Влияние обогащенной тромбоцитарной плазмы крупного рогатого скота на регенерацию кожных ран

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

В настоящее время в Российской федерации уделяют большое внимание эффективному развитию Ветеринарии.

Для обеспечения этих целей необходима работа высококвалифицированных специалистов - врачей ветеринарной медицины, профессионалов своего дела. Для их подготовки в нашем государстве уделяется большое внимание.

С развитием Ветеринарной медицины постоянного повышения качества лечебно-профилактической работы. Это обусловлено тем, что заболеваемость, гибель животных от незаразной патологии остаются достаточно высокими. Основными причинами воспалительных процессов являются: несоответствие условий содержания и кормления животных, генетические, морфофункциональные и этиологические особенности конкретных видов животных, повышенный уровень травматизма, снижение активности иммунных факторов защиты организма.

Одним из важнейших условий успешной работы ветеринарного специалиста является проведение мероприятий, направленных на повышение неспецифической резистентности организма животных к болезням, для чего необходимо не только контролировать условия содержания и кормления животных. Но и рационально использовать средства, повышающие устойчивость организма к болезням. Задачи исследования:

Для достижения заявленной цели исследований нами были решены следующие задачи:

1. Изучить технологию получения обогащенной тромбоцитарной плазмы.

2. Проанализирована нормативная и отчётная документация, вет клиник ВГАУ.

3. Освоены лабораторные методы исследования Крови. И получение гистологического материала.

4. Освоены методы лечения ран.

Научно-практическая значимость работы заключается в установлении регенерации ран с помощью обогащенной тромбоцитарной плазмы КРС.

В качестве вопросов, выносимых на защиту отмечаем следующие:

1. Экспериментальные данные полученные в Вет клиниках ВГАУ. При использовании Тромбоцитарной плазмы КРС на собаках разных возрастных групп.

2. Анализ полученных результатов.

1. Обзор литературы

1.1 Раны

Раной называют нарушение целости покровов тела (кожи, слизистых оболочек) под влиянием внешнего насилия. Раны, при которых повреждены только кожа и слизистые оболочки (до фасции), называются поверхностными. Если повреждение распространяется на расположенные глубже ткани (мышцы, сухожилия, нервы, кости и т. д.), то раны считаются глубокими. Раны, сообщающиеся с полостью, называются проникающими (раны грудной клетки, живота, головы, сустава и др.).

В зависимости от характера ранящего предмета различают на: резанные, колотые, рубленые, ушибленные, лоскутные, скальпированные, размозженные, укушенные, огнестрельные и другие раны.

Следует выделить особый вид поверхностных ран, которые очень часто возникают в производстве, - экскориации кожи и ссадины. При первом повреждении повреждаются только верхние слои кожи, при втором - все слои. Первая помощь при таких повреждениях заключается в туалете раны с помощью мыла, воды, перекиси водорода, обработке любыми антисептическими средствами (2 % спиртовой раствор бриллиантового зеленого, хлоргексидин, повиаргол).

По характеру повреждения тканей различают следующие виды ран: резаные, колотые, рубленные, рваные, ушибленные, размозженные, укушенные, отравленные, огнестрельные (слепые, сквозные, касательные, опоясывающие), зараженные.

Резаные раны образуются при повреждении тканей режущими острыми предметами (ножом, стеклом, бритвой, косой). Края раны ровные, поэтому быстро заживают, зияние полости и кровотечение незначительны. Глубокие же раны с повреждением сухожилий, мышц и других тканей зияют очень сильно, сопровождаются обильным кровотечением, заживают медленно.

Колотые раны наносятся узкими, округлыми и длинными остры ми колющими предметами (штыком, гвоздем, толстой проволокой, шилом, вилами, иглой, сучком дерева). Имеют небольшие наружные размеры, но узкий длинный раневой канал, неровный из-за смещения тканей, иногда проникающий в грудную или брюшную полость. Поэтому подобные травмы чаще встречаются в указанных полостях и дистальной части конечности, возможно повреждение внутренних органов. Такие раны очень опасны, медленно заживают, иногда образуют свищи. Могут сопровождаться повреждением кровеносных сосудов и вызывать наружное и внутреннее капельное кровотечение, которое появляется лишь после извлечения из тканей инородного тела. Зияние колотых ран незначительно, место укола иногда незаметно. В глубине раны часто образуется гематома, а в случае инфицирования развивается флегмона.

Рубленые раны возникают в результате удара тяжелым острым предметом (топором, долотом, саблей). Такие раны сильно зияют, болезненны, бывают глубокими и окружены нежизнеспособными тканями, но менее кровоточивыми.

Рваные раны возникают от механического растяжения тканей за пределы ее эластичности (разрыв кожи и тканей рогами, торчащими в стенках гвоздями и друг ими острыми выступами, крючками, копями животных). Значительно разрушаются ткани с образованием неровных, лоскутных краев, кровоизлияний и гематом. Разновидностями данных ран являются скальпированные, ушибленные и размозженные раны.

Ушибленные раны возникают при сильном воздействии на мягкие ткани тупых предметов (камнем, палкой, молотком, обухом топора, бортом машины, при повале животного на твердый грунт). Рана неглубокая, но опасная, так как в глубине ее находятся раздавленные и пропитанные кровью ткани, в подкожной клетчатке появляются гематомы.

Размозженные раны возникают при столкновении животных с движущимся транспортом или при падении на них тяжелых предметов. Они характеризуются наличием обширных участков раздавленных тканей и развитием травматического некроза. Иногда сопровождаются полным отчленением сегмента конечности с отрывом кожи выше уровня повреждения глубжележащих тканей.

Укушенные раны возникают от укусов домашних и диких животных и характеризуются обильным микробным загрязнением за счет микрофлоры полости рта и, как правило, осложняются нагноением и требуют длительного лечения. Кроме того, при укусе животным, больным бешенством, в организм может попасть вирус бешенства.

Отравленные раны возникают при укусах ядовитыми змеями, пчелами, осами, шмелями, пауками, скорпионами, тарантулами, ядовитыми химическими веществами. При таких ранах отсутствует зияние и кровотечение, но резко выражена болевая реакция. Кроме того, при данных ранах возможно отравление организма токсинами, выделяемыми ими.

Огнестрельные раны возникают при ранениях пулями, осколками -- нарядов, мин, гранат. Они подразделяются на: а) касательные, когда ранящий предмет проходит только по поверхности органа (сустава конечности); б) слепые -- в них имеется только входное отверстие и огнестрельный предмет застревает в тканях; в) сквозные, когда ранящий предмет проходит насквозь, оставляя входное и выходное отверстия раневого канала. Сквозные и слепые раны могут быть с повреждением и без повреждения внутренних органов; г) у опоясывающих ран раневой канал на значительном расстоянии огибает какой-либо орган (конечность, сустав).

Выделяют также проникающие ранения, характеризующиеся нарушением целостности всех слоев ткани (органа).

Зараженные раны -- в рану попадают микроорганизмы, вызывающие сложный патологический процесс, либо заразную болезнь, и приводящие к интоксикации организма или летальному исходу (экспериментальным путем, вредительство).

Кроме описанных, встречаются также комбинированные раны, которые могут сочетать элементы двух или более дефектов (ушибленные и рваные, ушибленные и размозженные, ушибленные и колотые). Признаки ран могут проявляться в разной степени, это зависит от вида ранящего предмета, глубины повреждения и травмированного участка тела.

Заживление ран -- это общебиологический процесс, приобретенный в процессе филогенетического развития животных и зависящий от условий их обитания и характера протекающих обменных процессов в организме. Последние как раз и определяют видовые различия в заживлении ран у животных.

Механизм заживления ран протекает по трем видам: первичному и вторичному натяжению, под струпом.

По первичному натяжению заживают раны неинфицированные, то свежими жизнеспособными краями, плотно соприкасающимися между собой (швом), характеризующиеся слабыми признаками воспаления и отсутствием нагноения при условии остановки кровотечения, удаления сгустков крови, инородных тел. Процесс заживления таких ран длится 6-8 дней. На месте зажившей раны остается еле заметный рубец розового цвета, который впоследствии становится светлым.

По вторичному натяжению заживают инфицированные раны, осложненные гнойным воспалением, у которых имеется большая раневая полость, постепенно заполняемая грануляционной тканью, и сильное расхождение краев раны; если рана содержит сгустки крови, инородные тела и мертвые ткани; при развитии гнойной инфекции в ране; когда понижены защитные силы организма и процессы регенерации протекают медленно (кахексия, нарушение обменных процессов, гиповитаминоз).

Заживление таких ран длительно, от нескольких недель до 2-3-х лет. Это зависит от патогенности микробов, состояния раны, иммунобиологических свойств организма. Рубец вначале розовый, а затем белый.

Заживление ран под струпом. Так заживают раны поверхностного повреждения (ссадины, царапины, пролежни, ожоги). Кровь и лимфа вместе с раневым экссудатом на поверхности раны при свертывании образует темно-коричневую корку (струп), который хорошо защищает рану от механических воздействий, загрязнений, удерживает края раны в состоянии неподвижности, предупреждает высыхание грануляции. Под струпом происходят процессы грануляции и эпителизации. Такие раны обычно не гноятся и быстро заживают.

1.2 Лечение ран

Лечение ран должно быть комплексным и зависеть от времени ранения, характера повреждения тканей, вида инфекции и характера раневых осложнений. Комплексное лечение включает в себя механическую, физическую, химическую, биологическую антисептику и патогенетическую терапии.

Механическая антисептика -- это первичная хирургическая обработка ран, которая включает в себя удаление из раны размозженных и загрязненных тканей, сгустков крови, инородных тел, возбудителей инфекции. Хирургическая обработка раны устраняет источники инфекции и интоксикации, способствует быстрой регенерации поврежденных тканей и заживлению дефекта, предупреждает раневые осложнения. Наилучшие результаты получают при обработке свежих ран. Не требуют хирургической обработки мелкие поверхностные раны; множественные слепые, с большим количеством мелких осколков; сквозные пулевые, случайные поверхностные резаные раны, не содержащие некротизированных тканей.

Физическая антисептика направлена на создание благоприятных для заживления ран физических условий среды (необходимая влажность воздуха, высушивание ран, применение порошков и пудр, 1%-ных гипертонических (уменьшающих интоксикацию) растворов средних солей, ультрафиолетовых лучей, наложение отсасывающих повязок). В данный вид антисептики входит открытое лечение ран, их перевязка, применение дренажей.

Открытое лечение раны осуществляется без наложения швов и повязок, но допускает применение каркасной повязки, которая защищает рану от вторичного загрязнения, не препятствует стоку экссудата и доступу в рану воздуха. Оно является обязательным при ушибленных глубоких ранах с признаками анаэробной инфекции, так как атмосферный воздух, действие солнечной радиации понижают вирулентность гнилостной и анаэробной микрофлоры, ускоряют развитие грануляций и рост кожного эпителия.

Лечение с применением дренажей применяют при скоплении экссудата в глубоких ранах.

Перевязка раны включает в себя комплекс лечебных мероприятий. Первую перевязку делают через 4-5 дней после хирургической обработки раны. Ежедневные перевязки могут применять в случаях прогрессирующего развития раневой инфекции. Оптимальные условия для заживления ран создаются только при редкой смене повязок.

Химическая антисептика основана на использовании химических веществ, которые убивают активность патогенных возбудителей, препятствуют гниению и некротическому распаду тканей, завершают процесс очистки раны, подготавливают необходимые условия для регенерации соединительной ткани и эпителия. Антисептические вещества должны быть безвредными для живых тканей. К таковым можно отнести сульфаниламидные препараты, антибиотики, растворы солей, бальзамические мази и др.

Биологическая антисептика направлена на предупреждение развития бактерий в ранах. Ее в основном осуществляют антибиотиками, вакцинами, сыворотками, антивирусами.

Лечение гнойных ран включает в себя хирургическую их обработку с последующей антибиотикотерапией в сочетании с короткой, циркулярной или параневральной новокаиновой блокадой.

При лечении длительно незаживающих ран применяют ионогальванизацию с йодистым калием, УВЧ, обогревательные лампы Минина, парафинолечение, паролечение, электролечение, которые улучшают кровоснабжение патологически измененных тканей, усиливают циркуляцию лимфы, способствуют эпителизации.

1.3 Тромбоциты

Тромбоциты выполняют две основных функции:

1) формирование тромбоцитарного агрегата, первичной пробки, закрывающей место повреждения сосуда;

2) предоставления своей поверхности для ускорения ключевых реакций плазменного свёртывания.

Относительно недавно установлено, что тромбоциты также играют важнейшую роль в заживлении и регенерации поврежденных тканей, выделяя из себя в повреждённые ткани факторы роста, которые стимулируют деление и рост повреждённых клеток. Факторы роста представляют собой полипептидные молекулы различного строения и назначения. К важнейшим факторам роста относятся тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста (TGF-в), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста эпителия (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF).

Физиологическая плазменная концентрация тромбоцитов -- 180--360*109 тромбоцитов на литр.

Уменьшение количества тромбоцитов в крови может приводить к кровотечениям. Увеличение же их количества ведет к формированию сгустков крови (тромбоз), которые могут перекрывать кровеносные сосуды и приводить к таким патологическим состояниям, как инсульт, инфаркт миокарда, легочная эмболия или закупоривание кровеносных сосудов в других органах тела.

Неполноценность или болезнь тромбоцитов называется тромбоцитопатия, которая может быть либо уменьшением количества тромбоцитов (тромбоцитопения), либо нарушением функциональной активности тромбоцитов (тромбастения), либо увеличением количества тромбоцитов (тромбоцитоз). Существуют болезни, уменьшающие число тромбоцитов, такие как гепарин-индуцированная тромбоцитопения или тромботическая пурпура, которые обычно вызывают тромбозы вместо кровотечений.

В связи с неточностью описаний, отсутствием фотографической техники и запутанностью терминологии ранних периодов развития микроскопии, время первого наблюдения тромбоцитов точно неизвестно. Чаще всего их открытие приписывается Донне (1842, Париж), однако есть данные, что их наблюдал ещё сам создатель микроскопа, ван Лёвенгук (1677, Нидерланды). Термин «кровяные пластинки», который до сих пор является предпочтительным в англоязычной литературе (blood platelets), был введен Биццоцеро (1881, Турин), который также сыграл ведущую роль в выявлении связи тромбоцитов с гемостазом и тромбозом. Это впоследствии привело к появлению термина «тромбоцит» (Декхюйзен, 1901), который в русском языке стал основным. В англоязычной литературе термин используется исключительно для ядерных тромбоцитов у не-млекопитающих (thrombocytes). Кроме того, в русской литературе для тромбоцитов может употребляться термин «бляшка Биццоцеро».

Участие в свёртывании.

Особенностью тромбоцита является его способность к активации -- быстрому и как правило необратимому переходу в новое состояние. Стимулом активации может служить практически любое возмущение окружающей среды, вплоть до простого механического напряжения. Однако основными физиологическими активаторами тромбоцитов считаются коллаген (главный белок внеклеточного матрикса), тромбин (основной белок плазменной системы свертывания), АДФ (аденозиндифосфат, появляющийся из разрушенных клеток сосуда или секретируемый самими тромбоцитами) и тромбоксан А2 (вторичный активатор, синтезируемый и выбрасываемый тромбоцитами; его дополнительная функция заключается в стимуляции вазоконстрикции).

Активированные тромбоциты становятся способны прикрепляться к месту повреждения (адгезия) и друг к другу (агрегация), формируя пробку, перекрывающую повреждение. Кроме того, они участвуют в плазменном свёртывании двумя основными способами -- экспонирование прокоагулянтной мембраны и секреция б-гранул.

Экспонирование прокоагулянтной мембраны.

В нормальном состоянии мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свёртывания. Отрицательно заряженные фосфолипиды, в первую очередь фосфатидилсерин, сосредоточены на внутреннем слое мембраны, а фосфатидилхолин внешнего слоя связывает факторы свёртывания гораздо хуже. Несмотря на то, что некоторые факторы свёртывания могут связываться и с неактивированными тромбоцитами, это не приводит к формированию активных ферментативных комплексов. Активация тромбоцита предположительно приводит к активации фермента скрамблазы, который начинает быстро, специфично, двухсторонне и АТФ-независимо перебрасывать отрицательно заряженные фосфолипиды из одного слоя в другой. В результате происходит установление термодинамического равновесия, при котором концентрация фосфатидилсерина в обоих слоях выравнивается. Кроме того, при активации имеет место выставление и/или конформационное изменение многих трансмембранных белков внешнего слоя мембраны, и они приобретают способность специфически связывать факторы свёртывания, ускоряя реакции с их участием. Активация тромбоцитов имеет несколько степеней, и экспрессия прокоагулянтной поверхности является одной из высших. Только тромбин или коллаген могут вызывать такой сильный ответ. Более слабые активаторы, особенно АДФ, могут вносить вклад в работу сильных активаторов. Однако, они не способны самостоятельно вызвать появление фосфатидилсерина; их эффекты сводятся к изменению формы тромбоцитов, агрегации и частичной секреции.

Секреция б-гранул.

Тромбоциты содержат несколько типов гранул, содержимое которых секретируется в процессе активации. Главными для свертывания являются б-гранулы, содержащие высокомолекулярные белки, такие как фактор V и фибриноген.

Заболевания, ведущие к понижению количества тромбоцитов в крови.

Тромбоцитопения.

Болезнь Верльгофа (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура).

Тромботическая пурпура.

Тромбоцитопеническая пурпура, вызванная лекарствами (например, гепарином).

Болезнь Гоше.

Апластическая анемия.

Ведущие к повышению количества тромбоцитов в крови или к нарушению их функциональности.

HELLP-синдром (Hemolysis, Elevated Liver enzyme values and Low Platelet counts).

Гемолитический уремический синдром.

Химиотерапия.

Лихорадка Денге.

Тромбоцитоз.

Нарушения способности тромбоцитов к адгезии и агрегации.

Синдром Бернара-Сулье.

Тромбастения Гланцмана.

Синдром Скотта.

Болезнь фон Виллебранда.

Синдром Германского-Пудлака.

Синдром серых тромбоцитов.

Нарушения метаболизма тромбоцитов.

Пониженная циклооксигеназная активность, врождённая или приобретённая.

Дефицит пула тромбоцитов, врождённый или приобретённый.

Заболевания, в которых тромбоциты играют ключевую роль.

Атеросклероз.

Ишемическая болезнь сердца.

Инфаркт миокарда.

Цереброваскулярная болезнь.

Периферическая артериальная окклюзионная болезнь.

Рак.

Малярия.

Астма.

Синдром Самтера.

Тесты для оценки сосудисто-тромбоцитарного компонента гемостаза:

Время кровотечения.

Количество тромбоцитов в крови.

Индуцированная агрегация тромбоцитов.

Качественные дефекты тромбоцитов, лежащие в основе большого числа геморрагических диатезов, подразделяют на следующие группы:

- дизагрегационные тромбоцитопатии, обусловленные отсутствием или блокадой мембранных рецепторов тромбоцитов (тромбастения Гланцмана и др.);

- болезни отсутствия плотных и б-гранул;

- нарушения высвобождения гранул;

- нарушения образования циклических простагландинов и тромбоксана А2;

- дефицит, аномалии и нарушения мультимерности фактора Виллебрана;

- нарушения обмена нуклеотидов и транспорта кальция.

Все хирургические мероприятия проводят при определенной фиксации животных.

1.4 Использование богатой тромбоцитами плазмы

Использование богатой тромбоцитами плазмы для ускорения роста кости и мягких тканей стало настоящим прорывом в хирургии. Эта относительно новая биотехнология - одно из направлений тканевой инженерии и клеточной терапии, которые в настоящее время привлекают все большее внимание медицинской общественности. Из-за относительной новизны, возможно неправильное понимание и употребление термина «богатая тромбоцитами плазма». Цель настоящей статьи заключается в правильном толковании данного термина. Кроме того, в статье обсуждается безопасность и наиболее эффективные способы использования материала.

Что можно называть обогащенной тромбоцитами плазмой?

Если трактовать термин дословно, то обогащенная тромбоцитами плазма - это плазма, концентрация тромбоцитов в которой превышает нормальную. В норме концентрация тромбоцитов в крови колеблется между 150 тыс./мкл и 350 тыс./мкл и в среднем составляет 200 тыс./мкл. мода стиль Научно доказано, что стимулирующий эффект обогащенной тромбоцитами плазмы проявляется, если концентрация тромбоцитов в ней равна 1.000.000/мкл. Поэтому, на настоящий момент обогащенной тромбоцитами плазмой называют обогащенной тромбоцитами плазмой, если концентрация тромбоцитов в ней равна 1.000.000/мкл. При меньшей концентрации стимулирующий эффект не проявляется, в то же время до сих пор не было показано, что увеличение концентрации тромбоцитов свыше 1.000.000/мкл приводит к дальнейшему ускорению регенерации.

Чем обогащенная тромбоцитами плазма отличается от рекомбинантных факторов роста.

Поскольку богатую тромбоцитами плазму получают из собственной крови пациента, она абсолютно безопасна с точки зрения переноса инфекционных заболеваний, например, ВИЧ или вирусного гепатита.

При увеличении концентрации тромбоцитов увеличивается концентрация факторов роста. Ниже перечислены семь основных факторов роста, которые содержатся в богатой тромбоцитами плазме: тромбоцитарный фактор роста (PDGF-aa, PDGF-bb, PDGF-ab), трансформирующий фактор роста (TGF-в1, TGF-в2), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эпителия (EGF). Эти естественные факторы роста находятся в биологически предопределенных соотношениях. Все это отличает богатую тромбоцитами плазму от рекомбинантных факторов роста. Рекомбинантные факторы роста синтезируются культурой яйцеклеток китайского хомяка, в ядро которых с помощью бактериального вектора введен человеческий ген. В результате продуцируется фактор роста одного типа, который затем применяется без синтетического или естественного носителя. В естественном сгустке содержатся фибрин, фибронектин и витронектин, которые еще называют адгезивными молекулами, которые совершенно необходимы для миграции клеток, остеокондукции, эпителизации и остеоинтеграции. В БоТП эти вещества содержатся в той же концентрации, что и в нормальном сгустке (т.е. 2-4 г/л), именно поэтому БоТП не является фибриновым клеем. Кроме того, БоТП не обладает остеоиндуктивным эффектом, т.е. такая плазма не может инициировать образование кости без присутствия костных клеток. Таким эффектом обладают только костные морфогенетические протеины (КМП), которые способны инициировать образование кости de novo. Однако исследования показали, что при использовании рекомбинантного КМП образуется незрелая кость, причем для ее образования требуется больше времени, чем необходимо в естественных условиях. Возможно, что комбинация БоТП и КМП может значительно усилить активность последнего.

БоТП стимулирует ангиогенез (т.е. рост сосудов) и митоз клеток, которые участвуют в процессе регенерации. В силу этого БоТП не может значительно улучшить характеристики неклеточных костных материалов. Однако, поскольку сокращение сроков роста и созревания кости было продемонстрировано при применении аутогенной кости и БоТП, то можно предположить, что применение комбинации аутогенной кости, неклеточного костного материала и БоТП тоже приведет к увеличению скорости формирования кости.

Терминология.

Для обозначения БоТП в литературе употребляется множество неточных терминов. Наиболее распространенным среди них является «тромбоцитарный концентрат». Это не совсем верно, потому что истинный тромбоцитарный концентрат должен содержать только тромбоциты, но не содержит плазмы, а поэтому не может свернуться и сформировать сгусток. В клинической практике используется продукт, который является концентратом тромбоцитов в небольшом объеме плазмы, а поэтому правильнее его будет называть «богатая тромбоцитами плазма».

Следующий термин «тромбоцитарный гель» также не является точным. БоТП - это не что иное, как кровяной сгусток, в котором увеличена концентрация тромбоцитов. В этом сгустке имеются адгезивные молекулы (о них шла речь выше), которые усиливают биологическую активность сгустка, а в геле их нет.

Некоторые авторы переиначили термин БоТП в «сверх-богатая тромбоцитами плазма», «очень богатая тромбоцитами плазма» и даже «очень-очень богатая тромбоцитами плазма», что по своей сути является словоблудием, которое уместно в кофейне, а не в клинической литературе.

Устройства для получения БоТП.

На рынке, как компании, так и отдельные исследователи продвигают значительное количество устройств, для получения БоТП. Практикующему врачу следует помнить, что БоТП должна иметь концентрацию тромбоцитов не менее 1 млн./мкл, быть стерильной и апирогенной. Наконец, тромбоциты в БоТП должны быть жизнеспособными. Необходимо заметить, что стерильность и апирогенность - это не одно и то же. Стерильность - это отсутствие микроорганизмов. Апирогенность - это отсутствие любых веществ, которые могут вызвать лихорадку. Так что в устройствах для получения БоТП должны использоваться только сертифицированные апирогенные материалы.

Для выделения тромбоцитов из нативной крови, центрифуга должна работать в два этапа. На первом этапе эритроциты отделяются от плазмы и лейкоцитов с тромбоцитами. Во время второго этапа происходит окончательное разделение плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов с незначительным количеством эритроцитов на БоТП и бедную тромбоцитами плазму (наличие небольшого количества эритроцитов в БоТП неизбежно, потому что молодые и наиболее активные тромбоциты находятся вместе с самой легкой фракцией эритроцитов. Последние и придают БоТП красную окраску. Тромбоциты сами по себе имеют соломено-желтую окраску. - примеч. пер.). При одноэтапном разделении крови истинной БоТП не образуется. Вместо этого получается смесь богатой и бедной тромбоцитами плазмы с крайне низкой концентрацией тромбоцитов. Независимо от скорости вращения центрифуги и времени центрифугирования разделение эритроцитов и тромбоцитов за один этап невозможно. Это замечание для тех, кто собирается приобрести лабораторную центрифугу или ее модификацию для получения БоТП. Такие центрифуги предназначены для ДИАГНОСТИЧЕСКИХ целей, а не для получения БоТП. Они не дают значительного увеличения концентрации тромбоцитов, повреждают последние при выделении, не одобрены FDA, в некоторых из них используются пирогенные материалы. Так что такие центрифуги использовать не следует.

Одобрение FDA и в самом деле необходимо. Пациент защищен от передачи инфекций через БоТП, поскольку этот продукт аутогенный, а вот персонал - нет. Устройства, в которых возможна утечка крови из-за негерметичности контейнеров или из-за установки неправильного противовеса небезопасны как в медицинском аспекте, так и в юридическом. Практическим врачам лучше использовать устройства, которые одобрены FDA как устройства для получения БоТП. Наилучшим решением было бы использование устройств для получения БоТП, для которых имеется одобрение FDA на использование БоТП с материалами для костной подсадки. Ни один стоматолог не может получить лицензию для инфузии или реинфузии крови или ее компонентов, однако этого и не требуется, поскольку БоТП применяется местно. Для получения БоТП достаточно забрать у пациента с помощью венепункции 45-60 мл крови. Такая незначительная кровопотеря никак не влияет на состояние здоровья, не требует никакого лечения или изменения образа жизни. Необходимость в реинфузии отсутствует, тем более что это и не безопасно.

Применение БоТП.

БоТП может быть смешана с костным материалом, нанесена на принимающее ложе перед применением костного материала, нанесена поверх костного материала или использована в качестве биологической мембраны. В любом случае БоТП должна быть коагулирована ex tempore (т.е. непосредственно перед использованием). Свертывание крови сопровождается активацией тромбоцитов, последние при этом высвобождают факторы роста.

Мембрана из БоТП является результатом активации факторов свертывания. Они же активируют тромбоциты (т.е. стимулируют выброс тромбоцитами факторов роста). В течение первых 10 мин. тромбоциты секретируют около 70% факторов роста из тех, которые в них находятся. Полное высвобождение факторов роста происходит в течение часа. После этого тромбоциты продолжают синтезировать дополнительное количество факторов роста в течение приблизительно 8 дней, после чего тромбоциты погибают 90% факторов роста высвобождается в течение первых 10 мин. Оставшиеся 10% высвобождаются в течение последующих 1-1,5 часа. Таким образом, БоТП должна быть активирована непосредственно перед использованием и ни в коем случае заранее. Необходимо критически относиться к публикациям, в которых сообщается об изучении БоТП, так как зачастую на самом деле речь идет о факторах роста полученных из свежего сгустка или из жидкости над сгустком. БоТП после активации - это и свежий сгусток, и жидкость, которая над ним находится.

Описанные выше факты полезны для тех, кто пытается разработать концепцию получения БоТП из свернувшейся крови, а также компаниям, которые продвигают на рынке «пробирки для разделения сыворотки». Сыворотка - не плазма, в ней практически нет тромбоцитов. Получить же БоТП из свернувшейся крови и вовсе невозможно! Поскольку естественной функцией тромбоцитов является инициация процесса заживления и гемостаз, то при образовании кровяного сгустка все тромбоциты в нем и останутся, а в сыворотке тромбоцитов не будет. Таким образом получить БоТП можно только из крови, которая еще не свернулась, т.е. из крови в которую добавлен антикоагулянт.

Какой антикоагулянт следует использовать.

Выбор антикоагулянтов достаточно велик. Несмотря на это, только два из них могут поддерживать метаболизм тромбоцитов и обеспечивать выделение последних, не повреждая их. Цитратный антикоагулянт с декстрозой (ACD-A) наиболее предпочтителен. Цитрат связывает ионы кальция, благодаря чему кровь не свертывается, а декстроза и буферы поддерживают метаболизм тромбоцитов. Именно этот антикоагулянт используется в банках крови для хранения тромбоцитарной массы для инфузий. Цитрат фосфат декстрозный антикоагулянт (CPD) также может быть использован, однако следует принимать во внимание, что по сравнению с ACD-A он на 10% менее эффективно поддерживает метаболизм тромбоцитов.

Факторы роста, БоТП и опухоли.

Поскольку факторы роста стимулируют пролиферацию клеток, то было высказано предположение, что рекомбинантный костный морфогенетический протеин и БоТП могут приводить к развитию опухолей. На самом деле ни один фактор роста не может вызвать раковое заболевание, потому что все они влияют на клеточную мембрану, а не на клеточное ядро. Вторичный посредник факторов роста инициирует нормальную экспрессию генов, а не патологическую экспрессию, которая лежит в основе развития опухолей. Факторы роста не являются мутагенами в отличие от истинных канцерогенов, таких как ионизирующие излучения, табачные смолы и т.д. Факторы роста - это естественные белки человеческого организма. БоТП - это естественный кровяной сгусток, но с повышенным содержанием тромбоцитов.

Получение и использование БоТП.

БоТП лучше всего получать из аутогенной крови, которую забрали незадолго до начала операции или непосредственно в её начале. Так следует поступать, поскольку тромбоциты концентрируются в области хирургического вмешательства, инициируя коагуляцию и заживление. При этом их концентрация в крови несколько снижается. Концентрация тромбоцитов снижается еще больше, если во время операции происходит гемодилюция из-за внутривенного введения жидкостей. После того, как БоТП получена, она остается стерильной в жидком состоянии в течение 8 часов. Более того, через 8 часов она будет так же эффективна, как была сразу после получения, поэтому ее можно использовать при продолжительных вмешательствах. Сразу после разделения плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов на БоТП и бедную тромбоцитами плазму, первую необходимо как можно быстрее отделить от второй. Если этого не сделать, то с течением времени тромбоциты будут диффундировать в бедную тромбоцитами плазму, и их концентрация в БоТП снизится.

2. Специальная часть

2.1 Материал и метод

Мы подробно исследовали 20 ран у десяти пациентов, посетивших ветеринарную клинику ВГАУ. После получения пациентом назначенного лечения в соответствии с методами и протоколом, мы осуществляли клинический контроль вплоть до полного заживления.

Пациенты отбирались последовательно среди тех, кто первым поступил в в вет клиники ВГАУ указанной патологией и разрешил соответствующее лечение. У пациентов с множествеными ранами выбирались раны, получившие более серьезные повреждения.

Распределение по группам.

Пациентов разделили на две группы в зависимости от получаемого лечения:

-- Группа A (5 пациентов) получала обычное местное лечение + тромбоцитарную массу.

-- Группа B (5 пациентов) получала местное лечение.

Все пациенты, участвующие в исследовании, получали следующее традиционное лечение:

После промывания ран физ. раствором было назначено следующее лечение: местно порошок трицилина. Антибиотик амоксицилин 0.1мл на 1 кг массы повязка на рану.

Для Группы А проводилось следующее:

1. Подробное разъяснение лечения пациенту, который затем подписывал информированное согласие.

2. Взятие 20 куб.см периферической крови в 4,5 мл стерильные пробирки с 0,5 мл цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Кроме того, кровь брали и для клинического анализа для получения полной лейкоцитарной формулы и биохимии, анализа на лейкоз.

Пробирки с пробами крови центрифугировали 7 минут на 2 100 об/мин, для разделения плазмы на составляющие. Для нашего исследования мы использовали фракции плазмы с большим количеством тромбоцитов, т.е. 200-400 pl (0,2-0,4 куб.см.) сразу после клеток эритроцитарного ряда. 1-2 мл были получены после центрифугирования, когда гематокрит находится в рамках обычных клинических параметров.

Подкожная инъекция.

В стерильной среде (операционной) и после проводилась под кожная инъекция тромбоцитарной массы под раневую поверхность 0,5-1 мл в 12 часов и еще раз в 6 часов. На 24 часа накладывалась повязка с кремом с антибиотиком.

Метод клинической оценки.

Оценка субъективных симптомов пациента и клиническая оценка раны проводились при помощи микроскопии гистологического исследования и визуальных показателей, а так же анализа крови. Статистическое исследование проводилось следующим образом: средние показатели со стандартным отклонением; процент в форме критериев Тьюки и значимость в форме критерия Крускала-Уоллиса, а также корреляции Пирсона.

Описание морфологии ран у собак в экспериментальных и контрольной группах. После повреждения кожного покрова раны у всех групп собак выглядели одинаково. Сразу после нанесения ран отмечали кровотечение, которое останавливали с помощью тампонирования. После остановки кровотечения в ране оставались кровяные сгустки, которые также удаляли с помощью тампона. Раневая поверхность была блестящая, влажная. Края раневой поверхности ровные с кровоподтёками. Болезненности не отмечалось ни при надавливании на раневую поверхность, ни при введении тромбоцитарной плазмы. Через час после нанесения ран вводили тромбоцитарную плазму. Общее состояние животных оставалось в целом удовлетворительным, но несколько угнетенное. С целью предотвращения разлизывания ран в первые сутки были сделаны бинтовые повязки. Аппетит животных всех групп оставался в норме, без изменений, ректальная температура была в норме.

Также бралась кровь на исследование Кровь забирали в стерильные пробирки, в которых содержался стерильный антикоагулянт - одна капля гепарина (50 ЕD на 10 мл крови). После наполнения пробирки и извлечения иголки, место пункции обрабатывали 70 этиловым спиртом.

Исследования крови проводили в лаборатории вет клиник.

Через сутки после введения тромбоцитарной аутоплазмы отмечали подсушивание ран. Раневая поверхность была ровная блестящая, слегка увлажнённая. У подопытной группы площадь раневой поверхности уменьшилась. Контур раневой поверхности изменился, раневая поверхность стала неправильной формы у 3 собак из 5. Цвет раневой поверхности равномерно светло-красный. Края раневой поверхности ровные без кровоподтёков. Болезненности при пальпации не отмечается. У подопытной группы № 2 раневая поверхность, более увлажнённая по сравнению с ранами подопытной группы №1. Цвет распределён неравномерно от тёмно - красного до чёрного к середине поверхности раны. Края раневой поверхности неровные, их цвет неравномерной интенсивности. У животных контрольной группы раневая поверхность слегка увлажнённая, цвет от бледно - розового до тёмно-красного. Края раневой поверхности неровные, неравномерно окрашены - от светло - розового до красного. Болезненность при пальпации отсутствует. Общее состояние удовлетворительное, аппетит, активность и общая температура в норме.

Через 24 ч после второй инъекции у всех отмечалось появление шёрстного покрова. Однако у собак подопытных групп шёрстный покров был наиболее обильный, по сравнению с контрольной группой. В подопытной группе № 1 у 2 собак из 5 струп имел разрыв в середине, под ним находилась грануляционная ткань. Струп ломкий, отслаивается по периферии. В подопытной группе № 2 струп плотный, сухой, равномерно прилегает по всей раневой поверхности, бордового цвета. Струп не возвышается над раневой поверхностью. Края струпа плотно прилегают к краям раневой поверхности. У собак контрольной группы струп коричневого цвета, плотно прилегает в центре раневой поверхности и отслаивается по периферии. В центре струп плотный, по периферии более ломкий. Края струпа возвышаются над раневой поверхностью. Раневая поверхность безболезненна при надавливании у всех групп собак. Общее состояние животных оставалось удовлетворительным, температура тела в норме.

Через 24 ч после третьей инъекции произошло заметное уменьшение ран по площади у собак подопытных групп по сравнению с контрольной группой. В контрольной группе № 1 наиболее отчётливо видно появление эпидермального валика. Струп плотно прилегает к раневой поверхности, местами к периферии отслаивается, красно - коричневого цвета. В подопытной группе № 2 струп плотно прилегает по всей поверхности, не возвышается над раневой поверхностью, отмечено появление эпидермального валика. Струп бордового цвета. В контрольной группе произошло незначительное уменьшение ран по площади, струп плотно прилегает в центре и отслаивается по периферии, возвышаясь над раневой поверхностью. В центре струп плотный, а к периферии ломкий. Шёрстный покров вокруг раневой по-верхности скудный.

Шёрстный покров, удалённый при подготовке поля операции у собак в подопытных группах восстанавливался быстрее и был обильнее по сравнению с контрольной группой.

Согласно данным, что диаметр ран был достоверно (р < 0,05) меньше у собак подопытных групп по сравнению с контрольной группой животных.

2.2 Краткая производственная характеристика ветеринарных клиник ВГАУ

Ветеринарные клиники ВГАУ находятся Воронежской области в городе Воронеж ул. Ломоносова 114а, организованы 16 марта 2009 года на базе клинических кафедр факультета ветеринарной медицины.

С целью оказания лечебно-профилактической помощи животным.

Со дня образования до нынешнего года Ветеринарные клиники ВГАУ находятся в подчинение ВГАУ императора Петра I.

Клиники, расположенные в северной части Воронежской области и в северной части города.

Климат в зоне расположения Клиник умеренно-континентальный, влажный. Снежный покров сохраняется 130-140 дней в году, продолжительность теплого периода с температурой выше 10С 120-135 дней. Среднегодовая температура воздуха составляет +8С, продолжительность вегетативного периода 185-195 дней. Среднее количество осадков колеблется в пределах 540-560 мм в год.. Территория Вет клиник имеет почвенный покров песчаный рельеф местности на территории города холмисто-бугристый. На территории города следующие водоемы: Воронежское водохранилище.

Ветклиники специализируется в лечение всех видов животных от мелких грызунов до крупных сельскохозяйственых животных. Клиники работают в таких направлениях как: терапия мелких домашних животных, терапия с/х животных, терапия экзотических животных, хирургия мелких домашних животных, хирургия с/х животных, хирургия экзотических животных, рентгенология всех видов животных, ультрозвуковая диагностика всех видов животных, лабораторная диагностика всех видов животных.

С целью профилактики инфекционных болезней ветеринарная клиника проводит вакцинацию, а также дезинфекции, дезинсекции, дератизации.

13 видов животных было на приеме веет клиниках за прошедшие 3 года.

1. Крыса декоративная - Rattus rattus,

Var. alba et var. policolor.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Грызуны - Ordo Rodentia.

Семейство Мышиные - Familia Muridae.

Лабораторные и декоративные одомашненные разновидности черной крысы. Лабораторные крысы - альбиносы, декоративные имеют чепрачную окраску.

2. Собака домашняя - Canis familiaris.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Хищные - Carnivora.

Семейство Псовые - Canidae.

3. Кошка домашняя - Fйlis silvйstris cбtus.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Хищные - Carnivora.

Семейство Кошачьи - Felidae.

4. Хомяк обыкновенный - Cricetus cricetus.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Грызуны - Ordo Rodentia.

Семейство хомяковые - Cricetidae.

5. Кролик степной -Sylvilagus audubonii.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Зайцеобразные - Lagomorpha.

Семейство Зайцевые - Leporidae.

6. Бык домашний, или корова -Bos taurus taurus.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Парнокопытные, парнопалые - Artiodactyla ().

Семейство Полорогие - Bovidae.

7. Коза домашняя-Capra hircus.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Парнокопытные, парнопалые - Artiodactyla ().

Семейство козьи- Caprinae.

8. Овца домашняя-Ovis aries.

Класс Млекопитающие - Class Mammalia.

Отряд Парнокопытные, парнопалые - Artiodactyla ().

Семейство Полорогие-Bovidae.

9. Лошадь- Equus.

Класс Млеко питающие - Class Mammalia.

Отряд непарнокопытные- Perissodactyla.

Семейство Лошадиные- Equidae.

10. Курица домашняя- Gallus gallus,

Класс Птицы - Aves.

Отряд курообразные- Galliformes.

Семейство фазановые- Phasianidae.

2.3 Анализ причин возникновения заболевания в хозяйстве.

В Ветклинике часто приходится сталкиваться с различными видами ран: резаные, колотые, рубленные, рваные, ушибленные, размозженные, укушенные, отравленные, огнестрельные (слепые, сквозные, касательные, опоясывающие), зараженные.

Резаные раны образуются при повреждении тканей режущими острыми предметами (ножом, стеклом, бритвой, косой). Края раны ровные, поэтому быстро заживают, зияние полости и кровотечение незначительны. Глубокие же раны с повреждением сухожилий, мышц и других тканей зияют очень сильно, сопровождаются обильным кровотечением, заживают медленно.

Колотые раны наносятся узкими, округлыми и длинными остры ми колющими предметами (штыком, гвоздем, толстой проволокой, шилом, вилами, иглой, сучком дерева). Имеют небольшие наружные размеры, но узкий длинный раневой канал, неровный из-за смещения тканей, иногда проникающий в грудную или брюшную полость. Поэтому подобные травмы чаще встречаются в указанных полостях и дистальной части конечности, возможно повреждение внутренних органов. Такие раны очень опасны, медленно заживают, иногда образуют свищи. Могут сопровождаться повреждением кровеносных сосудов и вызывать наружное и внутреннее капельное кровотечение, которое появляется лишь после извлечения из тканей инородного тела. Зияние колотых ран незначительно, место укола иногда незаметно. В глубине раны часто образуется гематома, а в случае инфицирования развивается флегмона.

Рубленые раны возникают в результате удара тяжелым острым предметом (топором, долотом, саблей). Такие раны сильно зияют, болезненны, бывают глубокими и окружены нежизнеспособными тканями, но менее кровоточивы.

Рваные раны возникают от механического растяжения тканей за пределы ее эластичности (разрыв кожи и тканей рогами, торчащими в стенках гвоздями и друг ими острыми выступами, крючками, копями животных). Значительно разрушаются ткани с образованием неровных, лоскутных краев, кровоизлияний и гематом. Разновидностями данных ран являются скальпированные, ушибленные и размозженные раны.

Ушибленные раны возникают при сильном воздействии на мягкие ткани тупых предметов (камнем, палкой, молотком, обухом топора, бортом машины, при повале животного на твердый грунт). Рана неглубокая, но опасная, так как в глубине ее находятся раздавленные и пропитанные кровью ткани, в подкожной клетчатке появляются гематомы.

Размозженные раны возникают при столкновении животных с движущимся транспортом или при падении на них тяжелых предметов. Они характеризуются наличием обширных участков раздавленных тканей и развитием травматического некроза. Иногда сопровождаются полным отчленением сегмента конечности с отрывом кожи выше уровня повреждения глубжележащих тканей.

Укушенные раны возникают от укусов домашних и диких животных и характеризуются обильным микробным загрязнением за счет микрофлоры полости рта и, как правило, осложняются нагноением и требуют длительного лечения. Кроме того, при укусе животным, больным бешенством, в организм может попасть вирус бешенства.

Отравленные раны возникают при укусах ядовитыми змеями, пчелами, осами, шмелями, пауками, скорпионами, тарантулами, ядовитыми химическими веществами. При таких ранах отсутствует зияние и кровотечение, но резко выражена болевая реакция. Кроме того, при данных ранах возможно отравление организма токсинами, выделяемыми ими.

Огнестрельные раны возникают при ранениях пулями, осколками -- нарядов, мин, гранат. Они подразделяются на: а) касательные, когда ранящий предмет проходит только по поверхности органа (сустава конечности); б) слепые -- в них имеется только входное отверстие и огнестрельный предмет застревает в тканях; в) сквозные, когда ранящий предмет проходит насквозь, оставляя входное и выходное отверстия раневого канала. Сквозные и слепые раны могут быть с повреждением и без повреждения внутренних органов; г) у опоясывающих ран раневой канал на значительном расстоянии огибает какой-либо орган (конечность, сустав).

Лечением ран уходить очень продолжительное время это занимает время и средство врача и владельца животного поэтому главной задачей стоит способ их заживления и не допускания побочных эффектов.

2.4 Клинические признаки, результаты лабораторных исследований, патологоанатомические изменения

Основными клиническими ран являются боль, кровотечение и зияние.

Выраженность болевого синдрома зависит от локализации раны. Боль сильнее при ранении в местах скопления нервных окончаний и при ранении крупных нервных стволов. Боль зависит от характера ранящего орудия и быстроты нанесения; чем острее орудие и быстрее наносится рана, тем меньше боли ощущает человек. Болевые ощущения могут быть снижены при пребывании пострадавшего в состоянии аффекта, шока, алко­гольного или наркотического опьянения. Боль является защит­ной реакцией организма, но длительные и интенсивные боли могут вызвать истощение центральной нервной системы и нару­шение функций жизненно важных органов.

Интенсивность кровотечения зависит от повреждения от повреждения крупных сосудов, локализации раны (наиболее выраженные при ра­нении в области лица, головы, шеи), состояния свертывающей системы и гемодинамики (сильное кровотечение бывает при гемофилии, высоком артериальном давлении).

Зияние раны зависит от взаиморасположения линий Лангера и самой раны (разрез вдоль линий Лангера исключает зияние ран).

Общая реакция организма на повреждение зависит от тяжести ранения, которое определяется размерами раны, ее глубиной, характером повреждения внутренних органов и развивающимися осложнениями, такими как травматический шок, острая кровопотеря, терминальное состояние, присоединение хирургической инфекции.

Метод подсчета эритроцитов, лейкоцитов в счетной камере Горяева.

Для проведения подсчета эритроцитов кровь набирали в меланжер смесителя для эритроцитов до метки 0,5, кончик капилляра протерли ваткой, затем в смеситель до отметки 101 набрали разбавляющую жидкость, представляющую собой 0,35 % раствор хлорида натрия.

Затем закрыли смеситель с обоих концов большим и средним пальцами руки и встряхивающими движениями перемешивали в течение 2 минут. Получили разведение крови 1:200. Первые три капли разведенной крови из меланжера удалили на ватку, а четвертой заправили камеру Горяева. Для этого поднесли кончик меланжера с каплей к краю щелевидного пространства, образованного между средней полоской камеры и плоскостью притертого покровного стекла. Капля заполнила пространство камеры.

Выждав три минуты, осуществили подсчет эритроцитов с помощью микроскопа, при объективе «8» и окуляре «* 15». Подсчет проводили в левом верхнем, большом квадрате (разделенном на 16 маленьких квадратов), а затем еще в 4 больших квадратов, расположенных по диагонали сетки вправо вниз (всего в 5 больших квадратах).

Количество эритроцитов определяли по следующей формуле:

Х=АБ/ВГ = 10000 * 4, где

Х - количество эритроцитов в 1 мл крови.

А - число эритроцитов, подсчитанных а 5 больших квадратов.

Б - степень разведения крови (200).

В - количество маленьких квадратиков в 5 больших (16 * 5 =80).

Г - объем счетной камеры над маленьким квадратиком (1/4000 мл).

При подсчете лейкоцитов в меланжер для лейкоцитов набирали кровь до метки 0,5, затем жидкость Тюрка (3 % раствор уксусной кислоты - 100 мл, 1 % раствор метиленового синего или генциана фиолетового 1 мл) до отметки «11». Смеситель закрывали с обоих концов пальцами и для перемешивания встряхивали в течение 2 минут. При этом произошло разрушение эритроцитов уксусной кислотой, а генциан фиолетовый окрасил лейкоциты. Было получено разведение крови 1:20. Первые три капли удаляли на вату, а четвертой заряжали камеру Горяева. Через 3 минуты (для оседания лейкоцитов на дно камеры) осуществляли подсчет клеток. Подсчет проводили под микроскопом при объективе «8» и окуляре «* 15» в 100 больших квадратах.

...