Иммунохимические методы анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Общая характеристика иммунохимического метода анализа

2. Структура и свойства антигенов и антител

3. Физико-химическое взаимодействие антиген-антитело

4. Иммуноферментный анализ (ИФА)

4.1 Сущность и классификация ИФА

4.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА

4.3 Гетерогенные методы ИФА

4.4 Гомогенный метод ИФА

4.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов

4.6 Ингибиторный иммуноферментный анализ

4.7 Практическое применение ИФА

5. Иммунофлюоресцентный анализ

6. Радиоиммунологический анализ (РИА)

7. Иммуноцитохимический и иммуногистохимиеский анализ

Заключение



Введение

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анлиза уменьшить до нескольких минут.

Исторически первым среди них был радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов прошлого века. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп ¹²⁵I, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10^-12 М и ниже). На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании полистирольных планшетов для иммобилизации антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов.



1. Общая характеристика иммунохимического метода анализа

В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела - это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в имунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества - антигена.

Достоинства метода:

· Быстрота и простота определения;

· Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях;

· Не сложная пробоподготовка;

· Высокая точность;

· Не требуется дорогостоящей аппаратуры.

Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы.

Метод применяется для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов, определения биологически активных веществ.

Для определения моновалентных антигенов используется конкурентная схема - в систему водятся меченые ферментом вещества, которые конкурируют с антигеном при взаимодействии с ограниченным числом центров связывания специфичных антител.

Существует два способа реализации иммунохимического анализа - прямой и непрямой.

Прямой способ. Антитела нанесены на твердую фазу, ферментная метка вводится в антиген. Преимущества - небольшое число стадий и, соответственно, возможность автоматизации определения. Недостатоки - сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных коньюгатов (промежуточная стадия имунной реакции), а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента

Непрямой способ. Антиген наносится на твердую фазу, ферментной меткой отмечаются вторичные антитела, полученные против иммуноглобулинов соответствующего типа. Достоиством этого способа является возможность устранения влияний различных эффектов на каталитические свойства ферментов.

На основе иммуннохимического метода создано множество тест-систем. Они реализуются обычно на микропланшетах или в пробирках. С помощью тест-систем определяются гормоны и лекарства в сыворотке крови. Кроме того, на основе имунной реакции создаются биосенсоры.



2. Структура и свойства антигенов и антител

Генетически чужеродные вещества, попадая в организм высших животных и человека, способны вызывать в них ряд специфических процессов, направленных на их удаление из организма. Система организма, выполняющая эту функцию, называется иммунной системой, а сами процессы - иммунологическими. К важнейшим из них следует отнести образование специфических белков крови - антител (иммуноглобулинов). Вещества, способные вызывать специфические иммунологические реакции в организме, получили название антигенов. Способность антигенов вызывать иммунный ответ называется иммуногенностью, а способность образовывать комплексы с антителами - антигенностью. К антигенам относятся белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты как в очищенном виде, так и в виде компонентов различных биологических структур (клеток, тканей, вирусов и т.д.).

На поверхности молекулы сложного антигена можно выявить функциональные группы или остатки, обуславливающие антигенную специфичность, называемые антигенными детерминантами или эпитопами. Число эпитопов на поверхности сложной молекулы определяет валентность антигена. Понятие антигенная детерминанта включает в себя последовательность образующих ее химических функциональных групп и их пространственное расположение. В молекулах белков антигенная детерминанта образуется совокупностью аминокислотных остатков ( может варьировать от 5 до 20). Антигенные детериминанты белков бывают двух типов - секвенциальные, т.е. представляющие собой последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, и конформационные, образованные аминокислотными остатками из различных частей белковой глобулы. Во многих случаях единичная замена аминокислоты в структуре антигенной детерминанты или изменение конформации белковой глобулы являются достаточными для изменений антигенной специфичности макромолекулы. Если два антигена имеют только часть одинаковых антигенных детерминант, их называют перекрестно реагирующими антигенами.

Низкомолекулярные вещества, не способные сами вызывать образование антител, но приобретающие иммуногенные свойства после конъюгирования с высокомолекулярными носителями, например, бычьим сывороточным альбумином, называются гаптенами. К гаптенам относится широкий круг природных соединений: пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты, антибиотики, витамины, олигосахариды и т.д.

Биологическая функция антител заключается в защите организма от проникновения чужеродных веществ путем образования прочных специфических иммунных комплексов с соответствующими антигенами и последующего удаления их из организма. Способность антител образовывать высокоспецифичные прочные иммунокомплексы с различными веществами и возможность получения антител в необходимых количествах являются основой иммунохимических методов анализа.

В организме антитела вырабатываются специфическими клетками крови - В-лимфоцитами, каждый из которых имеет на своей поверхности до 100 000 рецепторов одинаковой специфичности, способных узнавать любой чужеродный антиген. Антиген, встречаясь в кровотоке с комплементарным ему рецептором, проводит отбор (селекцию) соответствующего В-лимфоцита, который затем, трансформируясь в плазматическую клетку и многократно делясь, образует клон клеток. Каждый клон плазматических клеток секретирует гомогенные по своей структуре антитела. Однако так как антиген активирует в крови сразу большое количество типов В-лимфоцитов, которые содержат рецепторы различной степени специфичности по отношению к исходному антигену, такой иммунный ответ и антитела называются поликлональными. Сыворотку животного, содержащую специфические к данному антигену антитела, называют антисывороткой, при этом обычно указывают против какого антигена и каким животным она выработана (например, антисыворотка кролика против эритроцитов человека). Принципиально важным является то, что поликлональные антитела даже против одной-единственной антигенной детерминанты гетерогенны как по структуре активного центра, так и по физико-химическим свойствам. В том случае, если антиген поливалентен, например, белок, то в сыворотке крови образуются антитела, направленные против каждой индивидуальной антигенной детерминанты, что еще более усложняет состав антител.

В середине 70-х годов был разработан принципиально новый путь получения антител, основанный на слиянии (гибридизации) лимфоцитов иммунизированного животного с миеломными клетками с образованием новых клеток - гибридом. Особенностью таких клеток является их способность размножаться и продуцировать антитела в искусственных условиях вне организма. С помощью специальных методов клонирования можно выделить одну гибридную клетку, которая, размножаясь, будет секретировать в неограниченных количествах антитела только одного вида - моноклональные антитела, которые являются гомогенными как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам.

Структура антител. Иммуноглобулины по своей химической структуре относятся к большому классу природных соединений - гликопротеидам, т.е. белкам, содержащим в своей структуре олигосахариды. Несмотря на огромное разнообразие антител и их гетерогенность, все они обладают некоторыми общими структурными элементами, обеспечивающими выполнение их основных функций.

По своим антигенным, эффекторным сфвойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM (Ig обозначает иммуноглобулин).

Общей структурной единицей всех иммуноглобулинов является комплекс из четырех полипептидных цепей - двух идентичных между собой легких цепей с молекулярной массой 23 кД каждая ( L-цепи, от английского слова light- легкий) и тяжелых с молекулярной массой по 53000 (Н-цепи, от английского heavy- тяжелый). Каждая из легких цепей прочно соединена с NH₂-концевыми участками тяжелых цепей благодаря наличию межцепочечных дисульфидных связей и множеству слабых гидрофобных, электростатических и других межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. В целом структура такого комплекса напоминает латинскую букву Y (или Т) и характерна для иммуноглобулинов классов IgG, IgD, и IgE (рис.1).

Рис.1. Пространственная структура молекулы IgG

При действии протеолитического фермента папаина молекула IgG распадается на три фрагмента, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антигены (так называемые Fab-фрагменты) и третий, способный к кристаллизации (Fc-фрагмент), отвечающий за эффекторную функцию антител (Рис.2). Другой протеолитический фермент пепсин разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи от S-S связи между Н-цепями в Fc-фрагменте. В результате образуются так называемый рFc'-фрагмент, представляющий остатки тяжелых цепей и соединенные дисульфидными связями два Fab-фрагмента, обозначаемые как F(ab')₂-фрагмент.

Рис.2. Схематическое изображение структуры молекулы IgG.

Антигенсвязывающий центр расположен в NH₂-концевых частях Н- и L-цепей. Таким образом каждая молекула IgG, а также F(ab')₂-фрагменты содержат по два одинаковых антигенсвязывающих центра, а Fab-фрагмент - один.

Молекулы антител имеют большое число S-S -связей, которые можно разделить на 3 категории - межцепочечные, внутрицепочечные и связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов, обусловливающих образование полимерных молекул - IgM и IgА. Структура иммуноглобулинов различных классов обусловлена числом и расположение S-S связей в молекулах, а также количеством четырехцепочечных элементов. IgМ присутствует в сыворотке в виде пентамера четырехцепочечных комплексов, соединенных S-S связями между Н-цепями. Некоторое количество IgА сыворотки также присутствует в виде димерной и тетрамерной формы (Рис. 3).

Рис.3. Схематическое изображение структуры молекул иммуноглобулинов различных классов

Легкие цепи иммуноглобулинов бывают только двух типов - или , и являются общими для всех пяти классов, в то время как тяжелые цепи обладают структурными, иммунологическими и химическими особенностями, характерными для каждого класса иммуноглобулинов. При исследовании аминокислотной последовательности было обнаружено, что все легкие и тяжелые цепи имеют одну принципиальную структурную особенность: они состоят из двух частей - вариабельной (V) и константной (С) (Рис.4).



Рис.4. Схематическое изображение расположения константых и вариабельных участков в молекуле IgG.

Постоянная или константная часть легких цепей (С_L) включает 107 аминокислотных остатков СООН-концевого участка, константная часть тяжелой цепи приблизительно в три раза (или в четыре в случае IgM и IgA) длиннее вариабельной. Оставшиеся последовательности аминокислотных остатков в NH₂-концевой половине легких и тяжелых цепей образует так называемые вариабельные области (V_C и V_H). В каждой из легких цепей молекул антител существуют две внутрицепочечные дисульфидные связи, число такх связей в тяжелых цепях различно (4-6). Каждый из внутрицепочченых дисульфидных мостиков образует петлю из 55-70 аминокислотных остатков.

По данным рентгеноструктурного анализа, участки пептидных цепей вблизи петли образуют глобулярную структуру, в которую включается около 110 аминокислотных остатков (Рис.5). Такие глобулы в структуре молекул антител получили название доменов. NH₂- концевой домен тяжелой цепи обозначают как V_H, а три последующих в константной области тяжелой цепи - как С_H1, С_H2 и С_H3 (для легкой цепи, соответственно V_L и C_L).



Рис.5. Схематическое изображение локализации доменных участков в легкой и тяжелых цепях иммуноглобулинов.

Связывание антигена происходит в доступной растворителю щели активного центра, образованной вариабельными доменами в NH₂-концевой части легкой и тяжелой цепей. Способность связывать антигены с той же эффективностью, что и нативные молекулы антител, обладают Fab и F(ab')₂-фрагменты иммуноглобулинов. Основным принципом организации антигенсвязывающих центров иммуноглобулинов является полицентровая структура. Малые антигенные детерминанты связываются на ограниченном участке активного центра, комплементарном данной детерминанте. Большие детерминанты могут занимать практически всю область связывания



3. Физико-химическое взаимодействие антиген-антитело

Специфическое взаимодействие антител с соответствующими антигенами, в результате которого образуются комплексы антиген -- антитело (иммунные комплексы). Часто конечным результатом этой реакции является связывание токсинов, обездвиживание вирулентных бактерий, нейтрализация вирусов. Антигенсвязывающие центры молекулы антитела могут связывать несколько неродственных антигенов. Такие антигены обладают структурным сходством и носят название перекрестно реагирующих. Гомогенная популяция молекул антител может связывать различные молекулы с очень малым структурным сходством или вовсе несхожие. В этом случае говорят о мультиспецифическом связывании, которое объясняют образованием связей в различных участках внутри антигенсвязывающих центров.

Реакция антиген -- антитело протекает в две фазы, которые различаются между собой по механизму и скорости. Первая фаза -- специфическое соединение активного центра антитела с соответствующими группами антигена или гаптена; вторая -- неспецифическая фаза, следующая за первой, -- визуально наблюдаемая реакция. При взаимодействии антител с простыми гаптенами вторая фаза, как правило, отсутствует. При некоторых условиях, например в отсутствие солей, первая фаза может осуществиться, а вторая -- нет. Первая фаза протекает всегда быстро, а вторая иногда очень медленно.

Соединение антигена с антителом обратимо; прочность соединения, называемая аффинитетом, может быть количественно измерена с помощью определения константы ассоциации. Существует также термин авидности антител, который употребляется для описания суммарной силы взаимодействия поливалентного антитела с полидетерминантным антигеном.

В большинстве случаев популяции антител, появляющиеся в сыворотке иммунизированных животных, представляют собой гетерогенный набор молекул с разными антигенсвязывающими центрами и с различной аффинностью к антигену. Гетерогенность популяции антител по аффинности и специфичности отражает гетерогенность клеток, секретирующих антитела. Каждая антителообразующая клетка вырабатывает гомогенную популяцию молекул. Часто отмечают, что с увеличением времени после иммунизации происходит повышение средней аффинности антител. Это «созревание иммунного ответа» отражает отбор клеток, образующих более аффинные антитела, и позволяет очень малому количеству антител более эффективно реагировать с антигеном и создавать защиту организма при повторном попадании в него микроорганизмов.

При изучении механизма взаимодействия антител с антигеном с помощью спектрополяриметрии и других физико-химических методов установлено, что в момент связывания антителом гаптена возникает конформационная перестройка молекулы антитела. При этом молекула антитела становится более устойчивой к действию различных денатурирующих агентов, а также и к гидролизу протеолитическими ферментами. Очевидно, в процессе связывания детерминантной группы антигена происходит адаптационная перестройка активного центра антитела.

Взаимодействие антитела с молекулой антигена сопровождается, в свою очередь, изменениями пространственной структуры антигена. Так, метмиоглобин превращается в апомиоглобин в результате комплексообразования с антителом, направленным к апомиоглобину, а лишенная активности в-галактозидаза -- в активный фермент в результате реакции с антителами к активной форме в-галактозидазы. Таким образом, при взаимодействии антигена с антителом оба соединения оказывают взаимное влияние на собственную пространственную конформацию. Возникающие конформационные изменения имеют обратимый характер. Извлеченные из иммунных комплексов антитела сохраняют антигенсвязывающую активность и не отличаются по химическим и физическим свойствам от нативных антител.

Характер реакций, протекающих во второй фазе А. -- а. р., определяется в значительной мере физическими свойствами антигена и проявляется в виде нескольких основных феноменов (агглютинации, нейтрализации токсинов и преципитации).

Феномен агглютинации заключается в том, что микроорганизмы, животные клетки или другие корпускулярные антигенные частицы, находящиеся во взвеси, под влиянием антител склеиваются между собой. Реакция агглютинации нашла широкое применение для определения групп крови человека, резус-фактора, количественного определения антител и антигенов.

Реакция нейтрализации токсинов основана на свойствах антитоксинов (антител против токсинов), которые, соединяясь с соответствующими токсическими веществами, нейтрализуют их. Степень нейтрализации может быть учтена посредством введения восприимчивому животному смеси токсин -- антитоксин. Количество антитоксина в иммунной сыворотке характеризуют тем количеством минимальных смертельных доз токсина, которое может быть нейтрализовано определенным количеством сыворотки. Реакцией нейтрализации пользуются для определения концентрации токсинов возбудителей дифтерии, столбняка и др. Для этого применяют стандартизированные антитоксические сыворотки.

Феномен преципитации заключается в образовании нерастворимых комплексов антиген -- антитело в результате соединения растворимого антигена со специфическими антителами и выпадании этого комплекса в осадок. Особый случай реакции преципитации -- реакция иммунной флоккуляции, которая происходит только в относительно узком диапазоне концентраций антигена, а при незначительном избытке антител и антигена образуются растворимые комплексы. Реакцию преципитации используют для количественного определения антигенов и антител, концентрации иммуноглобулинов различных классов в крови людей, в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белков сыворотки крови в реакции Чистовича -- Уленгута.

Способность антител соединять антигенные частицы в крупные конгломераты (агглютинация бактерийных и других клеток, преципитация растворенных антигенов) обусловливается наличием по крайней мере двух активных центров в молекуле антитела. Одна специфическая группа соединяется с одной антигенной детерминантой, другая -- с аналогичной детерминантой другой антигенной частицы. Двухвалентность антител обеспечивает возможность соединения неограниченного числа антигенных частиц в конгломераты. При различном числе антигенных детерминант на молекуле антигена характер структуры конгломератов комплекса антиген -- антитело может быть разным. При избытке антигена или антител крупные конгломераты вообще не возникают вследствие заполнения реагирующих участков молекул избыточным количеством второго компонента. Вследствие этого А. -- а. р. максимально проявляются только в определенном диапазоне концентрации обоих реагентов, в так называемой зоне эквивалентности.

Взаимодействие антигена с антителом приводит к реализации ряда биологических (эффекторных) функций антител. К ним относятся феномены связывания комплемента, лизиса, антителозависимой цитотоксичности и опсонизации.

Феномен связывания комплемента -- присоединение комплемента к комплексу антиген -- антитело. Комплементом называют многокомпонентную самособирающуюся систему белков крови, которая играет одну из ключевых ролей в поддержании иммунного гомеостаза. Активация системы комплемента, индуцируемая в результате А. -- а. р., сопровождается многочисленными нарушениями гомеостаза, связанными в первую очередь с повреждением клеток или изменением их функции. Только два класса антител (lgG и lgM) обеспечивают активацию системы комплемента. В зависимости от специфичности антител, типа клеток-мишеней, числа и природы участвующих в реакции компонентов комплемента могут наблюдаться необратимые повреждения клеточной мембраны, увеличиваться восприимчивость к фагоцитозу, высвобождаться фармакологические агенты типа гистамина, происходить направленные миграции клеток (хемотаксис). На способность комплемента присоединяться к комплексу антиген -- антитело основана реакция связывания комплемента, которую применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), рада вирусных инфекций, изучении противотканевых антител и аутоантител.

Феномен лизиса -- способность некоторых антител в присутствии комплемента растворять клетки, против которых они возникли. Феномен антителозависимой клеточной цитотоксичности -- контактный лизис клетками-киллерами (К-клетки) чужеродных клеток, покрытых lgG-антителами. Этот процесс не зависит от системы комплемента. Феномен опсонизации заключается в том, что антитела усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов в отношении тех антигенов, против которых они получены.

иммунохимический антиген антитело гомогенный



4. Иммуноферментный анализ (ИФА)

4.1 Сущность и классификация ИФА

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

Рис. 6 Основной принцип ИФА: 1) для выявления антигенов; 2) для выявления антител

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

[AT]+[АГ]-[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы - носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы - в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия - образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

4.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА

Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

- высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

- наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

- возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

- отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и в-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты. Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

- обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

- образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

- субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов - флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Образование конъюгата. Конъюгат - это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата - один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

- высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

- достаточной специфичностью в рабочем разведении;

- преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

- оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

- достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

4.3 Гетерогенные методы ИФА

Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела - конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце.

После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов - ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

Рисунок 7.



Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

Основное достоинство данного метода - высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 - 6 часов.

Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

4.4 Гомогенный метод ИФА

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА , занимает минуты и даже доли минут).



Рис.8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа (А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, ( несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

4.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела - конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА (рис.9).



Рис. 9 «Сендвич» - вариант ИФА.



4.6 Ингибиторный иммуноферментный анализ

В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, связывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональна содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стандартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена.

1. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген. Подбирают рабочее разведение меченых антител с помощью титрования.

2. Проводят предварительную инкубацию конъюгата в разведении, предшествующем рабочему, с разведениями исследуемого образца, стандартного антигена и положительных контрольных проб.

3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля 100%-ного связывания в несколько лунок вносят только меченые антитела, без ингибирующего антигена. Панели инкубируют, затем проводят отмывку.

4. Добавляют субстрат.

5. Проводят учет результатов.

Концентрация определяемого антигена в исследуемом образце обратно пропорциональна ферментативной активности на твердой фазе.

ИФА может использоваться не только для определения растворимого антигена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.



4.7 Практическое применение ИФА

ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для:

* массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);

* выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;

* определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

* выявления иммунных комплексов;

* выявления онкомаркеров;

* определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);

* определения общего IgE и специфических IgE антител;

* скрининга моиоклональных антител;

* определения цитокинов в биологических жидкостях.

Чувствительность метода

ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. По сравнению с вышеназванными методами ИФА менее трудоемок и менее продолжителен по времени, удобен для выполнения большого числа однотипных анализов.

В ИФА сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Различные варианты ИФА различаются по своей чувствительности. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Средняя чувствительность ИФА - 10-9 - 10-12 моль.



5. Иммунофлюоресцентный анализ

Иммунофлюоресценция -- люминесценция (свечение) при микроскопии в ультрафиолетовом спектре биологического объекта, предварительно обработанного меченными флюорохромом антителами. Иммунофлюоресценция разработана Кунсом в 1942 г. и применяется как метод экспресс-диагностики инфекционных болезней.

Принцип иммунофлюоресцентного метода (реакции иммунофлюоресценции - РИФ) основан на визуальном учете специфического взаимодействия флюорисцирующих специфических антител с гомологичным антигеном. Образующийся при этом, комплекс антиген-антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа (приложение 2). Таким образом, с помощью РИФ реализуется непосредственный контроль за первой фазой серологических реакций, причем специфичность метода сочетается с высокой чувствительностью. Предложено и применяется несколько вариантов реакции иммунофлюоресценции:

A. Прямая реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - для её выполнения используют непосредственно специфические антитела, меченные флюорохромом.

B. Непрямая реакция иммунофлюоресценции (РНИФ) - для её выполнения используют видоспецифические (против антител человека или животных) иммуноглобулины, меченные флюорохромом.

Постановка РИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон), наносят на них люминесцирующую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 37⁰С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-21⁰С). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют в люминесцентном микроскопе или в обычном микроскопе с люминесцентной приставкой, с использованием масляной иммерсионной системы.

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырехплюсовая шкала: «+++» и «+++» - очень яркая и яркая; «++» и «+» - выраженная и слабая ободочная, зеленая флюоресценция клеток.

Постановка РНИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон), наносят на них иммунную специфическую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 37⁰С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-21⁰С). Для удаления избытка специфических антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Затем наносят на них антитела к иммуноглобулинам животного, при иммунизации которого была полученная использованная на первом этапе иммунная специфическая сыворотка, меченные флюорохромом, взятые в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 37⁰С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-21⁰С). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют в люминесцентном микроскопе или в обычном микроскопе с люминесцентной приставкой, с использованием масляной иммерсионной системы (например, МИКМЕД 2вар.11).

...