подвергаться деструкции под воздействием химических реагентов, использованных для его выделения, либо ферментов, присутствующих в составе сырья.

Экстракция. Метод экстракции подразумевает извлечение веществ, содержащихся в сырье, в раствор, и используется как начальный этап очистки. Возможно два варианта экстракции:

1) Растворение полисахарида и ряда сопутствующих веществ и отделение нерастворимых примесей. Таким образом, получают растительные слизи и некоторые бактериальные экзополисахариды. Чаще всего в качестве растворителя используют воду, однако полисахариды с большим количеством кислотных функциональных групп лучше растворяются в разбавленных минеральных кислотах, а гемицеллюлозы экстрагируют в щелочной среде.

Экстракция полисахаридов сопровождается растворением полярных низкомолекулярных соединений, некоторых белков и нуклеиновых кислот, поэтому дальнейшая обработка экстракта предусматривает удаление этих веществ.

2) Выделение полисахарида из смеси в виде осадка. Так, хитин и целлюлоза сохраняют целостность структуры при жёсткой щелочной или окислительной обработке, которая приводит к деструкции остальных биополимеров.

Экстракция требует предварительного измельчения сырья; при этом часть фибриллярных молекул может быть повреждена либо механическим путём, либо окислением кислородом воздуха (последнее - в щелочной среде).

Осаждение. Перевод вещества из раствора в осадок можно осуществить несколькими путями:

1) Нагревание экстракта / исходной смеси с последующим охлаждением. В ходе данной процедуры выпадают в осадок полисахариды, растворимость которых в горячей воде значительно выше, чем в холодной: в-глюкан из овса, инулин и др.

2) Осаждение органическим растворителем, смешивающимся с водой. Обычно применяют 80% этанол, который растворяет низкомолекулярные примеси, в т. ч. олигосахариды, в то время как полисахариды выпадают в осадок.

3) Фракционное осаждение. В этом случае получают серию фракций осаждаемых веществ, соответствующих разным концентрациям осадителя в растворе; в каждой фракции содержание целевого полисахарида выше, чем в предыдущей. Данный способ может быть пригоден для разделения смеси полисахаридов. Например, кислые полисахариды могут быть отделены от нейтральных в виде нерастворимых кальциевых или бариевых солей.

4) Добавление комплексообразователей. Остатки уроновых кислот и моносахаридов с соседними гидроксильными группами образуют нерастворимые комплексы с ионами меди; высокомолекулярные комплексообразователи (амилоза) взаимодействуют таким же образом с целлюлозой, и т.п. [29].

В результате осаждения полисахаридов из первичных экстрактов часто получают смеси, загрязнённые неуглеводными примесями, в первую очередь белком и неорганическими солями, поэтому необходимо подвергнуть экстракт предварительной обработке посредством диализа, ультрафильт-рования или ферментативной очистки.

Диализ. В процессе диализа раствор экстракта помещают в целлофан, погружённый в воду; при этом низкомолекулярные примеси диффундируют через целлофан наружу. Диффузия ускоряется под действием электрического поля (электродиализ) или при перемешивании. Для удаления катионов из растворов кислых полисахаридов диализ проводят в подкисленной среде.

Ультрафильтрование представляет собой фильтрование раствора через полупроницаемую мембрану с определённой величиной пор и так же позволяет избавиться от низкомолекулярных примесей.

Ферментативная обработка разрушает высокомолекулярные примеси, которые не удаётся удалить при помощи диализа. Очистка раствора от использованного фермента осуществляется одним из методов денатурации белков: нагревание, действие химических реагентов (щёлочи, трихлоруксусной кислоты, хлороформа с амиловым спиртом и т.д.), избирательная сорбция белков на геле фосфата кальция[29]. Такие методы применяются для деструкции неферментных белков, загрязняющих раствор[31].

Хроматография - разделение веществ, различающихся по определённым физико-химическим параметрам.

Bид хроматографии, основанный на разделении веществ по молекулярному весу - гель-фильтрация на сефандексе. Сефандекс - полусинтетический сорбент полисахаридной природы; его гранулы содержат поры и формируют т. Н. «молекулярное сито», которое задерживает внутри низкомолекулярные вещества и не препятствует диффузии полимеров. Существуют наборы сефандексов с различной величиной пор для разделения смеси полисахаридов. Так получают декстраны[29].

Ионообменная хроматография позволяет разделить вещества в соответствии с их зарядом (например, отделить кислые полисахариды от нейтральных). Ионообменник - это твёрдый носитель заряженных групп, которые способны за счёт электростатистического взаимодействия связывать ионы исследуемых молекул. Таким образом, заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником и могут быть элюированы для дальнейшей обработки[31].

Pаспределительная и адсорбционная хроматография не нашли широкого применения в области получения полисахаридов[29].

Распределительная хроматография выявляет разную подвижность исследуемых веществ при распределении последних между двумя фазами, стационарной (матрикс, носитель, сорбент) и мобильной (растворитель, проявитель). Адсорбционная хроматография может разделить вещества в том случае, если при одинаковых концентрациях они демонстрируют разную степень связывания с сорбентом[31]. Проблемы, которые возникают при использовании данных видов хроматографии при работе с растворами полисахаридов, обусловлены склонностью последних к межмолекулярной ассоциации и образованию коллоидных растворов.

Электрофорез основан на способности веществ, имеющих заряженные группы атомов, двигаться в растворителе под действием электрического поля [31].

Использование данного метода ограничено сложностью подбора условий эффективного разделения (состав буферной смеси, концентрация растворителя, сила тока, продолжительность фореза и др.). Тем не менее, электрофорез успешно используется для отделения сульфированных полисахаридов от полиуронидов водорослей, маннаны от глюканов Candida albicans и компоненты других гетерогенных полисахаридных смесей[29].

Ультрацентрифугирование (седиментация) обеспечивает концентрационное распределение веществ по центрифужной пробирке под действием центробежной силы. Измерение длины траектории движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определением скорости седиментации; зная эту величину, можно вычислить коэффициент седиментации - показатель, значение которого зависит от молекулярной массы и формы частицы[31].

Процесс выделения полисахаридов так же можно облегчить путём изменения поверхностных свойств продуцируемого вещества (например, за счёт удаления поверхностного полимерного материала типа липополисахаридов). При этом надо помнить, чтобы клеточный материал не выходил из периплазматического пространства; необходимо также избегать лизиса клеток с последующим загрязнением конечного продукта.

Часто есть опасность при выделении полисахаридов деструкции под действием ферментов. Растворы полисахаридов могут служить средой для роста микроорганизмов, попадающих туда из воздуха лаборатории. Для предотвращения расщепления полисахаридов ферментами микроорганизмов к растворам прибавляют толуол, тимол или хранят их при низкой температуре[31].

Особенности выделения и очистки некоторых полисахаридов

Внеклеточный полисахарид	Источник	Особенности структуры и / или физико-химических свойств	Первичная обработка	Предпочтительные методы выделения и очистки
Пектиновые вещества растений	Водоросли; плоды покрытосеменных растений	Склонность к образованию гелей.	Измельчение и экстракция.	Комплексообразование. Фракционное осаждение Cu2+, Ba2+, Mg2+ и др.
Камеди	Повреждённые или инфицированные ткани растений	Высокая степень гетерогенности моносахаридного состава. Обязательное наличие кислотных остатков. Вязкость, образование стеклообразной массы при застывании	Отсутствие экстракции.	Комплексообразова-ние. Фракционное осаждение Ba2+ или Ca2+. Электрофорез.
Растительные слизи	Растительные ткани	Вязкость.	Возможно отсутствие экстракции (если целевой полисахарид - поверхностная слизь).	Возможно комплексообразование (при наличии кислотных остатков). Фракционное осаждение Ba2+ или Ca2+.

Методы анализа ПС

Общий принцип выяснения последовательности моносахаридных остатков в полисахариде состоит в расщеплении цепи на олигосахаридные фрагменты, установлении строения таких фрагментов и последующей реконструкции структуры макромолекулы по структурам олигосахаридов.

Выяснение конфигурации гликозидных связей - и есть задача моно-мерного анализа, она относится к детализации структуры отдельных звеньев. Проблема в том, что все методы мономерного анализа очень деструктивны и обязательно включают расщепление гликозидных связей. А при всех известных способах расщепления гликозидных связей, применяемых в мономерном анализе полисахаридов (кроме ферментативного гидролиза, см. ниже), информация о конфигурации этой связи теряется.

Похоже, универсальный (гипотетический) метод определения конфигурации гликозидных связей в полисахаридах реализует себя вот так. Это должен быть такой метод расщепления гликозидных связей, который приводил бы количественно к производным моносахаридов, подобно кислотному гидролизу. Но с той, однако, разницей, что структура этих производных должна зависеть от конфигурации расщепляемой гликозидной связи исходного остатка. Тогда мы имели бы метод мономерного анализа, который одновременно давал бы информацию и о природе каждого мономерного звена, и о конфигурации его гликозидной связи. Наилучшее доступное сейчас приближение к идеалу - это окисление ацетатов полисахаридов хромовым ангидридов в уксусной кислоте.

...