Механизмы регуляции апоптоза в нейроэндокринной системе гипоталамуса в позднем онтогенезе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Механизмы регуляции апоптоза в нейроэндокринной системе гипоталамуса в позднем онтогенезе

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

БАЖАНОВА Елена Давыдовна

Санкт-Петербург, 2011



Работа выполнена в лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Учреждения Российской Академии Наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Анисимов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Неворотин Алексей Иосифович

доктор биологических наук, профессор Чумасов Евгений Иванович

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клиониковна

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургская общественная организация "Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН"

Защита диссертации состоится 08 февраля 2011 г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12, тел. (812) 234-68-68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12. автореферат разослан “____”_______________2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д001.22.02.

доктор медицинских наук П.А. Дыбан



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время процесс старения привлекает внимание множества исследователей (Zhang et al., 1995; Mattson et al., 1999, 2001; Kim et al., 2001; Beneke and Burkle, 2004). В процесс старения, как известно, вовлечены сложные механизмы, в которых принимают участие самые различные молекулярные системы - иммуномодуляторы, ростовые факторы, гормоны, нейрогормоны, рецепторные и многие другие белки (Cutler, 1991; Browner et al., 2004; Heiser et al., 2004; Holzenberger et al., 2004; Lutomska et al., 2008). Согласно некоторым авторам, старение может запускаться 2 механизмами: укорочением теломер и повреждением ДНК (Ding and Shen, 2008), что индуцирует клеточное старение (Eller et al., 2006; Lucassen et al., 1997; Harrigan et al., 2007). Однако и тот, и другой механизмы старения в высокой степени зависят от р53-статуса (Li et al., 2008, Campisi, 2002). Продукт гена-онкосупрессора р53 играет критическую роль в поддержании геномной целостности в клетках млекопитающих. Возможность р53 индуцировать апоптоз - важнейшая функция этого белка-фактора супрессии опухолей, определяющая его роль в старении (Sommers et al., 2005; Sharma et al., 2007). Необратимая остановка пролиферации старых клеток сопровождается p53-зависимой транскрипционной активацией генов-мишеней p53 (Atadja et al, 1995). Активация p53 в старых клетках, по-видимому, происходит в ответ на хромосомные разрывы, ассоциированные с укорочением теломер в стареющих клетках (Harley and Sherwood, 1997). Таким образом, многими авторами показано активное участие апоптоза в старении клеток (Fearnley and Lees, 1991; Fearnley et al., 1991; Nagai et al., 1993; Yoshiyama et al., 1994; Taglialatela et al., 1996; Kiatipattanasakul et al., 1996).

Как известно, старение организма во многом зависит от изменения нейроэндокринной регуляции (Olovnikov, 2007). Очевидно, что состояние нейросекреторных клеток на поздних этапах онтогенеза влияет на их морфофункциональную активность и определяет темпы и направление старения органов-мишеней.

В то же время практически не изучены инволюционные изменения нейронов мозга, генетические «триггеры» старения и пути утилизации стареющих клеток. Не определены молекулярные механизмы клеточной гибели на поздних этапах онтогенеза. Имеющиеся литературные данные представлены результатами, полученными в основном на клеточных культурах, т.е. в условиях изоляции однородных клеток (Oshima et al., 1995; Gray et al., 1997; Poot et al., 2004; Dimri et al., 2005; Kimura et al., 2005; Nyunoya et al., 2009). Подобные данные невозможно адаптировать к физиологическим процессам, протекающим в целом организме.

В связи с этим, представляется актуальным исследовать механизмы регуляции апоптоза клеток нейроэндокринной системы при старении. Использование в качестве модели трансгенных мышей даст возможность изучить роль тирозинкиназного рецептора онкопротеина HER2/neu в регуляции апоптоза нейронов старых животных. Предполагается, что изменение сигнальных каскадов апоптоза при старении является базой для развития новообразований. Известно, что недостаточная активность онкосупрессора р53 является причиной канцерогенеза и, соответственно, сокращения продолжительности и качества жизни индивида (Sommers et al., 2005; Пискунова и др., 2007). Таким образом, очевидно, что выявление механизма р53-зависимого апоптоза и взаимосвязи онкогена HER2/neu c генами, регулирующими р53 (WRN) и транскрипционными мишенями р53 будет иметь большое практическое значение в теоретической и клинической медицине.

Кроме того, представляет глубокий интерес выявление роли другого важного проапоптотического фоктора - TNF-alpha (tumor necrosis factor, фактор некроза опухолей) в регуляции апоптоза при старении. На модели TNF-нокаутных мышей будут исследованы изменения механизмов апоптоза, вызванные отсутствием гена TNF.

Результаты данного исследования будут иметь практическое значение в онкологии и геронтологии.

Цель исследования - изучить молекулярныe механизмы регуляции апоптоза клеток нейроэндокринной системы на поздних этапах онтогенеза и выявить морфофункциональные изменения, связанные со старением.

Достижение поставленной цели осуществлялось путем решения следующих задач:

изучить адаптивные возможности и механизмы стрессорного ответа гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы при старении.

изучить сигнальные пути, приводящие к изменению уровня апоптоза нейронов мозга при старении.

оценить вклад клеточных рецепторов - рецептора эпидермального фактора роста (HER2) и фактора некроза опухолей (TNF) в реализацию апоптоза нейронов гипоталамуса при старении.

изучить возможность модуляции старческого апоптоза нейронов мозга и определить возможные геропротекторы.

выявить изменения морфофункциональной активности клеток нейросекреторной системы гипоталамуса, связанные с активацией генов апоптоза в позднем онтогенезе.

Научная новизна. гипоталамус апоптоз некроз опухоль

Впервые дан комплексный анализ нонапептидергической, NPY-ергической и моноаминергической систем гипоталамуса на поздних этапах онтогенеза. Выявлена возрастная динамика функциональных и адаптивных возможностей нейросекреторной системы, а также зависимость синтеза вазопрессина и апоптоз-ассоциированных молекул от генотипа животного.

Разработано концептуальное представление об участии апоптоза в инволюционных процессах нейронов мозга. Впервые получены данные, объясняющие механизм регуляции апоптоза нейросекреторных клеток гипоталамуса млекопитающих на поздних этапах онтогенеза. Выявлены гены, активирующие/тормозящие сигнальные пути апоптоза нейронов при старении и определены апоптотические сигнальные каскады гибели нейронов молодых и старых животных. Анализ результатов выявил ряд генов, активация которых характерна для нейросекреторных клеток на поздних этапах онтогенеза, что позволило определить возможные генетические «триггеры старения» в НЭС. Подтверждено наличие caspase-зависимого пути клеточной гибели при старении.

Впервые изучены инволюционные изменения нейронов гипоталамуса ускоренно стареющих мышей линии HER2/neu и обнаружены причины низкого уровня апоптоза у этих животных. Впервые показано, что отсутствие определенных генов, участвующих в канцерогенезе (TNF) (TNF-нокаутные мыши), и сверхэкспрессия онкопротеина HER2/neu (HER2/neu-трансгенные мыши) оказывает определенное влияние на онтогенетическую модель регуляции апоптоза.

Впервые изучено действие иммуномодуляторов (альфа-интерферон, циклоферон) на синтез нейрогормонов и апоптоз-ассоциированных белков в нейросекреторных клетках в позднем онтогенезе. Показано, что участие иммуномодуляторов в регуляции апоптоза зависит от стадии онтогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гипоталамо-гипофизарная система старых животных находится в состоянии напряжения (включая пептидергическую, NPY-ергическую, моноаминергическую системы), в связи с чем механизмы гипоталамического стрессорного ответа у старых крыс значительно отличаются от реакции молодых животных. На поздних этапах онтогенеза адаптивные реакции протекают тяжелее и с запаздыванием в связи с возрастными нарушениями в нейроэндокринной системе.

2. При физиологическом старении нейросекреторные клетки гибнут путем апоптоза, при этом активируется внешний путь клеточной гибели (caspase-8-зависимый), митохондриальный (изменения экспрессии белков семейства Bcl-2) и р53-зависимый путь, связанный с повреждением ДНК.

3. Индукция апоптоза при старении не зависит от наличия гена TNF.

4. Сигнальные пути апоптоза одинаковы в нейросекреторных центрах молодых мышей, но различаются у старых животных в физиологических условиях и при стрессе.

5. Участие иммуномодуляторов в регуляции клеточной гибели нейронов гипоталамуса зависит от стадии онтогенеза и от вида иммуномодулятора.

6. Сверхэкспрессия HER2/neu достаточна для защиты от возраст-зависимой активации апоптоза в нейросекреторных центрах. Основным механизмом подавления апоптоза у трансгенных мышей является блокирование р53-зависимого каскада, что приводит к снижению синтеза caspase-8 и Вах, дисрегуляции синтеза антиапоптотических белков Bcl-2 и Mcl-1.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты проведенных исследований позволяют расширить и углубить представления о возрастных изменениях одной из наиболее важных регуляторных систем организма - нейроэндокринной системы, как ее центрального звена (гипоталамо-гипофизарная система), так и периферического (кора надпочечников). Данные, полученные в работе, позволяют выявить роль отдельных генов в регуляции старения и апоптоза, а также конкретные механизмы гибели нейронов мозга при старении.

Практическая ценность результатов исследования состоит в необходимости учета возрастных особенностей при использовании иммуномодуляторов и лечебной гипероксигенации в эксперименте и в клинике.

Выявленные в работе закономерности регуляции апоптоза на поздних этапах онтогенеза, особенности протекания инволюционных процессов в нейронах мозга могут быть использованы при изучении курсов физиологии, клнточной биологии, возрастной физиологии, геронтологии и гериатрии в вузах биологического и медицинского профиля, при подготовке аспирантов данных специальностей, а также учтены при использовании в геронтологии, гериатрии и онкологии.

Материалы диссертации включены в курс лекций по физиологии Российского государственного педагогического университета им. Герцена

(Санкт-Петербург).

Апробация работы.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: Международная конференция «Колосовские чтения» (С-Петербург, 1997, 2006), II National Gerontology Congress with international participant (Bucharest, Romania, 1997), World Congress of neurohypophysial hormones (Monreal, Quebec, Canada, 1997), 1-я и 2-я конференции с международным участием “Эндокринные механизмы регуляции функций в норме и патологии”, посвященная 75- и 80-летию проф. Колпакова (Новосибирск, 1997, 2002), The 4^th International Congress of Neuroendocrinology (Kitakyushu, Japan, 1998), Genetic and developmental psychoneuroendocrinology, International Symposium (Новосибирск, 1999), Всероссийские конференции с международным участием «Нейроэндокринология» (С.-Петербург, 2000, 2003, 2005, 2010), ХХХ Всероссийское Совещание по проблемам высшей нервной деятельности, посвящ. 150-летию Павлова (С.-Петербург, 2000), International Conference “Free radicals in the development and functions of CNS. From fetus to aging” (С.-Петербург, 2001), конференция молодых ученых и специалистов (С.-Петербург, 2003), VIII Meeting on high pressure biology (Москва, 2003), International Symposium “Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals” (Москва, 2003), the 2^nd International Conference on Functional Genomics of Ageing (Crete, Greece, 2004), научно-практическая конференция «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2004), VII международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2004), XIX съезд Физиологического общества им. Павлова (Екатеринбург, 2004), электронная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2004, 2005, 2008), 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), V Методологический семинар «Методология и методика научных исследований в области естественно-научного образования» (С.-Петербург, 2005), International Summer school in Behavioral Neurogenetics (Москва. 2005), XIII Международное Совещание им. Орбели по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 2006), межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» (С.-Петербург, 2006), международная конференция «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), the 2nd World Congress on Gender-Specific Medicine (Rome, Italy, 2007), ХХ съезд Физиологического общества им. Павлова (Москва, 2007), VI European Congress of International Association of Gerontology and Geriatrics (С.-Петербург, 2007), IX Российско-Китайский симпозиум «Новые материалы и технологии» (Астрахань, 2007), конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (С.Петербург, 2008), международный симпозиум «Профессиональное здоровье и качество жизни» (Гавана, Куба, 2009), 12th International TNF Conference «The TNF superfamily and its interactions with other signaling proteins in infection, autoimmunity, cancer and therapy» (El Escorial, Madrid, Spain, 2009), 1st International Congress on Controversies in Longevity, Health and Aging (Barcelona, Spain, 2010).

Результаты исследований опубликованы в следующих журналах: «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», «Морфология», «Neuroscience Behavior Physiology», «Цитология», «Успехи современной биологии», «Естественные науки», «Mechanisms of ageing and development», «Успехи геронтологии», «Доклады Академии наук», а также в сборнике трудов «Environment and human health: The complete works of International Ecologic Forum», 2003, St. Petersburg, Russia / Editor in chief G.A. Sofronov. Spb.: SpecLit, 2003. - 864 p.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 59 работ, в том числе 21 статья в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка.

Общий объем диссертации 334 страницы с 9 таблицами и 80 рисунками. Список литературы включает 578 публикаций, в том числе 468 иностранных.

В работе использованы следующие сокращения:

А - адреналин

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АТ - антитела

АЯ - аркуатное ядро

ВП - вазопрессин

ГГАКС - гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система

ГГНС - гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система

ЗДГ - задняя доля гипофиза

ИА - интерферон-альфа

ИГХ - иммуногистохимический

Инс - инсулин

ИПП - инсулин-подобные пептиды

ИР - иммунореактивный

КА - катехоламины

КЛ - кортиколиберин

кПВЯ - крупноклеточная часть паравентрикулярного ядра

КС - кортикостерон

МА - моноамины

мПВЯ - мелкоклеточная часть паравентрикулярного ядра

НА - норадреналин

НЗСВ - наружная зона срединного возвышения

НПY - нейропептид Y

НСК - нейросекреторные клетки

НСЦ - нейросекреторные центры

НЭС - нейроэндокринная система

ОТ - окситоцин

ПВЯ - паравентрикулярное ядро

ПДГ - передняя доля гипофиза

ПКГ - переднекомиссуральная группа

СВ - срединное возвышение

СОЯ - супраоптическое ядро

ТГ - тирозин-гидроксилаза

ЦНС - центральная нервная система

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика экспериментального материала, условий экспериментов и методических приемов исследования

Животные содержались в виварии при естественном освещении в стандартных условиях. Поскольку наркоз вызывает резкий выброс нейрогормонов в кровь, нами для умерщвления животных была применена быстрая декапитация.

Часть экспериментов проведена на крысах-самцах линии Вистар - молодых (3-6 мес.) и старых (14-28 мес.), и крысах в возрасте от 1 до 80 дней постнатальной жизни (всего 160 животных) (иммобилизация, опыт с избегаемым и неизбегаемым стрессом).

Были использованы белые беспородные мыши-самцы - молодые (2 мес) и старые (18 мес), всего 120 мышей (оксидативный стресс, применение ИА).

В исследовании использовали TNF-нокаутных мышей молодых (2-4 мес) и старых (13-18 мес), всего 20 мышей. Мыши данной линии выведены в лаборатории молекулярной иммунологии (зав. лабораторией: член-корр. РАН, д.б.н. проф. Недоспасов С.А.) ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва) методом генетического нокаута и переведены на генетическую основу C57BL/6 путем возвратного скрещивания (Grivennikov et al., 2005]. Разведение их поддерживалось в НИИ онкологии им. Петрова (С.-Петербург). Панель содержит линию мышей с модифицированным геном фактора некроза опухолей (TNF), подготовленные к тканеспецифической делеции гена. Характеристика линии: у мышей с полной делецией гена TNF нарушена защита от ряда патогенов. Данные мыши представляют собой уникальную панель для изучения роли тканеспецифической продукции цитокинов семейства TNF при врожденном и приобретенной иммунодефиците. Контролем служили мыши дикого типа (линия C57Bl/6) (wild type, WT) 4 и 18 мес, всего 20 мышей.

Были использованы мыши самцы: HER2/neu трансгенные молодые (2 мес) и старые (11 мес). Гомозиготные HER2/neu трансгенные мыши получены из Charles River Facility (Hollister, CA), the Italian National Research Center for Aging. Разведение их поддерживалось в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (С.-Петербург). Мыши данной линии являются ускоренно стареющими (Semenchenko et al., 2004), вследствие множественных функциональных повреждений и канцерогенеза продолжительность их жизни составляет около 12 мес. Контролем служили мыши дикого типа (линия Swiss-derived outbred mice (SHR), питомник Рапполово, С.-Петербург) 2 и 18 мес. (9 мышей в каждой группе). Всего использовано 60 мышей.

Иммобилизационный стресс.

1. Изучение адаптационных возможностей НЭС у старых и молодых крыс в разное время после стресса

Стрессируемые крысы находились в пластиковых контейнерах соответствующего размера (1 ч). Животных декапитировали сразу и через 1, 2, 3 сут после стресса.

2. Исследование действия индуктора интерферона (циклоферона) при стрессе

В опыте были следующие группы: интактные мыши; подопытная группа, подвергшаяся иммобилизационному стрессу в пластиковых контейнерах соответствующего размера (1 ч); мыши, получавшие циклоферон per os в 1, 2, 3, 5 сут. один раз в день в дозе 0,154 мг - для молодых, 0,216 мг - для старых, на 6 сутки эти мыши были подвергнуты иммобилизации; мыши, получавшие циклоферон per os по той же схеме, без стресса. Животных декапитировали через 18 ч после стресса.

Изучение характера локализации NPY-ергических нейронов в гипоталамусе

Кроме интактных взрослых крыс линии Вистар (3 мес), использованы крысы в возрасте от 1 до 80 дней постнатальной жизни и старые животные (28 мес). Для изучения локализации NPY-ергических нейронов в гипоталамусе трем взрослым крысам был введен интрацистернально колхицин (75мкг в 2 мкл) за 2 дня до декапитации. Существование проекций от NPY-ергических нейронов, локализованных в АЯ, к основным пептидергическим НСЦ показано с помощью хирургической изоляции медиобазального гипоталамуса (4 взрослых крысы под нембуталовым наркозом в стереотаксическом аппарате по координатам атласа (Сентаготаи Я. и др., 1965), согласно описанию Halasz, Pupp (1965)) за 4 недели до декапитации (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Л.Н. Маслова). В результате операции в изолированном участке в связи с гипофизом остаются медиальная часть перивентрикулярных ядер, АЯ, базальная часть вентромедиального ядра и СВ.

Эксперимент с избегаемым и неизбегаемым стрессом

Установка для стрессорного воздействия состояла из 2 клеток с токопроводящим полом для неизбегаемого стресса (НС) и для избегаемого (ИС). Электрический ток (1 мА, 60 Гц, 1-15 сек) подавали одновременно на обе клетки 60 раз в течение 1 ч, интервалы между включениями тока 15-45 сек. В клетке для ИС крыса могла перейти в безопасный отсек, а в клетке для НС возможности избежать воздействия электрического тока у крысы не было. Переход одной крысы в безопасный отсек камеры отключал ток, подаваемый на пол клетки, где находилась крыса из группы НС, т.е. животные 2 опытных групп получали равное по силе и продолжительности электрокожное раздражение, и единственное различие между ИС и НС состояло в возможности животного контролировать ситуацию. Декапитацию производили через 72 ч после стресса.

Оксидативный стресс

Как стресс-фактор использовали гипероксию в барокамере (1,5 ч при 2 атмосферах абсолютных кислорода). В качестве протектора повреждений, определяемых возрастом и кислородом, был выбран интерферон-альфа (ИА) (Interferon leucocytic human siccum, 500 ME/мл; НПО Биомед, Россия). В опыте были следующие группы: интактные мыши каждого возраста (контроль); мыши, в течение 3 сут получавшие ИА интраназально по 50 мкл 2 р. в день, декапитацию производили на 4 день; мыши, подвергшиеся гипероксигенации; мыши, получавшие ИА в течение 3 сут перед стрессированием. Животных 3-й и 4-й групп декапитировали сразу после стресса.

Определение катехоламинов (КА) (норадреналин (НА), адреналин (А)) в ткани надпочечников

Экстракцию КА производили из замороженной ткани надпочечников. Содержание КА (НА и А) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии под высоким давлением (Лаборатория университета г. Грац, Австрия) с помощью электрохимических детекторов (Beckman Gold, 5401 и BAS-LC 4B). Конъюгированные КА были определены после гидролиза с сульфатазами 4 типов (Sigma, Munich, Germany).

Радиоиммунный анализ концентрации кортикостерона (КС) в крови

Собранную после декапитации животных кровь центрифугировали, плазму хранили при -С. Определение содержания КС в плазме крови проведено Д.А. Жуковым с помощью РИА [19] в лаборатории медицинской фармакологии (заведующий проф. Е.Р. dе Кloеt) университета г. Лейден (Нидерланды).

Гистологическая обработка материала

Гипоталамическую область головного мозга с гипофизом фиксировали в 4% параформальдегиде и после рутинной проводки заливали в парафин. Были изготовлены чередующиеся серии фронтальных срезов (5-6 мкм). Для анализа использовались срезы, содержащие супраоптическое, паравентрикулярное, аркуатное ядра (СОЯ, ПВЯ, АЯ), переднекомиссуральную группу (ПКГ) и срединное возвышение (СВ), отдельно изучали нейросекреторные клетки (НСК) крупно- (кПВЯ) и мелкоклеточной (мПВЯ) части. У части мышей гипоталамическая область мозга после фиксации в 4%-ном параформе, последующих рутинных процедур (вода, сахароза, быстрая заморозка в изопентане) была заморожена при -20^оС, и впоследствии на криостате были изготовлены чередующиеся срезы (5-6 мкм).

У мышей HER2 определен вид, число и размер опухолей, после рутинной гистологической проводки и окраски проведено микроскопическое исследование опухолей (окраска гематоксилином-эозином), которые классифицированы согласно International Agency for Research on Cancer Recommendations.

Определение уровня апоптоза в тканях

1. Люминисцентная микроскопия срезов, окрашенных этидия бромидом

Подсчитывали количество клеток с конденсированным хроматином. Для выявления апоптотических клеток на фиксированных срезах тканей был применен метод окраски этидием бромидом (Sigma), который способен встраиваться в дуплексную ДНК, что обеспечивает высокую интенсивность его флуоресценции в УФ свете. Наибольшая плотность флуоресценции регистрируется в клетках с конденсированным хроматином [13, 14], что в условиях высокодифференцированной нейросекреторной ткани соответствует исключительно апоптотическим клеткам.

2. TUNEL-метод

Для сравнения и контроля применен метод детекции апоптоза TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) с использованием терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы для выявления разрывов ДНК (кит для TUNEL Sileks, Россия).

Иммуногистохимические (ИГХ) методики

На срезах, содержащие изучаемые ядра, проводили ИГХ реакции с использованием немеченных антител (АТ) (Sternberger L. A., Joseph S. A., 1979) к ВП, ОТ и NPY, (Research Diagnostics Inc., USA) любезно предоставленных нам профессором J.A. Dierickx (Бельгия), к КЛ и тирозин-гидроксилазе (ТГ), которая является первым ферментом в цепи синтеза КА. Для выявления на одном и том же срезе NPY-ергических волокон и ВП- или ОТ-продуцирующих нейронов использовалась двойная ИГХ реакция. В качестве маркера активности нейронов использовали белок с-fos (Lafarga M. et al., 1992; Cai A. et al., 1997), выявляемый с помощью ИГХ реакции с немеченными антителами к с-fos.

Для выявления апоптоз-ассоциированных молекул в НСК проводили: двойную ИГХ реакцию с немечеными поликлональными АТ к антиапоптотическим белкам Bcl-2 (BD Biosciences, USA) (визуализация с помощью флюоресцентно меченных вторичных поликлональных АТ Су-2; Acris Antibodies GmbH, Germany), и Mcl-1 (BD Biosciences, USA) (визуализация - флюоресцентно меченные вторичные поликлональные АТ Су-3; Acris Antibodies GmbH, Germany) и двойную ИГХ реакцию с немечеными поликлональными АТ к белку Bcl-2 (BD Biosciences, USA), (визуализация - Су-2), и проапоптотическому белку Bax (BD Biosciences, USA) (визуализация - Су-3).

Выявляли маркеры апоптоза и другие изучаемые белки с использованием следующих АТ: поликлональные к Bcl-2, Mcl-1, Bax (BD Biosciences, USA), к FLICE (caspase-8) и caspase-9 (Santa Cruz Biotechnology, USA), к ВП (Sigma Aldrich, USA), к Инс/ИПП-ИР веществу (любезно предоставлены Ю.И. Русаковым, лаб. молекулярной нейроэндокринологии, ИЭФБ РАН), моноклональные к p53 (Sigma Aldrich, USA), C-raf-1 (любезно предоставлены Dr. Papp U.R., Universitat Wurzburg, Germany).

In situ гибридизация. Приготовление шаблонов и синтез рибопроб

Рибопробы для детекции ВП, р53 и wrn мРНК мыши были приготовлены с помощью метода in vitro транскрипции с использованием синтетического шаблона. Нешаблонный стренд (non-template strand - NT; NTVMTU8 5'-GTAATACGACTCACTATAGGAGGGAGAGAG) кодирует 18-ти-нуклеотидный промотер для Т7 РНК полимеразы. Соответственный GGG

сиквенс нижней полосы Т7 промотера был замещен на GGA для уменьшения образования абортивных транскриптов и, посредством этого, повышения эффективности синтеза необходимых транскриптов полной длины. Шаблонный стренд (template strand - TS; TSAvpmo 5'-AAGAGGGCCATCTCTGACATGGAG CTGAGACAGTGTCTCCCCTGCGGCCCGGGCGGCAAAGGACGCTGCTTCGG ACCACTCTCTCCCTCC-3') представляет копию ДНК мыши в части ВП мРНК, поэтому он кодирует РНК, которая может быть использована как проба для метода in situ гибридизации. Для WRN шаблонный стренд (template strand - TS; TSwrnmo5'-AAATGTTACTTGTTTCACATTTCTTCCATGTCAGTTTTCCCCCA GGGATTAAAAATGTTACTAGAAAACAAATCAATTCTCTCTCCCTCC-3') представляет копию ДНК мыши в части WRN мРНК. Для p53 шаблонный стренд (template strand - TS; TSwrnmo5'-5'-AGTCTGGGACAGCCAAGTCTGTT ATGTGCACGTACTCTCCTCCCCTCAATAAGCTATTCTGCCAGCTGGCGAAGACGTCTCTCTCCCTCC-3') представляет копию ДНК мыши в части p53 мРНК.

Одноцепочечный регион шаблона был замещен с использованием Klenow Fragment (exo-) (NEB, USA). Чтобы пометить рибопробу, мы использовали модифицированный NTP, DIG-11-UTP (Roche Applied Science, USA). Рибопробы были созданы с помощью реакции in vitro транскрипции с вышеуказанным шаблоном, как рекомендовано в руководстве по использованию DIG-11-UTP.

Гибридизация была выполнена с использованием дигоксигенин-меченых ВП, р53 и WRN рибопроб на свежих замороженных срезах. Мы использовали стандартный протокол, опубликованный ранее (Glasgow et al., 1999).

Количественное хемилюминисцентное иммунное определение в крови 17в-эстрадиола

Образцы крови изучаемых животных, собранные после декапитации, были центрифугированы, и полученная плазма хранилась при -20⁰C. Уровень 17в-эстрадиола в плазме крови был определен с помощью анализатора Elecsys 2010 и кита (Roche Diagnostics, USA).

Анализ изображений

Изображения срезов, содержащих изучаемые НСЦ, после выполнения ИГХ реакций, in situ гибридизации, TUNEL и окрашенных этидия бромидом, были получены с помощью микроскопа PFM (WPI, USA) и цветной видеокамеры camera DIC-E (WPI, USA), Leika DFC 300 FX (Германия), разрешение 1392х1040 пикселей (увеличение х 40). Для оценки интенсивности экспрессии изучаемых белков и уровня апоптоза использовалась программа VideoTest Software.

Подсчитывали число с-fos-ИР и ТГ-ИР НСК на 5-6 срезах каждого животного в НСЦ, затем вычисляли средние доли клеток для группы мышей. Было подсчитано среднее количество NPY-ИР нейронов на 5 срезах АЯ на уровне P3.5 по атласу Сентаготаи и др. (1965).

В НСК определяли среднюю максимальную яркость (в относительных единицах, представляющих отношение яркости фона к яркости объекта) Bcl-2-, Mcl-1- и Вах-ИР вещества на 5-6 срезах для каждого животного, отдельно в каждом ядре. Кроме того, подсчитывали число НСК с колокализацией Bcl-2 и Mcl-1, Bcl-2 и Вах.

Определяли оптическую плотность ИР вещества для каждого антитела отдельно в клетках НСЦ на 5-6 гипоталамических срезах для каждого животного, отдельно в каждом ядре, КЛ-, ВП- и ТГ-ИР вещества, содержащихся в НЗСВ, ВП и ОТ в ЗДГ. На основании этого высчитывали среднюю оптическую плотность (выражена в относительных единицах, представляющих отношение яркости фона к яркости объекта) изучаемых белков в НСЦ для группы мышей. Так же производили денситометрию для определения мРНК ВП и мРНК WRN в СОЯ и ПВЯ.

Количество апоптотических клеток подсчитывали на 4-5 срезах, содержащих СОЯ, ПВЯ, и срезах коры надпочечников у каждой мыши с последующим определением среднего количества на группу. Для сравнения, уровень апоптоза был определен с помощью TUNEL. Были получены абсолютные значения (подсчитывалось количество темноокрашенных апоптотических клеток на гипоталамический центр, взятое как среднее на один срез).

Морфометрия и морфологическое описание наблюдаемых изменений в тканях

После проведения ИГХ реакций проводили кариолометрию ВП- и ОТ-ергических клеток в изучаемых НСЦ и вычисляли объем ядрышек, как показатель интенсивности синтеза нонапептидов. Также определяли долю НСК с одним ядрышком, расположенным в центре ядра, с эксцентрично расположенными и эктопированными ядрышками и многоядрышковыми ядрами. Показателем интенсивности синтеза глюкокортикоидов служил объем ядер клеток пучковой зоны коры надпочечников (Автандилов, 1980; Шейбак, 1988). Для характеристики путей транспорта нейрогормонов с помощью микроскопа NU-2 при увеличении 2.500 точечной методикой, используя сетку с шагом 1 см, стереологически определяли относительную ширину просвета сосудов НЗСВ и ЗДГ. Кроме того, с помощью световой микроскопии (БИОЛАМ И) сделано морфологическое описание наблюдаемых изменений в структурах гипоталамуса и коре надпочечников на срезах, окрашенных гематоксилином-эозином.

Статистическая обработка полученных данных

Достоверность различий между группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента (р<0.05) c использованием коммерческой программы Microsoft Excel 5.0a. При обработке результатов эксперимента был использован также корреляционный анализ и коэффициенты вариации (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфофункциональная характеристика нейросекреторных центров и их изменения в позднем онтогенезе. Гипоталамическая регуляция функции коры надпочечников у старых и молодых крыс

Нонапептидергическая система гипоталамуса. Результаты проведенного эксперимента с использованием в качестве стресса острой иммобилизации показали наличие различных механизмов адаптации к стрессорным условиям у крыс разного возраста. У молодых крыс ВП освобождается через наружную зону срединного возвышения (НЗСВ) в аденогипофиз, и таким образом участвует в стимуляции стресс-реакции коры надпочечников во время всего изученного периода.

На поздних этапах онтогенеза адаптивные реакции протекают тяжелее, поскольку компенсаторные механизмы уже напряжены в связи с возрастными особенностями. Нами показано более активное состояние НСЦ гипоталамуса у старых контрольных крыс, по сравнению с молодыми. Такое напряжение, наблюдаемое уже у контрольных животных, вероятно, и приводит к неадекватной реакции на стресс старых крыс. Мы выявили, что взаимосоотношения НСЦ у молодых крыс после стресса аналогичны таковому у контрольных старых крыс. Таким образом, по ВП- и ОТ-синтетической активности состояние контрольных старых животных можно определить как стрессорное. В связи с этим у животных на поздних стадиях онтогенеза реакция на иммобилизацию происходит с запаздыванием. Наличие даже незначительной задержки в реакции ГГНС и связанное с ней замедление адаптивных процессов снижает выживаемость этих особей в экстремальных условиях.

Изменения NPY-ергической системы гипоталамуса крыс в позднем онтогенезе и еe участие в регуляции нонапептидергических НСЦ. До сих пор неясны многие вопросы, связанные с влиянием на активность нонапептидергических клеток некоторых нейропептидов, выполняющих роль нейротрансмиттеров или нейромодуляторов при передаче сигналов к НСК. Одним из таких нейрохимических регуляторов является нейропептид У (NPY). Известно, что он, являясь антиподом ВП по действию на диурез и Na-урез, снижает системное артериальное давление, возбудимость ЦНС, стимулирует аппетит и подавляет жажду (Gray and Morley, 1986). NPY повышает солевой обмен, участвует в генезе медленноволнового сна и подавляет циркадные ритмы полового поведения (Horvath et al., 1992; Чернышева, 1995). Мало изучена роль NPY в регуляции ВП- и ОТ-ергических НСК, ее развитие в ходе постнатального онтогенеза и становление связей между NPY-ергической системой и гипоталамическими нонапептидергическими нейронами. В эксперименте с введением колхицина выявлено наличие значительной NPY-ергической иннервации ВП-ергических НСК ПВЯ и, несколько меньшая - СОЯ. Также показана колокализация ВП и NPY в нейронах СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. Исследования показали онтогенетическую зависимость NPY-ергической иннервации - у новорожденных крысят и у старых крыс плотность NPY-ИР нейронов была достоверно ниже, чем у взрослых животных. Изучение NPY-ергической системы гипоталамуса старых крыс показало, что у них NPY-ИР нейроны в АЯ не выявляются ИГХ методами, но количество NPY-ИР волокон в ПВЯ достоверно меньше, чем у контрольных взрослых крыс (Рис. 1). Вероятно, это связано с поступлением меньшего количества NPY в ПВЯ из АЯ в результате снижения интенсивности синтеза NPY в клетках АЯ старых крыс при одновременном сохранении этими клетками возможности к его активному выведению.

Рис. 1. Плотность NPY-ергической иннервации ПВЯ интактных крыс на разных стадиях постнатального развития. В - взрослые животные, С - старые. * - достоверность по отношению к группе взрослых крыс.

Участие катехоламинергических клеток гипоталамуса в регуляции стрессорной реакции организма при старении. Адаптация организма к различным стрессорным ситуациям протекает при активном участии ГГАКС. Одним из факторов, влияющих на активность центрального звена этой системы - пептидергических нейроэндокринных центров гипоталамуса, является катехоламинергическая система мозга. Роль КА в регуляции функции пептидергических НСК СОЯ и ПВЯ до сих пор полностью не выяснена, хотя показано участие КА в формировании стрессорного ответа у крыс (Guillaume et al., 1987; Szafarczyk et al., 1987; Spinedi et al., 1988). У взрослых млекопитающих многократно описана интенсивная КА-ергическая иннервация СОЯ и ПВЯ. Основными источниками этой иннервации считаются aдренергические зоны C1, C2, C3 продолговатого мозга (Gunningham et al., 1990; Shioda et al., 1992), норадренергические клетки А1 - вентральной части продолговатого мозга и А2 - медиальной части ядра солитарного тракта (Swanson et al., 1983). Кроме того, известны КА-ергические центры, расположенные в гипоталамусе, такие как перивентрикулярное ядро, АЯ и zona incerta. Показаны проекции от этих центров к ПВЯ и СОЯ (Ginsberg et al., 1994; Wagner et al., 1995). Следовательно, можно предположить, что они участвуют в регуляции функции пептидергических нейросекреторных элементов.

Выявлена ТГ в отдельных пептидергических клетках ПВЯ и СОЯ, причем количество таких клеток увеличивается после стресса (иммобилизация) у крыс обеих возрастных групп. Состояние КА-центров у молодых и старых крыс было различным, как в контроле, так и при стрессе. У контрольных старых животных в КА-ергических центрах (АЯ и zona incerta) и в пептидергических (ПВЯ и ПКГ) число КА-ергических клеток достоверно больше, чем у молодых крыс (Рис. 2). Как КА-ергические клетки, так и пептидергические НСК гипоталамуса, у старых крыс уже в контроле были активированы по сравнению с молодыми. Возможно, такое состояние напряжения НЭС было причиной возникновения различий в реакции на стресс у животных разного возраста.

У старых животных реакция на стресс отличается меньшей реактивностью ПВЯ, АЯ и НЗСВ при сохранении реакции ПКГ. Таким образом, изменение состояния КА-ергических центров гипоталамуса при стрессе говорит об их активном участии в регуляции стрессорных реакций организма. Разнонаправленные реакции, наблюдаемые в КА-ергических центрах гипоталамуса при стрессорном воздействии, свидетельствуют об их различной функциональной роли в механизме адаптации. Можно заключить, что при старении происходит хроническая активация КА-ергических нейросекреторных гипоталамических элементов, подобно тому как это описано для пептидергических НСК старых контрольных крыс (Бажанова и др., 1996). Таким образом, напряжение пептидергической и КА-ергической систем при старении может выражаться усилением активности синтеза белка пептидергическими клетками и увеличением числа выявляемых КА-ергических клеток, что свидетельствует скорее всего тоже о повышении продукции КА.

Рис. 2. Количество ТГ-ИР НСК у молодых и старых крыс. * - достоверность различий между молодыми и старыми животными.

В опытах с избегаемым и неизбегаемым стрессом доказано, что дисфункция ГГАКС в старости особенно четко выявляется при нагрузке: у старых животных после избегаемого стресса наблюдалось длительное последействие, вполне сравнимое с результатами, полученными после неизбегаемого в обеих возрастных группах.

Онтогенетические особенности экспрессии апоптоз-ассоциированных молекул в НСК гипоталамуса и коры надпочечников мышей.

В результате наших экспериментов (оксидативный стресс, иммобилизация, применение перед стрессированием животных цитокинов - ИА, экзогенного индуктора интерферона - циклоферона) показано, что при старении в первую очередь снижается функция центрального звена, что, возможно, и приводит в дальнейшем к возрастным изменениям периферического звена эндокринной системы. У интактных старых животных возрастные изменения проявляются изменением функциональной активности НСЦ вследствие потери НСК (увеличение процента апоптоза (Рис. 3, 4А)) с одновременным повышением активности коры надпочечников, имеющем, вероятно, компенсаторный характер.

Полученные нами данные указывают на то, что оксидативный стресс может вызвать развитие апоптоза НСК, и на одной из начальных стадий данного процесса синтезируется белок с-fos (Рис. 4В). Показано, что активность НСК и число апоптотических клеток в СОЯ молодых и старых мышей не изменяется при гипероксии, т.е., вероятно, оксидативный стресс не является специфическим для данного ядра. Однако кислород вызывает увеличение числа с-fos-ИР НСК в ПВЯ животных обеих возрастных групп.

Обнаружено, что НСК гипоталамуса синтезируют Инс/ИПП, выступающий как фактор выживания клеток, однако его содержание снижается в нейронах старых животных, коррелируя с активацией апоптоза (Рис. 5А). По литературным данным, инсулин/ИПП в нейронах, связываясь со своим мембранным рецептором, активирует PI3K/Akt-cAMP сигнальный путь, который может переключать внутриклеточные процессы, направляя текущий статус на метаболизм, клеточный рост и пролиферацию или апоптоз (Pertseva, 2005). Предупреждая апоптоз, Инс/ИПП способен индуцировать экспрессию Bcl-2 (Ueno et al., 1994) и подавлять активацию проапоптотических белков caspase-3 и Bad (Barber et al., 2001; Tseng et al., 2002). Итак, низкое содержание



Рис. 3. Микрофотография СОЯ старых мышей, окраска бромид этидия (апоптотические клетки), люминисцентная микроскопия, увел. х400.

АВ

Рис. 4. 4А Количество апоптотических НСК в СОЯ и ПВЯ. По оси У: проценты, М - молодые мыши, С - старые мыши. * - достоверность отличий по отношению к контролю, о - достоверность отличий между молодыми и старыми контрольными животными. То же для рис. 5-9. 4В Количество с-fos-ИР НСК в СОЯ и ПВЯ, По оси У: оптическая плотность.

Рис. 5. 5А Количество инсулин/ИПП-ИР материала в СОЯ и ПВЯ. 5В Количество вазопрессин-ИР материала в СОЯ и ПВЯ.



Рис. 6. Микрофотография ПВЯ молодых мышей. ИГХ реакция с антителами к Мcl-1, увел. х400.

Инс/ИПП в изучаемых НСК старых животных изменяет физиологический статус этих клеток, промотируя клеточную смерть. Снижение содержания Инс/ИПП, вероятно, может также приводить к зависимому от возраста уменьшению экспрессии с-fos в НСЦ (Рис. 4В). Снижение способности НСК активировать гены предраннего ответа (с-fos) в ответ на внеклеточные сигналы может быть одной из причин, приводящих к значительной потере нейронов СОЯ и ПВЯ при старении.

Взятые вместе, наши находки поддерживают предположение об апоптозе при старении как конечном пункте генетически программированного плана развития.

Показано, что белок Bcl-2 в нейронах НСЦ старых мышей не препятствует инициации апоптоза. Регуляция апоптоза одинакова в изучаемых НСЦ у молодых мышей (см. предлагаемую нами схему - Рис. 20). Однако пути, приводящие стареющую клетку к гибели, различаются в СОЯ и ПВЯ (в ПВЯ - уменьшение экспрессии Mcl-1 (Рис. 6), Bcl-2, Инс/ИПП, в СОЯ - только Инс/ИПП (Рис. 5А), усиление проапоптотического звена - в СОЯ повышается уровень p53 и Вах, а в ПВЯ - только р53) (Рис. 20). Это свидетельствует о тесной связи старения и апоптоза.

Изучено действие иммуномодуляторов на НСК гипоталамуса в онтогенезе.

Эффект ИА у старых животных проявляется усилением дистрофических процессов и снижением белкового синтеза в СОЯ и ПВЯ (Рис. 5). У молодых мышей не показано влияние ИА на НСЦ, но обнаружено увеличение количества апоптотических клеток в коре надпочечников. Сигнальный каскад апоптоза у молодых мышей при действии ИА идентичен в обоих ядрах, тогда как у старых мышей есть различия между СОЯ и ПВЯ (см. предлагаемую нами схему - Рис. 7). Эти различия могут быть связаны с возрастными изменениями, происходящими в ГГАКС интактных старых животных.

ИГХ исследование содержания ВП показало, что у молодых и старых контрольных мышей в клетках СОЯ ВП экспрессируется несколько интенсивнее, чем в ПВЯ (Рис. 5В). Была обнаружена тенденция к снижению содержания ВП в НСК обоих НСЦ при старении. ИА оказывает супрессорный эффект на синтез ВП, инсулина/ИПП (Рис. 5) и Bcl-2 (Рис. 8) в клетках молодых и старых мышей.

Рис. 7. Влияние ИА на функциональное состояние НСК и уровень апоптоза у молодых и старых мышей.



Рис. 8. Количество Bcl-2-ИР материала в СОЯ и ПВЯ. По оси У: оптическая плотность.

Обнаружено, что ИА не является протектором апоптоза нейронов гипоталамуса при старении, однако введение циклоферона, индуктора эндогенного интерферона, сопровождалось уменьшением уровня апоптоза у молодых и старых животных. Применение иммуномодуляторов перед стрессом снижает уровень апоптоза в НСЦ только у старых животных. Таким образом, участие иммуномодуляторов в регуляции программированной клеточной гибели зависит от стадии онтогенеза.

Участие гена TNF в механизмах апоптоза и старения НСК.

Проведенное исследование позволило изучить программированную клеточную гибель нейронов гипоталамуса TNF-нокаутных мышей, выявить зависимость апоптотического каскада от активации каспаз и оценить адаптивные возможности НЭС в позднем онтогенезе.

Мы показали, что уровень апоптоза НСК гипоталамуса молодых мышей не отличается у животных разных линий (TNF-/-, WT и белых беспородных), также как и динамика апоптоза в позднем онтогенезе (значительное повышение количества гибнущих нейронов, примерно одинаковое в СОЯ и ПВЯ, во всех группах мышей, максимальное у белых беспородных мышей) (Рис. 9).



A B

Рис. 9. А Уровень апоптоза в НСЦ. Обозначения: По оси У: проценты, WT - мыши дикого типа (wild type), TNF-/- - TNF-нокаутные мыши, М - молодые мыши, С - старые мыши, МК - молодые белые беспородные мыши, СК - старые белые беспородные мыши, * - достоверность отличий по отношению к молодым животным, «WTC» - достоверность отличий по отношению к старым мышам дикого типа, «TNF-/-C» - достоверность отличий по отношению к старым TNF-нокаутным мышам. То же для последующих рисунков данной главы. В Апоптотические клетки в ПВЯ старой TNF-нокаутной мыши, окраска этидия бромидом, увел. х400.

Различия в уровне caspase-8 в НСЦ, выявленные у молодых мышей разных линий, исчезают с возрастом, поскольку синтез caspase-8 при старении увеличивается во всех группах (Рис. 10А). Отмечено, что в НСЦ старых животных содержание caspase-8 коррелирует с уровнем апоптоза в изученных группах мышей (Рис. 10А). Можно предположить, что в отсутствие TNF активация caspase-8 осуществляется другими факторами, например, через FAS-ligand, IL-6, р53 и тд. Таким образом, можно заключить, что интенсификация апоптоза при старении не зависит от гена TNF, и апоптоз при старении является каспазо-зависимым.

Не было выявлено активации caspase-9 при старении, влияние возраста либо отсутствовало (TNF-нокаутные мыши), либо выражалось в снижении уровня данного показателя (WT) (Рис. 10В). В настоящее время описаны 2 каспазо-зависимых пути апоптоза, один из них, инициируемый извне, идет посредством активации caspase-8 рецепторами клеточной поверхности, другой, внутренний, связан с освобождением цитохрома с, последующей активацией APAF1 и, далее, caspase-9 (Madden et al., 2007). Результаты нашего исследования показывают, что при старении в НСК мышей активируется внешний путь клеточной гибели, c участием поверхностно-клеточных рецепторов. Причиной активации данного пути апоптоза может быть любой генотоксический стресс, например, оксидативный - как известно, при старении значительно повышается уровень перекисного окисления липидов (Ishii, 2007).

Рис. 10. 10А Содержание caspase-8-ИР материала в НСЦ. Обозначения: «WTM» - достоверность отличий по отношению к молодым мышам дикого типа, «TNF-/-М» - достоверность отличий по отношению к молодым TNF-нокаутным мышам. 10В Содержание caspase-9-ИР материала в НСЦ.

Для определения путей регуляции программированной клеточной гибели мы исследовали экспрессию белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Mcl-1, Bax) в НСК. Синтез проапоптотического белка Вах в НСК можно оценить неоднозначно: примерно одинаковый уровень у молодых животных всех линий и значительные отличия при старении (повышение в СОЯ во всех группах, снижение в ПВЯ (WT) или отсутствие изменений (TNF-/-, нелинейные мыши)) (Рис. 11А). Ранее нами было показано, что в активации возраст-зависимого апоптоза имеет значение соотношение Вах с другими членами семейства Bcl-2 (Bcl-2, Mcl-1) (Бажанова и др., 2006; Молодцов и др., 2006). Несмотря на уменьшение количества проапоптотического белка Вах в ПВЯ, снижения уровня апоптоза не происходит, вероятно, за счет активации каких-либо других белков-индукторов апоптоза (предположительно р53), и интенсивно экспрессирующейся caspase-8.

В отношении антиапоптотического белка Bcl-2 нужно отметить, что изменения его при старении (возрастание в СОЯ и снижение в ПВЯ) наблюдались только у нелинейных мышей (Рис. 11В). Примерно так же можно

Рис. 11. Содержание Вах-ИР (11А), Bcl-2-ИР (11В), Mcl-1-ИР (11С), ВП-ИР (11D) материала в НСЦ. Обозначения: «wtM» - достоверность отличий по отношению к молодым мышам дикого типа, «TNF-/-М» - достоверность отличий по отношению к молодым TNF-нокаутным мышам.

Охарактеризовать и изменения при старении уровня другого антиапоптотического белка, Mcl-1: повышение синтеза в СОЯ старых мышей всех изученных групп и отсутствие изменений (WT, TNF-/-) или даже снижение (нелинейные мыши) в ПВЯ (Рис. 11С). В сравнении с возрастающим при старении уровнем апоптоза НСК это говорит о том, что протекторная функция антиапоптотических белков-членов семейства Bcl-2 на поздних этапах онтогенеза снижается, и эти белки уже не могут уменьшить число гибнущих нейронов (Рис. 11А-С).

Таким образом, одной из причин апоптоза в СОЯ при старении является повышение уровня проапоптотического белка Вах во всех изученных группах животных, в ПВЯ - дисбаланс синтеза белков семейства Bcl-2 (Рис. 11А-С).

Содержание ВП в НСК является важным морфофункциональным критерием НЭС. По нашим данным, уровень ВП у молодых нелинейных мышей значительно выше, чем у TNF-нокаутных и WT животных (Рис. 11D). При старении у белых беспородных мышей количество ВП в НСК гипоталамуса не изменялось. Однако даже повышение содержания данного нейрогормона у старых мышей TNF-/- и WT не позволяет достигнуть уровня ВП у нелинейных животных (Рис. 11D).

В своих исследованиях мы показали отсутствие изменений ВП на поздних этапах онтогенеза у мышей линии SHR (Молодцов и др., 2006), и повышение синтеза его у HER2/neu (Бажанова и др., 2007, 2009) и крыс Wistar (Бажанова и др., 1996). Другими авторами была выявлена активация синтеза ВП у людей после 80 лет и у старых крыс (Fliers et al., 1985). Можно заключить, что экспрессия ВП в гипоталамусе примерно одинакова в разных НСЦ (СОЯ и ПВЯ), и зависит от возраста и генотипа животного.

Таким образом, в нашей работе впервые показана динамика апоптоза НСК в онтогенезе TNF-/- мышей, рассмотрен сигнальный каскад клеточной гибели при отсутствии TNF?, и произведена оценка функционального состояния (уровень вазопрессина) НЭС мышей разных генетических линий. Выявлена интенсификация синтеза ВП при старении у животных обеих линий. Мы показали, что при старении наблюдается активация апоптоза НСК, и отсутствие гена TNF не влияет на активность данного процесса. Результаты проведенного исследования показывают, что при старении в НСК мышей активируется внешний путь клеточной гибели, c участием поверхностно-клеточных рецепторов и caspase-8, а также р53-зависимый путь. Сигнальные пути, опосредующие клеточную гибель в разных НСЦ при старении, различны. Так, в СОЯ Вах играет определяющую роль в индукции апоптоза НСК при старении во всех изученных группах животных. В ПВЯ большее значение имеет снижение антиапоптотической защиты. Таким образом, дисбаланс синтеза белков семейства Bcl-2 играет важную роль в развитии старческого апоптоза.

...