Полисахариды растений как перспективный источник получения лекарственных средств. Структура, физико-химические свойства, методы анализа

Современные методы определения структуры полисахаридных цепей несовершенны и имеют ограниченную область. Нельзя, однако, забывать о резком расширении возможностей наших методов при их совместном приме-нении. Например, частичный кислотный или ферментативный гидролиз удаляет боковые цепи. Для этого разбирают продукты гидролиза на моносахаридный состав и длину боковых цепей, а так же главную цепь, которая анализировать значительно легче. Для этого полисахарид подвергают деградации по Смиту, которая в благоприятном случае приводит к расщеплению главной цепи. Мы получаем, так сказать, две неполные карты структуры в разных красках. А их наложение друг на друга даст уже полную картину. Вот так для большинства полисахаридов удается уже сейчас собрать почти исчерпывающую структурную информацию[32].

Деградация по Смиту:

Деградация по Смиту основана на более избирательной, но и более сложной последовательности реакций. Ключевой стадией здесь служит окисление полисахарида солями иодной кислоты - периодатами. При этой реакции происходит разрыв С-С-связи в гликолях с образованием диальдегида, последующее восстановление которого приводит к образованию диола.

Гликозидные связи, соединяющие моносахаридные звенья друг с другом, чувствительны к действию кислот, поэтому обработка полисахаридов кислотами вызывает их деполимеризацию. Основной функциональной группировкой полисахаридов является гидроксильная группа, и превращения этой группы - в первую очередь, получение простых и сложных эфиров и окисление - играют очень большую роль и при установлении строения, и в практическом использовании полисахаридов. Интересно отметить, насколько резко отличаются простые и сложные эфиры полисахаридов от свободных полисахаридов по физическим свойствам. Эти эфиры плохо растворимы в воде, легко растворяются в органических растворителях, причем в производных такого типа отсутствует сильное межмолекулярное взаимодействие, так как нет возможностей для образования водородных связей. Другие функциональные группы, встречающиеся в полисахаридах, также могут участвовать в обычных превращениях. Так, карбоксильные группы уроновых кислот могут быть этерифицированы, восстановлены, аминогруппы аминосахаров - ацилированы и т.д. Общими особенностями реакций полисахаридов, связанными с их полимерным характером, являются трудность достижения полноты реакции по всем функциональным группам макромолекулы, и трудность проведения избирательных реакций, если только реагирующие группы не отличаются очень сильно по реакционной способности.

Полисахарозам соответствует общая формула (С6Н10О5) n * Н20, где п - достаточно велико; они безвкусны, аморфны и не растворимы в воде. Так же, как и дисахарозы, они при гидролизе превращаются в С6- и С5 - сахара [33].

Подлинность моносахаридов

Подлинность глюкозы и лактозы устанавливают, нагревая до кипения растворы препаратов с реактивом Фелинга. При этом глюкоза образует кирпично-красный осадок оксида меди (I). При действии на глюкозу, сахаро-зу и лактозу аммиачным раствором нитрата серебра выделяется черный оса-док серебра.

Для испытания подлинности к раствору сахарозы (1:2) последовательно прибавляют растворы нитрата кобальта и гидроксида натрия. Появляется фиолетовое окрашивание.

Pастворы глюкозы и лактозы образуют с фенилгидразином выпадающие в осадок фенилгидразоны. При последующем нагревании на водяной бане получаются окрашенные в желтый цвет озазоны. Озазоны имеют характерную температуру плавления. Глюкоза взаимодействует с тремя молекулами фенилгидразина:

Под воздействием минеральных кислот или щавелевой кислоты моно- и дисахариды превращаются при нагревании в пробирке на пламени горелки в фурфурол или его производные (дисахариды вначале гидролизуются в моносахариды). Из гексоз (глюкоза) образуется окси мети л фурфурол, а из пентоз (фруктоза) - фурфурол:

Фурфурол или оксиметилфурфурол, являясь летучими соединениями, взаимодействуют с анилином или новокаином, нанесенным на фильтровальную бумагу, которой накрывают пробирку. Вначале образуются основания Шиффа, имеющие светло-желтую окраску, а затем фурановый цикл раскры-вается и получается йолиметиновый краситель - производное оксиглюта-конового альдегида (малиново-фиолетовое окрашивание):

Углеводы образуют со спиртовым раствором б-нафтола и концентрированной серной кислотой cоединения хиноидной структуры, окрашенные в красно-фиолетовый цвет. В основе реакции также лежит процесс образования фурфурола или оксиметилфурфурола, которые конденсируются с б-нафтолом в триарилметановое хиноидное соединение[34].

Качественные реакции на полисахариды:

Pеакция на крахмал с раствором йода:

При нанесении на порошок 2-3 капли раствора йода наблюдается сине-фиолетовое окрашивание.

Реакция на целлюлозу с раствором йода:

На порошок наносят пипеткой каплю раствора йода. Целлюлоза окрашивается раствором йода в желтый или коричневый цвет.

Pеакция на слизи со щелочью:

При смачивании порошка раствором едкого натра появляется желтое окрашивание.

Реакция на слизи с тушью:

Семена льна измельчают и помещают на предметное стекло в каплю туши (разведенную водой 1:10), тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. На темно-сером (почти черном) фоне выделяются белыми пятнами клетки со слизью.

Реакции на инулин:

а) проводят реакцию с раствором йода для доказательства отсутствия крахмала;

б) на образец наносят пипеткой 2-3 капли 20% спиртового раствора б-нафтола и каплю концентрированной серной кислоты. С течением времени появляется фиолетовая окраска.

Осаждение слизи этанолом из водного извлечения:

10 г. измельченного сырья (листья подорожника) помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды и нагревают с обратным холодильником на электрической плитке в течение 30 минут, поддерживая слабое кипение. Извлечение фильтруют через 5 слоев марли.

К 10 мл фильтрата прибавляют 10-30 мл 95% этанола и перемешивают.

Появляются хлопьевидные сгустки, выпадающие в осадок при стоянии (полисахариды).

Реакция с ацетатом свинца:

К 2 мл извлечения из подорожника прибавляют 2 мл раствора ацетат свинца. Выпадает объемный осадок слизи.

Реакция с раствором щелочи (аммиака):

К 1-2 мл 10% настоя корня алтея, приготовленного на холодной воде, прибавляют несколько капель раствора гидроксида натрия (или аммиака).

Смесь приобретает лимонно-желтую окраску.

Реакция с хлористоводородной кислотой:

В пробирку наливают 1 мл 10% настоя корня алтея и прибавляют несколько капель концентрированной хлористоводородной кислоты. Образуется желтовато-зеленое окрашивание. К смеси приливают 2 мл 95% этанола. Слизь коагулирует в пористый сгусток[35].

Xимические методы

Для определения содержания моносахаридов (МС), установления моносахаридного состава в образцах полисахаридов, определения местоположения заместителей и вида гликозидных связей используют разнообразные химические методы в сочетании с методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Для анализа полисахаридов методом ГЖХ их подвергают гидролизу до МС с последующим получением летучих производных. Как правило, для гидролиза используют серную и трифторуксусную (ТФУ) кислоты, но предпочтение отдают более летучей и легко удаляемой ТФУ. Преимуществом данного метода является его высокая чувствительность и использование небольшого количества вещества. Недостатки связаны, в основном, со стадиями получения производных сахаров, когда восстановление или ацетилирование могут пройти не полностью[38].

Сейчас есть разнообразные методы гидролиза полисахаридов, а также способы получения производных в зависимости от условий проведения (время и температура). Так, например, Хама с соавторами разработали метод определения компонентов МС галактанов, включая 3,6 - ангидрогалактозу, в виде диэтилдитиоацеталей (диэтилмеркапталей) в результате ангидромеркаптолиза. В отличие от ранее использованной HCl в этантиоле, Хама предложил другую систему растворителей для меркаптолиза, содержащую дополнительно метанол в объемном соотношении этантиол: метанол 2:1, что позволяло получить диэтилмеркаптали МС без образования 28 метилгликозидов. Плюс разработанного метода является отсутствие в продуктах реакции аномерных и структурных изомеров.

Затем появился достаточно простой метод, содержащий последовательное проведение мягкого восстановительного гидролиза и ангидромеркаптолиза. В результате такого гидролиза МС остатки на восстанавливающих и невосстанавливающих концах могут быть определены либо как спирты, либо как диэтилдитиоацетали соответственно[38].

Для определения местоположения заместителей и характера связи используют метод метилирования. Данный метод состоит из метилирования полисахаридов метилйодидом в сильноосновной среде с последующим кислотным гидролизом, в результате которого разрушаются гликозидные связи без деградации ангидрокольца. Для предотвращения неполного метилирования и десульфатирования полисахариды чаще всего используют в форме их тетраэтиламмониевых солей[38].

Методы определения.

В настоящее время для этих целей используют классические методы химии углеводов, комбинирование методов структурной химии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (спектроскопии ЯМР), методы химической и ферментативной модификации, хроматографические методы (газо-жидкостная хроматография (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), гельпроникающая хроматография), а также методы световой микроскопии и электрофорез[36]. В последние годы для установления тонкой структуры полисахаридов стали использовать различные виды масс-спектрометрии[37].

ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием

В 1950-х годах инфракрасные спектры (ИК-спектры) большинства углеводов были описаны при попытке соотнести различия в структуре моно-, олиго- и полисахаридов. Обнаружено, что аномерные формы гликозидов легко различимы в ИК-спектрах, а частоты от 1240 до 820 см-1 указывают на распределение сульфатных групп, присутствующих в гиалуроновой кислоте и 30 мукополисахаридах. Позже, данный метод стали применять для анализа сульфатированных полисахаридов красных водорослей.

Открытие в 1965 г. Метода быстрого Фурье преобразования позволило разработать новое поколение ИК-спектрометров с Фурье-преобразованием, оснащенных программным обеспечением, способным выполнять обработку спектральных данных. Этот метод является быстрым, не требует больших количеств веществ и в результате анализа вещество не разрушается, что, несомненно, является преимуществом метода.

В ИК-спектрах углеводов можно выделить пять областей. Область 3600-2800 см-1 соответствует валентным колебаниям O-H и C-H, тогда как область 1500-1200 см-1 относится к области локальной симметрии. Полосы поглощения при 1200-950 см-1 отражают C-O валентные колебания, область 950-700 см-1 называют областью «отпечатков пальцев» или аномерной, область ниже 700 см-1 - скелетная область[38].

Cпектроскопия 13С ЯМР

Спектры 1 Н и 13С ЯМР дают более полную информацию о составе и строении полисахаридов, чем ИК-спектры. Использование 13С ЯМР спектроскопии для установления первичной структуры галактанов было предложено в 1978 г. Спектры 13С ЯМР характеризуются довольно большим диапазоном химических сдвигов атомов углерода, и даже небольшие изменения в окружении атомов углерода вызывают ощутимое изменение значений химических сдвигов. В связи с этим, спектроскопия 13С ЯМР, по сравнению со спектроскопией 1 Н ЯМР, явлется наиболее информативным методом при установлении структуры гибридных полисахаридов. Так, например, замещение атома кислорода МС остатка (гликозилирование, метилирование или сульфатирование) приводит к сдвигу сигнала на 6-11 м.д. в область слабого поля для атома углерода, несущего заместитель (б-эффект замещения), и на 2-4 м.д. в область сильного поля для двух соседних атомов (в-эффект). Образование 3,6 - ангидрокольца, которое можно рассматривать как продукт внутримолекулярного замещения одновременно при О-3 и О-6 остатка галактозы, вызывает конформационную инверсию пиранозного кольца и значительное изменение в химических сдвигах всех атомов углерода по сравнению с исходным галактопиранозным остатком. Таким образом, спектры 13С ЯМР регулярных полисахаридов соответствуют спектрам дисахаридов и представляют собой 12 хорошо разрешенных сигналов.

Для получения хорошо разрешенного спектра ЯМР образец полисахарида обрабатывают ультразвуком и снимают спектр при повышенной температуре с целью уменьшения вязкости раствора полимера[38].

Значения химических сдвигов рассчитывают относительно таких внутренних стандартов, как диметилсульфоксид (ДМСО), тетраметилсилан (ТМС) и метанол. Недостатком ТМС, затрудняющим его широкое использование, является плохая растворимость в полярных растворителях, даже таких, как вода. В связи с этим, комиссия ИЮПАК предложила использовать 2,2 - диметил-2-силапентан - 3,3,4,4,5,5 - d6-5-сульфонат натрия (ДСС) в качестве единого эталона для спектроскопии 1 Н и 13С ЯМР в сильнополярных растворителях. Следует отметить, что химические сдвиги спектров 13С ЯМР для галактанов относительно ДСС оказываются в среднем на 2,1 м.д. больше, чем сдвиги относительно ТМС, в 34 то время как в спектрах 1 Н ЯМР химические сдвиги незначительно отличаются от тех, что были получены ранее.

Спектроскопия 13С ЯМР имеет невысокую чувствительность, поэтому информация о минорных компонентах полисахаридов может быть недоступна. Тем не менее, остатки пировиноградной кислоты, входящие в состав сложных полисахаридов, можно определить по характерным сигналам их атомов углерода вместе с 1,3 - связанной D-галактозой.

Достоинством спетроскопии 13С ЯМР является его высокая информативность. Количественное определение состава смеси сульфатированных полисахаридов основано на интенсивности резонансов аномерных атомов углерода обоих колец дисахаридного звена.

Может проводится дополнительная химическая модификация. Так для структурного анализа сложных галактанов, в молекуле которых встречается несколько различных повторяющихся звеньев, предложен новый подход, заключающийся в сопоставлении спектров 13С ЯМР нативного полисахарида, продукта его метилирования и продуктов десульфатирования этих двух полимеров[38].

Спектроскопия 1 Н ЯМР

Преимущество спектроскопии 1 Н ЯМР перед 13С ЯМР заключается в высокой чувствительности метода, что позволяет анализировать меньшее количество вещества с меньшими затратами времени.

В последнее время для анализа сложных полисахаридов используются различные виды двумерной спектроскопии: 1 Н- 1 Н COSY (корреляционная 36 спектроскопия), 1 Н- 1 Н ROESY (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат), 1 H - 13C HSQC (гетероядерная одноквантовая корреляция), которые позволяют провести отнесение сигналов протонов МС остатков и осуществить углерод-протонную корреляцию. Данные, полученные при анализе таких двумерных спектров, позволяют определить положение заместителей. Двумерная спектроскопия является важнейшим инструментом при установлении новых структур полисахаридов, не требующим проведения дополнительных химических модификаций[38].

Ферментативные методы:

Сейчас при анализе гибридных структур галактанов часто используют специфические ферменты - агаразы и каррагиназы.

Ферментативный анализ является чувствительным методом, с помощью которого можно установить тонкие детали структуры, не идентифицируемые методами спектроскопии и химическими методами. Данный метод позволяет получить фрагменты полимера, состоящие из повторяющихся единиц, которые могут быть структурно целыми, и изучить их распределение вдоль полимерной цепи. Основными продуктами ферментативного гидролиза сульфатированных полисахаридов являются олигосахариды с определенной длиной цепи, для разделения которых используют высокоразрешенную хроматографию[38].

Агаразы - ферменты, катализирующие гидролиз агара. Источниками этих ферментов являются морские грамотрицательные бактерии.

Следует отметить, что активность ферментов чувствительна к таким параметрам, как Рн и температура среды. Так, например, температура гелеобразования агара около 38°С, поэтому большинство агараз проявляют активность при температуре 30°С, за исключением бактерий Vibrio sp. JT0107 и Alteromonas sp. C-1. Большинство ферментов нестабильны при высоких температурах. Кроме того, большинство агараз проявляют оптимальную активность при нейтральном и слабощелочном Рн[38].

Заключение

Проведенные в последние годы исследования по изучению различных свойств полисахаридов растений показывают, что перспектива полиуглеводов в создании новых лекарственных средств лежит в их будущем использовании при комплексном лечении. Многофункциональность ранее казавших фармакологических индифферентых углеводных соединении лежит в областях профилактики (например простудных заболеваний), лечении (при различных кровотечениях) и диагностики разных болезней (рентгеновская или компьютерная томография).

В независимости от появлении новых фармацевтических технологии по созданию новых лекарственных средств, фармацевтический анализ углеводных биополимеров сложен и требует комбинирования различных методик.

Список использованной литературы

1) Полисахариды - высокомолекулярные продукты конденсации [электронный ресурс] - электрон. дан. - режим доступа http://lektsii.com/

2) Строение, классификация полисахариды [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://pharmspravka.ru/

3) Гурьев А.М. Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и перспективы их использования в терапии злокачествен-ных новообразований: автореф., дис, … /А.М. ГУРЬЕВ - Томск 2011. - 297 с.

4) Источники и методы получения лекарственных веществ [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://mirznanii.com/

5) Куркин В.А. «Фармакогнозия» второе издание; Учебник для студентов фармацевтических вузов./ В.А. Куркин - Самара - 2007 год.

6) МПК A61K 36/882. Средство на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов/Е.Н. Амосова, М.В. Белоусов, А.М. Гурьев, Е.П. Зуева, С.Г. Крылова, К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, М.С. Юсубов №2308285: заяв. 14.12.2005, публ. 20.10.2007

7) Полисахариды [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://ido.tsu.ru/

8) Классификация полисахаридов [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://www.onemedic.ru/

9) Войс Р.Ф., Финтельманн Ф. Фитотерапия / пер. с нем./Р.Ф. Войс, Ф. Финтельманн - М., 2004. - 243

10) Бабкин В.А. Разработка опытно-промышленной технологии производства комплексной биологически активной добавки к комбикормам для сельско-хозяйственных животных, содержащей полисахариды и полифенолы лист-венницы: реферат зав. лабораторией химии древесины д.х.н., профессор / В.А. Бабкин - Иркутск 2013 г.

11) Hauer J. Mechanism of stimulation of human natural killer cytotoxicity by arabinogalactan from Larix occidentalis / J. Hauer, F.A. Anderer // Cancer Immunol. Immunother. 1993. V. 36. P. 237-244.

12) Медведева Е.Н. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования / Е.Н. Медведева, В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27-37.

13) Пищевые волокна: новый взгляд на традиционные добавки // Бизнес пищевых ингредиентов. 2008. №3.

14) Patent US 5141739. Delivery of X-Ray contrast agents using receptor mediated endocytosis / Chu Jung, Palmacci S., Josephson L. 1992. ч

15) Patent US 5490991. Directed delivery of radioprotectants using a receptor specific carriers / Enriquez P., Chu Jung, Groman V. 1996.

16) Галочкин В.А. Неспецифическая резистентность и мясная продуктивность у бычков при введении в рацион араби-ногалактанов

17) Бабкин В.А. Экологически безопасная технология производства полиса-харидов из отходов лесозаготовок и лесопиления / В.А. Бабкин, Ю.А., Малков, Е.Н. Медведева, Н.Н. Трофимова, Н.В. Иванова // Российский химический журнал (ЖВХО им. Д.И. Менделеева). 2011. Т. LV, №1. С. 10 - 16.

18) Медико-биологическое значение растений, содержащих полисахари-ды [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://mirznanii.com

19) Фармакологическая активность растительных полисахаридов [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://studopedia.su/

20) Что содержат растения [электронный ресурс] электрон. дан. режим доступа http://medicineways.narod.ru

21) Пектины: применение в медицинской практике [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://www.vostokpharm.ru

22) Виноградов Т.А., Гажев Б.Н. Практическая фитотерапия./Т.А. Виноградов, Б.Н. Гажев М.: Эксмо-Пресс, 2001.

23) Слизи: классификация, строение, физико-химические свойства, методы обнаружения и количественного определения [электронный ресурс] электрон. дан. режим доступа http://studall.org

24) Цикорий дикий (Цикорий обыкновенный) Cichorium intybus L. (Аналитический обзор) Б.М. Зузук, Р.В. Куцик. [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://www.provisor.com.ua

25) Лекарственные растения Государственной Фармакопеи / под ред. И.А. Самылиной. - М.: АНМН, 2001.-488 с.

26) Целлюлоза [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://www.chemport.ru/

27) Гурьев А.М. Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и перспективы их использования в терапии злокачественных новообразований: автореф., дис, … /А.М. ГУРЬЕВ - Томск 2011. - 297 с.

28) Прочносвязанные с целлюлозой полисахариды клеточной стенки ксилемы льна [электронный ресурс] - электрон. дан. http://megabasefile.ru/

29) Методы выделения и очистки полисахаридов [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://biofile.ru/

30) Гаммерман А.Ф. Лекарственные растения. / А.Ф. Гаммерман, Г.Н. Кадаев, Яценко-Хмелевский А.А. - М.: Высшая школа, 1983. - 394 с

31) Фрайфелдер Д.А. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии. Пер. с англ. / Ф.А. Фрайфелдер - М.: Мир. - 1980. - 581 с.

32) Установление строения полисахаридов [электронный ресурс] электрон.

дан. режим доступа http://www.xumuk.ru/

33) Арзамасцева Л.П. Фармацевтическая химия: Учеб. пособие / Л.П. Арзамасцева. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 640 с.

34) Глущенко Н.Н. Фармацевтическая химия: Учебник для студ. сред. проф. учеб. заведений / Н.Н. Глущенко, Т.В. Плетенева, В.А. Попков - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 384 с.

35) Коренская И.М. Учебно-методическое пособие для самостоятельной рабо-ты по подготовке и проведению лабораторных занятий по фармакогнозии / И.М. Коренская - Воронеж 2008. - 854 с

36) Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатиро-ванных полисахаридов красных водорослей // Химия растительного сырья. /А.И. Усов - 2001. - №2. - С. 7-20

37) Goncalves A.G., Ducatti D.R.B., Grindley T.B., Duarte M.E.R., Noseda M.D. ESI-MS differential fragmentation of positional isomers of sulfated oligosaccharides derived from carrageenans and agarans // J. Am. Soc. Mass Spectrom. - 2010. - Vol. 20. - P. 1-13

38) Кравченко А.О. Комплексное исследование полисахаридов и фотосинтетических пигментов красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis:дис. кандидата химических наук / А.О. Кравченко Тихоокеанский институт биорганической химии им. Г.Б. Елякова - ВЛАДИВОСТОК - 2015. - 161 с

39) Углеводы [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа http://www.xumuk.ru/uglevody/027.html

40) Карригинан [электронный ресурс] - электрон. дан. режим доступа https://ru.wikipedia.org

41) Supplementation with Larch Arabinogalactan Found to Support the Body's Immune Defenses Against Respiratory Tract Infections [электронный ресурс] - электрон. Дан. http://www.lonza.com/

Размещено на Allbest.ru