Разработка системы поиска препаратов для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии наук Институте физиологически активных веществ РАН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Разработка системы поиска препаратов для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Григорьев Владимир Викторович

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологически активных веществ РАН

Научный консультант:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Сергей Олегович Бачурин.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Георгий Иванович Ковалев;

Доктор биологических наук Анатолий Николаевич Иноземцев;

Доктор биологических наук, профессор Николай Михайлович Митрохин.

Ведущая организация - ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится 2009 года на заседании диссертационного Совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан “2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (г. Москва, ул. Балтийская, д. 8).

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Е.А. Вальдман.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Характерной тенденцией развития современного общества в большинстве стран мира является увеличение продолжительности жизни и связанное с этим повышение в структуре населения доли лиц пожилого и старческого возраста. Эти процессы видоизменяют удельный вес различных форм патологий в популяции, среди которых доминирующее место занимают нейродегенеративные болезни. Именно поэтому, проблема когнитивных расстройств, в большинстве случаев развивающихся при нейродегенеративных заболеваниях позднего возраста, признается в настоящее время одной из наиболее актуальных и значимых с медико-социальной точки зрения (Иллариошкин, 2007).

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний в пожилом возрасте. Ежегодно число больных БА и родственными формами увеличивается на 800 тысяч в Европе и на 360 тысяч в США и Канаде (Brookmeyer et al., 1998; Sykes et al., 2001). К настоящему времени число людей с БА составляет около 20 млн. человек во всем мире, что наносит экономический ущерб, оцениваемый в 100 миллиардов долларов ежегодно (Fillit, Hill, 2005). Проблема старческого слабоумия является исключительно актуальной также и для нашей страны. Анализ эпидемиологических исследований позволяет говорить о том, что общая численность больных БА в России превышает 1 млн. человек (Гаврилова, 2001).

Вместе с тем, в настоящее время в реальной медицинской практике для лечения, в частности, БА широко используется крайне ограниченное число препаратов - всего четыре, три из которых являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы. Все эти препараты обладают рядом побочных свойств. Поэтому создание новых препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций является важнейшей задачей современной фармакологии (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 1998; Воронина, Т.А., 2003; Островская Р.У. и др., 2002; Bachurin, 2003; Середенин С.Б. и др., 2006).

Одним из наиболее интенсивно развиваемых в настоящее время направлений создания новых лекарственных средств является поиск потенциаторов АМРА рецепторов и блокаторов NMDA рецепторов глутаматергической системы мозга (Lynch, Gall, 2006; Villmann, Becker, 2007). Неконкурентный блокатор NMDA рецепторов мемантин уже используется для лечения больных БА (Farlow, 2004). В то же время попытки применения других блокаторов NMDA- или потенциаторов АМРА рецепторов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций у человека дают неоднозначные результаты. Потенцируя АМРА рецепторы в опытах in vitro, и улучшая память экспериментальных животных в поведенческих экспериментах, а также у людей-добровольцев, ряд потенциаторов АМРА рецепторов в клинических испытаниях не показывает достоверного улучшения когнитивных функций больных (Goff et al., 2008; Chappel et al., 2007). Безуспешными до сих пор остаются и попытки клинического использования антагонистов NMDA рецепторов (кроме мемантина) (Ikonomidou et al., 2000; Ikonomidou, Turski, 2002; Albensi et al., 2004). Все это делает актуальным выработку системы поиска перспективных соединений среди потенциаторов АМРА- и блокаторов NMDA рецепторов для оптимизации процесса создания новых лекарственных средств.

Цель исследования.

Определить прогностическую роль модуляции АМРА и NMDA рецепторов ЦНС млекопитающих лигандами глутаматных рецепторов с целью оптимизации поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях

Задачи исследования

1. Изучить влияние ряда эндогенных гормонов и пептидов на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов нейронов мозга млекопитающих.

2. Определить электрофизиологическим методом параметры ответов АМРА и NMDA рецепторов нейронов коры и мозжечка головного мозга млекопитающих на воздействие новых соединений.

3. Исследовать когнитивно-стимулирующие свойства наиболее активных соединений в поведенческих тестах.

4. Изучить нейропротективное и когнитивно-стимулирующее действие отечественного лекарственного препарата димебон и участие глутаматных рецепторов в его реализации.

5. По результатам исследований определить критерии поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

Научная новизна

Впервые электрофизиологическим методом показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, в которых ответы NMDA рецепторов на агонисты NMDA и хинолинат, соагонист глицин, конкурентные антагонисты АР5 и АР7 значительно отличаются. Полученные результаты, наряду с данными других исследователей, полученными методами молекулярной биологии, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих.

Получены новые данные о механизмах действия ряда эндогенных пептидов на глутаматные рецепторы, свидетельствующие об их способности существенно модулировать работу АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга и тем самым влиять на когнитивные функции и нейродегенеративные процессы.

Впервые выявлено, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) потенцирует токи АМРА рецепторов и блокирует токи NMDA рецепторов. Установлено, что соматостатин аналогичным образом влияет на ответы АМРА и NMDA рецепторов. Можно предположить, что эти свойства CLIP и соматостатина определяют их важную роль в процессах формирования памяти.

Среди новых представителей химических классов: ациклических производных изотиомочевины (дибензиламинов и изотиомочевин) и N,N-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены вещества, обладающие свойствами позитивных аллостерических модуляторов АМРА рецепторов и неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов. Показано, что соединения-лидеры - IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 - обладают высокими когнитивно-стимулирующими свойствами и низкой токсичностью.

Впервые установлен механизм действия димебона на АМРА и NMDA рецепторы и изучены его переносимость и влияние на отдельные показатели старения у экспериментальных животных при длительном применении.

Установлено, что действие димебона на АМРА и NMDA рецепторы аналогично действию эндогенных пептидов, играющих важную роль в формировании памяти.

Сформулирована система поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов на основе способности веществ одновременно потенцировать АМРА- и блокировать NMDA рецепторы.

Научно-практическая значимость

1. Разработана методология поиска препаратов для коррекции когнитивных функций при нейродегенративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

2. Расширено представительство химических классов позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

3. Показано, что соединения-лидеры - IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 представляют несомненный интерес для дальнейших предклинических испытаний в качестве препаратов для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях.

4. Показано, что представитель гидрированных пиридо ([4,3-b]) индолов - димебон - помимо высоких когнитивно-стимулирующих и нейропротекторных свойств, обладает также свойствами при длительном применении предупреждать развитие отдельных признаков старения экспериментальных животных.

5. Результаты электрофизиологических и фармакологических исследований димебона легли в основу нормативных материалов и были представлены в Россздравнадзор для получения разрешения на проведение клинических испытаний димебона по новому применению - в качестве средства для лечения БА.

Личный вклад автора

Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи и планов работы, в постановке и проведении экспериментальных исследований, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Апробация работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены на следующих научных конференциях и съездах: на I Всесоюзном Совещании «Глутаматные рецепторы», Ленинград, 1987; на 7-th Conference of European Neurochemichal Society, Sweden, Stockholm, 1988; на межреспубл. конференции, Волгоград, 1989; на XIY Менделеевском Съезде, Москва, 1989; на 13^rd Int. Congress of the Int. Society for Neurochemistry, Australia, Sydney, 1991; на 3^rd Int. Congress of Compar. Physiol. and Bioch., Tokyo, 1991, на 16-th Meeting of the Int. Society for Neurochemistry, 1997, Boston, USA; на 4-th Congress of European Society for Clinical Neuropharmacology, 1997, Eilat, Israel; на 9-th Int. Congress of the Czech and Slovak Neurochemichal Society, 1998, Martin, Slovakia; на 2-й Российской конф. Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии, 1999, Москва; на 5^th Int. Conf. on Neuroprotective Agents, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA; на III Российской конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Э.Я.Штернберга, 2003, Москва; на Конф. «Фундаментальные науки-медицине». Росс. Акад. Наук, Москва, 2003; на XVII^th Int. Symposium on Medicinal Chemistry, 2004, Copenhagen, Denmark & Malmo, Sweeden; на Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc: the World of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery, 2004, Gif-sur-Yvette, France; на Симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), 2005, Москва; на 7^th Int. Conference “Alzheimer's and Parkinson's Diseases”, Sorento, Italy, 2005; на XIV European Bioenergetics Conference, 2006, Moscow; на 8^th Int. Symposium on Neurobiology and Neuroendocrinology of Aging, Bregenz, Austria, 2006; на 10^th Int. Conf. on Alzheimer's Disease and Related Disorders, Madrid, Spain, 2006; на III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», 2007, С-Петербург; на конференции «Орг. химия для медицины», 2008, Черноголовка.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 14 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК; получено 8 патентов на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав, посвященных описанию материала, методов и результатов исследования, обсуждению результатов, выводов, а также списка использованных 485 источников литературы, включающего 68 работ отечественных и 417 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 85 рисунков.

Материалы и методы исследования

Исследованы новые соединения 3-х химических классов. Ациклические изотиомочевины были условно разделены на два класса: дибензиламины (N, S-замещенные N'-1-[(гетеро)арил] -N'-[(гетеро)арил] метилизотиомочевины), и алкилизотиомочевины (S-замещенные N-1-[(гетеро)арил]алкил-N'-1-[(гетеро)арил] алкилизотиомочевины), синтезированные к.х.н. А.Н. Прошиным (ИФАВ РАН); N,N'-замещенные 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаны и производные пирролидинового ряда (аналоги АМПАкина BDP), синтезированы на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова М.И. Лавровым (Зав. кафедрой - академик РАН Н.С. Зефиров).

Исследованы эндогенные вещества: дельта-пептид сна (DSIP) (кат. № 150793, ICN), уридин (кат. № U3750, “Sigma”), мурамиловые пептиды (MDP) (кат. № A9519, “Sigma”), интерлейкин-1в (IL-1в) (кат. № 195774, ICN), кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) (кат. № 152723, ICN), холецистокинин (CCK-4) (кат. № 154544, ICN), соматостатин (кат. № 195505, ICN); производные арахидоновой и докозагексаеновой кислот: амиды арахидоновой (AК) кислоты с дофамином - анандамид (AК-ДA), и этаноламином (AК-ЭA), амид докозогексаеновой кислоты (ДГК) с дофамином (ДГК-ДA), и эфиры ДГК с этиленгликолем (ДГК-ЭГ) и нитроэтиленгликолем (ДГК-НЭГ). Производныe АК и ДГК синтезированы д.х.н., проф. В.В. Безугловым (Институт Биоорганической Химии РАН) и к.х.н. И.В. Серковым (ИФАВ РАН); производные глутаминовой кислоты - фосфорсодержащие аминокарбоновые кислоты - 2-амино-5-фосфонопентановая (АР5) и 2-амино-7-фосфоногептановая (АР7) кислоты, синтезированные к.х.н. В. В. Рагулиным (ИФАВ РАН).

В качестве препаратов сравнения исследованы лекарственные средства: димебон (субстанция, ООО “Органика”), мемантин (М9292, “Sigma”), такрин (№ 154198, ICN), и соединения: циклотиазид (C9847, “Sigma”) и МК-801 (M107, Sigma”).

Для создания на животных экспериментальной модели болезни Альцгеймера использовали нейротоксин AF64A - (1-этил-1[2-гидроксиэтил]азиринидиум хлорид (“Bachem”).

Эксперименты в тесте «Условный рефлекс активного избегания» проведены на 160 крысах самцах популяции Вистар массой 240-280 г.

Эксперименты в тесте «Узнавания новой локализации объекта» проведены на 440 мышах самцах линии C57Bl/6 в возрасте 3-4 месяца.

Эксперименты в тесте «Открытое поле» проведены на 30 мышах самках линии C57Вl/6 в возрасте 27 месяцев.

Хронический эксперимент по изучению переносимости димебона при его длительном применении проведен на 98 мышах-самках линии С57Bl/6 возраста 21 месяц.

Все животные содержались в виварии ИФАВ РАН в стандартных условиях. Световой цикл состоял из 12 часов дня и 12 ночи, день начинался в 6 часов и заканчивался в 18 часов.

Животные получали комбикорм ПК-120-1 для лабораторных крыс и мышей (экструдированный). Сертификат соответствия № POCC RU. ПР15. В11046.

ГОСТ Р50258-92.

Для измерения трансмембранных токов исследуемых нейронов Пуркинье мозжечка головного мозга крыс и нейронов коры головного мозга крыс, а также культивируемых нейронов гиппокампа крыс нами использован электрофизиологический метод patch-clamp в конфигурации whole cell (Hamill et al., 1980).

Нейроны Пуркинье выделяли из мозжечков 12-16 дневных крыс популяции Вистар. Для выделения использовали модифицированный метод Kaneda et al., (1988). Для выделения нейронов коры головного мозга использовали тот же метод с той лишь разницей, что возраст крыс составлял 7-9 дней, и время инкубации с ферментами составляло 14-16 минут в зависимости от возраста животных.

Культуральные нейроны получали из гиппокампов новорожденных крыс (1-2 суток) способом трипсинизации с последующим пипетированием. Культуральные клетки приготовлялись к.б.н. Н.Н. Лермонтовой и н.с. Т.П. Серковой (ИФАВ РАН).

Для получения трансмембранных токов производили активацию АМРА (б-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота) рецепторов аппликацией растворов агонистов этих рецепторов - каиновой кислоты (КК) или глутаминовой кислоты, активацию NMDA рецепторов - аппликацией растворов агониста этих рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA) методом быстрой суперфузии растворов.

Для отведения токов использовали боросиликатные микроэлектроды (сопротивление 2,5 - 5,5 мОм). Для регистрации токов использовали прибор EPC-9 (HEKA, Germany). Запись токов осуществлялась при помощи лицензионной программы Pulse (HEKA) на жесткий диск компьютера Pentium-3. Обработка результатов осуществлялась при помощи программы Pulsefit (HEKA).

Экспериментальная модель БА на крысах создавалась внутрижелудочковой инъекцией нейротоксина AF64A, который вызывает селективное разрушение ацетилхолиновых синаптических окончаний с последующей деградацией нейронов и снижением содержания ацетилхолиновых маркеров в гиппокампе и коре головного мозга крыс (Fisher, Hanin, 1986; Walsh, Opello, 1994; Lermontova et al., 1998). Под эфирным наркозом в стереотаксисе крысам в боковые желудочки мозга инъецировали 3 нмоль AF64A в 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости, контрольным крысам вводили 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости.

Действие эндогенных гормонов и пептидов на пресинаптические глутаматные рецепторы определяли при помощи метода захвата ⁴⁵Са²⁺ в синаптосомы коры мозга крыс при стимуляции глутаматом и NMDА. Синаптосомы коры мозга крыс выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajosh, 1975) из коры мозга новорожденных крысят (9-10 дней) популяции Вистар. Данные эксперименты проводили совместно с н.с. Л.Н. Петровой (ИФАВ РАН).

Исследования по оценке «Условного рефлекса активного избегания» (УРАИ) проведены на крысах с экспериментальной моделью БА по методу Т.А. Ворониной, Р.У. Островской (2005). На следующий день после операции крысам первой группы внутрибрюшинно вводили исследуемые вещества - димебон или IP5051 - в соответствующих дозах и это введение осуществляли ежедневно в течение 12 - 14 дней. Другой группе крыс с холинотоксином AF64A давали физраствор из расчета 0,1 мл/кг веса. Группам сравнения с холинотоксином AF64A вводили антихолинэстеразный препарат такрин или блокатор NMDA рецепторов мемантин. Контрольной интактной группе крыс внутрибрюшинно в течение всего времени эксперимента вводили физраствор. Все крысы в двухкамерной клетке типа Shuttle-box обучались избегать болевого раздражения, подаваемого через электрифицированный пол. Данные эксперименты проводили совместно с к.х.н. Н.В. Лукояновым и к.б.н. Н.Н. Лермонтовой (ИФАВ РАН).

Изучение действия веществ на память осуществляли с помощью теста узнавания объекта (“Object recognition test”) по методу (Gaffan, 1992; Kolb et al., 1994; Steckler et al., 1998). Эксперименты проводили в камере наблюдения, которая изготовлена из непрозрачного органического стекла белого цвета размером 48х38х30 см. В качестве объектов обследования использовали стеклянные флаконы коричневого цвета диаметром 2,7 см и высотой 5,5 см. За 2 - 3 мин. до помещения животного камеру и объекты обследования протирали 85% спиртом. Животных всегда помещали в центр камеры. Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно за 1 час до тренировки. Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя. Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

Для определения двигательной активности животных, их эмоционального состояния и ориентировочно-исследовательской реакции использовали тест открытого поля по методу Т.А. Ворониной, С.Б. Середенина (2005). Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

Состояние органов и тканей животных в длительном эксперименте оценивали с помощью гистологического метода. Для этого у павших животных и у животных в агональном состоянии забирали кусочки из внутренних органов и тканей. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после гистологической проводки заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Данные эксперименты проводили совместно с проф. Л.М. Михалевой (ГУ НИИ морфологии человека РАМН).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета программы Microsoft Excell (версия Windows XP). Представлены средние арифметические и их доверительные интервалы (M±m). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Достоверными принимали различия при р?0,05. Построение графиков осуществляли также с помощью программы Microsoft Excell.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение влияния эндогенных физиологически активных веществ и их синтетических производных на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов

Фундаментальные исследования, проведенные электрофизиологическим методом patch-clamp на свежевыделенных нейронах коры и гиппокампа головного мозга крыс в конце 80-х годов, показали, что в разных нейронах ответы на агонист NMDA рецепторов NMDA, его эндогенный лиганд хинолиновую кислоту (ХК), соагонист глицин и конкурентные антагонисты АР5 и АР7 существенно варьировали. Обнаружено 4 типа нейронов, в которых сочетания ответов на эти вещества имели устойчивый характер, но существенно отличались друг от друга (Grigoriev et al., 1991а, 1991б; Григорьев и др., 1992, Григорьев, 1993а; 1993б). В нейронах 1 типа возможность генерации токов NMDA и ХК полностью зависела от наличия глицина, АР5 полностью подавляла NMDA- и ХК-активируемые токи, АР7 блокировала токи только на 60%; в нейронах 2 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые не зависели от наличия глицина, АР5 и АР7 полностью блокировали токи NMDA и ХК с глицином и без него; в нейронах 3 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые глицин существенно потенцировал, АР5 и АР7 обе почти одинаково блокировали токи обоих агонистов на 40-70%; в нейронах 4 типа NMDA и ХК без глицина вызывали разные токи, глицин изменял ток NMDA, но не влиял на ток ХК, АР5 не влияла на токи ХК, но блокировала изменение тока NMDA, АР7 блокировала прибавку тока, которую давал глицин, и частично подавляла ток без глицина.

Одновременно в ведущих лабораториях мира методами молекулярной биологии были выделены mРНК субъединиц NMDA рецепторов. Было установлено, что имеются два основных типа субъединиц: NR1 и NR2, но субъединиц NR2 имеется 4 подтипа - NR2A, NR2B, NR2C и NR2D (Holmann, Heineman, 1994). Полученные методом реконструкции 4 типа NMDA рецепторов, состоящие из двух NR1 и двух каких-либо NR2(Х) субъединиц имели существенные отличия в своих функциональных и фармакологических свойствах (Buller et al., 1994; Chazot et al., 1994; Monyer et al., 1994; Laurie, Seeburg, 1994; Kendrick et al., 1996; Buller, Monaghan, 1997). В то же время имелось значительное сходство в реакциях этих разнородных NMDA рецепторов с данными, полученными нами.

Таким образом, полученные нами результаты, наряду с данными других исследователей, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих, что явилось фундаментом для последующего синтеза избирательных и терапевтически перспективных лигандов этих рецепторов.

С целью установления механизмов эндогенной регуляции когнитивных и нейродегенеративных процессов было изучено влияние ряда эндогенных пептидов на АМРА и NMDA рецепторы.

Электрофизиологические эксперименты на нейронах гиппокампа показали, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) вызывает потенциацию ответов АМРА рецепторов в широком диапазоне концентраций (рис. 1). Кроме того, CLIP блокирует ответы постсинаптических NMDA рецепторов, и в определенном диапазоне концентраций блокирует пресинаптические NMDA рецепторы. Особенностью действия CLIP на пресинаптические NMDA рецепторы является то, что он вызывает их блокаду только в очень низких концентрациях - 10^-14-10^-11 М.

Рис. 1. Влияние CLIP на NMDA (1) и КК (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентраций CLIP в Молях, по оси ординат - амплитуда токов по отношению к контролю %.

Соматостатин блокирует постсинаптические NMDA рецепторы, но активирует АМРА рецепторы практически во всем диапазоне концентраций (рис. 2). Это хорошо согласуется с его противосудорожным действием и участием в процессах памяти (Matsuoka et al., 1994). Соматостатин также блокирует вход кальция, который вызывается активацией пресинаптических NMDA рецепторов, что подтверждает ранее полученные результаты о блокаде им входа кальция в пресинаптические терминали (Boehm, Betz, 1997).

Рис. 2. Влияние соматостатина на KK- (1) и NMDA (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентраций соматостатина в Молях, по оси ординат - амплитуда токов по отношению к контролю в % (контроль=100%).

Установлено, что дельта-сон-вызывающий пептид (DSIP) блокирует постсинаптические NMDA рецепторы. Определенный интерес имеют установленные нами различия в действии DSIP на постсинаптические NMDA рецепторы в нейронах коры и гиппокампа. Начиная с концентрации DSIP 1х10^-13 М, величина ответов в нейронах коры составляет в среднем 40% от контрольных величин. В нейронах гиппокампа его действие несколько отличается: блокирующий эффект наблюдается с концентраций DSIP на порядок выше - 1х10^-12 М - и имеет волнообразный характер. Установлено, что DSIP также оказывает ингибирующее действие на пресинаптические NMDA рецепторы. В то же время DSIP не влияет на ответы АМРА рецепторов.

Уридин вызывал значительную, но не полную блокаду постсинаптических NMDA рецепторов и практически полную концентрационно-зависимую блокаду пресинаптических NMDA рецепторов. Учитывая сомногенное действие уридина, можно предположить, что он играет важную роль в процессах общего торможении ЦНС, и также нейропротекторную роль во время сна (Kimura et al., 2001). Обнаружен небольшой потенцирующий эффект уридина на АМРА рецепторы, но пока не установлена его роль в когнитивных процессах.

Мурамиловые дипептиды (MDP) в наших экспериментах потенцировали АМРА и блокировали NMDA рецепторы. Холестокинин (ССК-4) блокировал захват кальция в узком диапазоне доз - (1х10^-9 - 1х10^-7 М) и в этом отношении его действие похоже на действие интерлейкина 1-в (IL1-в), только последний был на 2 порядка активнее. Эти данные говорят о том, что оба эти вещества в узком диапазоне доз способны модулировать пресинаптические NMDA рецепторы и тем самым нервную возбудимость и пластичность.

Проведенные исследования показали, что производные АК и ДГК в низких концентрациях, в отличие от самих кислот, способны влиять на ответы АМРА рецепторов. AК-ДА, ДГК-ДА и ДГК-ЭГ способны заметно потенцировать трансмембранные токи, вызываемые активацией АМРА рецепторов. ДГК-НЭГ, напротив, вызывает угнетение токов АМРА рецепторов. Полученные результаты подтверждают, что модификация молекулы эндогенного вещества может привести к весьма существенному изменению спектра его физиологической активности.

Наибольший интерес представляют данные о действии CLIP, который оказывает стимулирующее влияние на память во время фазы парадоксального сна, на глутаматные рецепторы (Seidenbecher et al., 1993; Wetzel et al., 2003; Ambrosini et al., 2001; Wetzel et al., 1994), а также соматостатина. Нами впервые установлено, что CLIP и соматоститин потенцируют АМРА рецепторы и блокируют NMDA рецепторы в широком диапазоне концентраций (6 порядков), что является крайне важным для проявления их память-стимулирующего эффекта. Полученные результаты расширяют наши знания о том, как эндогенные соединения могут осуществлять регуляцию когнитивных процессов. Один из таких механизмов может заключаться в модуляции АМРА и NMDA рецепторов.

Анализ полученных результатов в данном разделе работы позволяет заключить, что исследованные эндогенные пептиды играют важную роль в регуляции глутаматергической медиаторной системы мозга. Они действуют в крайне низких концентрациях, начиная с концентрации 1х10^-14 М, концентрационно зависимо и обратимо, что говорит об исключительной специфичности соответствующих рецепторов. Диапазон оказываемого ими влияния на ответы постсинаптических глутаматных рецепторов достаточно узок и, как правило, не превышает 60-70% изменения от уровня контрольных значений.

Таким образом, выявленные параметры модуляции АМРА и NMDA рецепторов эндогенными веществами, в первую очередь CLIP и соматостатином, дают ориентиры для поиска и отбора синтетических соединений в качестве потенциальных терапевтических препаратов. На их основе были разработаны направления синтеза новых соединений в нескольких химических классах.

Изучение влияния новых химических соединений на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов

В результате направленного синтеза в ИФАВ РАН и на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова были синтезированы новые вещества в трех химических классах, которые были изучены на их способность модулировать ответы АМРА и NMDA рецепторов нейронов ЦНС.

Изучение влияния производных дибензиламинов

Действие веществ на АМРА рецепторы. Показано, что большая часть соединений этого класса потенцирует токи АМРА рецепторов, но с разной степенью эффективности. Результаты исследований действия веществ на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье представлены в таблице 1.

Табл. 1. Влияние новых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. В колонках - амплитуды токов в % при действии соответствующей концентрации вещества (M±m).

№ п/п	Шифр	Концентрация веществ
		10-7М	2х10-7М	5х10-7М	10-6М	10-5М	3х10-5М
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42	IP5051J IP5051Cl IP5051Br IP6016 IP6024 IP6025 IP9011 IP9039 IP9095 IP9117 IP9118 IP9120 IP9121 IP9122 IP9125 IP9126 IP9127 IP9128 IP9129 IP9143 IP9152 IP9153 IP9200 IP9223 IP9225 IP9236 IP9238 IP9240 IP9241 IP9242 IP9255 IP9260 IP9262 IP9263 IP9266 IP9267 IP9268 IP9269 IP9270 IP9271 IP9275 IP9276	100 100 100 100 100 100 100 - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 104 100 100 100 100 100 100 169 100 100 100 130 100 120 130 100 100 200	- - - - - - 145±35 100 105 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -	130±5 130±5 130±5 - - - 155±25 150±15 105 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -	165±10 165±10 165±10 145±5 160±10 100 145±25 130±5 105 100 100 120±10 110±5 125±10 100±5 180±10 100 100 100 100 210±10 220±20 100 100 170±10 100 124±5 139±10 119±5 125±5 100 173±5 160±20 200±20 180±15 140±15 135±5 260±5 170±10 100 115±5 143±15	550±35 550±25 550±25 260±15 285±25 100 100 100 105 100 100 160±20 140±15 170±20 125±5 250±20 100 100 100 100 245±20 280±30 100 100 210±15 100 150±15 180±25 140±10 360±45 100 164±15 560±45 810±130 210±20 178±22 470±10 330±10 185±10 160±5 300±45 142±10	1050±55 1050±55 1050±45 295±35 350±45 100 100 100 100 100 100 290±35 210±30 310±35 145±15 250±30 100 100 100 100 275±35 320±40 100 100 - 100 150±15 215±40 180±25 700±95 100 125±20 800±70 910±95 275±25 200±29 770±15 360±15 350±150 380±10 615±65 135±8

Примечание: амплитуда контрольных токов взята за 100%.

На рисунке 3 приведены графики влияния некоторых представителей производных дибензиламинов на каинат-вызванные токи, демонстрирующие диапазон их активности как потенциаторов АМРА рецепторов.

На основании анализа полученных данных определено наиболее активное соединение. Этим соединением оказалось IP5051, вызывающее наибольшую потенциацию АМРА рецепторов.

Проведенные исследования показали, что циклотиазид (ЦТ) - модельный потенциатор АМРА рецепторов, блокирующий их десенситизацию, и соединение IP5051 оказывают на КК-вызванные токи аналогичное действие. Графики зависимости концентрация - ответ для КК, и для КК в присутствии 30 мкМ ЦТ или IP5051 (рис. 4) показывают, что оба соединения вызывают непараллельный сдвиг кривой концентрация-ответ для КК в диапазоне концентраций последней от 10 до 4000 мкМ. Ответы в присутствии IP5051 были немного больше, чем в присутствии ЦТ.

Практически полное сходство действия ЦТ и IP5051 на ответы, вызываемые активацией АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье (рис. 4), позволяет сделать вывод, что в основе механизма потенцирующего действия IP5051 лежит блокада десенситизации АМРА рецепторов.

Рис. 3. Действие некоторых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. Соединения: 1 - IP5051, 2 - IP9242, 3 - IP9122, 4 - IP9260, 5 - IP9128.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентраций веществ в Молях, по оси ординат - амплитуда токов по отношению к контролю в %.

Рис. 4. Влияние ЦТ и соединения IP5051 на зависимость концентрация - ответ для токов, вызванных аппликацией КК в нейронах Пуркинье.

Примечание: Ответы нормализованы к ответам, вызываемым аппликацией максимально использованной концентрации КК - 4 мМ для соответственно контроля (?) (принятом за 1) и в присутствии 30 мкМ ЦТ (_) и IP5051 (?).

Действие соединения IP5051 на NMDA рецепторы в нейронах коры головного мозга крыс. Установлено, что IP5051 блокирует токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов. По степени чувствительности NMDA-активируемых токов к действию IP5051 и характеру вызываемой им блокады NMDA рецепторов исследованные нейроны коры головного мозга крыс были разделены на 2 группы.

Соединение IP5051 в нейронах 1 группы (n=5) блокировало ответы NMDA рецепторов в низких концентрациях. Важной особенностью действия IP5051 в этих нейронах явилось то, что более эффективно оно блокировало токи большей амплитуды. IC₅₀ соединения IP5051 для блокады токов различной амплитуды были неодинаковы и тем меньше, чем больше были NMDA-активируемые токи. Для максимальных токов в наших экспериментах IC₅₀ равнялась 0,4±0,15х10^-6 М. Для самых маленьких токов IC₅₀ равнялась 2,1±0,4х10^-6 М (рис. 5).

Рис. 5. Блокада соединением IP5051 NMDA-вызванных токов в нейронах 1 группы коры головного мозга крыс.

Примечание: 1- контроль, 2-6 - концентрации IP5051- 0,5 мкM, 1,0 мкM, 2,0 мкM, 10,0 мкM и 30,0 мкM соответственно.

Соединение IP5051 в нейронах 2 группы (n=13) вызывало блокаду NMDA-активированных токов в гораздо более высоких концентрациях. Характер блокирующего действия в этих нейронах также существенно отличался от действия IP5051 в нейронах 1 группы. Величина блокирующего эффекта не зависела от амплитуды NMDA-активированных токов. IC₅₀ соединения IP5051 в этой группе нейронов составляет примерно 2,3х10^-5 М.

Изучение влияния производных алкилизотиомочевины

Действие веществ на АМРА рецепторы. Только два соединения данного класса веществ - IP9040 и IP9150 потенцировали токи АМРА рецепторов. Особенностями действия этих веществ на токи АМРА рецепторов являются небольшие величины потенцирующего эффекта - максимум 170% от контроля - и обращение потенцирующего эффекта на противоположный при дальнейшем увеличении концентрации веществ (табл. 2).

Табл. 2. Влияние новых производных алкилизотиомочевины на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

№п/п	Шифр IP	10-9 М	10-8 М	3х10-8 М	10-7 М	5х10-7 М	10-6 М	10-5 М	3х10-5 М
1 2 3 4 5 6 7 8 9	IP9040 IP9130 IP9131 IP9132 IP9133 IP9134 IP9135 IP9142 IP9150	- - - - - - - - 107±2	100 - - - - - - - 165±22	136±5 - - - - 100 - - -	137.5±4 102 105 100 100 107 100 100 127±9	148±6 - - - - - - - -	121±3 105 110 100 100 105 100 100 100 ±10	57±7 83 92 98 100 80 100 100 90	38±9 - - - - - - - 85

Примечание: амплитуда контрольных токов взята за 100%. Вверху - концентрации веществ в молях. В колонках - амплитуды токов в % к контрольным значениям при действии соответствующей концентрации вещества (M±m). Амплитуда контрольных токов взята за 100%.

Действие веществ на NMDA рецепторы. Установлено, что соединение IP9040 во всех исследованных нейронах коры головного мозга (n=7) одинаково блокирует NMDA-активируемые токи независимо от их амплитуды. IC₅₀ для IP9040 составила 0,8±0,2х10^-6 М. Соединение IP9150 аналогичным образом блокировало токи NMDA рецепторов. IC₅₀ для IP9150 - 1,5±0,5х10^-6 М (n=4).

Изучение влияния производных N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло [3.3.1] нонанов на функциональное состояние АМРА рецепторов

На основании компьютерного моделирования на кафедре органической химии МГУ были предсказаны и синтезированы новые производные, в качестве потенциаторов АМРА рецепторов, относящиеся к классу 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов. Их структура представляет собой как бы сдвоенную молекулу АМРАкина BDP, что, по замыслу авторов, должно существенно усилить потенцирующие свойства соединений (Тихонова и др., 2004).

Действие обоих веществ на АМРА рецепторы имело куполообразную форму: низкие концентрации увеличивали токи, а большие наоборот - блокировали их (рис. 6). Оба соединения не влияли на NMDA-вызванные токи в нейронах коры головного мозга крыс в концентрациях 1х10^-7 М - 3х10^-5 М.

Рис. 6. Влияние производных N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1] нонанов на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: 1 - XXX-1, 2 - ХХХ-2. Амплитуда контрольных токов принята за 100%. По оси абсцисс - логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятом за 100%.

По своей активности в потенцировании АМРА рецепторов соединение ХХХ-2 является “абсолютным рекордсменом”: концентрация 10^-11 М является наименьшей из известных в настоящее время, в которой вещества - позитивные модуляторы АМРА рецепторов - способны вызывать потенциацию АМРА рецепторов. Как недавно установлено, процесс десенситизации предотвращается встраиванием двух молекул потенциатора АМРА рецепторов в межщелевое пространство между двумя S1S2 “петлями”, образующими димер АМРА рецептора (Jin et al., 2005). Молекулы соединений ХХХ-1 или ХХХ-2, представляя собой производные сдвоенных молекул АМРАкина BDP, по-видимому, способны более эффективно, чем одиночные молекулы потенциатора, встраиваться в это пространство, предотвращая поворот димера.

Изучение влияния соединений серии ОСЛМ (производных BDP) на функциональное состояние АМРА рецепторов.

Два соединения из синтезированного ряда - ОСЛМ-4 и ОСЛМ-8 - оказались активнее на 3 порядка исходного соединения BDP в потенциации токов АМРА рецепторов (рис. 7). Другие соединения этого ряда не показали способности потенцировать КК-вызванные токи. Все исследованные соединения, кроме BDP, приобрели свойство при увеличении концентрации блокировать КК-вызванные токи.

Рис. 7. Действие ОСЛМ-4 (1), ОСЛМ-8 (2) и BDP (3) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятом за 100%.

Таким образом, среди новых производных дибензиламинов, алкилизотиомочевины и N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены соединения, которые обладают свойствами позитивных модуляторов АМРА рецепторов. Ранее подобная активность для представителей данных химических классов показана не была. Изучение механизма действия новых соединений на АМРА рецепторы показало, что потенциация ответов АМРА рецепторов происходит аналогично действию ЦТ, т.е. за счет уменьшения их десенситизации.

Другой важнейшей особенностью некоторых представителей производных дибензиламинов и алкилизотиомочевины является их способность неконкурентно блокировать NMDA рецепторы наряду с потенциацией АМРА рецепторов.

Изучение процесса блокады NMDA рецепторов соединением IP5051 показало, что в разных нейронах оно блокирует рецепторы различными механизмами. Один из механизмов, по-видимому, заключается в блокаде NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы. Такое предположение можно сделать, сравнивая блокаду NMDA рецепторов в нейронах 1 группы с литературными данными, полученными при изучении действия ифенпродила на ответы NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы (Kew et al., 1996) (Ифенпродил - прототипический антагонист NR2B субъединицы NMDA рецепторов). Имеется практически полная аналогия в характере блокирующего действия IP5051 и ифенпродила (рис. 8).

АБ

Рис. 8. Сравнение блокирующего действия соединения IP5051 на токи NMDA рецепторов в нейронах 1 группы и ифенпродила на токи NR2B-содержащих NMDA рецепторов (из Kew et al., 1996).

Примечание: ^- маленькие токи, ¦ - большие токи. По оси абсцисс - логарифм концентрации IP5051 (А) и ифенпродила (Б), по оси ординат - величина блокирующего действия соединений в %, полная блокада - 100%.

В нейронах 2 группы IP5051 связывается, по-видимому, только с участком связывания МК-801 (блокатор ионного канала NMDA рецептора с очень медленной скоростью диссоциации) в ионном канале NMDA рецептора, но в гораздо более высоких концентрациях, чем в нейронах 1 группы. Вероятно, что и характер этого связывания сходен с характером блокирующего действия МК-801, о чем говорит длительное время отмывки МК-801 и IP5051 в больших концентрациях.

Соединение IP9040 также блокирует NMDA рецепторы. Вероятно, IP9040 блокирует NMDA рецепторы только путем блокады ионного канала NMDA рецептора, но характер этой блокады существенно отличается от блокады, вызываемой IP5051 в нейронах 2 группы. Сравнительный анализ блокирующего действия IP9040 и мемантина позволяет предположить, что оно осуществляется аналогично, по механизму быстрой диссоциации с рецептором, поскольку и мемантин и соединение IP9040 отмывались одинаково быстро, в течение 2-3-х минут.

Изучение фармакологической активности соединений-лидеров на моделях хронических нейродегенеративных заболеваний и в поведенческих тестах

Целью данной серии экспериментов было установить возможную связь между параметрами изменения ответов АМРА рецепторов в нейронах головного мозга при действии соединений и влиянием этих соединений на обучение и память экспериментальных животных. Для достижения этой цели определено влияние наиболее активных новых и модельных соединений на обучение и память как нормальных животных, так и животных с экспериментальной моделью БА.

Изучено влияние соединения IP5051 на обучение и память животных с экспериментальной моделью БА в тесте УРАИ. В таблице 3 представлены результаты измерения количества правильных переходов во время обучения животных.

Табл. 3. Процент “правильных” переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала; последние 15 сигналов - при действии соединения IP5051.

Группы	Контроль	AF64A	AF64A+ IP5051 1,0 мг/кг	AF64A+ IP5051 5,0 мг/кг
Процент правильных переходов	78 ± 5 р < 0,001	37 ± 6,5	67 ± 6 р < 0,05	85 ± 7 р < 0,001

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных с AF64A.

Через 24 часа крыс повторно помещали в установку и замеряли количество “правильных” переходов в другую камеру при подаче 25 сигналов. В расчет брали 5 последних сигналов. Тем самым было определено влияние IP5051 на память животных (табл. 4).

Табл. 4. Процент “правильных” переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала - последние 5 сигналов - при действии соединения IP5051 (влияние на память).

Группы	Контроль	AF64A	AF64A+ IP5051 1,0 мг/кг	AF64A+ IP5051 5,0 мг/кг
Процент правильных переходов	66 ± 8 Р < 0,05	28 ± 7	68 ± 7 р < 0,05	88 ± 6 р < 0,05

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных с AF64A.

В результате исследования установлено, что IP5051 в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг достоверно улучшало количество “правильных” переходов как во время обучения, так и во время воспоминания у животных с экспериментальной моделью БА.

Влияние новых и модельных веществ на обучение и память интактных

животных было изучено в тесте узнавания новой локализации объекта. При тестировании через 48 часов после тренировки контрольные животные затрачивали на обследование объекта в известной и новой локализации одинаковое количество времени, т.е. они воспринимали объекты в обоих местах как новые. Животные, которым вводили IP5051 в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг, затрачивали на обследование объекта в новой локализации достоверно больше времени, чем на обследование в старой, а результаты животных, получивших дозу 0,5 мг/кг (р=0,051), находятся на границе достоверности (рис. 9). Исследование соединения IP9268 показало, что только животные, получившие оединение в дозе 5,0 мг/кг, помнят расположение объектов (рис. 10). Животные, получившие другие соединения: IP9150 в дозах 0,05 - 2,0 мг/кг; IP9040 в дозах 0,1 -1,0 мг/кг; ХХХ-1 в дозе 0,1 мг/кг; ХХХ-2 в дозе 0,01 мг/кг; ОСЛМ-4 в дозе 0,1 мг/кг; BDP в дозах 1,0 и 2,0 мг/кг помнят расположение объектов.

Рис. 9. Влияние соединения IP5051 на память в тесте узнавания новой локализации известного объекта.

Примечание: ряд 1- контроль, ряд 2 - IP5051. Дозы IP5051 - в мг/кг.

Проведенные исследования показали, что соединения, которые потенцируют токи АМРА рецепторов, улучшают память животных в поведенческих экспериментах.

Рис. 10. Влияние соединения IP9268 на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации.

Однако, не во всех случаях имелась прямая связь между величиной потенцирующего эффекта ответов АМРА рецепторов веществом и величинами доз, в которых это вещество оказывает когнитивно-стимулирующее действие. Хотя для некоторых соединений одного химического класса такая связь прослеживалась, в других случаях наблюдалось явное противоречие. Например, соединения ХХХ-1 и ХХХ-2 отличаются по своей активности в качестве потенциаторов АМРА рецепторов в 10 раз. В качестве стимуляторов памяти ХХХ-2 также активнее ХХХ-1 в 10 раз. Однако, для другой пары веществ наблюдается совсем иная картина: соединения IP5051 и IP9268 вызывают почти одинаковую потенциацию АМРА рецепторов (1050% и 770% соответственно при 3х10^-5М), но в поведенческих экспериментах первое соединение было в 100 раз активнее, чем второе. В поисках ответа на вопрос за счет чего возникает такая большая разница в эффективных дозах этих веществ, обратим внимание на то, что IP5051 дополнительно блокирует NMDA рецепторы. Может ли блокада NMDA рецепторов вносить свой вклад в проявление когнитивно-стимулирующего действия вещества? Исследование механизма действия димебона - лекарственного препарата, который обладает высоким нейропротекторным и когнитивно-стимулирующим действием (Bachurin et al., 2001a; Doody et al., 2008) позволило предложить ответ на этот вопрос.

Прогностическая значимость для клинических испытаний результатов электрофизиологических и фармакологических исследований новых соединений на примере препарата димебон

Изучение влияния димебона на функциональное состояние АМРА рецепторов. Установлено, что димебон вызывает позитивную модуляцию ответов АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье. Димебон приводил к увеличению каинат-вызванных токов на 16%, начиная с концентрации 2х10^-7 М. В концентрации 5х10^-7 М димебон вызывал потенциацию в среднем на 52%. Увеличение концентрации препарата не увеличивало потенциацию КК-вызванных токов. В диапазоне концентраций димебона 1х10^-6 - 2х10^-5 М потенциация токов составляла в среднем 42%. Дальнейшее увеличение концентрации димебона приводило к уменьшению потенцирующего эффекта, и в концентрации 4х10^-5 - 5х10^-5 М потенциация токов была равна нулю или ответы были даже меньше, чем в контроле (до - 6%). Таким образом, потенциация каинат-вызванных токов димебоном имеет куполообразную форму (рис. 11).

Сравнение действия димебона с действием ЦТ показало, что в основе потенцирующего влияния димебона на АМРА рецепторы лежит его способность снижать десенситизацию этих рецепторов.

Изучение влияния димебона на функциональное состояние NMDA рецепторов. Установлено, что димебон оказывает блокирующее действие на токи, вызываемые аппликацией NMDA в нейронах (n=33) коры головного мозга крыс. По характеру этой блокады мы разделили исследованные нейроны коры на 2 группы. В нейронах 1-й группы (n=9) димебон в низких концентрациях блокировал NMDA-активируемые токи: IC₅₀=7,7±1,4х10^-6 М (рис. 12). В нейронах 2-й группы (n=24) димебон блокировал NMDA-активируемые токи в гораздо более высоких концентрациях: IC₅₀ = 7,3±2,1х10^-5 М. димебон нейрон лекарственный

Рис. 11. Действие димебона (1) и циклотиазида (2) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентрация веществ в Молях. По оси ординат - амплитуда ответов в % по отношению к контролю. Амплитуда токов в контроле взята за 100%.

Препарат сравнения мемантин также оказывал блокирующее действие на NMDA-активируемые токи (n=23), отличавшееся от действия димебона. В нейронах 2-й группы по нашей классификации мемантин эффективно блокировал токи: IC₅₀ =1,4±0,4х10^-6 М. В нейронах 1-й группы мемантин менее эффективен: IC₅₀=1,5±0,32х10^-5 М (рис. 12).

Таким образом, оба препарата блокируют NMDA рецепторы, но действуют, вероятно, на разные их субъединицы и/или на разные участки рецептора. Наши опыты подтверждают, что мемантин действует как блокатор открытого состояния ионного канала NMDA рецептора, действующий по механизму быстрой диссоциации с рецептором. Одной из вероятных мишеней действия димебона, в отличие от мемантина, является участок связывания ифенпродила, локализованный на NR2B-субъединице NMDA рецептора. Сравнительный анализ результатов компьютерного 3d моделирования, проведенного на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова, показал, что димебон может достаточно эффективно взаимодействовать с участком связывания ифенпродила на N-концевом домене NR2B субъединицы (чему соответствует блокада NMDA рецепторов в низких концентрациях в нейронах 1 группы), но гораздо менее эффективно взаимодействовать с участком связывания МК-801 внутри ионного канала NMDA рецептора (Тихонова, 2005; Tihonova et al., 2002) (блокада NMDA рецепторов в высоких концентрациях в нейронах 2 группы).

...