Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.07 - микробиология

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ-СИНБИОТИКОВ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

Амерханова Аделаида Михайловна

МОСКВА - 2009



Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Алешкин Владимир Андрианович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Бондаренко Виктор Михайлович

доктор биологических наук, профессор Осипова Ирина Григорьевна

доктор биологических наук Лахтин Владимир Михайлович

Ведущая организация:

Российский Государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «___» ____________2009 г. в ______час. на заседании диссертационного Совета Д 208.046.01 в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан «____» ___________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук С. Ю. Комбарова



ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время становится реальностью нависшая над планетой угроза глобального экологического кризиса, существование в условиях которого приводит к развитию нарушений микробной экологии человека, сопровождающихся возникновением иммунодефицитных состояний, нарушением метаболических процессов и аллергизацией макроорганизма.

Наиболее восприимчивым к этим воздействиям является микробиоценоз кишечника, который реагирует на неблагоприятные факторы задолго до клинических проявлений снижением уровня индигенной микрофлоры и возрастанием содержания условно-патогенных микроорганизмов, т.е. состоянием дисбаланса микрофлоры - дисбиозом (Куваева И.Б., 1991, Пинегин Б.В., 1984, Воробьев А.А.,1997, Шендеров Б.А, 1998, Коршунов В.М., 2000, Eckburg P.B., 2005, Бондаренко В.М., 2007). Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз. Ведущее место среди них принадлежит препаратам на основе микроорганизмов - представителей нормофлоры, что обусловлено их многофункциональным воздействием, включая нормализацию микробиоценоза, иммунного и метаболитного статуса организма, процессов электролитного обмена и т.д. (Поспелова В.В., 2000, Онищенко Г.Г., 2002, Воробьев А.А., 2004, Грачева Н.М., 2004, Мазанкова Л.Н., 2004, Новокшенов А.А., Учайкин В.Ф., 2004, Кафарская Л.И., 2005, Осипова И.Г., 2006, Парфенов А.И., 2006, Бондаренко В.М., 2007, Феклисова Л.В., 2007 г., Лахтин В.М., 2008, Callaway T.R, 2008, Fotiadis C.I, 2008, Francavilla R.,2008, Myllyoma E., 2008).

В связи с широкой распространенностью дисбиотических состояний важное научное и прикладное значение имеет установление закономерностей, связанных с процессами формирования и стабилизации нормобиоценоза, причин, вызывающих его нарушения. Вместе с тем, в настоящее время наши представления об индигенной микрофлоре в полной мере не отражают как всего многообразия отношений внутри микробного сообщества биотопа, так и его взаимосвязей с макроорганизмом.

Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише (Сукачев В.Н., 1964, Бигон М., Харпер Дж., 1989, Рыбальченко О.В., 2008). В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии (Разумовский С.М., 1999). Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающего с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен (Гончарова Г.И., 1982; Козлова Э.П., 1986, Леванова Л.А., 2003, Rambaud J.C. et al., 2006, Лахтин В.М., 2008).

Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология и пр. могут нарушить естественный ход развития микробиоценоза (Соколова К.Я., 1999, Мухина Ю.Г., 2005, Кафарская Л.И., 2006, Smehilova, 2008). Становление микробиоценоза ЖКТ в младенческом возрасте во многом определяет физиологический и иммунный статус организма в будущем, поэтому нарушения в ходе этого процесса требуют коррекции. Конструирование препаратов, представляющих собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу ЖКТ человека в определенный возрастной период, является обоснованным подходом к решению данной актуальной проблемы.

Усиление эффекта применяемых средств можно прогнозировать также от сочетанного использования рационально подобранного состава пробиотических микроорганизмов, пребиотиков и функционально активных ингредиентов, дефицит которых является следствием дисбиоза (Gibson G.R., 1995, Тутельян В.А., 2002, Лахтин В.М., 2008, Шендеров Б.А., 2008). Такие препараты относятся к группе синбиотиков (Collins M.D., 1999). Данное перспективное направление также открыто для дальнейших исследований.

Таким образом, выбор темы настоящего исследования определяется актуальностью разработки высокоэффективных средств нового поколения для коррекции микроэкологических нарушений у детей и взрослых.

Цель исследования

Научное обоснование, биотехнологическая разработка и клинико-лабораторное подтверждение эффективности новых подходов к коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ с помощью препаратов-синбиотиков на основе консорциумов бифидобактерий, комплементарных микробиоценозу различных возрастных групп людей, лактобацилл, пребиотиков и функционально значимых ингредиентов, дефицит которых возникает при дисбиозе.

Задачи исследования:

1. Изучить биологические, культуральные, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики штаммов бифидобактерий, оценить их производственную перспективность и отобрать виды, которые относятся к основным представителям бифидофлоры ЖКТ человека.

2. Разработать условия совместного культивирования биомассы бифидобактерий, имеющей многовидовой состав.

3. Оптимизировать методы обезвоживания биомассы бифидобактерий и лактобацилл - распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое.

4. Изучить пребиотические и технологические свойства различных растворимых пищевых волокон и оценить перспективность их включения в состав препаратов-синбиотиков.

5. Разработать рецептуру, технологическую документацию, изготовить экспериментально-производственные серии препаратов-синбиотиков. Оценить микробиологические, санитарно-гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов препаратов при хранения. Осуществить их санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.

6. Изучить эффективность и безопасность разработанных препаратов при использовании в практике профилактической и восстановительной медицины у людей, относящихся к различным возрастным категориям людей. бифидобактерия синбиотик культуральный биомасса

Научная новизна

Впервые предложен алгоритм рецептуростроения препаратов нормофлоры, основанный на принципе видового доминирования бифидобактерий в ЖКТ у различных возрастных групп людей (Патенты РФ 2180348, 2180914, 2180915). Разработаны биотехнологические приемы конструирования препаратов-синбиотиков нового поколения «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» на основе консорциумов бифидобактерий, лактобацилл и ингредиентов, обладающих иммуностимулирующим, метаболическим и пребиотическим действием.

Теоретическая значимость

Выявленная в научных исследованиях смена видового состава бифидо-флоры в процессе онтогенеза явилась теоретическим обоснованием нового подхода к конструированию и применению средств коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ - использованию консорциумов микроорганизмов нормофлоры, видовой состав которых моделирует сукцессионные ряды, меняющиеся в течение жизни человека. Это обеспечивает их комплементарность микробиоценозам ЖКТ конкретных возрастных групп пациентов и обеспечивает высокую эффективность при применении.

Практическая значимость

Разработаны и внедрены в практику новые оригинальные препараты-синбиотики, высокоэффективные при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ и дифференцированно подобранные для различных возрастных групп людей. Разработаны новые биотехнологические приемы совместного культивирования консорциумов бифидобактерий. Разработаны методы распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое для получения препаратов с высоким содержанием пробиотических микроорганизмов, длительно сохраняющих жизнеспособность. Подтверждена пребиотическая активность ингредиентов - источников пищевых волокон (порошок клубней топинамбура, цикория, яблочного пектина) и показана их технологическая значимость для увеличения сроков и температурного диапазона хранения препаратов.

Проведенные исследования и разработанные на их основе рецептурный состав, санитарно-гигиенические документы и производственные регламенты позволили обеспечить прохождение процедуры независимой экспертизы продукции и документации и государственной регистрации Федеральной службой Роспотребнадзора с внесением в Государственный реестр биологически активных добавок к пище:

1. «Бифидум-Мульти-1» для детей от рождения до 3-х лет -

СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000085.10.05.

2. «Бифидум-Мульти-2» для детей от 3-х до 12-ти лет -

СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000086.10.05.

3. «Бифидум-Мульти-3» для взрослых - СЭЗ № 77.99.03.919.Б.000087.10.05 ( ТУ 9197-003-38989935-03, изменения к ТУ 9197-003-38989935-03 № 1.

4. «Нормоспектрум для детей» - СГР № 77.99.23.3.У.10079.9.05

5. «Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14-ти лет» - СГР № 77.99.23.3.У.10080.9.05 - ( ТУ 9197-004-38989935-05)

Впервые организовано производство и начат серийный выпуск перечисленных препаратов на предприятии биотехнологического профиля «Амфита».

Внедрение в практику

Разработанные препараты используются с профилактической целью и для реабилитации пациентов в следующих учреждениях:

1. «Бифидум-Мульти-1» в ГУ « Федеральное агентство высокотехнологичной медицинской помощи Научный Центр Акушерства, гинекологии и перинатологии» с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций у новорожденных группы риска.

2. «Бифидум-Мульти-1» в условиях детской консультации для профилактики микроэкологических и функциональных нарушений ЖКТ у детей первых 18 месяцев жизни.

3. «Бифидум-Мульти-1» в условиях стационара НИИ детской гастроэнтерологии (г. Нижний Новгород) у детей с нарушениями пищеварения и микрофлоры кишечника.

4. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в аллергологическом Центре КНИИЭМ (г.Казань) у детей с аллергодерматозами.

5. «Бифидум-Мульти-2» и «Нормоспектрум для детей» для профилактики острых респираторных заболеваний у часто болеющих детей, посещающих детские дошкольные учреждения.

6. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микрофлоры и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

7. «Нормоспектрум для детей» и «Нормоспектрум для взрослых» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микроэкологии и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

8. «Бифидум-Мульти-1,2» в Оренбургской государственной медицинской академии в комплексной схеме восстановления микрофлоры у девочек с неспецифическими вульвовагинитами.

9. «Нормоспектрум для взрослых» в Федеральном агентстве «НИИ иммунологии» для коррекции дисбиотических нарушений у больных после перенесенных аллергических заболеваний (г. Москва).

10. «Нормоспектрум для взрослых» на кафедре гастроэнтерологии ФГУ «УНМЦ» Управления делами Президента РФ для коррекции микрофлоры ЖКТ у пациентов с функциональными заболеваниями кишечника (синдром раздраженного кишечника, функциональный запор) с синдромом дисбактериоза.

11. «Нормоспектрум для взрослых» в клинической онкологической больнице № 62 (г. Москва) для профилактики ГГСИ у больных, оперированных по поводу колоректального рака.

12. «Нормоспектрум для взрослых» в Астраханской государственной медицинской академии дл восстановления микрофлоты ЖКТ у больных язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, гастродуоденита после проведения специфической антихеликобактериальной терапии.

Анализ результатов данных исследований приведен в клинических отзывах, актах внедрения, актах клинических наблюдений.

Награды за разработку и внедрение:

Получены: знак РОСТЕСТ ГОССТАНДАРТА РОССИИ - За высокое качество с правом маркировки продукции «ЗНАКОМ КАЧЕСТВА «ВСЕ ЛУЧШЕЕ ЗДОРОВЬЮ»; золотая медаль ВВЦ, 2002 г.; золотая медаль им. И.И.Мечникова Российской Академии естественных наук «За практический вклад в укрепление здоровья нации» - 2003 г.; серебряная медаль III Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2003 г.; серебряная медаль Всероссийского научно-промышленного форума «Россия-единая - 2003»; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2004 г.; бронзовая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2006 г.; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2008 г.; медаль Международного фонда биотехнологий им. академика И.Н.Блохиной за участие в конкурсе «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека».

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 24 января 2008 г.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: Международная научно-практическая конференция «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), Всероссийский симпозиум «Современные аспекты здорового образа жизни» (Москва, 2003), Всероссийский форум «Великие реки» в рамках конкурса «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека» (Нижний Новгород, 2003), Международная конференция «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2003), 7-ой Международный Конгресс «Здоровое питание» (Москва, 2003), Международная научно-практическая конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), 6-ая Международная ассамблея «Новые медицинские технологии» (Москва, 2006), Международный конгресс «Новые технологии в детском питании» (Москва, 2006), Международный научно-практический конгресс «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация» (Москва, 2006), Международный симпозиум «Иммунобиологические препараты в педиатрии» (Москва, 2006), Всероссийская конференция детских инфекционистов (Санкт-Петербург, 2006), Международный конгресс «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические проблемы» (Санкт-Петербург, 2007), Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008, 2009), Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).

Положения, выносимые на защиту

1. Отбор видов бифидобактерий по признаку доминирования в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей представляет собой новый концептуальный подход к конструированию препаратов для коррекции микрофлоры кишечника.

2. Устойчивые консорциумы - продукт совместного культивирования симбиотической ассоциации технологичных и высокоэффективных видов бифидобактерий являются основой для получения препаратов нового поколения.

3. Распылительная сушка при низкой температуре теплоносителя и сушка-гранулирование в псевдоожиженном слое перспективны для получения высокоактивных препаратов на основе пробиотических микроорганизмов длительного хранения в широком диапазоне температур.

4. Новый концептуальный подход в разработке и принципе рецептуростроения оригинальных препаратов-синбиотиков «Бифидум-мульти» и «Нормоспектрум».

5. Преимущества по клинико-лабораторным показателям синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» при использовании в профилактической и восстановительной медицине у разных возрастных групп пациентов по сравнению с аналогичными препаратами моновидового состава.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 64 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ -8, в других изданиях - 45, в патентах на изобретение - 11.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 416 наименований, в том числе, 208 зарубежных и 208 отечественных работ. Диссертация изложена на 280 страницах основного текста, содержит 31 рисунок и 79 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы, объем проведенных исследований Исследования проведены в 2000-2008 годах в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИЭМ им. Г. Н. Габричевского в рамках НИР (Рег. номер 01.2.006 08847 ).

Объектами исследований служили культуры бифидобактерий и лактобацилл, в т.ч.: из международных коллекций -13; из отечественных коллекций - 40. В ходе работы было выделено и идентифицировано 270 культур бифидобактерий и лактобацилл, из них 40 идентифицировано до вида, 230 - до рода.

Исследования проводились как традиционными методиками, разработанными в лаборатории биологии бифидобактерий (Гончарова Г.И., 1968, Лянная А.М., 1981), так и с помощью модифицированных и современных методов исследования (Жиленкова О.Г., 2004, Воронина О.Л., 2008).

Для исследования антибиотикочувствительности был применен модифицированный диско-диффузионный метод на основе МУК 4.2.1890-04 «Методические рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» и рекомендаций Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов, NCCL, 2002 г., США. Использовали диски с антибиотиками производства НИИ ЭМ (Россия, Санкт-Петербург).

Таксономию изолятов устанавливали по морфологическим, культуральным, физиологическим и ферментативным свойствам. Для изучения спектра биохимической активности культур применялись коммерческие тест-системы: API-20CHL и API-50CHL (bioMerieux, Франция) и АНАЭРОтест 23 (PLIDA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия).

Видовая идентификация бифидобактерий проводилась молекулярно-биологическими методами, разработанными группой исследователей под руководством к.б.н. Ворониной О.Л. и к.б.н. Лунина В.Г. (ИНБИ РАН им.А.Н.Баха, ВНИИСБ РАСХН).

Параметры распылительной сушки при низкой температуре теплоносителя изучали на полупромышленной установке «Мобильный Минор», модернизированной для целей данной работы сотрудниками ОАО Биохиммаш к.т.н. Астафьевым Е.И. и к.т.н. Коноваловым Н.А.

Изучение параметров сушки в псевдоожиженном слое проводилось на лабораторной установке, сконструированной сотрудниками ЦКБ «Боеприпасы» к.т.н. Шереметом А.П. и к.т.н. Островским В.Г.

В ходе исследований было изготовлено 143 образца биомассы, высушенной распылительным методом и 117 образцов биомассы, обезвоженной сушкой-гранулированием в псевдоожиженном слое. 112 образцов биомассы в качестве контрольной было высушено сублимационным методом.

Для изучения динамики культивирования - как монокультур, так и культур многовидового состава - произведено 360 образцов КЖ на средах различного состава. В работе применяли стандартные лабораторные и производственные питательные среды, используемые для культивирования, селекции и контроля бифидобактерий и лактобацилл и разработанные нами оригинальные среды на основе растительного сырья (Патент РФ № 2214454).

Содержание жизнеспособных микроорганизмов в образцах определяли методом посева и последующего инкубирования десятикратных разведений КЖ и образцов сухой биомассы и готовых препаратов в полужидких средах.

В ходе подготовки к экспертизе и государственной регистрации изготовлено 36 экспериментально-производственных серий препаратов, изучены их санитарно-гигиенические, микробиологические и технологические параметры, определены сроки и условия хранения.

Исследования в области экспериментальной медицины, направленные на изучение профилактического действия разработанных БАД, проводились на следующих группах:

- больные в стационарах инфекционного и гастроэнтерологического профиля - 125 человек в возрасте старше 18-ти лет; дети от 4 до 6 лет в детских дошкольных учреждениях - 98 человек; дети от 3 месяцев до 14 лет в стационарах гастроэнтерологического и инфекционного профиля - 164 человека; новорожденные в отделении перинатологии - 61 человек; онкологические больные - 200 человек.

Проведение данных исследований и анализ полученных результатов осуществлялись на базе КИБ №1 г. Москвы совместно с сотрудниками клинического отдела МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под руководством д.м.н., заслуженного деятеля науки, профессора Грачевой Н.М.; на базе обсервационного детского отделения ГУ НЦ АГиП РАМН совместно с зав.отделением. д.м.н., профессором Пономаревой Л.П., к.м.н. Бондарь О.Е., зав. лабораторией микробиологии ,д.м.н., профессором Анкирской А.С.; в детских дошкольных учреждениях под руководством зав.отделением детских инфекций МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, д.м.н., профессором Феклисовой Л.В. и к.м.н. Мескиной Е.Р.; на базе хирургического стационара 62-ой клинической онкологической больницы совместно с руководителем кабинета клинической фармакологии, д.м.н., профессором Митрохиным С.Д.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием методов вариационной и описательной статистики; для оценки достоверности различий между показателями использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение и отбор производственно-перспективных видов бифидобактерий

Задачей данного раздела работы был отбор штаммов бифидобактерий по признаку видового доминирования в микробиоценозе различных возрастных групп людей. Согласно данным исследований 60-80 гг., основными представителями бифидофлоры ЖКТ человека являются B.bifidum, B.longum, B.infantis, B.breve, B.adolescentis (Reuter G., 1963), видовое присутствие и долевое участие которых, вместе с тем, меняется в процессе онтогенеза (Рис.1).

Виды B. bifidum и B. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп; вид B.adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды B.infantis и B. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста (Biavati B., 1984, Козлова Э.П., 1986), при этом вид B.infantis данные исследователи относили к преобладающему, а значит, наиболее значимому для организма в этот возрастной период.

Исследования, проведенные в последнее десятилетие, благодаря открытию высокочувствительных молекулярно-биологических методов, существенно расширили знания в области видового разнообразия бифидобактерий (Satokari R.M., 2000, Reuter G., 2001, Ефимов Б.А., 2005, Шкопоров А.Н., 2007 и др.). Открыто уже 43 вида бифидобактерий (Okamoto M, 2008), но состав видов, являющихся доминантными в ЖКТ человека, по данным ряда авторов (Matsuki T., 2004, Бондаренко В.М., 2007) не меняется. При этом, результаты ряда исследований приводят к заключению о влиянии неблагоприятной экологии, отсутствия грудного вскармливания и широкого применения заменителей грудного молока в развитых странах на процесс онтогенеза в младенческий период, в том числе, на становление нормофлоры ЖКТ.

Рис. 1. Видовой состав бифидофлоры у людей разных возрастных групп (по данным Гончаровой Г.И., 1986 )

Так, в ряде европейских странах у обследованных детей отмечалось полное отсутствие вида B.infantis. На этом фоне у детей республики Гана, где в силу экономических причин дети находятся только на грудном вскармливании, бифидобактерии этого вида выделялись в 72% (Young S.L., 2004).

У искусственно вскармливаемых младенцев отмечается пролиферация видов B.adolescentis и B.animalis, нехарактерных для детей этого возраста (Козлова Э.П., 1986, Mah K.W., 2007, Smehilova M., 2008), т.е. идет формированию другого сукцессионного ряда. Таким образом, закономерное формирование микробиоценоза ЖКТ младенца определяется присутствием доминантных видов бифидобактерий (Ventura M., 2007). В связи с представленными данными совершенно очевидно, что для выполнения поставленной задачи - конструирования препаратов, предназначенных для разных возрастных групп людей, видовой спектр бифидобактерий должен быть представлен доминантными видами бифидобактерий B.bifidum, B.longum, B.infantis, B.breve, B.adolescentis, как наиболее физиологичными для организма человека в разные периоды жизни. С этой целью были отобраны штаммы, относящиеся к вышеперечисленным видам; для сравнения использовали типовые штаммы из международных коллекций.

Для выбора высокоэффективных и технологичных культур были изучены 24 культуры бифидобактерий, изучены их морфологические, физиолого-биохимические, культуральные, антагонистические свойства, определен спектр чувствительности к 15 антибиотикам, относящимся к 7 группам антибактериальных препаратов, определена безвредность на лабораторных животных. В результате проведенных исследований отобрано 11 производственно-перспективных штаммов.

Предварительная видовая идентификация в наших исследованиях основывалась на микробиологических и биохимических тестах. Однако неоднозначность результатов, трудоемкость данных методов стимулировали поиск иных подходов для решения поставленных задач.

Анализ литературы показал, что типирование на основе секвенирования одной и более мишеней в геноме бифидобактерий позволяет провести видовую идентификацию штаммов и дифференцировать виды (Новикова Н.А., Соколова К.Я., 2004, Шкопоров, 2006, Бондаренко В.М., 2006, Gill S. R., 2006, Kazuyoshi N, 2008, Namba K., 2008 и др.). В настоящей работе видовую принадлежность штаммов определяли на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal). Результаты представлены в табл. 1.



Таблица 1 - Видовая идентификация выборки коллекционных штаммов бифидобактерий

№	Штамм бифидобактерий	Видовая идентификация по:
		фенотипическим признакам	гену 16S рРНК	Гену tal
1.	ГКНМ: ГО-13	B. adolescentis	B. adolescentis	B. adolescentis
2.	ГКНМ: Г 75-13	B. adolescentis	B. longum/ infantis	B. longum
3.	ГКНМ: МС-42	B. adolescentis	B. longum/ infantis	B. breve
4.	ГКНМ: 40	B. adolescentis	B. adolescentis	B. animalis
5.	ГКНМ: 536	B. bifidum	B. bifidum	bifidum
6.	ГКНМ: 791	B. bifidum	B. bifidum	bifidum
7.	ГКНМ: 35	B. bifidum	B. bifidum	B. breve
8.	ГКНМ: ЛВА-3	B. bifidum	B. bifidum	B. breve
9.	ГКНМ: 1	B. bifidum	B. bifidum	B. bifidum clone 1
				B. breve clone 2
10.	ГКНМ:79-119	B. breve	B. breve	B. breve
11.	ГКНМ:79-88	B. breve	B. breve	B. breve
12.	ГКНМ: 23	B. breve	B. breve	B. animalis
13.	ГКНМ: 73-15	B. infantis	B. longum/ infantis	B. infantis
14.	ГКНМ: 11-45	B. infantis	B. longum/ infantis	B. infantis
15.	ГКНМ: 302-87	B. infantis	B. longum/ infantis	B. animalis
16.	ГКНМ: B379M	B. longum	B. longum/ infantis	B. longum
17.	ГКНМ: 46	B. longum	B. longum/ infantis	B. infantis
18.	ГКНМ: Я-3	B. longum	B. longum/ infantis	B. adolescentis
19.	ГКНМ: 8	B. longum	B. longum/ infantis	B. breve clone 1
				B. animalis clone 2

* Полужирным шрифтом выделены штаммы, идентифицированные одинаково по результатам секвенирования и по фенотипическим признакам

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что различить виды B. longum и B. infantis позволяет только анализ второй мишени, фрагмента гена трансальдолазы. Результаты генотипирования и фенотипической идентификации совпали для восьми штаммов. В таблице они выделены полужирным шрифтом.

Штаммы ГКНМ: Г75-13 и ГКНМ: 46 идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам.

Штаммы ГКНМ: МС-42, ГКНМ: 40, ГКНМ: 35, ГКНМ: ЛВА-3, ГКНМ: 23, ГКНМ: 302-87 и ГКНМ: Я-3 оказались природными рекомбинантами. Штаммы ГКНМ: 1 и ГКНМ: 8 - генетически неоднородные.

Проведенный анализ позволяет сделать вывод, что генотипирование по фрагменту 16S рРНК не различает все виды бифидобактерий. Таким образом, предложенный подход - анализ штаммов бифидобактерий и по фрагменту гена трансальдолазы дает более полное представление об их видовых различиях.

Уточненные данные видовой принадлежности позволили провести отбор производственно-перспективных штаммов по признаку видового доминирования в микробиоценозе разных возрастных групп для дальнейших исследований в направлении конструирования ассоциаций бифидобактерий - как основы для препаратов целевого назначения.

2. Изучение динамики глубинного культивирования бифидобактерий в монокультурах и в составе смешанной культуры

2.1 Культивирование монокультур бифидобактерий

В настоящее время в промышленном масштабе производится биомасса только трех штаммов - видов B.bifidum 1 и B.bifidum 791 для фармацевтической промышленности и B.adolescentis МС-42 для молочной промышленности. В связи с этим для решения поставленной задачи - создания устойчивых многовидовых консорциумов впервые предстояло изучить кинетику роста разных видов бифидобактерий - сначала в монокультурах, а затем подобрать условия для их совместного культивирования.

В настоящей экспериментальной работе в качестве модели были использованы следующие штаммы: Bifidobacterium bifidum 791, B. breve 79-119, B.infantis 73-15, B. longum В379М, B. adolescentis ГО-13. В качестве среды выращивания использовали ГМ-среду. Начальный рН среды культивирования составлял 6,7. Инокулят вносился в количестве 5 % от общего объема среды. Пробы из ферментера отбирались с интервалом в один час на протяжении всего цикла культивирования и анализировали их по показателям оптичекой плотности, значению числа КОЕ/мл после культивирования, значение активной кислотности. На основании полученных данных рассчитывали удельную скорость роста µ, время генерации g по формулам [Ильницкая И.Ю., 1986]:

µ = lgX1- lgX0 Х 2,3 и g = 0,693,

t1 - t0 µ

где: X0 и X1 - концентрация биомассы (оптическая плотность культуры в начале и в конце отрезка времени); 2,3 - коэффициент перехода от десятичных логарифмов к натуральным. Показатели, характеризующие динамику процесса культивирования, представлены на рис. 2,3,4 логарифмическими кривыми.

Рис.2. Изменение числа КОЕ/мл бифидобактерий



Рис. 3. Изменение оптической плотности КЖ

Рис 4. Изменение активной кислотности (рН)

Как видно из представленных данных, в заданных условиях культивирования отсутствовала лаг-фаза. Длительность экспоненциальной фазы составляла у различных культур от 6 до 12 часов. В течение этого времени происходил равномерный прирост биомассы, что подтверждалось наблюдающейся корреляцией нарастания оптической плотности, активной кислотности и числа КОЕ/мл бифидобактерий. При этом для каждой культуры в идентичных условиях была характерна своя динамика роста. Так, для каждого штамма было отмечено свое значение соотношения числа КОЕ/мл к оптической плотности, что связано с морфологическими и физиологическими особенностями каждого штамма.

Было также показано, что большое значение имеет возраст и количество посевного материала: оптимальным вариантом является засев культурой в период экспоненциальной фазы роста. Инокулят, взятый на стационарной фазе роста, задерживает адаптацию и развитие культуры. Интересно отметить, что пост-экспоненциальная фаза роста культуры имеет ступенчатый характер, что можно объяснить продукцией метаболитов, тормозящих рост культуры [Бандоян А.К., 1984, Вахитов Т.Я., 2000, 2006 ].

Таким образом, полученные нами данные культивирования различных штаммов бифидобактерий показали, что, каждый из них имеет свои особенности культивирования, которые проявляются, прежде всего, в длительности экспоненциальной фазы развития. Если процесс не подвергается искусственной регуляции, пределом развития популяции является содержание бифидобактерий в 1 мл не более lg 9 КОЕ/мл.

2.2 Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации

Решение данной задачи представляет большую важность как с технологической, так и с медико-биологической точек зрения.

С одной стороны, совместное культивирование существенно удешевляет и упрощает производственный процесс. С другой стороны, принцип консорциума пробиотических штаммов, оказывающих взаимное синергидное действие на этапах изготовления препарата и в условиях последующего персистирования in vivo, должен быть приоритетным в создании микробных биопрепаратов. Правомочность такого подхода подтверждает высокая эффективность препарата «Ацилакт» на основе трех штаммов ацидофильных лактобацилл, сконструированный с учетом межвидового синергизма [Поспелова В.В., 1990].

В эксперименте были использованы те же штаммы бифидобактерий, что и в предыдущем исследовании. Культуры данных штаммов отличаются морфологией колоний, выросших на полужидкой среде, настолько, что была возможна их визуальная дифференциация в составе смешанной популяции. Для проведения совместного культивирования подбирали строго количественно соотношение посевного материала каждого из штаммов. Посев культур проводили поэтапно, с периодичностью в 1 час, регулируя рН культуральной жидкости перед засевом нового штамма до рH 6,7, создавая этим для него оптимальные стартовые условия. Очередность засева зависела от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов: 1 час - B. longum В379М; 2 час - B. breve 79-119; 3 час - B.infantis 73-15; 4 час - B. bifidum 791; 5 час - B. adolescentis Г0-13.

Процесс культивирования вели 12 часов при стандартных условиях.

Как видно из представленных на рис. 5 данных эксперимента, при предложенной схеме внесения посевного материала не происходило взаимного ингибирования культур. Кроме того, у отдельных культур (B.breve, B.infantis, B.adolescentis) показатели числа КОЕ/мл были выше, чем при раздельном выращивании, что подтверждает синергидный эффект в консорциуме. Число КОЕ/мл бифидобактерий в консорциуме составило 5,6х109, т.е. сумму из числа КОЕ/мл каждой из пяти культур.

Рис 5. Сравнительные результаты совместного и раздельного культивирования бифидобактерий

Таким образом, исходя из полученных данных, алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование определенных штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.

Рис.6. Сравнительные данные числа КОЕ/мл бифидобактерий в консорциуме и в монокультурах после хранения в течение 15 дней

Еще одним преимуществом совместного выращивания явилась лучшая выживаемость в процессе хранения: в консорциуме отдельные виды сохранялись в жизнеспособном состоянии дольше (рис.6).

Полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий, но и синергидном эффекте и большей стабильности при хранении консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.

3. Разработка новых производственных приемов обезвоживания биомассы

Используемый в настоящее время сублимационный метод высушивания биомассы микроорганизмов требует дорогостоящего оборудования, обладает низкой производительностью и большой энергоемкостью, что и определяет перспективность поисков альтернативных методов высушивания.

3.1 Отработка режима распылительного высушивания пробиотических микроорганизмов при низкой температуре теплоносителя

Распылительные сушилки широко применяются в пищевой промышленности, однако, их применение для высушивания препаратов на основе вегетативных культур микроорганизмов до настоящего времени весьма ограничено. Это связано с недостаточно изученным влиянием повреждающих факторов при распылительном высушивании на выживаемость микроорганизмов и отсутствием конструктивного решения для эффективного ведения процесса сушки. Негативное воздействие на клетки микроорганизмов начинает проявляться при температурах, превышающих температуру их культивирования, а также при длительном температурном воздействии. Поэтому губительное влияние на клетки микроорганизмов можно свести к минимуму, если поддерживать температуру на выходе из сушильной камеры, равную или близкую к 370С. Помимо модернизации сушильной установки с целью снижения температуры и сокращения времени воздействия был изучен ряд факторов, от которых зависит качество конечного продукта сушки: подобраны защитные среды, выбран оптимальный состав среды культивирования, определена фаза роста культуры, в которой она наиболее устойчива к повреждающим воздействиям в процессе сушки.

Так, было показано, что на ход процесса сушки и качество полученных препаратов влияет такой фактор, как возраст культуры и ее морфологическое состояние (рис. 7).

Как видно на рисунке 7, пробы культуральной жидкости штамма B.bifidum 791, полученные путем глубинного культивирования в ферментере в течение 5 и 7 часов, т.е. во время экспоненциальной фазы роста, высушивались с лучшими показателями числа жизнеспособных клеток и наименьшими потерями - 56,5%+3% и 53,6%+4 % соответственно. Для культуры на третьем часу роста (лаг-фаза) потери были существенными - 85,7%+5%. В стационарной фазе роста (15 часов роста) потери жизнеспособности оказались самыми существенными и составили 90,2%+1%. Таким образом, культура в экспоненциальной фазе роста наиболее устойчива к механическим и температурным воздействиям в процессе сушки.

Рис. 7. Зависимость числа КОЕ/г бифидобактерий в высушенных образцах от морфологического состояния культуры

Было показано, что на качестве процесса сказывается и состав среды выращивания. Сравнительный анализ параметров готового продукта - биомассы, выращенной на производственных и опытных средах, позволил разработать состав среды на основе водного экстракта топинамбура, которая при удовлетворительных показателях остаточной влажности (9,0 %) обладала удовлетворительными ростовыми качествами и высушивалась распылительно с содержанием жизнеспособных бифидобактерий lg КОЕ/г 2,4х109.

Не менее важным этапом данного раздела явилось изучение выживаемости пробиотических микроорганизмов в готовом препарате в процессе длительного хранения. Поиск методов улучшения сохраняемости препаратов распылительной сушки привел к заключению, что в препарат необходимо ввести модифицирующую добавку, снижающую уровень остаточной влаги и улучшающую физико-механические свойства препарата (сыпучесть, гигроскопичность). Помимо влияния на сохранность микроорганизмов, выбранный ингредиент должен обладать также полезным действием на организм человека. К таким ингредиентам можно отнести яблочный пектин. Пектины благотворно влияют на процессы пищеварения, регулируют моторную функцию ЖКТ, стимулируют рост нормофлоры, угнетают УПМ (Лазарева Е.Б., 2007). Молекулы пектина способны связывать катионы поливалентных металлов (кадмия, цинка, свинца, кобальта, стронция и др.).

Пектин добавлялся к сухой биомассе в соотношении 1:1. Поскольку влажность пектина не превышала 3,0%, результирующая влажность смеси биомассы с пектином была около 6,0%. В смеси с пектином заметно улучшились технологические свойства сухого препарата. Данные по хранению сухого препарата бифидобактерий распылительной сушки в смеси с пектином приведены в виде логарифмических кривых роста (рис.8).

Рис. 8. Выживаемость бифидобактерий в смеси с пектином при разных температурах хранения

Представленные данные иллюстрируют выживаемость бифидобактерий как при стандартных условиях (50С), так и при комнатной температуре (220С) .

Введение модифицирующей добавки в виде яблочного пектина позволило получить сухой препарат на основе бифидобактерий, устойчивый к хранению в широком интервале температур и с улучшенными физико-механическими свойствами. При повышенной температуре хранения (400С) препарат не хранился дольше 7 суток.

Таким образом, благодаря биотехнологическим приемам, разработанным в рамках данного исследования, показана перспективность использования метода распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя для производства пробиотических препаратов.

3.2 Разработка методических подходов к высушиванию пробиотических микроорганизмов на сушильной установке в псевдоожиженном слое

Перспективным методом высушивания пробиотических микроорганизмов является конверсионная технология сушки-гранулирования в псевдоожиженном слое. Четкое конструктивное разделение зоны подачи горячего воздуха и рабочей зоны продукта, находящегося в псевдоожиженном слое, практически исключает перегрев биомассы при установившемся режиме (Островский В.Г., 2002). Суспензия культуральной жидкости, распыляемая форсунками в псевдоожиженном слое, в виде мелких капель осаждается на частицы носителя и высыхает на них.

В данном фрагменте работы проведено изучение ряда производственных питательных сред на пригодность использования для производства сухого препарата по данной технологии: в сравнительных экспериментальных исследованиях ряда производственных сред показано, что наиболее перспективной является кукурузно-лактозная среда.

Для снижения воздействия различных повреждающих факторов, связанных с диспергированием культуральной жидкости, резкими колебаниями давления при входе в распыляющее устройство и при выходе из него, увеличением концентрации электролитов и токсичных веществ в окружающей клетку среде, были подобраны вещества для снижения влияния этих факторов - стабилизирующих рН, изменяющих физико-химические и реологические свойства жидкой субстанции, обладающих антиоксидантным действием, т.е. защитные среды.

Важной технологической составляющей данного раздела явилось изучение возможности использования различных вариантов носителей для нанесения на них жидкой культуры бифидобактерий. Особенное внимание представляло растительное сырье с высоким содержанием ФОС; к ним можно отнести клубни топинамбура, цикория и сою. КЖ штамма B.bifidum 791 наносилась на порошок сои, топинамбура и цикория (для сравнения использовалась лактоза). Полученные данные представлены на рис.9.

Рис. 9. Результаты высушивания биомассы бифидобактерий в псевдоожиженом слое на различных носителях

Как видно на рис.9, все партии готового сухого препарата удовлетворяют предъявляемым требованиям к препаратам по количественному содержанию пробиотических микроорганизмов. Наилучшие результаты получены в пробе, где в качестве носителя использовался порошок из клубней топинамбура, а также порошком цикория - субстратами, содержащими биогенный инулин. Таким образом, метод высушивания биомассы пробиотических микроорганизмов в псевдоожиженном слое является перспективным технологическим приемом: путем напыления биомассы бифидобактерий на функционально значимые ингредиенты возможно получение готовых форм препаратов-синбиотиков. Готовый продукт имеет вид мелких, равномерных гранул, которые можно использовать как самостоятельную форму препарата, а также полуфабрикат для изготовления капсул и таблеток.

4. Изучение пребиотических и биотехнологических свойств топинамбура, цикория и смолы акации

Больший интерес при разработке препаратов-синбиотиков представляют ФОС - растворимые пищевые волокна, сочетающие комплекс технологических свойств со способностью оказывать позитивное влияние на ряд физиологических функций организма: нормализацию микробиоты, усвоение минералов, снижение уровня глюкозы (Gibson G.R., 1995, Van den Heuvel E., 1999, Caers.W., 2004, Шендеров Б.А., 2008).

Основными источниками ФОС являются топинамбур и цикорий - природные кладовые инулина - органического вещества из группы полисахаридов, полимера D-фруктозы, молекула которого состоит из 30-36 остатков фруктозы в фуранозной форме. Олигофруктоза содержит до 10 молекул фруктозы.

Смола акации - это также растворимое волокно, с химической точки зрения представляющее собой полисахарид с молекулярным весом более 200000 дальтон, состоящий главным образом из арабиногалактана и глюкуроновой кислоты.

Задачей данного раздела явилось сравнительное изучение перспективности этих веществ для включения в состав препаратов-синбиотиков.

Из порошка топинамбура готовили водный экстракт в качестве углеводной основы питательной среды для культивирования бифидобактерий. В данном питательном субстрате определяли состав редуцирующих сахаров. В инулиновом компоненте преобладали фракции со степенью полимеризации фруктозы 5-14, т.е. смесь инулина и олигофруктозы. В качестве среды контроля использовали субстрат того же состава, но вместо фильтрата топинамбура в качестве источника углеводов добавляли лактозу. Обе среды стерилизовали и параллельно засевали культурой штамма B.bifidum 791. Сравнительные результаты показателей, характеризующих процесс культивирования на средах, в состав которых входят разные углеводы, представлены на рис. 10 в виде графиков 1,2.

График 2

Рис. 10. Сравнительные результаты культивирования бифидобактерий на субстратах, содержащих различные источники углеводов

Сравнение логарифмических кривых роста показывает, что при выращивании на среде с топинамбуром ярко выражена и значительно удлиняется лаг-фаза и, в общей сложности, время культивирования увеличивается на 3 часа. При этом конечный выход биомассы бифидобактерий остается на том же уровне, что и при культивировании на среде с лактозой. Динамика потребления редуцирующих сахаров на среде с топинамбуром подтверждает, что бифидобактерии обладают ферментной системой бета-фруктозидаз, позволяющей им расщеплять инулин, что и объясняет его пребиотический эффект. Как наглядно демонстрирует график 2на рис.10, после того, как происходит заметное нарастание биомассы бифидобактерий, наблюдается скачок на кривой, что должно свидетельствовать, на наш взгляд, об активном усвоении инулина.

Сравнение микроскопических препаратов из культур, выращенных на разных средах, показало, что при выращивании на среде с топинамбуром культура более однородна по морфологии; не отмечалось тенденций к агрегации и образованию скоплений клеток. Результаты вискозиметрии также показали, что КЖ этой среды обладает меньшей вязкостью.

Рис. 11. Показатели содержания жизнеспособных бифидобактерий в препаратах (КОЕ/г) после высушивания

Эти данные позволяют думать о возможном получении менее гигроскопичного сухого препарата и увеличении сроков его хранения, что получило подтверждение в наших исследованиях: результаты сравнительного анализа образцов биомассы после сублимационной сушки показали, что наилучшие показатели по числу КОЕ/г жизнеспособных бифидобактерий и остаточной влажности были в образцах, выращенных на среде, содержащей экстракт топинамбура (рис.11). Таким образом, топинамбур является ценным и перспективным сырьем для производства препаратов пробиотического назначения, и как источник ФОС, и как технологическая добавка.

Было проведено сравнительное изучение влияния растворимых пищевых волокон на скорость накопления и конечный выход биомассы, а также сохранность пробиотических микроорганизмов при хранения.

В наших исследованиях использовался комплексный продукт (инулин с олигофруктозой) бельгийской фирмы ORAFTI, полученный путем водной экстракции из клубней цикория (торговая марка Raftilosa Sinergy) и коммерческий продукт из смолы акации (торговая марка Fibregum) в виде порошка.

Изучение влияния растворимых волокон на динамику роста и накопления биомассы пробиотических культур проводили на модели штаммов B. bifidum 791, B. longum B379M, L. plantarum 8-PA-3, внося добавки Fibregum и Raftilosa Sinergy в разных концентрациях в среды выращивания. После засева испытуемыми культурами и инкубации определяли число КОЕ/мл КЖ. На рисунке 12 представлены результаты влияния добавок на результаты культивирования штамма L. plantarum 8-PA-3.



Рис. 12. Влияние растворимых пищевых волокон на динамику роста L.plantarum 8-PA-3

Как показали наши эксперименты, добавление в среду выращивания растворимых пищевых волокон Fibregum и Raftilosa Sinergy стимулирует рост бифидобактерий и лактобацилл. Выход биомассы бифидобактерий при этом увеличивается в 5-6 раза. На лактобациллы (штамм L.plantarum 8-PA-3) Fibregum и Raftilosa Sinergy оказывали более выраженный стимулирующий эффект, увеличивая выход биомассы не менее, чем на порядок.

Интересно отметить увеличение длительности экспоненциальной фазы роста на среде с добавлением Raftilosa Sinergy. Это можно объяснить различиями в углеводном составе опытных и контрольной сред и включением в метаболический процесс разных групп ферментов, как уже отмечалось в эксперименте с топинамбуром. Молекула Fibregum представляет собой однородный по составу полисахарид в соединении с более разнородными гликопротеинами.

Было изучено влияние добавок Raftilosa Sinergy и Fibregum на сохранность сухой биомассы бифидобактерий. Исходное содержание бифидобактерий составляло 3,0х108 КОЕ/г.

В условиях пониженной температуры (4-60С) к концу 60 дней исходную концентрацию бифидобактерий сохранили все образцы.

При хранении проб при t 22-24 0С, как показывает рисунке 13, уже к концу второй недели в контрольных образцах и образцах с Fibregum показатели числа КОЕ/г снизились в два раза, а к концу срока хранения - в контрольном - на два порядка, с добавкой Fibregum - на порядок. При этом в пробах, содержащих Raftilosa Sinergy, число жизнеспособных бифидобактерий осталось неизменным в течение всего срока хранения. При хранении всех образцов при температуре 300С каждую неделю активность микроорганизмов падала на один порядок

...