Лекарственные растительные средства

Несмотря на то что начальные и конечные стадии синтеза холестерина происходят в пероксисомах, одна из лимитирующих реакций протекает в каналах эндоплазматической сети клеток, а именно стадия, катализируемая сквален-синтазой. По-видимому, ингибиторы сквален-синтазы будут подавлять биосинтез холестерина, но не будут затрагивать синтез производных геранилпирофосфата, в том числе долихолов и коэнзима Q10. Развитие побочного эффекта статинов, такого, например, как миалгия, может быть связано с падением уровня митохондриального убихинона. Ингибиторы сквален-синтазы, находящиеся на стадии доклинических испытаний, снижали уровень холестерина и не вызывали миалгии. Некоторые единичные испытания показали, что новые препараты в минимальных дозах снижали уровень ЛНП на 70-80%. Однако значительное снижение ЛНП приводит к дефициту витаминов А и Е и развитию липопротенемии, ритонопатии, атаксии и полинейропатии. Новые лекарственные препараты снижают уровень ЛНП не более чем на 20% и не вызывают липопротенемии, что подтвердилось в опытах на животных и клеточных линиях человека. Некоторые новые препараты являются ингибиторами биосинтеза изопреноидов, подавляя, таким образом, биосинтез холестерина. Известно, что метронидазол снижает уровень ЛНП на 10-20%. В то же время дериваты метронидазола не исследованы как возможные препараты для монотерапии.

Образование комплексов липопротеинов зависит от уровня экспрессии сенсора холестерина, белка активатора регуляторного элемента стеринов в ЭПР. Данный сенсор регулирует экспрессию гена Аpо-В и высвобождает протеин-2, связывающий регуляторный элемент стеринов (SREBR-2). Комплекс регулирует размер и количество частиц аполипопротеина В путем деградации и индукции синтеза. Прямую корреляцию размера частиц холестерина в ЭПР и в плазме обеспечивает микросомальный транспортный белок (МТР). Разработаны специфические ингибиторы МТР, которые находятся в фазе 1 доклинических испытаний. Показано, что ингибиторы МТР снижали активность ЛНП на 70-80% одновременно со снижением уровня триглицеридов на 30-40%. Пока ни один препарат этого типа не проходил клинических испытаний. К сожалению, похоже, что ингибирование МТР приводит к повышению пула частиц холестерина в гепатоцитах и развитию ожирения печени или неалкогольному гепатиту. Данную проблему можно преодолеть путем совмещения ингибиторов МТР с ниацином, блокирующим синтетазу жирных кислот.

Одним из ключевых моментов развития атеросклероза при поступлении экзогенного холестерина или суперпродукции эндогенного холестерина является реакция этерификации молекулы холестерина. В макрофагах реакция этерификации является триггером образования активированных клеток. В гепатоцитах или энтероцитах реакция этерификации зависит от синтеза липопротеинов. Реакцию этерификации катализирует ацил-холестерин-ацилтрансфераза (AXAT). Фермент присутствует в 2 формах: АХАТ-1 обнаруживается во многих клетках, АХАТ-2 обнаруживается только в гепатоцитах и слизистой тонкого кишечника. Ингибитор АХАТ азасимиб находится на стадии доклинических испытаний. Показано, что препарат препятствует образованию жировых клеток и снижает площадь атеросклеротических бляшек у кроликов с повышенным синтезом холестерина, но не влияет на уровень ЛНП в плазме. Активность препарата повышалась при совместном его применении со статинами. Новый ингибитор АХАТ авасимиб проходит клинические испытания на пациентах.

Около 25% ЛНП попадает в плазму благодаря абробции липидов в кишечнике. Испытания маргаринов типа «ситостанол/ситостерол» показало, что маргарины в дозе 20 г/сут действовали как конкурентные ингибиторы абробции холестерина в интестинальной стенке, что приводило к снижению уровня ЛНП в плазме на 8-14%. Применение дериватов желчных кислот также приводит к снижению уровня ЛНП на 10-15%. Препараты этого типа лучше совмещать со статинами, поскольку при изолированном применении они нарушают функцию ЖКТ у 30% пациентов.

Препарат эзетимиб - специфический ингибитор захвата холестерина. Установлено, что мишенью препарата является комплекс Niemann-Pick C1-подобного протеина-1 с аннексином, 2-кавеолином и транспортером стеролов. В отличие от статинов, препарат не влияет на уровень содержания витамина Е и при ежедневной дозе 10 мг, получаемой пациентом вместе со статинами или без них, снижает захват холестерина на 14%. Некоторые клинические испытания показали, что эзетимиб особенно активен при гомозиготной наследственной гиперхолестеронемии. Статины в максимальной дозе снижают уровень ЛНП только на 30%, тогда как эзетимиб в низкой дозе снижает уровень ЛНП также на 30%. Кроме того, препарат не оказывал побочных действий на желудочно-кишечный тракт.

Препараты, способные ингибировать транспорт желчных кислот (ЖК), разрабатываются давно, поскольку показано, что транспорт ЖК связан с уровнем холестерина. Однако известно, что препараты этого ряда оказывают побочные действия на желудочно-кишечный тракт. Мишенью новых препаратов является транспортер пузырных желчных кислот (IBAT), который обеспечивает поступление желчи в портальную вену печени. Снижение транспорта ЖК в портальную вену приводит к индукции ферментов синтеза желчных кислот из холестерина. Индукция 7-б-гидроксилазы вследствие активации рецептора холестерина, зависимого от фарнезила, предшественника сквалена, является примером влияния транспорта желчных кислот на биосинтез холестерина. Интересно, что эзетимиб и статины, подобно желчным кислотам, циркулируют в печени, однако не известно, проникают они в портальную вену с помощью IBAT или нет.

Фибраты являются активаторами рецептора б пролиферации пероксисом (PPAR-б). В высоких дозах фибраты снижают уровень триглицеридов на 70%, увеличивают уровень ЛВП на 20% и снижают уровень ЛНП на 10-25%. Глитазоны являются агонистами рецепторов PPAR-г и увеличивают экспрессию рецепторов инсулина в мышцах, повышая таким образом чувствительность к инсулину. На практике оральные гипогликемические препараты снижают уровень триглицеридов на 5-15% и увеличивают уровень ЛВП. Однако клинические испытания комбинированной терапии не проводились. Нельзя отрицать синергичный эффект двух препаратов хотя бы по причине высокой гомологии PPAR-б и PPAR-г. По-видимому, будут синтезированы агонисты сразу обеих изоформ рецепторов.

Х-рецепторы печени (LXR) существуют в 2 изоформах: б- и в-изоформы, определяющие внутриклеточные уровни холестерина. У человека LXR контролируют экспрессию транспортера холестерина ABC-A1, ABC-G1 и транспортного белка эфира холестерина СЕТР. Агонисты увеличивают уровень ЛВП, но в то же время активируют синтез липидов и повышают уровень триглицеридов, особенно LXR-в. Индукторы CYP3A4 (cytochrome P450 3A4), такие, как фенобарбитал и карбамазепин, повышают уровень 4-в-гидроксихолестерина, активного лиганда LXR. Индукторы увеличивают уровень триглицеридов и ЛВП. Напротив, антагонисты LXR, С3-жирные кислоты, понижают уровень триглицеридов, но не влияют на уровень ЛВП, поскольку ингибируют транспортер холестерина ABC-A1. Существуют некоторые данные о том, что С3-жирные кислоты снижают вероятность смерти от неожиданной остановки сердца, однако для подтверждения этой информации необходимы клинические испытания.

Эфир холестерина транспортируется белком СЕТР в обмен на триглицериды. Известно, что этанол ингибирует СЕТР и увеличивает уровень ЛВП, что снижает риск развития атеросклероза. Ингибирование СЕТР должно предотвратить перенос эфира холестерина из ЛВП, увеличив таким образом уровень ЛВП, и снизить уровень ЛНП. С помощью вивальных моделей показано, что ингибирование СЕТР снижает риск развития атеросклероза.

При болезни Альцгеймера пептиды Ав (1-42) накапливаются в нейронах, индуцируют фосфолипазу А2, синтез простагландинов, которые вызывают повреждение синапсов и снижают выживаемость нейронов. Испытание лекарственного коктейля, содержащего симвастатин (статин, проникающий через гематоэнцефалический барьер) и сквалестатин, специфический ингибитор сквален-синтазы в культуре нейронов, показало, что комплексный препарат предотвращал индукцию фосфолипазы А2 и аттенуировал экзогенный холестерин.

EP2306 и EP2302 - новые ингибиторы сквален-синтазы. Интересно, что в смеси с симвастатином данные препараты значительно подавляли синтез триглицеридов и секрецию Аpo В, увеличивали экспрессию рецепторов ЛНП и транспорт ЛНП клетки. Испытания показали, что ингибиторы EP2306 и EP2302 в сочетании со статинами или сами по себе могут быть эффективными препаратами для снижения содержания холестерина и триглицеридов в крови. Установлено, что препараты подавляли биосинтез липидов, снижали содержание холестерина и улучшали антиоксидантные свойства крови. EP2306 и EP2302 повышали экспрессию NO-синтазы в клетках ВАЕ на 40% и 165% соответственно, а в клетках СРАЕ на 195% и 152% соответственно. Однако препараты не повышали активности NO-синтазы. То, что ингибиторы сквален-синтазы способствовали аккумуляции NO-синтазы в клетках эндотелия, проливает свет на механизм подавления этими ингибиторами атеросклероза и связанных с ним патологий.

На основе сквалена создаются нанопрепараты с высоким сродством к мишеням на поверхности опухолевых клеток, нарушающих липидный метаболизм и регенерацию плазматической мембраны. В качестве примера можно привести гемцитабин-сквален и лапаквистат ацетат, новый ингибитор сквален-синтазы.

20. Морские природные соединения. Путь к новым лекарственным препаратам

Главными биологическими источниками природных соединений долгое время являлись высшие наземные растения и почвенные микроорганизмы, а после изобретения и широкого распространения легководолазной техники ими стали и разнообразные морские организмы. Изучение морских организмов заметно расширило число известных природных соединений. В самом деле, если общее число изученных природных соединений, по-видимому, не превышает 120-150 тыс., а по оценкам многих специалистов - существенно ниже этой цифры, то в морских организмах было открыто около 20 тыс. таких веществ.

В 1951 г. Вернер Бергман сообщил о выделении из губок Cryptotethia crypta, собранных у побережья Флориды, необычных нуклеозидов (спонготимидин и спонгоуридин, а затем и ряда других), содержащих арабинозные остатки вместо рибозных или дезоксирибозных, как в большинстве соединений этого класса. Эти работы стимулировали появление в фармакологии концепции антиметаболитов. Антиметаболитами стали называть активные субстанции лекарств, имеющие не только значительное сходство с метаболитами человека, но и существенные структурные различия. Антиметаболиты включаются в биосинтез тех или иных биополимеров, чаще всего ДНК, и тормозят его, проявляя противоопухолевые и противовирусные свойства.

После открытия Бергмана были разработаны два арабинонуклеозидных медицинских препарата: арабиноаденин («Аra-A», «Видарабин») и арабиноцитозин («Аra-C», «Цитарабин»), которые на протяжении десятков лет применяются в клинической практике в качестве противоопухолевых и противовирусных лекарств. Еще несколько лекарств нуклеозидной природы («Азидотимидин», «Ацикловир» и др.) отличаются от «обычных» нуклеозидов другими структурными особенностями.

Однако дальнейшая разработка противоопухолевых лекарств на основе морских природных соединений шла не так успешно. И дело не в том, что не было найдено соединений с высокими противоопухолевыми активностями. Наоборот, в некоторых морских беспозвоночных были обнаружены минорные вторичные метаболиты, обладающие экстремально высокой токсичностью для опухолевых клеток. По своей цитотоксичности они в сотни-тысячи раз превосходят большинство из ныне применяемых противоопухолевых лекарств. Например, спонгистатин, из морских тропических губок - самое активное из всех природных и синтетических соединений, найденное за всю историю изучения противоопухолевых веществ в Национальном институте рака (США). Его присутствие в одной из губок сначала обнаружили по биологической активности соответствующих экстрактов, но само это соединение долго не могли выделить в количествах, необходимых для структурного изучения.

Ингибирующая доза, вызывающая 50 %-ную гибель опухолевых клеток (IC₅₀), была равна 10^-10 М (в отношении клеток рака прямой кишки) и 10^-12 М (в отношении клеток рака молочной железы). В опытах на животных, имеющих смертельные злокачественные опухоли, при введении спонгистатина в дозе 25 мкг/кг наблюдали их 70 %-ное выживание.

Всего же было найдено несколько десятков экстремально токсичных для опухолевых клеток морских метаболитов. Очень важно, что многие из них относятся к принципиально новым структурным сериям противоопухолевых веществ, что открывает хорошие перспективы для синтетического моделирования. До открытия этих веществ все применяемые в химиотерапии природные соединения относились не более чем к 4-5 структурным типам.

В то же время создание на основе морских природных соединений медицинских препаратов нового поколения тормозится рядом осложняющих моментов. Во-первых, такие вещества часто труднодоступны. Достаточные для широкого использования количества невозможно получить из самих морских организмов, так как их продуценты, как правило, являются редкими и рассеянными видами, а способы марикультивирования таких биологических объектов в большинстве случае не разработаны. Экономически приемлемые синтезы для большинства этих веществ также до сих пор не созданы из-за сложности их структур и обилия в них асимметрических центров. Во-вторых, не всегда эти высокотоксичные для опухолевых клеток соединения показывают хорошую противоопухолевую активность на животных и людях. Наконец, в-третьих, некоторые из них обладают побочными эффектами, в т. ч. вызывают поражения почек или других органов и систем, что исключает их клиническое применение.

Тем не менее недавно была успешно завершена разработка еще одного противоопухолевого лекарства морского происхождения. В конце 2007 года препарат «Трабектидин» («Джонделис») был разрешен к применению в странах Европейского союза для лечения сарком мягких тканей. Токсичная концентрация (IС₅₀) этого вещества для опухолевых клеток L-1210 была очень низкой (0.5 нг/мл), а в микрограммовых дозах (на кг веса подопытных животных) оно показывало высокую противоопухолевую активность на различных моделях мышиного рака.

Механизм биологического действия активной субстанции «Трабектидина» - эктейнасцидина-743 - на опухолевые клетки связан с его способностью проникать в малую бороздку ДНК и алкилировать остатки гуанозина. Кроме того, он вызывает программируемую гибель (апоптоз) опухолевых клеток и усиливает противоопухолевое действие ряда известных лекарств («Доксорубацина», «Паклитакселя» (таксола) и др.). Хотя препарат разрешен пока только для лечения сарком мягких тканей, в процессе его клинических испытаний были получены замечательные результаты и при лечении некоторых других видов злокачественных опухолей.

Ряд других морских природных соединений с экстремально высокой противоопухолевой активностью, во многих случаях сравнимой с активностью спонгистатина и эктейнасцидина, изучаются сейчас в качестве потенциальных противоопухолевых лекарств и находятся на разных стадиях клинического и доклинического тестирования.

Например, бриостатин-1, 26-членный макроциклический лактон из мшанки Begula neritina, распространенного в Мировом океане обрастателя доков и пирсов, был выделен группой Петита из Университета штата Аризона после ряда повторных сборов биологического материала. Его структуру установили с помощью рентгеноструктурного анализа. Соединение имеет 11 асимметрических центров и вряд ли в ближайшие годы может быть получено с приемлемым выходом путем органического синтеза. Показано, что это вещество является модулятором протеинкиназы С, иммуностимулятором и индуцирует клеточную дифференциацию. Оно усиливает противоопухолевое действие ряда лекарств, но вызывает в качестве побочного эффекта миалгию.

В России были выделены алкалоиды из асцидий поликарпин и варацин С, обладающие высокой токсичностью в отношении опухолевых клеток, причем варацин С превосходит по своей цитотоксичности известный «Доксорубицин» и более активно в кислотной среде, с чем связана некоторая его избирательность в отношении опухолей по сравнению с нормальными тканями. В самом деле, известно, что многие опухоли подкисляют себя из-за повышенного гликолиза.

21. Релиз-активные лекарственные препараты -- новое направление в лечении острых респираторных вирусных инфекций

Успехи фармакологии последних десятилетий, связанные с использованием высоких технологий (генная терапия, рекомбинантные технологии и др.), повысили результативность лечения ряда заболеваний, однако радикально не решили проблему эффективности и безопасности лекарственных средств. Последнее определяет актуальность поиска принципиально новых подходов и создания на этой основе оригинальных лекарственных препаратов. Одним из таких подходов, активно и всесторонне обсуждающихся в последние годы, является использование малых и сверхмалых доз и релиз-активных форм препаратов.

В целом феномен релиз-активности может быть представлен в следующем резюмирующем виде.

Предполагается, что биологические и физико-химические свойства в растворах релиз-активных лекарственных препаратов сохраняются за счет сложных термодинамических процессов, приводящих к специфическим структурным, конформационным изменениям носителя. Крайне важно, что эффекты подвергнутого специальной технологической обработке лекарственного средства в сверхвысоких разведениях качественно идентичны эффектам этого же средства в терапевтических дозах, но в редуцированном и/или модифицированном виде. Технология производства не только сохраняет в сверхразбавленных растворах биологическую активность, но и придает препаратам особые групповые свойства, характеризующиеся модифицирующим феноменом релиз-активных лекарственных препаратов. Благодаря непосредственному воздействию на конформационные характеристики молекул-мишеней, релиз-активные лекарственные формы способны оказывать модифицирующее действие на базовые физико-химические и биологические свойства исходного вещества и структурно близких ему молекул, в том числе посредством модуляции активности соответствующих рецепторов и влияния на лиганд-рецепторные взаимодействия.

Релиз-активные препараты предназначены для лечения и профилактики хронических неинфекционных, многофакторных, заболеваний и инфекций, включая острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ). Данный класс препаратов включает как монопрепараты, например, Тенотен, Тенотен детский (РА АТ к мозгоспецифическому белку S-100), Анаферон и Анаферон детский (РА АТ к г-интерферону (ИФН), Импаза (РА АТ а к эндотелиальной NO-синтазе), Артрофоон (РА АТ к ФНО-б), Афала -- (РА АТ к простат-специфическому антигену), Диетресса -- (РА АТ к каннабиноидным рецепторам 1 типа), так и комбинированные лекарственные препараты -- Эргоферон (РА АТ к ИФН-г, СD4, гистамину), Колофорт (РА АТ к ФНО-б, мозгоспецифическому белку S-100 и гистамину), Бризантин (РА АТ к мозгоспецифическому белку S-100 и каннабиноидным рецепторам 1 типа), Диваза (РА АТ к мозгоспецифическому белку S-100 и эндотелиальной NO-синтазе).

Относительно недавно появившиеся на отечественном фармацевтическом рынке релиз-активные лекарственные препараты обладают не только доказанной терапевтической эффективностью (классы доказательности от А до С), но и очевидными преимуществами и привлекательными для современной практической медицины свойствами. Среди них наиболее значимыми с клинической точки зрения представляются следующие: 1. Отсутствие токсичности, формирования толерантности, привыкания и пристрастия. 2. Высокая эффективность, сравнимая с фармакологическими «эталонными» препаратами (озельтамивир, интерфероны, диазепам и др.). 3. Удобное пероральное применение. 4. Оптимальное соотношение высокой терапевтической эффективности с безопасностью применения в клинической практике. 5. Хорошие фармакоэкономические показатели. 6. Возможность длительного применения с профилактической целью и для лечения хронических заболеваний. 7. Возможность безопасного применения у пациентов с сопутствующими заболеваниями как для монотерапии, так и в комплексном лечении. 8. Возможность безопасного применения в педиатрической практике.

22. Определение лекарственных препаратов в биожидкостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

В связи с увеличением в последнее время числа острых и смертельных отравлений различными лекарственными препаратами все более актуальным становится вопрос химико-токсикологических и судебно-химических исследований по идентификации лекарственных препаратов и определения их концентраций в биологических средах. Также важное значение в химико-токсикологическом анализе занимает вопрос мониторинга лекарственных препаратов в крови, поскольку с этим связан выбор метода лечения пациентов. В связи с этим с каждым годом растут требования, предъявляемые к судебно-химическим исследованиям, поскольку расширяется список определяемых препаратов, увеличивается число отравлений комбинацией двух и нескольких лекарственных препаратов, повышаются требования к чувствительности методик, к избирательности. Все это требует разработки новых методик анализа, основывающихся на современных инструментальных методах исследования.

Химико-токсикологический и судебно-химический анализ различных лекарственных препаратов в биологических средах представляет значительные трудности в связи с существенными различиями как самих биологических матриц, так и анализируемых лекарственных препаратов. Кроме того, важно учитывать метаболизм лекарственных препаратов. Химическое исследование лекарственных препаратов в биологических средах включает несколько последовательных стадий: стадии извлечения лекарственного препарата из биологического объекта, стадии очистки от соэкстрактивных веществ, стадии концентрирования и стадии анализа. Традиционно для извлечения лекарственных препаратов из биологических объектов используют жидкость-жидкостную экстракцию раздельно для веществ кислого и основного характера, и основным методом исследования остается метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Как уже отмечалось, с каждым годом растет перечень лекарственных препаратов в химико-токсикологической экспертизе, и определение лекарственного препарата в биологических объектах становится все более сложной задачей. Используемый в настоящее время метод ТСХ имеет ряд недостатков: данный метод неспецифичен, поскольку идентификация неизвестного лекарственного препарата этим методом часто неоднозначна (а иногда невозможна) из-за совпадения параметров нескольких лекарственных препаратов, не дает количественной оценки вещества и требует затрат большого количества реактивов и времени.

В настоящее время все более широко внедряются инструментальные методы анализа, обладающие высокой чувствительностью и избирательностью: газовая хроматография с масс-селективным детектором (ГХ/МСД), высокоэффективная жидкостная хроматография с многоволновым детектированием (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез (КЭ). Все эти методы можно также использовать в скрининговом варианте.

Известны варианты скрининга методом ТСХ и УФ-СФМ, методом ТСХ и ГХ/МСД, есть варианты методом ВЭЖХ. Метод ГХ/МСД требует дорогостоящего оборудования, дополнительной пробоподготовки для перевода лекарственных препаратов в более летучие соединения и расхода дорогостоящих реактивов. Несомненным достоинством метода ГХ/МСД является наличие библиотеки (базы данных) лекарственных, наркотических препаратов и их метаболитов. Методы ВЭЖХ и КЭ отличаются простотой, небольшими трудозатратами, малым расходом реактивов, но не имеют библиотек, подобных ГХ/МСД, которые необходимо создавать самостоятельно в процессе работы.

Были проведены сравнительные исследования количественного содержания лекарственных препаратов, извлекаемых из биологических жидкостей по предлагаемому методу и методу А.А. Васильевой, результаты представлены в таблице. Экспериментально установлено, что степень извлечения лекарственных веществ из крови предлагаемым методом в среднем в 20-30 раз выше, чем по методу А.А. Васильевой.

Таким образом, полученные данные на примере модельных смесей на основе крови, мочи и желчи и реальных пробах показали, что для идентификации лекарственного препарата при отравлениях можно использовать предлагаемый метод однократной экстракции из 0,6 мл биологических жидкостей смесями растворителей: хлороформа с ацетоном и хлороформа с ацетонитрилом. Степень извлечения лекарственных веществ из крови предлагаемым методом в 20-30 выше, чем в извлечениях по методу А. А. Васильевой. Кроме того, данный метод позволяет количественно определять лекарственные препараты в биологических матрицах. Предлагаемый метод имеет ряд преимуществ: значительно снижает трудоемкость анализа, снижает стоимость анализа за счет уменьшения объемов используемых реактивов, сокращает случайные и систематические ошибки в процессе подготовки проб, избирателен и чувствителен.

23. Лекарственные препараты как мутагены

Важным проявлением побочного действия лекарственных средств является их мутагенность. Мутагенные свойства обнаружены у ряда лекарственных веществ (цитостатиков, андрогенов,эстрогенов и др.). Непрерывно пополняющийся арсенал лекарственных средств проходит биологическую проверку, в которую включены методы мутагенной проверки.

Наиболее выраженным мутагенным действием обладают цитостатики и антиметаболиты, используемые для лечения злокачественных новообразований и как иммунодепрессанты. Наибольшую группу цитостатиков с мутагенным действием составляют препараты алкилирующего действия (производные этиленимина, нитрозомочевины). Они повреждают ДНК в процессе репликации. Цитостатические препараты (винбластин, винкристин), действующие как ингибиторы веретена митотического деления, вызывают анеуплоидию и полиплоидию, вызывают зависимое от дозы повышение частоты хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах человека. Некоторые из препаратов (тиофосфамид) оказывают прямое мутагенное действие, для других (циклофосфамид) требуется метаболическая активация. Противоопухолевые антибиотики индуцируют хромосомные аберрации в клетках человека в зависимости от дозы. В группу лекарственных веществ, вызывающих в культуре клеток человека хромосомные аберрации можно отнести некоторые противосудорожные, психотропные, гормональные препараты, противовоспалительные средства. Иногда тщательная проверка снимает «мутагенное клеймо» с препарата, как это произошло с изониазидом и диэтиламидом лизергиновой кислоты. Существует группа препаратов, обладающих слабым мутагенным эффектом (некоторые метилксантины, психотропные средства, хлоралгидрат и др.), несмотря на их слабое мутагенное действие, из-за их широкого применения необходимо вести тщательные наблюдения за генетическими эффектами этих соединений. Это касается не только больных, но и медицинского персонала, использующего препараты.

24. Направленный транспорт лекарственных препаратов: современное состояние вопроса и перспективы

Одной из ведущих тенденций, проявляющихся в современной фармакологии, является создание систем направленного транспорта лекарств. Предпосылкой к её появлению явилось то обстоятельство, что препарат, введенный в организм традиционными способами, распределяется в нем относительно равномерно, проникая не только в органы-мишени, где он должен проявить терапевтический эффект, но и в другие органы, где действие препарата может носить негативный характер, тем больший, чем большая доза использовалась. При этом лекарственное вещество достигает своих биологических мишеней в концентрации, значительно меньшей по сравнению с необходимой терапевтической, что вынуждает использовать дозы, которые на один-два порядка превышают теоретически необходимые.

Реализация целенаправленного концентрирования лекарственного препарата исключительно или хотя бы преимущественно в зоне, охваченной патологическим процессом, позволяет резко снизить нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие, сократить терапевтическую дозу лекарства и кратность его введения. В связи с этим по эффективности и минимальной токсичности направленный транспорт фармакологических средств сравнивается с «точечным бомбовым ударом».

Для обеспечения направленности действия лекарств предложено использовать регионарное введение препаратов. Примерами подобных методов служат: внутрисуставное введение гормональных препаратов при лечении ревматоидного артрита; введение цитостатиков непосредственно в сосуд, питающий опухоль; внутрикоронарное введение тромболитических ферментов при терапии, вызванного тромбозом инфаркта миокарда. Применение регионарного введения лекарств в перечисленных случаях показало высокую эффективность. В то же время очевидно, что данный подход не может претендовать на универсальность, кроме того, его применение требует наличия достаточно сложной аппаратуры контроля.

Начиная с 70-х гг. XX в. изучается возможность создания систем доставки лекарств непосредственно к патологическому очагу путем связывания молекул лекарственного вещества и неких других молекул (векторов), обладающих тропностью к определенным клеткам (метод «мечения»), а также путем заключения молекул лекарства в «биоактивные» капсулы на основе полупроницаемых искусственных или естественных мембран (метод «упаковки»).

В качестве векторов для доставки лекарственных препаратов рассматриваются гормоны, ферменты, пептиды, антитела, гликопротеиды, гликолипиды, вирусы. Подход с использованием гибридных конструкций (конъюгатов) типа «белковый вектор - химиопрепарат» получил применение в разработке противораковых препаратов. Избирательность действия таких конъюгатов достигается либо за счет наличия на поверхности опухолевых клеток специфических рецепторов, «узнаваемых» векторным белком или антителом, либо за счет значительно более высокого уровня рецепторов векторного белка на поверхности опухолевых клеток по сравнению с нормальными.

Конъюгация препарата с белковым вектором может быть осуществлена с помощью химической сшивки (в простейшем случае - дисульфидная или тиоэфирная связь), полиэтиленгликолевого или полипептидного линкера. В любом случае, способ конъюгации должен удовлетворять двум основным критериям: высокий выход реакции и возможность внутриклеточного расщепления.

Использование в качестве векторов вирусных частиц является одной из основ генной терапии - лечения наследственных, мультифакторных и инфекционных заболеваний путем введения экзогенного генетического материала в клетки пациентов с целью направленного изменения генетических дефектов или придания отдельным клеточным органеллам новых свойств. Вирусы обеспечивают избирательность доставки генетического материала в строго определенные ткани и клетки, поскольку каждый вирус способен репродуцироваться только в клетках определенного типа. Но наряду с несомненными достоинствами вирусные векторы имеют и ряд существенных недостатков. Так, ретровирусные системы способны активировать онкогены и блокировать опухолевые супрессорные гены в инфицированных клетках, аденовирусные системы способны продуцировать токсичные вирусные белки и вызывать сильный иммунный ответ.

Новым направлением в биомедицине является разработка способов адресной доставки лекарств с использованием в качестве векторов различных наноструктур. Показано, что наноразмерные формы углерода (фуллерены, нанотрубки) обладают высокой проникающей способностью по отношению к биомембранам и, что весьма важно, могут преодолевать гематоэнцефалический барьер и являться транспортерами для лекарственных препаратов. В перспективе это может быть использовано для расширения терапевтических возможностей лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний, а также нейроинфекций. Наночастицы золота, наносферы и наностержни, сформированные молекулами золота и никеля, наночастицы железа, обладающие магнитными свойствами, и другие наноструктуры, содержащие металлы, начинают весьма эффективно использоваться при адресной доставке фармакологических средств в клетки.

Для создания систем направленного транспорта лекарств, помимо неорганических наноразмерных частиц, предложено применение биологических и биогенных нанотранспортных средств. На основе комплексов белков с нуклеиновыми кислотами сегодня конструируются бионаномашины, способные выполнять важные биологически целесообразные «задания», в том числе корректировать течение патологических процессов в организме. Например, для коррекции метаболизма и цитокиновой активности макрофагов в зоне ишемии при остром инфаркте миокарда используются инженерные наноконструкции, построенные из полиаргинингуанидиндеривата, антибиотика и б-2-макроглобулина, связывающегося с так называемыми рецептор-родственными белками (LRP-рецепторами) на клеточной поверхности. Несомненно, что применение векторов на основе наночастиц для направленного транспорта лекарств является весьма перспективным направлением исследований, однако сегодня оно находится лишь на начальной стадии развития. Кроме того, остается открытым вопрос о возможных побочных эффектах применения наночастиц в биомедицине.

Для создания лекарственных форм, способных избирательно доставляться к органам-мишеням, разработаны подходы, основанные на пространственном отделении лекарственного препарата от внешней реакционной среды путем помещения его в искусственные микро- и наноконтейнеры. Одним из первых способов, предложенных для достижения данной цели, явилось создание липосомальной формы лекарственных препаратов. Липосомы представляют собой искусственно получаемые сферические частицы диаметром от 20 нм до 50 мкм, образованные из одного или не скольких бимолекулярных слоев фосфолипидов и содержащие внутри воду или раствор.

Для повышения тропности липосом к определенным органам и тканям их изготавливают из фосфолипидов и гликолипидов, изолированных из этих органов. Наилучшим гликолипидом для липосом в отношении их переноса в ткани головного мозга и печени является сульфатид, в ткани селезенки - ганглиозиды, в ткани легких - сфингомиелин. Человеческий б-интерферон, иммобилизованный в липосомы, мембрана которых построена из фосфатидилхолина, холестерина и сульфатида, после внутрибрюшинного введения в большей степени обнаруживается в крови, печени, селезенке и опухолевой ткани мозга.

На данный момент разработаны липосомальные формы противоопухолевых препаратов, таких как доксорубицин, метотрексат, винбластин, актиномицин, L-аспарагиназа, а также ряда пептидов, полиеновых антибиотиков, бычьего инсулина, противовоспалительных кортикостероидных препаратов - кортизона, гидрокортизона, дексаметазона. Весьма перспективным выглядит использование липосомальных форм препаратов для лечения внутриклеточного паразитизма (лейшманиоз, малярия, токсоплазмоз). Экспериментальным путем установлено, что липосомальная форма сурьмы подавляет размножение лейшманий в клетках печени в сотни раз эффективнее, чем обычная, при этом токсическое действие препарата существенно снижается. Актуальной представляется проблема инкапсулирования в липосомах и внутриклеточного введения нуклеиновых кислот.

В то же время липосомальные системы транспорта имеют ряд существенных недостатков, к основным из которых можно отнести быструю деградацию в кровеносном русле, доступность для лизиса клетками ретикулоэндотелиальной системы, а также малое количество транспортируемого соединения, ограниченное внутренним объемом липосомы. Липосомы могут блокировать легочные капилляры, вызывать повышение уровня глюкозы в крови, приводить к нарушению свертываемости крови и обмена холестерина. Широкое применение липосом сдерживается высокой стоимостью липосомальных форм лекарственных средств.

В качестве контейнеров для препаратов с противовирусной, противораковой и антибактериальной активностью предлагается использовать наноразмерные структуры: фуллерены и углеродные трубки. Уникальные свойства фуллеренов обусловлены их высокой реакционной способностью за счет большого количества свободных валентностей углерода. Одним из способов их введения в организм является инкапсуляция в липидную везикулу. Однако для применения в биомедицине чистые фуллерены малопригодны в силу их нерастворимости в водных растворах и, как следствие, ограничений по используемым концентрациям. Функционализация фуллеренов делает эти соединения биодоступными и, следовательно, более эффективными для исследований в биосистемах. Производные фуллерена C₆₀ являются перспективными реагентами широкого спектра действия, обладающими нейропротекторным и антибактериальным действием, а также способностью ингибировать протеазу ВИЧ-1.

Углеродные нанотрубки обладают повышенным сродством к липидным структурам. Кроме того, они способны образовывать стабильные супрамолекулярные комплексы (ансамбли) с пептидами и нуклеиновыми кислотами и инкапсулировать эти молекулы. Данное свойство определяет использование нанотрубок в области создания систем доставки вакцин и генетического материала. Как и в случае с фуллеренами, функционализация нанотрубок повышает эффективность их использования в качестве контейнеров. Углеродные нанотрубки, поверхность которых была модифицирована аммонийными группами и остатками аминокислоты лизина, успешно использовали для доставки плазмидной ДНК pCMV-Bgal, экспрессирующей в-галактозидазу, в клетки млекопитающих.

Как эффективные средства для доставки лекарственных средств выступают нанокомпозитные полиэлектролитные капсулы. Для их получения применяется метод полиионной сборки, заключающийся в последовательной адсорбции противоположно заряженных молекул полиэлектролитов на поверхности коллоидных частиц с последующим растворением и удалением исходного темплата. При помощи данного метода могут быть получены капсулы, отличающиеся широким диапазоном размеров (от 50 нм до 50 мкм) с возможностью выбора в качестве материала оболочки практически любых синтетических и природных полиэлектролитов, липидных бислоев, неорганических наночастиц (к примеру, наночастиц серебра, золота или оксида железа (II)) и ионов многовалентных металлов; с контролируемой толщиной и многофункциональностью стенок капсулы; их контролируемой проницаемостью для любых низко- и высокомолекулярных соединений. В состав оболочек таких микрокапсул на этапе синтеза вводят неорганические наночастицы магнетита Fe₃O₄ с сильно выраженными магнитными свойствами, что позволяет управлять движением капсул при приложении внешнего магнитного поля.

Отдельным направлением, сформировавшимся в результате изучения возможности транспортировки лекарств к патологическому очагу, является разработка систем доставки, в которых в качестве носителей используются естественные контейнеры - форменные элементы крови человека или животных, не покрытые соответствующими антителами к клеткам-мишеням. Методы, предполагающие использование аутоклеток крови для модификации их свойств с целью создания внутриклеточного депо препарата и осуществления направленного транспорта, объединяют под общим названием «экстракорпоральная фармакотерапия». Получаемые при этом клетки обозначаются термином «фармакоциты». Подобные системы доставки наиболее выгодны с точки зрения их биологической совместимости.

С позиции экстракорпоральной фармакотерапии наиболее перспективным представляется использование в направленном транспорте эритроцитов - самых многочисленных клеток крови с целым рядом желательных морфологических и физиологических характеристик. Достоинствами эритроцита как носителя лекарственных препаратов являются: высокая степень биологической совместимости, особенно при использовании аутологичных клеток; способность к биологическому разложению и как следствие отсутствие токсических продуктов деградации; длительность циркуляции в кровотоке, существенно превышающая аналогичные показатели для искусственных носителей; возможность загрузки широкого спектра фармакологических препаратов; относительно инертная внутриклеточная среда, защищающая поставляемый препарат от инактивации эндогенными факторами; простота получения из крови в количестве, необходимом для загрузки терапевтической дозы препарата.

Относительным недостатком применения эритроцита в качестве микроконтейнера для направленного транспорта лекарств является его сравнительно большой объем (около 90 мкм³), исключающий проникновение эритроцита в ткани и тем самым ограничивающий область его избирательной доставки только мишеням, доступным для кровотока. Недостатком эритроцитов по сравнению с другими носителями можно считать и постоянство их свойств.

Реализацию терапевтического эффекта лекарственного средства, заключенного в эритроцит, связывают с его медленным высвобождением в процессе циркуляции и непосредственно целенаправленным поступлением к клеткам ретикулоэндотелиальной системы. В последнем случае модифицированные эритроциты захватываются и лизируются преимущественно макрофагами селезенки и печени, создавая в этих органах высокие локальные концентрации препарата. Эритроциты с минимальным уровнем повреждений разрушаются большей частью селезенкой. Носители со значительной степенью повреждений разрушаются преимущественно печенью. В то же время указывается, что эритроцитам принадлежит главная роль в обеспечении эффекта направленности доставки лекарств и в легочную ткань. Будучи измененными в процессе экстракорпоральной обработки, эритроциты секвестируются в капиллярах малого круга кровообращения, что обеспечивает повышение концентрации препарата, ассоциированного с клетками, в ткани легких.

Включение в эритроциты фармакологических агентов может быть осуществлено различными методами: 1) самым распространенным является гипоосмотический лизис, при использовании которого эритроциты помещают в солевой раствор пониженной ионной силы. Лизису предшествует набухание клеток до достижения критического объема и давления. При этом мембрана эритроцита лопается с образованием пор, которые в зависимости от условий могут иметь размеры от десятков ангстрем до 1,0-2,0 мкм. Через образовавшиеся поры вещества, подлежащие включению, поступают из внешней среды внутрь эритроцитов. При восстановлении тоничности раствора до исходного уровня целостность поврежденной мембраны эритроцитов может восстанавливаться. Нагруженные подобным способом эритроциты способны длительно циркулировать в кровотоке. В то же время выход из клеток большей части содержимого в ходе гемолиза приводит к образованию так называемых «теней» эритроцитов, которые in vivo достаточно быстро уничтожаются фагоцитами. Метод гипоосмотического лизиса при получении эритроцитарных контейнеров используется в нескольких модификациях, включая диализный метод, при котором в эритроцитах в наибольшей степени сохраняются аденозинтрифосфат (АТФ) и цитоплазматические ферменты, что обеспечивает высокий выход жизнеспособных «запечатанных» клеток. 2) Для загрузки лекарственных препаратов в эритроциты также применяется метод электропорации. При этом суспензию эритроцитов вместе с включаемым веществом в изотоническом растворе помещают в пульсирующее электрическое поле напряженностью до 20 кВ/см при длительности импульсов от нано- до микросекунд. Превышение трансмембранного потенциала критической величины 1 В приводит к временному образованию пор в клеточной мембране. В соответствующей среде перфорация клеток идет без гемолиза, позволяя готовить эритроцитарные контейнеры, длительно живущие in vivo. Преимуществом метода является возможность инкапсулировать нерастворимые в цитоплазме компоненты. 3) Ряд биологических веществ может быть включен в эритроциты при индукции эндоцитоза. Суть этого способа в том, что под действием определенных фармакологических агентов происходит инвагинация (впячивание) участка мембраны эритроцита с последующим образованием в цитоплазме мембранных пузырьков с внеклеточным содержимым. Кроме того, многие препараты способны включаться внутрь эритроцитов и по обычным транспортным механизмам. Выход таких лекарств из носителей, введенных в кровеносное русло, может быть задержан на часы, сутки и даже недели, что делает возможным пролонгирование эффекта. Высвобождение препаратов из эритроцитарных носителей осуществляется тремя различными путями. Первый - это простая диффузия препаратов через мембрану, характерная для липофильных соединений (метотрексат, цианокобаламин, дексаметазон). Второй - активный транспорт препаратов через мембрану с вовлечением специфических механизмов. Третий - выход препаратов из клеток-носителей в результате разрушения последних, что свойственно лекарственным препаратам с высокой полярностью (гентамицин, гепарин, аспарагиназа, пептиды). В то же время такое подразделение весьма условно, поскольку разрабатываются способы модификации мембраны эритроцитов, а также комплексы препаратов с другими молекулами, что ведет к изменению особенностей высвобождения препарата из клетки.

Другим направлением в экстракорпоральной фармакотерапии является использование аутолейкоцитов. Механизм действия лейкоцитарных носителей связывают со следующим: после насыщения лекарственными веществами и возврата в кровоток лейкоциты за счет хемотаксиса мигрируют непосредственно в очаг воспаления, где путем стимулированного экзоцитоза или после своего разрушения высвобождают пиноцитированный во время инкубации лекарственный препарат. Из-за замедленного выделения препарата из лейкоцитов в сосудистом русле значительно удлиняется, по сравнению с обычным введением, период сохранения в крови эффективных терапевтических концентраций. Проведение направленного транспорта в данном случае обеспечивается получением лейкоцитов при помощи цитафереза. Применение направленного транспорта антибиотиков в аутологичных лейкоцитах в комплексном лечении больных с острыми воспалительными заболеваниями почек позволяет значительно уменьшить частоту гнойно-септических осложнений, сократить длительность стационарного лечения. Для повышения фиксации антибактериальных препаратов клетками облучалась лейковзвесь гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нм.

Наконец, в качестве варианта своего развития технология адресной доставки фармакологических средств рассматривает использование аутогенной клеточной массы крови, получаемой в ходе плазмафереза. Выявлена способность таких препаратов, как фторхинолоны, рифампицин, клиндамицин, тетрациклины и хлорамфеникол, концентрироваться внутри клеток. Для улучшения связывания антибиотика с форменными элементами крови и создания устойчивого комплекса «препарат - носитель» было предложено дополнительно инкубировать полученную в результате отделения плазмы крови цитовзвесь с корректором связывания - АТФ, изменяющим микровязкость мембран клеток и способствующим более выраженному насыщению клеток препаратом. При применении методики реинфузии клеточной массы крови с антибиотиками (цефалоспоринами, фторхинолонами) и даларгином при лечении людей, больных панкреонекрозом, отмечено повышение концентрации препаратов в очаге поражения, снижение эндогенной интоксикации, положительные сдвиги клеточного и гуморального иммунитета, уменьшение побочных воздействий лекарственных средств на организм.

Список литературы

Вартанян Л. П., Колесова М. Б., Горнаева Г. Ф., Пустовалов Ю. И. Производные кофеина перспективное направление поиска противораковых и радиомодифицирующих лекарственных средств для комплексного лечения злокачественных новообразований головного мозга // ПФБН. 2005. №4 С.1093-1095.

Ващенко В. И., Ващенко Т. Н. Церулоплазмин: от метаболита до лекарственного средства // ПФБН. 2006. №3 С.1254-1269.

Крепкова Л. В. Современные подходы к доклинической оценке безопасности лекарственных средств растительного происхождения// Биомедицина. 2011. №4 С.150-152.

Полковникова Ю. А., Степанова Э. Ф. Возможности создания пролонгированных лекарственных форм афобазола (обзор) // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. 2011. №4 (99)

Лесиовская Е. Е., Саватеева-Любимова Т. Н. Критерии доклинической оценки эффективности и безопасности лекарственных растительных средств // Биомедицина. 2011. №3 С.91-94.

Холодов Д. Б., Николаевский В. А. Модифицирующее действие кеторолака трометамина на мембраны эритроцитов // Вестник РУДН. Серия: Медицина. 2009. №4 С.503-506.

Чазов Е. И. Создание лекарственных средств аналогов защитных систем организма // Казанский мед.ж.. 2011. №5 С.672-676.

Сокурова А. М. Рицин как возможная модель для создания лекарственных средств нового поколения // ПФБН. 2007. №1 С.1482-1483.

Шабанов П. Д., Базиленко И. Б. Пропротен-100 в комплексном лечении алкоголизма // ПФБН. 2004. №1 С.626-635.

Рамш Станислав М. История создания отечественного лекарственного препарата ЃдибазолЃ // Историко-биологические исследования. 2011. №4 С.36-59.

Шабанов П. Д. Фармакология лекарственных препаратов пептидной структуры // ПФБН. 2008. №3-4 С.2399-2425.

Сорокина О. Н., Сумина Е. Г., Петракова А. В., Барышева С. В. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания флавоноидов в лекарственных препаратах растительного происхождения // Изв. Сарат. ун-та Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2013. №3 С.8-11.

Куркин В. А., Петрухина И. К., Акушская А. С. Исследование номенклатуры адаптогенных лекарственных препаратов, представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации // Фундаментальные исследования. 2014. №8-4 С.898-902.

Хаджиева З. Д., Теунова Е. А., Крахмалев И. С. Изучение антимикробной активности лекарственных препаратов с фитоэкстрактом // Фундаментальные исследования. 2010. №11 С.152-154.

Огай М. А., Степанова Э. Ф. Разработка и технологические исследования лекарственного препарата инсулин в липосомальной форме // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. 2010. №10 (81)

Неугодова Н. П., Долгова Г. В., Гавриков А. В. Некоторые вопросы оценки токсичности генно-инженерных лекарственных препаратов // Биомедицина. 2011. №3 С.98-100.

Жданова Г. О., Вятчина О. Ф., Быбин В. А., Стом Д. И., Федосеева Г. М. Использование Saccharomyces cerevisiae для оценки биологической активности лекарственных препаратов // Сиб. мед. журн. (Иркутск). 2013. №4 С.104-106.

Колесникова С. Г., Дьяконов Л. П., Балашов В. П., Гальнбек Т. В. Изменение адгезивных способностей клеток некоторых постоянных линий клеток под влиянием ряда лекарственных препаратов с антиаритмической активностью // Вет. патология. 2003. №1 С.32-34.