Характеристика нейроиммунного взаимодействия у больных ревматоидным артритом

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

артрит фенотипический иммунокомпетентный

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Характеристика нейроиммунного взаимодействия у больных ревматоидным артритом

Абрамов Сергей Валерьевич

НОВОСИБИРСК - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна

доктор медицинских наук, профессор Гайдуль Константин Валентинович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «30» марта 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «___» _______________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Ревматоидный артрит (РА) - самое распространенное заболевание аутоиммунной природы. РА страдают 1-2% взрослых независимо от расы и климатогеографических условий, 70% больных - женщины. Не только широкая распространенность, но и быстрая инвалидизация - в течение 5 лет почти 50% заболевших становятся инвалидами, обусловливает социальную значимость изучения данного заболевания. (Нац. рук-во, 2010; Ревматология, 2006; Harris E.D.,1990; Gabriel S.E., 2001; Avouac J., e.a., 2006) Известно, что ревматоидный артрит, являясь системным воспалительным заболеванием соединительной ткани с преимущественным поражением суставов по типу хронического прогрессирующего деструктивного полиартрита (Насонов Е.Л., 2007; Turesson C., e.a., 2007; Mjaavatten M.D., e.a., 2009), относится к истинным, то есть связанным с органическими изменениями, психосоматическим заболеваниям (Alexander G.E. 1992; Александер Ф., 2002; De Brouwer SJ, e.a., 2011). Тем не менее, двойственный - аутоиммунный и психосоматический генез РА, практически не влияет на методы, схемы и принципы лечения данного заболевания (Ревматология. 2010; Scott D.L., 2007; Van der Helm-van Mil A.H.M. e.a., 2007). Современная терапия РА увеличивает продолжительность и повышает качество жизни, но не способна вылечить больного и обладает серьезными осложнениями, что свидетельствует о том, что изучение РА требует новых подходов и как психосоматическая патология нуждается в комплексном исследовании нервной и иммунной систем больного.

В последние десятилетия, как в России, так и за рубежом активно развивается научное направление, изучающее механизмы, принципы, закономерности и значение для организма человека взаимодействия иммунной, эндокринной и нервной систем (Корнева Е.А., и др. 1999; 2009; Абрамов В.В., и др. 1996; 2004; 2009; Девойно Л.В., и др. 2009; Elenkov Ilia J., e.a. 2000). Результаты этих исследований позволили обозначить взаимозависимый характер этого взаимодействия как интеграцию систем (Абрамов В.В., 1992; Абрамов В.В., и др.2004, 2009). Интеграционный характер взаимодействия, в свою очередь, предполагал участие высшей нервной деятельности (ВНД) в указанном процессе. Далее была установлена роль ВНД в формировании иммунологической разнородности, существовании нейро-иммунных типов среди здоровых людей, выявленных на основе билатерально-асимметричной организации мозга, как фактора, детерминирующего особенности ВНД (Абрамова Т.Я., 2004).

В настоящее время известно, что люди с доминированием правого полушария головного мозга достоверно чаще болеют аутоиммунными и аллергическими заболеваниями (Geschwind N., Behan P.,1984). Дебют РА, его обострения и особенности клинического течения также связывают с межполушарными взаимоотношениями, состоянием нейроэндокринной и вегетативной систем (Абрамова Т.Я., 1995; Лещинская В.В., 2007; Труфакин С.В., 2007; Paliienko I., 2001; Doria A., e.a. 2005, 2006; Сalcaqni E., Elenkov I., 2006; Shahabi S., 2006).

Считается доказанным ведущее значение иммунных расстройств в развитии РА. Известно, что нарушения функций иммунокомпетентных клеток, в частности, дисбаланс T1/T2 популяций и формирование клеточных иммунных реакций являются одной из основных причин развития ревматоидного артрита (Doria A., 2006; Moudgil KD, e.a., 2011; Herman S, e.a. 2011; Munoz-Suano A, e.a. 2011; Karonitsch T, e.a. 2011). Вместе с тем, именно «неврологический» компонент этого психосоматического заболевания, а также связь между функциональным состоянием нервной системы и основного патогенетического звена аутоиммунного воспаления (на уровне баланса T - клеток первого и второго типа) изучены в меньшей степени.

Таким образом, двойственный - аутоиммунный и психосоматический генез ревматоидного артрита, свидетельствующий о роли особенностей личности больного в возникновении и течении хронического аутоиммунного воспаления, делает актуальными исследования, включающие нейроиммунологическую характеристику больных РА.

Цель исследования: Определить фенотипические, функциональные и генетические параметры иммунокомпетентных клеток и изучить характер взаимодействия иммунной и нервной систем больных ревматоидным артритом женщин, характеризующихся разными вариантами психонейроиммунных связей.

Задачи исследования:

1. Определить фенотипические характеристики иммунокомпетентных клеток больных РА, характеризующихся разными вариантами психонейроиммунных связей (CD4+,СВ8+(CD45RO+/ -, СD45RA+/-), экспрессию активационных маркеров).

2. Изучить функциональные свойства иммунокомпетентных клеток периферической крови у больных РА с разными вариантами психонейроиммунных связей (пролиферация, апоптоз, продукция цитокинов 1-го и 2-го типа).

3. Установить длину теломерных районов ДНК иммунокомпетентных клеток периферической крови больных РА с разными вариантами психонейроиммунного взаимодействия.

4. Выявить взаимосвязи фенотипических, функциональных и генетических параметров иммунокомпетентных клеток в условиях нарушений Т-клеточного звена иммунной системы у больных РА с учетом психонейроиммунной конституции.

Научная новизна. Впервые установлено, что патогенетическая разнородность ревматоидного артрита у женщин связана с функциональной межполушарной асимметрией мозга (ФМА). На основе выявления характера церебральной асимметрии определены три клинико-иммунологических варианта течения РА. Установлены, зависящие от ФМА, особенности дисбаланса Т - клеточного звена иммунной системы в группе больных РА: повышение CD4+ и дефицит CD8+ лимфоцитов в первой группе с доминантным левым полушарием и напротив, дефицит CD4+ и умеренная активация CD8+ лимфоцитов в третьей группе с преимущественно доминантным правым полушарием. Определены имеющие промежуточное значение и не отличающиеся от контралатеральных групп больных параметры Т - звена во 2 группе пациентов с активностью обоих полушарий. Впервые исследованы особенности иммунного ответа больных РА с различной ФМА относительно здоровых людей с аналогичной доминантностью на уровне параметров пролиферации и дифференцировки Т - клеточного звена иммунной системы. Установлен дефицит субпопуляции CD8+CD45RO+ - лимфоцитов во всех группах больных независимо от ФМА, при этом, степень выраженности этого дефицита и функциональная активность CD8+ клеток в группах больных проявлялась в разной степени. Пациентов первой группы характеризовал дефицит Т - клеток 2 типа (CD4+/IL4+; CD8+/IL4+). Повышение у пациентов 1 группы содержания CD4+ - лимфоцитов, несущих ранние маркеры активации, не сопровождалась адекватным увеличением экспрессии поздних маркеров активации, а также увеличением процессов пролиферации и дифференцировки и было сопряжено с дефицитом Тh. Для больных РА второй группы были характерны нарушения в процессах пролиферации и дифференцировки обеих Т - клеточных субпопуляций. При этом, у больных второй группы установлен избыток малодифференцированных и дефицит дифференцированных Т - лимфоцитов. Тем не менее, Т- лимфоциты пациентов 2 группы обладали значимым пролиферативным потенциалом, о чем свидетельствовала нормативная длина теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках. В третьей группе пациентов, с преимущественной доминантностью правого полушария, установлено значимое снижение Т-лимфоцитов 1 типа (CD4+/IFNг+; CD8+/IFNг+). Определены особенности вегетативного обеспечения висцеральных функций у больных РА, зависящие от характера ФМА и определяющие in vitro «чувствительность» МНК больных к ацетилхолину и адреналину на уровне параметров пролиферации и апоптоза, а также дифференцировки Т- клеток первого и второго типа в общей группе больных. Впервые установлен различный эффект терапии обострения РА у больных с различной ФМА (по критерию DAS28). В частности, хороший эффект терапии был выявлен в 3 группе с преимущественной доминантностью правого полушария. Удовлетворительный во второй, с активностью обоих полушарий и неудовлетворительный в первой группе больных РА с доминирующим по четырем парным функциям левым полушарием.

Теоретическая значимость и практическая ценность работы.

Теоретическая значимость работы заключается в расширении знаний о патогенетической роли нейроиммунного взаимодействия и механизмах его реализации у больных ревматоидным артритом. Полученные данные вносят вклад в исследование иммунопатологического процесса в рамках нейроиммунологии и ревматологии.

Практическая ценность работы заключается в обосновании необходимости комплексной оценки и учета состояния иммунной и нервной систем больных РА, как патологии, имеющей двойственный генез - аутоиммунный и психосоматический. Выявленные в работе закономерности создают условия для контроля над динамикой заболевания и эффективностью терапевтического воздействия, что, в целом, позволяет прогнозировать характер течения заболевания. Полученные данные служат основанием для разработки дифференцированных схем лечения, учитывающих роль индивидуальных характеристик нервной системы больного в течении РА.

Положения, выносимые на защиту:

У больных РА женщин нарушение субпопуляционной структуры и функциональной активности иммунокомпетентных клеток сопряжено со снижением функциональной активности нервной системы на уровне высшей нервной деятельности (память, способность к обучению), типологических свойств нервной системы (силы нервных процессов, силы возбуждения) и вегетативной нервной системы (на уровне нейровегетативной и гуморально-метаболической составляющей).

У больных РА функциональная межполушарная асимметрия мозга связана с патогенетической разнородностью заболевания, а также вариантами клинических проявлений и эффективностью лечения.

Вегетативная нервная система опосредует зависящее от ФМА взаимодействие нервной и иммунной систем у больных РА.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: 1. на семинаре лаборатории нейроиммунологии НИИ КИ СО РАМН (Новосибирск, октябрь 2008); 2. на 28 (LI) СЕССИИ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК (Новосибирск, 16 декабря 2008); 3. на Всероссийской конференции с международным участием «Современные направления исследований функциональной межполушарной асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2-3 декабря 2009); 4. на семинаре ИКИ СО РАМН (Новосибирск, май 2010); 5. на Всероссийской научной конференции "Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии" (Новосибирск 15-17 сентября, 2010); 6. на 8 отчетной конференции НИИ КИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (Новосибирск, июнь 2011).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 150 страницах машинописного текста, включающего 39 таблиц и 14 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 339 литературных источника, в том числе 257 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В обследование было включено 95 женщин больных РА (средний возраст 48±1,2; min 18, max 69 лет). Все пациенты проходили лечение и наблюдались врачами отделения ревматологии клиники УРАМН НИИ КИ СО РАМН г Новосибирска. Диагноз РА был выставлен и верифицирован в соответствии с критериями ACR 1987 г, а с 2008 года, в соответствии с переработанным проектом классификации РА 2007 г. Клиническое течение РА оценивалось по активности болезни, рентгенологической стадии и функциональному классу. В группе сравнения было обследовано 123 условно здоровые женщины, не имевших аутоиммунных, аллергических и острых воспалительных заболеваний, в возрасте от 19 до 69 лет (средний возраст 43,3±0,9).

Иммунологические методы

Определение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитофлюориметрии с помощью аналитической системы FACS Calibur фирмы Becton Discinson (США) согласно инструкции по эксплуатации. Применялись моноклональные антитела против CD3; CD4; CD8; CD16; CD19; CD20; HLA-DR фирм «МедБиоСпектр» и «Сорбент» (Москва), а также антитела CD45RO+ и CD45RA+ фирмы Becton Discinson (США) в соответствии с описаниями, представленными в инструкциях производителя антител.

Клеточные эффекторные функции определяли в тесте гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по интенсивности продукции фактора торможения миграции и фактора торможения распластывания в ответ на митогенную стимуляцию (ФГА) мононуклеаров (МНК) in vitro. (Кожевников В.С., 1998).

Определение активности моноцитов (ПАМ) и нейтрофилов (ПАН) по продукции эффекторных молекул. Принцип метода: выделенные клетки инкубируются с опсонизированным зимозаном, который является стимулятором процессов in vitro. В результате такого взаимодействия происходит кислородный взрыв - выделение пероксидов. Вводится ортофенилдиамин (ОФД), происходит его окисление вследствие разложения перекиси водорода. Оценивали по интенсивности окрашивания пробы на анализаторе «Multiskan MS» (Кожевников В.С.1998).

Определение гранулоцитарного и моноцитарного фагоцитоза проводилось на проточном цитофлюориметре фирмы Becton Discinson (США). Инкубировали выделенные на градиенте плотности фиколл-верографин (1,082 г/см3) мононуклеары и лейковзвесь клеток, полученную после добавления 10% р-р желатина (до 1% концентрации) к гепаринезированной периферической крови, с 10 мкл латекса, нагруженного гамма глобулином (Биопрепарат, Санкт-Петербург), меченным ФИТЦ. Иммуноцитометрию проводили с использованием параметров светорассеяния (FSC и SSC) для выделения областей моноцитов и гранулоцитов, из которых строили гистограммы (Кожевников В.С., 1998).

Определение уровня иммуноглобулинов классов G,A,M (IgG,A,M)в сыворотке крови проводилось турбодиметрическим методом c использованием наборов реагентов для микроанализа производства ЗАО НПО «СИНТЕКО» (г. Москва ) согласно инструкции по применению.

Оценка уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилось фотометрическим методом по Настаушевой Т.Л. (адаптация метода для нефелометра Трунова А.Н.,1997).Тест базируется на преципитации ЦИК в 3% и 4% ПЭГ (6000). Частное от деления показателей о.п. растворов с 4% на о.п. 3% ПЭГ позволяет судить об относительной молекулярной массе (О.м.м.ЦИК) комплексов, при этом показатель 1,1 свидетельствует о преобладании крупномолекулярных;1,11,5 - среднемолекулярных; 1,5 - о низкомолекулярных комплексах.

Определение фаз клеточного цикла и апоптоза в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов (Philpott N.J., et al. 1996; Nicoletti I. et al.1991; Fruenauf S., et al. 1998) проводили на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы СellQuestPro (Becton Dickinson, США). Относительное содержание клеток с гипердиплоидным (клетки в S-M фазах клеточного цикла) и с гиподиплоидным (апоптотические клетки) набором ДНК определяли по степени флуоресценции внутриядерного красителя 7-AAD. Результаты выражали в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству лимфоцитов (не менее 10000).

Определение внутриклеточных цитокинов в субпопуляциях Т-лимфоцитов. Относительное количество цитокин-продуцирующих (CD4+, CD8+ (IFNг+, IL-4+, IFNг+/IL-4+) клеток определяли методом трехцветной проточной цитометрии. Анализировали на цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы СellQuestPro (Becton Dickinson) (Maino V.C., 1998).

Определение влияния ацетилхолина йодида (1Ч10-7М) и адреналина гидрохлорида (1Ч10-7М) на клеточный цикл и апоптоз CD4+ и CD8+лимфоцитов. Стерильно выделенные мононуклеары (1·106клеток на лунку) культивировали в течение 24 часов с ацетилхолином йодидом (1Ч10-7М) и адреналином гидрохлоридом (1Ч10-7М) относительно контроля в полной культуральной среде при 37°С. Затем клетки собирали, отмывали и в каждой пробе определяли процент клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла и апоптоза с предварительным фенотипированием CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Проводили фиксацию, пермебиализацию, инкубировали с РНК-азой в дозе 20 мкг/мл, после которой проводили фиксацию 5% формалином, содержащим 7-актиноаминомицинД (7-ААД). Образцы анализировали на проточном цитофлюориметре.

Определение влияния ацетилхолина йодида и адреналина гидрохлорида на содержание внутриклеточных цитокинов в субпопуляциях CD4+, CD8+ лимфоцитов. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (= 1,082 г/см3). Затем МНК ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS, 5мМ L-глутамин, 10мМ Hepes. Ресуспендированные клетки переносили в лунки 24-луночного культурального планшета (Falcon, Becton Dickinson, США) в концентрации 106клеток на лунку и культивировали в течение 4 часов в присутствии стимулятора РМА (30 нгр/мл), кальциевого ионофора иономицина (1 мкгр/мл) и ингибитора белковой секреции брефелдина А (10мкгр/мл), а также ацетилхолина йодида (1Ч10-10 и 1Ч10-7М) и адреналина гидрохлорида (1Ч10-7 и 1Ч10-4М) против аналогичных проб контроля, не содержащих ацетилхолин и адреналин, при 37С в атмосфере 5% СО2. Определение содержания внутриклеточных цитокинов в CD4+, CD8+ лимфоцитах проводили на цитометре.

Измерение длины теломерных участков ДНК в Т- лимфоцитах Лейкоциты (1Ч106) смешивали с 5Ч105 спленоцитов мыши и осаждали. Осадок ресуспендировали в 300 мкл гибридизационного раствора, содержащего 70% формамида. Флуоресцеин (СССТАА)3 Peptide Nucleic Acid (PNA) зонд добавляли в концентрации 0,3 мкг/мл. Инкубировали при 80?С в течение 10 минут, гибридизация длилась 3 часа. По окончании гибридизации клетки переносили в пробирки для цитометрии, дважды отмывали 70% формамидом и однократно ЗФР-БСА, содержащим 0,1% Tween 20. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл ЗФР-БСА, содержащим 25 мкл/мл РНКазы и 7-аминоактиномицина. Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur с помощью программного обеспечения Cell Quest PRO. Сигнал флуоресценции теломер определяли как средний уровень флуоресценции (MFI) клеток, находящихся G0/G1 фазе клеточного цикла, вычитанием фоновой аутофлуоресценции (т.е. MFI контрольных образцов, прошедших FISH в отсутствии PNA зонда). Относительное значение длины теломерных районов ДНК определяли как отношение MFI исследуемого образца к MFI спленоцитов мыши. Дополнительно вводился коэффициент для уравновешивания сигнала на количество хромосом в клетках, т.к. у человека 46 хромосом, а у мыши 42. Оценка абсолютной длины теломерных участков ДНК проводилась пересчетом через относительную длину по формуле Y = 2014 + 286ЧX, где «Y» - это получаемая абсолютная длина в парах нуклеотидов, а «X» - это длина теломерных участков ДНК относительно клеток внутреннего контроля (ОДТ). Формула получена в результате пересчета по 5 донорам относительной длины через абсолютную, измеренную методом Southern Blotting.

Психологические методы

Тестирование параметров мышления. Использовался краткий ориентировочный тест (КОТ) - адаптированный тест Вандерлика (Анастази А., Урбина С., 2007). Результаты исследования выражались в баллах.

Тестирование параметров памяти. Для определения параметров кратковременной памяти и реминисценции памяти использовался метод 10 слов. При этом в течение ограниченного времени (30 секунд) обследуемый должен запомнить 10 слов (на карточке), не вызывающих эмоциональных реакций, после изъятия карточки и через 30 секунд мысленного повторения должен их воспроизвести (кратковременная память %). В течение последующих 15 минут обследуемого отвлекают посторонними разговорами, а затем он должен вновь воспроизвести указанные выше 10 слов (реминисценция памяти %) (Лурия А.Р., 1973).

Тестирование типологических особенностей нервной системы. Использовалась экспертная психологическая программа группы авторов под руководством профессора Б.Я. Первомайского (программное обеспечение Т.И. Клейн) (МСП «Катарсис». Психологический центр, Луганск, 1992). Указанная программа разработана на основе индивидуальных опросников, представляющих собой модифицированную версию опросников Strelau, Terelak (Strelau, Terelak, 1974), Paisey, Mangan (Paisey, Mangan, 1987). Она позволяет определить силу, подвижность и инертность возбудительных и тормозных процессов с математическим выражением полученных показателей. Результаты выражались в условных единицах (у.е)

Тестирование функциональной межполушарной асимметрии мозга по четырем парным функциям проводилось с помощью опросного метода и функциональных проб (Брагина Н.И., Доброхотова Т.А., 1988; Леутин В.П., Николаева Е.И., 1988). При этом в моторной сфере выявлялось функциональное предпочтение руки и ноги. Асимметрия в сенсорной сфере выявлялась в преимуществе одного глаза в бинокулярном акте зрения, а также в преимуществе уха при слухо-пространственном различении в бинауральном восприятии акустических сигналов. Асимметрия зрения, слуха, рук и ног определялась по преобладанию правых или левых значений проб, в каждом случае использовалось не менее 10 проб. Если сумма левых показателей равнялась сумме правых и были случаи равенства по одному из показателей, то отмечалась симметрия. Обследованные лица разделялись на 3 группы, отличающиеся степенью выраженности признаков право- и леволатеральности. В 1 группу «правшей» были отнесены люди абсолютно праволатеральные по четырем парным функциям. Группа амбидекстров включала всех остальных женщин с различной степенью выраженности в обоих полушариях право- левосторонних и симметричных показателей: группа 2 - амбидекстры с одним латерализованным слева или симметричным признаком (амбидекстры 1) и группа 3 - амбидекстры с двумя и более латерализованными слева или симметричными признаками (амбидекстры 2).

Методы функциональной диагностики. Определение активности отделов вегетативной нервной системы (ВНС) проводилось методом кардиоинтервалографии - оценки вариабельности сердечного ритма (ВРС). Частоту сердечных сокращений и измерение длительности R-R интервалов производили с помощью электрокардиографического комплекса «KARDi» (г.Зелиноград, Россия). Записывали 150 R-R интервалов в состоянии полного покоя обследуемого, 150 - во время проведения пробы с ментальной нагрузкой (устный счет) и 150 - на фоне проведения дыхательной пробы с фиксированной частотой дыхания (8 раз в минуту). Показатели ВРС рассчитывались во временной и частотной областях. На основании описанных параметров вариационной пульсометрии вычисляли интегративные показатели - индексы проф. Р.М. Баевского (А.М. Вейн с соавт, 2003). Методика анализа полученных данных и их физиологическая интерпретация были приведены в соответствие с соглашением, достигнутым Европейским обществом кардиологов и Северо-Американским обществом по электростимуляции и электрофизиологии (1996 г.).

Статистическая обработка данных. Для математической обработки полученных данных использовалась статистическая компьютерная программа STATISTICA 6.0 for Windows (StatSoft, USA). При сравнении 2 средних величин количественных показателей использовались параметрические (t-критерий Стьюдента для независимых и зависимых групп) и непараметрические методы (Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса). Для сравнения трех независимых групп применялся параметрический дисперсионный анализ (Breakdown and one-way ANOVA) и непараметрические методы сравнения (Краскела-Уолисса, медианный тест) согласно условиям применения данных статистических процедур (Реброва О.Ю., 2003). Сравнение групп по качественным признакам проводилась с использованием точного критерия Фишера. Для таблиц 2х2 использовался критерий проверки гипотез МакНемара. При оценке ранговой корреляции применялся непараметрический метод Спирмена. Различия между группами оценивались как значимые при p?0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

На начальном этапе анализа полученных результатов было установлено сочетанное изменение психологических (типологические свойства нервной системы, показатели памяти и «общих способностей»), иммунологических и функциональных параметров больных РА относительно здоровых женщин аналогичного возраста. В частности, больных характеризовало значимое снижение силы нервных процессов (р=0,001), силы возбуждения (р=0,003), подвижности возбуждения (р=0,001), общих способностей (р=0,001), кратковременной (р=0,001) и долговременной памяти (р=0,001), при этом, больным была свойственны повышенная активность первой сигнальной системы (р=0,02) и высокая инертность торможения нервной системы (р=0,001). Известно, что типологические свойства нервной системы, в частности, сила нервных процессов связана с эмоциональной сферой и вегетативной нервной системой (ВНС). Так, слабую нервную систему характеризует высокая концентрация адреналина, АКТГ и кортизола с увеличением выработки адреналина над норадреналином. В то же время, адреналин - гормон тревоги, а тревожность выше у лиц со слабой нервной системой (Ильин Е.П., 2004).

Состояние ВНС группы больных РА относительно здоровых свидетельствовало о переходе регуляции сердечного ритма (СР) с автономного на центральный контур управления и истощении мощности спектра за счет двух из трех ее составляющих (WLF, LF) в покое и при нагрузках на симпатический (СО) и парасимпатический (ПО) отделы.

Результаты сравнения иммунологических показателей больных РА и здоровых доноров согласовывались с литературными данными (Быковская С.Н., Насонов Е.Л.,2005; Moudgil KD, e.a., 2011; Herman S, e.a. 2011; Munoz-Suano A, e.a. 2011) и свидетельствовали о нарушении субпопуляционного состава Т-клеточного звена иммунной системы, количественной и функциональной активации В-лимфоцитов, а также о значимых изменениях моноцитарно-макрофагального звена иммунной системы и снижении содержания НК-клеток (CD16+) (таблица 1). Результаты анализа не только подтверждали известные ранее при РА нарушения иммунной системы, но и впервые выявили значимые изменения нервной системы на уровне параметров высшей нервной деятельности (ВНД), темперамента и активности отделов ВНС.

Таблица1

Иммунологические показатели у больных РА и здоровых женщин

Примечание: M±SD - средняя ± стандартное отклонение; р1 - t критерий Стьюдента; р2 - критерий Манн-Уитни; ИРИ - иммунорегуляторный индекс; ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы; ПАН - показатель активации нейтрофилов; ПАМ - показатель активации моноцитов;

Учитывая двойственный - аутоиммунный (Нац. рук-во, 2010; Mjaavatten M.D., e.a., 2009) и психосоматический (Александер Ф., 2002; De Brouwer SJ, e.a., 2011) генез РА, нами был проведен подробный анализ особенностей исследуемых параметров иммунной и нервной систем больных РА в зависимости от типологических свойств НС, которые, как известно, являются физиологической основой личности человека (Хьелл Л., Зиглер Д., 2006), а также были проанализированы указанные особенности от ВНД (память и «общие способности»), определяющих психическую деятельность (Николаева Е.И.,2008). Устанавливался характер корреляционных зависимостей, проводилось сравнение групп с «низкими» и «высокими» относительно медианы параметрами нервной системы, выявлялись частотные характеристики. Результаты этого анализа свидетельствовали о сопряженном изменении всех уровней ЦНС (ВНД, типологических свойств нервной системы, отделов ВНС) больного РА с иммунологическими параметрами, а также о связи клинических проявлений болезни с инерцией тормозных процессов в нервной системе. В комплексе установленные закономерности позволяют охарактеризовать состояние нервной системы больного РА как нарушение процессов адаптации. Известно, что адаптационные нарушения легко образуются при низком функциональном состоянии головного мозга (Ильин Е.П., 2004), о котором свидетельствует снижение силы возбудительных процессов у больных РА.

Важным результатом данного этапа работы являлось выявление выраженной зависимости между исследуемыми параметрами и активностью отделов ВНС, являющейся одним из основных каналов межсистемного взаимодействия. Более всего обратила на себя внимание связь между параметрами ВНД и ВНС. При сопоставлении «общих способностей» и ВНС, из 36 анализируемых параметров ВНС в 28 случаях была найдена статистически значимая зависимость, которая свидетельствовала о наличии прямых связей с показателями, характеризующими активность ПО ВНС и наличие обратных связей с параметрами характеризующими влияние симпатического отдела ВНС - (АМо) и усиление надсегментарного влияния (ИН), как в покое при фоновой записи (ФЗ), так и при функциональных нагрузках (МН, ДН).

О зависимости исследуемых параметров от ВНС свидетельствовали также результаты проведенного далее анализа активности отделов ВНС с учетом значения функциональной межполушарной асимметрии головного мозга (ФМА) у больных РА и здоровых женщин. Необходимость учета характера ФМА была обусловлена также известными фактами о детерминировании доминантным полушарием всех функций ЦНС (Moshel Y.A., e.a.2005; Byun M.S., 2009). Поэтому дальнейшим этапом работы являлось исследование особенностей иммунной и нервной систем у больных РА и здоровых женщин в зависимости от ФМА.

В результате анализа характера распределения по ФМА было установлено, что среди больных РА достоверно больше людей 3 группы с преимущественной доминантностью правого полушария относительно аналогичной группы здоровых женщин - (31% vs. 9% р<0,05). При этом, больные РА распределились следующим образом - 1 группа (правши): 29 человек (31% от общего числа больных), (средний возраст 51,3±1,3 min 33, max 67 лет), 2 группа (амбидекстры1): 36 человек (38%), (средний возраст 49±2,1 min 18, max 69 лет), 3 группа (амбидекстры2): 30 человек (31%), (средний возраст 43,4±2,5 min 20, max 68 лет) (рис1, а). По характеру ФМА группа здоровых женщин распределились следующим образом - 1 группа - 73 человека, 59% от общего числа здоровых женщин, (средний возраст 44,2±1,5 min 19, max 66); 2 группа - 39 человек (32%), (средний возраст 43,2±1,6 min 22, max 69), 3 группа - 11 человек (9%), (средний возраст 41,6±2,3 min 28, max 55) (рис1, б).

Рис 1. Количественное распределение больных РА (а) n=95 и здоровых (б) n=123 женщин по группам в зависимости от ФМА.

Общие группы больных РА и здоровых женщин не различались между собой по возрасту (48±1,2 и 43,3±0,9 соответственно; >0,05).

Таблица 2

Распределение по возрасту и длительности заболевания в группе больных РА в зависимости от ФМА

В результате выделения групп с различной ФМА, было установлено, что группы больных были сопоставимы по длительности заболевания, но значимо различались по возрасту (таблица 2). Частотный анализ не выявил достоверных различий по активности заболевания между группами больных с различной ФМА (ТМФ, р=0,07(1-3)). Отсутствие различий по активности процесса и длительности заболевания свидетельствовало о корректном формировании анализируемых групп. На этом фоне установленный факт значимых возрастных различий свидетельствовал о более раннем (в среднем на 8 лет) дебюте заболевания в третьей группе больных РА.

На следующем этапе исследования мы охарактеризовали психологические, иммунологические и функциональные показатели больных РА в зависимости от ФМА, которые свидетельствовали о том, что больные РА с различной церебральной асимметрией имели отличающиеся параметры не только нервной, но и иммунной систем (табл. 3). Обращало на себя внимание снижение памяти - важнейшего из параметров ВНД в 1 и 2 группах больных относительно 3 группы пациентов. Тем не менее, первая и вторая группы больных РА значимо различались между собой по активности ВНС. Так, если для пациентов группы 1 «правшей» с доминантным по четырем парным функциям левым полушарием характерны относительная активация парасимпатического отдела ВНС в покое и при нагрузке на СО ВНС, то пациенты второй группы «амбидекстры1» с доминантным по одному признаку правым полушарием, характеризовались относительным снижением активности парасимпатического отдела ВНС в покое и при нагрузке на СО ВНС, что также может свидетельствовать о реципрокном повышении активности СО ВНС.

Из спектра иммунологических параметров обращало на себя внимание относительное снижение содержания HLA-DR+ моноцитов со снижением уровня экспрессии данной молекулы на моноцитах больных первой группы, Кроме того, у первой группы выявлен высокий уровень ЦИК. Для второй группы также характерна активация гуморального звена иммунной системы: накопление низкомолекулярных ЦИК и антител к ДНК. В отличие от первой группы, для пациентов второй установлено относительное повышение пролактина, гормона, как известно, связанного со стрессом, что в сочетании со снижением тормозных процессов в нервной системе косвенно свидетельствует о высокой тревожности. Пациенты третьей группы «амбидекстры 2» с преимущественно доминантным правым полушарием характеризовались сбалансированным состоянием отделов ВНС и тормозных процессов в нервной системе, что сочеталось с высокими параметрами ВНД. Кроме того, третью группу пациентов отличало относительно низкое содержание ЦИК и антител к ДНК. Для 3 группы, как и для 2, было характерно повышение HLA-DR+ моноцитов, а также самый высокий уровень экспрессии HLA-DR молекулы.

Таблица 3

Психологические, иммунологические и функциональные показатели у больных РА в зависимости от ФМА

Примечание:M±SD; группа1 - «правши»; группа2 - «амбидекстры1»; группа3 - «амбидекстры2»; О.м.м. - относительная молекулярная масса ЦИК; ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы; ФЗ - фоновая запись; МН - ментальная нагрузка;

При сравнении групп здоровых женщин было установлено, что 3 группа (амбидекстры 2), с преимущественно доминирующим правым полушарием характеризовалась самыми высокими параметрами VLF как в покое (ФЗ) так и при нагрузках на СО и ПО ВНС. Полученный результат может свидетельствовать: во-первых, о более высоком уровне основного обмена, терморегуляции, эрготропных функций, активности гуморально-метаболических влияний на ритм сердца и, во-вторых, о переходе регуляции сердечного ритма на более низкий гуморально-метаболический уровень у здоровых людей старшего возраста, что подтверждало известные данные (Михайлов В.М., 2000). Следует отметить, что третья группа больных РА не отличалась от 3 группы здоровых женщин по параметрам ВНС в покое и при ДН, что свидетельствует о высоком уровне гуморально-метаболического обеспечения ВНС в этой группе.

Важным результатом этого этапа анализа являлось выявление факта большей частоты встречаемости людей с преимущественно доминантным правым полушарием, относящихся к 3 группе, среди больных РА. Известно, что дебют РА, а также обострения заболевания часто связывают со стрессом (Курыгин А.Г., Урываев В.А. 2006; Курыгин А.Г., Михайлов В.П., 2006; Michael R. Irwin, Mary Davis, Alex Zautra, 2008). По нашему мнению, негативная окраска эмоций, характерная для правого полушария, и его тесная связь с лимбической системой (Леутин В.П., и др..1988; 2005), снижают толерантность к стрессу у людей с доминантным правым полушарием, что, возможно, является решающим фактором в более раннем дебюте заболевания у пациентов с предрасположенность к заболеванию.

Результаты проведенного анализа свидетельствовали также, что как больные РА, так и здоровые женщины имеют особенности параметров иммунной и нервной систем, зависящие от ФМА и характер этих особенностей в группах больных и здоровых людей различен.

Следующим этапом работы было сравнение исследуемых параметров групп больных РА и здоровых женщин с одинаковой ФМА между собой. Все группы больных РА достоверно не различались от «своих» групп здоровых женщин по возрасту. В том числе и группы больных и здоровых «правшей» (51,3±1,3 и 44,2±1,5 соответственно; р = 0,09). При исследовании психологических показателей, включающих параметры памяти, «общих способностей» и характеристики типологических свойств нервной системы, были выявлены общие закономерности, характерные для всех групп (правши, амбидекстры1, амбидекстры2) больных. Так, во всех группах наблюдается снижение силы нервных процессов и общих способностей по сравнению с аналогичными группами доноров. 1 и 2 группа отличались снижением силы и подвижности возбуждения, а также показателей кратковременной и долговременной памяти. В 3 группе отмечается повышение активности 1 и 2 сигнальных систем и инертности торможения.

Наибольшее количество различий по иммунологическим показателям между больными РА и здоровыми донорами аналогичной группы выявлено в группах женщин с доминированием левого полушария (правшей): у больных РА 1 группы, в сравнении с 1 группой здоровых женщин, отмечалось увеличение образования активных форм кислорода нейтрофилами (ПАН), при этом уровень гранулоцитарного фагоцитоза был снижен. При оценке состава клеточных субпопуляций обнаружено снижение относительного содержания CD8+ Т-лимфоцитов и соответствующее повышение соотношения CD4+/CD8+ (ИРИ). Также в 1 группе больных РА установлено снижение экспрессии HLA-DR и повышение содержания ЦИК.

В группе 2 больных РА обнаружено снижение относительного содержания CD16+ НК-клеток, а также более высокий уровень JgA и ЦИК по сравнению с аналогичной группой здоровых женщин.

В группе 3 больных РА относительно здоровых женщин 3 группы на данном этапе анализа по исследуемым параметрам иммунной системы статистически значимых различий обнаружено не было.

При сравнительном анализе параметров активности отделов ВНС больных РА и здоровых людей, относящихся к одной группе ФМА, определено снижение тотальной мощности спектра (за счет VLF и LF ) при фоновой записи (группа 1 и группа 2) и при ментальной нагрузке (группа 2 и группа 3). Определено снижение временных показателей ПО ВНС - SDNN и RMSSD в покое в группе 1, SDNN и RMSSD в группе 2 при нагрузках и в покое, а также SDNN при ментальной нагрузке в группе 3. Изменений спектральных характеристик ПО ВНС (HF) не обнаружено ни в одной из исследуемых групп, возможно, в связи с низкими показателями этой составляющей спектра у здоровых людей старшего возраста. Кроме того, для больных РА было характерно повышение ИН при фоновой записи (группа 2) и при дыхательной нагрузке (группа 1).

Подводя итог по данному разделу анализа, можно сказать, что больные РА отличаются от здоровых людей с аналогичной ФМА снижением активности всех составляющих сердечного ритма - гуморально-метаболической, активности симпатического и парасимпатического отделов и о переходе управления СР в первой и второй группах с автономного на центральный тип, что свидетельствует о снижении адаптационных возможностей ВНС.

Таким образом, были установлены значимые различия психологических, иммунологических и функциональных параметров между больными РА и здоровыми женщинами, имеющими аналогичную ФМА. Особенности этих различий определяются характером функциональной межполушарной асимметрии. Следующим этапом работы являлось определение особенностей пролиферации и дифференцировки Т - лимфоцитов больных РА с различной ФМА.

Известно, что активация лимфоцитов является необходимым условием иммунного ответа, процессом, на котором базируются практически все иммунологические реакции. Одним из самых ранних маркеров активации, определяющих направление внутриклеточной сигнализации, является экспрессия корецептора Т- клеток CD28 (Andrew P. Fontenot, Laia Ghavari, Sean R. Bennet et al.2003). При исследовании содержания CD4+ и CD8+ - лимфоцитов, несущих маркеры активации, у пациентов больных РА с различной церебральной асимметрией установлены значимые различия между первой и третьей группами. При этом, для пациентов третьей группы характерно увеличение содержания CD8+ - Т - лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD28 (р=0,03) без повышения экспрессии поздних маркеров, поскольку в этой группе установлено относительное повышение содержания клеток, негативных по содержанию CD25+- лимфоцитов (р=0,044). При сравнении групп пациентов относительно здоровых женщин с аналогичной ФМА установлено значимое повышение содержания CD4+25+ лимфоцитов в первой группе пациентов и снижения CD3+4-8+ лимфоцитов в третьей группе больных РА (таблица 4). Дефицит CD8+ лимфоцитов в 3 группе, возможно, связан с установленным нарушением экспрессии поздних маркеров.

Вторая группа больных относительно здоровых женщин с аналогичной ФМА, характеризовалась значимыми различиями как CD4+, так и CD8+ лимфоцитов. При этом, в популяции CD4+ установлено повышение лимфоцитов, не несущих маркеры активации и значимое снижение клеток, экспрессирующих DR - молекулу, в то время как в популяции CD8+ -лимфоцитов выявлен дефицит как активированный, так и неактивированных Т - лимфоцитов.

Таблица 4

Активационные маркеры Т-лимфоцитов больных РА и здоровых женщин в зависимости от ФМА

Примечания: M±m;

Учитывая ключевую роль Т- лимфоцитов в патогенезе аутоиммунного заболевания на следующем этапе работы исследовались параметры пролиферации, определенной по фазам клеточного цикла и апоптоза различных субпопуляций CD4+ и CD8+ лимфоцитов больных РА с различной ФМА (таблица 5). Было установлено самое низкое содержание CD4+ клеток памяти (CD4+CD45RO+) и самый высокий уровень апоптоза указанной популяции клеток в третьей группе пациентов с преимущественно доминантным правым полушарием относительно других групп больных.

Таблица 5

Параметры фаз клеточного цикла и апоптоза больных РА с различной ФМА

Примечание: M±m;

В то же время, первая группа пациентов с доминантным левым полушарием, имела самое низкое содержание «наивных» CD8+CD45RA+ лимфоцитов и самый высокий уровень апоптоза во всей CD8+ популяции лимфоцитов.

В отличие от групп здоровых с аналогичной доминантностью (таблица 6), в первой группе выявился дефицит CD8+ и тенденция к активации CD4+, а в третьей группе - к снижению CD4+ клеток «памяти» и тенденция к активации CD8+ «наивных» Т- лимфоцитов. Для второй группы больных РА было характерно умеренное снижение CD8+CD45RO+ и значимое снижение апоптоза CD8+CD45RA+ - популяции Т- клеток.

Статистически значимых различий по показателям клеточного цикла и апоптоза между группами здоровых женщин с различной ФМА, обнаружено не было. Тем не менее, как и у больных РА (на уровне тенденции) в 1 группе здоровых женщин выявлено повышение содержания CD8+CD45RA+ в SM фазе и соответствующее снижение клеток в G1G0 фазе клеточного цикла. При сравнении показателей фаз клеточного цикла и апоптоза больных РА относительно здоровых женщин выявлено не зависящее от функциональной асимметрии снижение CD8+CD45RO+ лимфоцитов во всех исследуемых группах (таблица 6). Указанное снижение возможно обусловлено высокой плотностью в2-адренорецепторов на данной популяции клеток у лиц со стрессом, вызванным системной патологией (Elenkov Ilia J.,e.a. 2000). Степень дефицита CD8+CD45RO+ лимфоцитов в группах была различной. Так, в группе 1 больных РА было снижено общее содержание CD8+ лимфоцитов относительно первой группы здоровых женщин с аналогичной ФМА. Группа 2 больных РА, в отличие от здоровых женщин 2 группы, характеризовалась значимым снижением уровня апоптоза указанной популяции. Третья группа пациенток с преимущественно доминантным правым полушарием, в отличие от здоровых женщин 3 группы, характеризовалась выраженной тенденцией к повышению содержания CD8+CD45RA+ лимфоцитов.

Таблица 6

Сравнительная характеристика показателей клеточного цикла и апоптоза у больных РА и здоровых женщин с различной ФМА

Примечания: M±m;

Рис 2. Влияние ацетилхолина (1·10-7M) и адреналина (1·10-7M) на содержание CD8+ лимфоцитов, находящихся в SM фазе клеточного цикла в периферической крови здоровых женщин; p=0.036 группа 1 (контроль - ad(1·10-7M);

Поскольку больные РА с различной ФМА значимо различались между собой и здоровыми женщинами не только по параметрам Т- клеточного звена иммунной системы, но и по показателям активности отделов ВНС, на следующем этапе работы определялся характер влияния нейромедиатора ПО ВНС ацетилхолина (1·10-7M) и нейромедиатора СО ВНС, а также гормона адреналина (1·10-7M) на фазы клеточного цикла и апоптоз CD4+ и CD8+ - лимфоциты больных и здоровых женщин in vitro. Было установлено, что после суточной инкубации в полной культуральной среде (ПКС), лимфоциты здоровых людей без нейромедиаторов (в контроле) и в опыте (с добавлением физиологических концентраций ацетилхолина (ах) или адреналина (ad)) не различались по параметрам апоптоза между группами с различной ФМА. Между указанными группами здоровых людей были определены различия по содержанию CD8+ лимфоцитов, находящихся SM фазе, инкубированных с адреналином, в частности, увеличение показателя в группе 3.

Увеличение, тем не менее, являлось относительным (рис.2), поскольку при анализе зависимых групп, этот показатель в третьей группе под воздействием адреналина достоверно не изменился, в то время как, в первой группе было установлено снижение относительного содержания CD8+ лимфоцитов в SM фазе под влиянием адреналина.

При определении характера влияния нейромедиатора и гормона на фазы клеточного цикла и апоптоз Т - лимфоцитов больных РА были установлены значимые различия по показателям апоптоза CD4+- лимфоцитов. В частности, в контроле после суточной инкубации клеток в ПКС между группами больных с различной ФМА, в то время как инкубация этой клеточной популяции в присутствии ацетилхолина и адреналина, указанные различия нивелировала (таблица 7).

Различия по уровню апоптоза CD8+ лимфоцитов под влиянием адреналина между первой и третьей группой были установлены на уровне тенденций (0,69±0,3 vs. 0,33±0,11,соответственно; р=0,08), а достоверные различия по уровню апоптоза CD8+ лимфоцитов были определены под воздействием ацетилхолина, также с увеличением этого показателя в первой группе относительно третьей (0,52±0,15 vs. 0,25±0,07; р=0,051). В то время как, в контроле уровень апоптоза CD8+ - лимфоцитов между группами больных не имел достоверных различий. Из полученных нами in vitro результатов наибольший интерес вызывает факт повышения уровня апоптоза CD8+ клеток под влиянием физиологических доз ацетилхолина у больных РА первой группы и повышения апоптоза CD4+ клеток под влиянием ацетилхолина и адреналина без увеличения уровня пролиферативной активности этих клеток у пациентов второй и третьей групп.