Растворимый Fas при онкологических заболеваниях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

14.00.14. - онкология

03.00.04. - биохимия

Растворимый Fas при онкологических заболеваниях

Аббасова Светлана Георгиевна

Москва - 2008

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН \

Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е. Кушлинский

Член-корреспондент РАН, профессор В.М. Липкин

Официальные оппоненты:

Заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, доктор биологических наук, профессор Красильников Михаил Александрович

Заместитель Генерального директора ОАО «Всероссийский научный центр диагностики и лечения», заведующий отделом биотехнологии ВНЦДЛ, доктор биологических наук, профессор Свешников Петр Георгиевич

Заведующий лабораторией прогноза эффективности консервативной терапии опухолей ФГУ «Московский НИИ онкологии им. П.А. Герцена Росмедбиотехнологий», доктор биологических наук, профессор Сергеева Наталья Сергеевна

Ведущая организация: ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии МЗ и СР РФ

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Барсуков Ю.А.

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Гомеостаз многоклеточного организма поддерживается точно выверенным балансом между процессами пролиферации, дифференцировки и гибели клеток. Одним из основных механизмов элиминации опасных для организма клеток, к числу которых относятся вирус-инфицированные, опухолевые клетки, а также клетки, закончившие свой жизненный цикл, является апоптоз, или программированная клеточная гибель. Это очень сложный механизм, на различных этапах которого задействованы многочисленные факторы и рецепторы клеточной гибели, а также ряд адапторных белков, приводящий, в конечном итоге, к активации внутриклеточных протеаз и самоуничтожению опасной для организма клетки. Любые сбои в этом сложном процессе приводят к развитию серьезных патологий, в том числе к возникновению и росту злокачественных опухолей. Злокачественность новообразований определяется не только огромным пролиферативным потенциалом составляющих их клеток, но и устойчивостью этих клеток к действию факторов, регулирующих процессы дифференцировки и клеточной гибели.

Fas/APO-1/CD95 - является одним из ключевых рецепторов, запускающих программу самоуничтожения клетки (Itoh и соавт., 1991; Oehm и соавт., 1992). Экспрессия Fas показана почти во всех органах - в тимусе, почках, печени, сердце, легких, он также экспонирован на поверхности активированных лимфоцитов, натуральных киллеров, вирус-инфицированных и опухолевых клеток (Nagata and Golstein, 1995).

Индукция Fas-опосредованного апоптоза в клетке происходит после взаимодействия Fas с его лигандом - FasL. Механизм Fas-опосредованного апоптоза хорошо изучен: идентифицированы основные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Устойчивость клеток к Fas_зависимому апоптозу определяется как нарушениями в экспрессии, структуре, и функционировании белков, опосредующих Fas-зависимый апоптоз, так и повышенной продукцией растворимого Fas (sFas) этими клетками. Растворимый Fas дистантно ингибирует действие FasL, позволяя клеткам-продуцентам растворимого Fas уйти от противоопухолевой защиты организма. С помощью молекулярно-биологических методов было показано, что sFas является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas (Cheng и соавт., 1994; Cascino и соавт., 1995). Идентифицировано несколько растворимых изоформ Fas, среди которых преобладает одна - FasdelTM, или FasExo6Del, остальные изоформы продуцируются в незначительных количествах (Cascino и соавт., 1995; Cascino и соавт., 1996).

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью определения значения растворимого Fas в сыворотке крови при онкологических заболеваниях различного гистогенеза и локализации в прогнозе заболевания, а также в оценке устойчивости опухоли к применяемой терапии в конкретной клинической ситуации.

Цель исследования - Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для определения концентрации растворимого Fas в сыворотке крови, изучение связи показателей sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значения в прогнозе онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать разработанный нами сэндвич-ИФА для количественного определения sFas в сыворотке крови человека - оценить предел детекции тест-системы и воспроизводимость результатов анализа. Дать иммунохимическую характеристику моноклональных антител (МА), на основе которых разработан сэндвич-ИФА.

2. С помощью пептидного фагового дисплея определить структуру эпитопов для МА к полноразмерному Fas человека, на основе которых разработан сэндвич-ИФА, с целью выявления спектра изоформ sFas, которые должна детектировать разработанная тест-система.

3. Определить концентрацию sFas в сыворотке крови онкологических больных с наиболее часто выявляемыми опухолями (новообразования молочной железы, яичников, эндометрия, костей, толстой кишки, надпочечников и щитовидной железы) и провести анализ показателей sFas в зависимости от основных клинических, морфологических и некоторых биохимических критериев опухолевых процессов и определить его значение в прогнозе заболеваний.

4. Изучить корреляцию показателей sFas в сыворотке крови онкологических больных с показателями наиболее важных патогенетических факторов: активатора процесса неоангиогенеза в опухоли - VEGF, провоспалительного цитокина, ингибитора Fas-зависимого апоптоза - IL-6, уровня содержания рецепторов эстрогенов в опухоли при раке молочной железы, общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови при новообразованиях костей, уровня содержания активатора плазминогена (uPA) в ткани опухолей щитовидной железы.

Научная новизна. Разработана и охарактеризована оригинальная отечественная тест-система для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, не уступающая аналогичным тест-системам, описанным в литературе.

С помощью разработанной тест-системы впервые на большом клиническом материале определена концентрация и проведен анализ показателей растворимого Fas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации в сравнении с соответствующими показателями практически здоровых людей. Впервые определены связь sFas с основными клиническими, морфологическими и некоторыми биохимическими характеристиками опухолевых процессов и его значение в прогнозе заболевания при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеогенной саркоме, а также предиктивное значение sFas в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке.

Практическая значимость исследования состоит в разработке оригинальной отечественной иммуноферментной тест-системы для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови человека, а также в установлении значения этого белка как фактора прогноза при раке яичников, раке тела матки, раке коры надпочечников и остеогенной саркоме, а также его предиктивного значения в оценке эффективности неоадъювантной лучевой терапии при раке толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработанная тест-система на основе МА SA-7 и SA-8 может применяться для количественного определения sFas в сыворотке и плазме крови человека и других биологических жидкостях. Присутствие sFasL и других компонентов сыворотки крови не влияет на результаты количественного определения sFas. Разработанная нами тест-система должна детектировать основную изоформу sFas - FasExo6Del и три минорных изоформы sFas -FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo4,7Del.

Концентрация и частота выявления sFas в сыворотке крови больных новообразованиями различного морфогенеза и локализации достоверно превышают соответствующие показатели практически здоровых людей.

Показатели sFas в сыворотке крови связаны с основными клиническими характеристиками заболевания (стадия опухолевого процесса, размер опухолевого узла, степень дифференцировки опухоли и характер ее роста) при раке яичников, раке тела матки, раке толстой кишки и адренокортикальном раке.

Показатели sFas достоверно не различаются при злокачественных и доброкачественных новообразованиях молочной железы, костей, яичников и надпочечников, тогда как рак щитовидной железы характеризуется более высокими показателями sFas в сыворотке крови, чем доброкачественные и гиперпластические процессы щитовидной железы. Одновременно высокие уровни sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови характерны для злокачественных новообразований.

Высокий уровень sFas в сыворотке крови является неблагоприятным фактором прогноза для больных остеогенной саркомой, раком яичников, раком тела матки и адренокортикальным раком.

Высокая концентрация sFas в сыворотке крови является неблагоприятным предиктивным фактором эффективности применения неоадъювантной лучевой терапии при колоректальном раке в пожилом возрасте.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций», (Москва, 12-14 октября 1999 года); на VII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 10-14 апреля 2000 года); на 2-ом съезде онкологов стран СНГ (Киев, 23-26 мая 2000 года); на 7^th Biennial Meeting of the International Gynecological Cancer Society (Rome, Italy, September 26-30, 1999); на XI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004 года); на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва 20-22 октября 2004г.); на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 24-25 июня 2004 г.); на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005 г.); на I Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел, 31 мая-2 июня 2005 г.); на X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 21-23 ноября 2006 г.); на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.). Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции лаборатории клинической биохимии, лаборатории клинической иммунологии, х/о опухолей молочной железы, х/о проктологии, х/о диагностики опухолей НИИ КО, лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН; кафедры онкологии и кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ; лаборатории нейрохимии ФИБХ РАН 14 октября 2008 г.

Полученные результаты используются в практике лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 работа в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов и 8 глав результатов собственных исследований; заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Общий объем диссертации 272 страниц машинописного текста. Список литературы включает 84 отечественных и 448 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 67 таблицами и 26 рисунками.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика обследованных больных

В настоящее исследование были включены 1061 первичных больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями различного гистогенеза и локализации, из них 861 женщины и 200 мужчин, в возрасте от 14 до 80 лет. В общей группе пациентов были больные новообразованиями молочной железы (141), костей (99), яичников (347), тела матки (111), толстой кишки (113), щитовидной железы (141) и коры надпочечников (109).

Группу контроля составили 457 практически здоровых людей, 332 женщины и 125 мужчин, в возрасте от 17 до 76 лет.

Диагнозы всем больным были установлены впервые на основании результатов клинических исследований и подтверждены данными гистологического исследования, определение концентрации sFas в сыворотке крови проводили до начала специфического лечения.

Больных классифицировали по стадиям согласно международной классификации по системе TNM (Cancer TNM Classification of Malignant Tumours VI Ed.).

Группу больных новообразованиями молочной железы составили 119 женщин от 28 до 82 лет с первичным РМЖ и 22 пациентки с доброкачественными новообразованиями и фиброзно-кистозной болезнью в возрасте от 33 до 58 лет, которые были обследованы и получали лечение в НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН в период с декабря 1999г. по ноябрь 2003 г.

Проводили определение концентрации sFas и общей активности щелочной фосфатазы у 99 больного новообразованиями костей (61 мужчина и 38 женщин) в возрасте от 14 до 59 лет. Определение концентрации VEGF проводили только у больных остеогенной саркомой и опухолью Юинга. Новообразования костей были представлены следующими нозологическими единицами: первичная остеогенная саркома (32), вторичная остеогенная саркома (1), паростальная остеогенная саркома (1), периостальная остеогенная саркома (1), первичная хондросаркома (17), вторичная хондросаркома (1), опухоль Юинга (10), злокачественная фиброзная гистиоцитома кости (9), гигантоклеточная опухоль кости (10), плазмоцитома (1), гемангиоэндотелиома (1), гемангиоперицитома (1), хордома (3), липома кости (1), доброкачественная остеобластома (2), хондробластома (3), хондрома (1), костно-хрящевой экзостоз (2), аневризмальная костная киста (2).

В группе больных новообразованиями яичников было 141 больная злокачественными новообразованиями в возрасте от 24 до 80 лет и 206 пациенток с доброкачественными новообразованиями в возрасте от 18 до 69 лет, которые прошли обследование и лечение в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в период с января 2000 по март 2006 г.г. В группе больных ДОЯ были представлены следующие морфологические варианты опухоли: дермоид (24), киста желтого тела (20), фолликулярная киста (14), цистаденома (56), цистаденофиброма (6), простая киста (4), папиллярная цистаденома (10), опухоль Бреннера (8), пограничная опухоль (18), муцинозная пограничная опухоль (4), эндометриоидная киста (24), муцинозная киста (6), фиброма (8). В общей группе больных РЯ были следующие нозологические единицы: папиллярная цистаденокарцинома (22), серозная цистаденокарцинома (53), эндометриоидная аденокарцинома (27), муцинозная аденокарцинома (26), аденогенный рак (3), серозный рак (10).

В исследование были включены 111 больных раком тела матки (РТМ) в возрасте от 31 до 80 лет. Гистологическое исследование выявило следующие морфологические варианты строения опухолей у больных РТМ: аденокарцинома (102), железисто-плоскоклеточный рак (7), светлоклеточный рак (2). Больные находились в разных стадиях опухолевого процесса, большинство (62.8%) из них было в 1 и 2 стадии.

В исследование были включены 113 больных колоректальным раком, из них 57 мужчин и 56 женщин в возрасте от 35 до 72 лет.

В общую группу больных были включены 141 пациент с различными патологиями щитовидной железы, из них 127 женщин и 14 мужчин, в возрасте от 17 до 73, которые находились на обследовании и лечении в отделении опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН г. Москвы за период с декабря 1998 по январь 2002 года. Новообразования щитовидной железы были представлены следующими морфологическими типами опухолей: 1) рак щитовидной железы - 32; 2) аденома щитовидной железы - 16; 3) узловой коллоидный микро-макрофолликулярный зоб с признаками аденоматоза - 20; 4) узловой коллоидный микро-макрофолликулярный зоб без признаков аденоматоза - 48; 5) диффузный токсический зоб с признаками аденоматоза - 9; 6) диффузный токсический зоб без признаков аденоматоза - 14; 7) аутоиммунный тиореоидит Хошимото - 2.

В общей группе пациентов было 109 больных опухолями надпочечников, из них 59 мужчин и 50 женщин, в возрасте от 45 до 75 лет. Гистологическое исследование выявило следующие нозологические единицы: рак коры надпочечника - 32, аденома коры надпочечника - 52, адренокортикальная опухоль с неопределенным потенциалом злокачественности - 6, феохромоцитома - 18 и миелолипома - 1.

Сопутствующая патология выявлена более чем у половины (56%) всех больных новообразованиями. Среди сопутствующих заболеваний были гипертоническая болезнь, хроническая ишемическая болезнь сердца, стенокардия, миома матки, полип матки, мастопатия, хронический гастрит, хронический колит, хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, сахарный диабет II типа. Сочетание нескольких хронических заболеваний в анамнезе выявлено у 212 (20%) больных.

Лабораторные методы исследования

Определение концентрации sFas в сыворотке крови. МА против Fas SA-8 (IgG1 (); (4.0±0.6)x10⁷ М^-1) сорбировали на ИФА-планшеты (“Linbro”) в 0,05 М карбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 5 мкг/мл в течение ночи при 4^оС. Для блокирования остаточных свободных центров связывания планшеты инкубировали с 1% раствором БСА в фосфатно-солевом буфере (РВS) (рН 7.2) 1 час при 37^оС. Затем в планшеты вносили сыворотки больных и практически здоровых людей, которые хранили при -20^оС до анализа. Для построения калибровочного графика в каждый планшет вносили последовательные двукратные разведения полноразмерного рекомбинантного бакуловирусного Fas от 40 нг/мл до 0.1 нг/мл. Планшеты инкубировали 1.5 часа при 37^оС. После инкубации планшеты промывали раствором РВS, содержащим 0.1% Tween 20 (“Sigma”) (буфер для отмывки). Процедуру отмывки далее повторяли после каждой стадии теста. После отмывки в планшеты вносили биотинилированные МА против Fas SA-7 (IgG1 (); (5.8±0.7)x10⁸ М^-1) в концентрации 10 мкг/мл в буфере для отмывки, содержащем 0.1% БСА и инкубировали 2 часа при 37^оС. Затем в планшеты вносили раствор стрептавидин-пероксидазы (“Amersham”) в рабочем разведении в буфере для отмывки. Планшеты инкубировали 1 час при 37^оС. В качестве субстрата использовали свежеприготовленный раствор 0.04% орто-фенилендиамина в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5.0), содержащем 0.03% перекиси водорода. Планшеты инкубировали 15-20 минут при комнатной температуре до развития окраски. Реакцию останавливали 10% серной кислотой, оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на спектрофотометре MR 700 Microplate Reader (“Dynatech Labs”, США). Концентрацию sFas определяли по калибровочному графику, построенному заново для каждого планшета.

Определение эпитопов, узнаваемых МА SA-7 и SA-8, проводили с помощью библиотеки гептапептидов в варианте фагового дисплея - PH.D._7^ТМ (BioLabs, Cat. #E8100S) по прилагаемой инструкции.

Синтез пептидов проводили твердофазным методом в ручном твердофазном реакторе (Rodionov I.L. и соавт., 1992) с использованием Fmoc-стратегии (Reid G.E. и Simpson R.J., 1992).

Приготовление сыворотки крови пациентов и практически здоровых людей

Кровь у больных и практически здоровых людей забирали натощак из кубитальной вены с 8 до 9 утра. После свертывания крови пробирки центрифугировали при 500g в течение 10 минут, сыворотку аккуратно отбирали, разливали по промаркированным пробиркам и хранили при _20^оС до анализа.

Определение концентрации IL-6 в сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного набора «human IL-6» компании “R&D”, США по прилагаемой к набору инструкции производителя.

Определение концентрации VEGF в сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного набора “CytElisa^tm Human VEGF” компании “Cytimmune Science inс.” (США) по прилагаемой к набору инструкции производителя.

Определение концентрации uPA в гомогенизированной ткани опухоли проводили с помощью иммуноферментного набора реактивов, разработанных в Католическом Университете г. Наймегена в лаборатории проф. Т.Benraad'a (Нидерланды).

Определение рецепторов эстрадиола-17? в экстрактах опухоли молочной железы проводили радиолигандным методом при насыщающих концентрациях лиганда [2,4,6,7-³H]-эстрадиола-17 (“Amersham Int. PLC”, Англия). Неспецифичное связывание определяли при 100-200-кратном молярном избытке диэтилстильбэстрола. Для разделения свободных и связанных с рецептором стероидов пробы после инкубации обрабатывали суспензией активированного угля, покрытого декстраном. Радиоактивность образцов определяли на спектрометре “LS 6500” (“Beckman”, США).

Определение общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили оптимизированными методами при использовании автоматического анализатора «Hitachi 911».

Статистический анализ результатов исследования

Выбор центральных характеристик исследуемых количественных данных осуществляли после изучения формы их распределения. Оценку различия формы распределения от формы распределения Гаусса проводили по критерию согласия Колмогорова-Смирнова. При логнормальном распределении проводили математическое преобразование значений. Рассчитывали среднее значение показателя и его 95% доверительные границы, ошибку среднего, а также медианы (для логнормальных показателей) и пределы колебания.

Рассчитывали абсолютные и относительные частоты качественных и ординальных признаков. Оценку различий частот проводили непараметрическим критерием чi-2, для малых выборок - точным критерием Фишера. Расчет доверительных интервалов для малых долей проводили с учетом биноминального распределения.

Для выяснения диагностической способности показателей проводили дискриминантный анализ. Рассчитывали точное значение р. При множественных сравнениях значения р определяли с помощью специальных тестов с поправкой на множественность сравнений (test Scheffe). При корреляционном анализе рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона, а также значимость его отличия от нуля. Выживаемость рассчитывали по методу Каплана-Майера.

При выборе статистических процедур учитывали методологические требования Международного конгресса по гармонизации GGP “Статистические принципы для клинических исследований” (ICH Guidelines//Good Clin.Pract.J.-1998.-Vol.5, №4.-р.27-37).

Все вычисления проводили с помощью математических пакетов «Статистика» и SPSS.

2. Результаты собственных исследований

Разработка и характеристика сэндвич-ИФА для количественного определения sFas в сыворотке крови на основе моноклональных антител

Получение моноклональных антител против человеческого Fas

Для иммунизации брали 8-недельных мышей линии BALB/c, в качестве антигена использовали полноразмерный рекомбинантный бакуловирусный Fas (“Сoultronics”, Франция). Гибридизацию иммунных спленоцитов мыши с клетками мышиной линии NSO/1 проводили по стандартной методике. Отбор положительных гибридом проводили методом непрямого ИФА. Одиночные положительные клоны получали методом лимитирующих разведений.

МА нарабатывали в асцитной жидкости мышей линии BALB/c. Выделение МА из асцитной жидкости осуществляли преципитацией сульфатом аммония и последующей жидкостной хроматографией умеренного давления на колонке MonoQ. Определение типов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов проводили непрямым ИФА с помощью набора для типирования антител (“Amersham”, Великобритания).

Иммунохимическая характеристика полученных антител приведена в таблице 1.

Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител кFas

Антитело	Тип тяжелой и легкой цепи	Константа аффинности, М-1
SA-1	IgG2a()	(7.8±1.3)x107
SA-2	IgG1()	(4.1±0.3)x107
SA-3	IgG1()	(6.4±0.5)x107
SA-4	IgG1()	(2.1±0.4)x109
SA-5	IgG1()	(3.8±0.3)x107
SA-6	IgG1()	(3.3±0.2)x107
SA-7	IgG1()	(5.8±0.7)x108
SA-8	IgG1()	(4.0±0.6)x107
SA-9	IgG1()	(6.5±0.5)x107

С целью разработки тест-системы для количественного определения растворимого Fas в сыворотке крови были получены конъюгаты МА против Fas с биотином. Были проверены все возможные варианты сэндвич-ИФА, наилучшие результаты определения sFas показала «пара» антител SA-7 и SA-8. МА SA-7 и SA-8 выявляли одну мажорную полосу, соответствующую молекулярному весу полноразмерного Fas в клеточных экстрактах человеческих линий HL-60, MCF_7 и Jurkat, и не взаимодействовали с экстрактом клеток мышиной линии L929 в иммуноблоттинге, что может свидетельствовать о видовой специфичности этих антител.

Проводили определение минимальной концентрации sFas, детектируемой разработанной тест-системой, для этого делали последовательные двукратные разведения полноразмерного Fas от 10 до 0.08 нг/мл. Нижним пределом детекции sFas, определяемым сэндвич-ИФА, считали концентрацию Fas, достоверно превышающую фоновое значение оптической плотности тест-системы плюс три стандартных отклонения. Минимальный предел детекции sFas тест-системы на основе МА SA-7 и SA-8, определенный в 6 независимых экспериментах, составил 0.3 нг/мл (рис. 1).

Рис. 1. Калибровочный график для определения концентрации растворимого Fas

В литературе описано несколько тест-систем для определения концентрации sFas в варианте сэндвич-ИФА, нижний предел детекции которых колеблется от 2 нг/мл (Tomokuni A. и соавт., 1997) до 0.1 нг/мл (Seishima M. и соавт., 1996), по данному показателю разработанный сэндвич-ИФА не уступает аналогичным тест-системам.

Показали, что присутствие sFasL в концентрации 10 нг/мл не влияет на результаты количественного определения sFas разработанной нами тест-системой (рис. 2).



Рис. 2. Определение концентрации sFas в присутствии sFasL

С целью оценки воспроизводимости результатов определения концентрации sFas в сыворотке крови человека с помощью разработанного сэндвич-ИФА проводили определение уровня sFas в 8 различных образцах сыворотки в 6 параллельных повторах для каждого образца в пределах одного ИФА-планшета (intra-assay) и рассчитывали коэффициент вариации. Эксперимент повторяли 3 раза в независимых экспериментах (inter-assay) и рассчитывали коэффициент вариации для данного теста, учитывая результаты 18 определений для каждого образца сыворотки. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Результаты определения концентрации sFas в сыворотке крови в пределах одного ИФА-планшета

Образец сыворотки	Концентрация sFas, нг/мл	Коэффициент вариации, %
1	2.67, 2.75, 2.60, 2.59, 2.73, 2.65	2.5
2	5.45, 5.39, 5.55, 5.59, 5.48, 5.62	1.6
3	0.76, 0.85, 0.70, 0.81, 0.74, 0.77	6.9
4	3.59, 3.48, 3.75, 3.55, 3.67, 3.64	2.6
5	8.40, 8.90, 8.65, 8.56, 8.73, 8.57	2.0
6	1.78, 1.83, 1.64, 1.75, 1.68, 1.67	4.2
7	0.53, 0.64, 0.59, 0.58, 0.61, 0.57	6.3
8	3.67, 3.75, 3.53, 3.58, 3.64, 3.52	2.5
Средний коэффициент вариации (M±m), %	3.7±0.7

Коэффициент вариации изменялся от 1.6% до 6.9% и в среднем составил 3.7%. Полученные данные свидетельствуют о хорошей воспроизводимости результатов измерения концентрации sFas в данном виде теста (intra-assay). Коэффициент вариации был выше при низкой концентрации sFas в сыворотке крови, что объясняется бульшим вкладом ошибки метода (разброс значений оптической плотности, краевые эффекты) вблизи значения минимального предела детекции тест-системы.

Таблица 3. Результаты определения уровня sFas в независимых экспериментах

Образец сыворотки	Эксперимент №1	Эксперимент №2	Эксперимент №3	Коэффициент вариации, %
1	2.67	2.80	2.50	5.6
2	5.51	5.30	5.45	2.0
3	0.77	0.67	0.73	6.9
4	3.61	3.70	3.55	2.1
5	8.64	8.80	8.54	1.5
6	1.73	1.68	1.65	2.4
7	0.59	0.55	0.63	6.8
8	3.62	3.54	3.58	1.1
Средний коэффициент вариации (M±m), %	3.6±0.8

Проводили сравнение результатов определения концентрации sFas в сыворотке и плазме крови онкологических пациентов с использованием сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8.

Таблица 4. Сравнительные результаты определения концентрации sFas в сыворотке и плазме крови онкологических больных в сэндвич-ИФА на основе МА SA-7 и SA-8

Тип образца	Концентрация sFas, нг/мл	Коэффициент вариации, %
Сыворотка	4.28	4.30±0.06	1.3
EDTA-плазма	4.36
Гепарин-плазма	4.25

Из данных таблицы 4 видно, что разработанный нами сэндвич-ИФА дает близкие результаты определения концентрации sFas как в сыворотке, так и в плазме крови человека, при этом метод приготовления плазмы не влияет на результаты определения концентрации.

Определяли, насколько полно разработанный нами сэндвич-ИФА выявляет sFas в сыворотке крови, для этого в сыворотку, в которой первоначально не был выявлен sFas, вносили различные количества Fas и определяли его концентрацию, затем сравнивали определяемый показатель концентрации Fas в сыворотке с ожидаемой величиной. Результаты данных экспериментов отражены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительные результаты выявления привнесенного в сыворотку крови Fas

Концентрация добавленного Fas, нг/мл	% выявления добавленного Fas
9.0	86, 98, 93
6.0	88, 105, 99
3.0	87, 118, 113
1.5	102, 112, 95
0.8	105, 95, 98
Средний % выявления Fas	99.6

Из данных таблицы 5 видно, что присутствующие в сыворотке крови компоненты не влияют на выявление sFas c помощью разработанной нами тест-системы.

Определение структуры эпитопов, узнаваемых МА SA-7 и SA-8, с помощью пептидного фагового дисплея

Растворимый Fas является продуктом альтернативного сплайсинга мРНК Fas. В литературе описано несколько изоформ sFas и показано их количественное соотношение на уровне экспрессии мРНК: Fas FasExo6Del >>> FasExo3,4,6Del > FasExo4Del FasExo4,6Del FasExo4,7Del FasExo3,4Del. Также идентифицированы изоформы FasExo3Del и FasExo8Del (Cascino I. и соавт., 1995, 1996).

Поскольку МА SA-7 и SA-8 взаимодействуют с денатурированным Fas в иммуноблоттинге, то мы предположили, что эпитопы Fas, узнаваемые каждым из этих антител, являются не конформационными, а линейными. Поэтому для локализации минимальных эпитопов, с которыми взаимодействуют антитела, мы выбрали пептидную фаговую библиотеку PH.D._7^ТМ (New England BioLab) с представленностью около 2х10⁹ возможных вариантов гептапептидов и проводили четыре раунда аффинной селекции фаговых частиц из данной библиотеки. После клонирования были отобраны фаги, взаимодействующие с МА SA-7 и SA-8, которые использовали для иммунохимического анализа и определения cтруктуры аминокислотной последовательности пептидов, представленных данными фагами. Первичная структура пептидов, экспонированных фагами, показана в таблице 6.

Таблица 6. Структура пептидов, экспонированных фагами библиотеки PH.D.-7^ТМ, взаимодействующими с МА SA-7 и SA_8 против полноразмерного человеческого Fas

Название клона

Структура пептида в составе фага

Кa, М-1

Название клона

Структура пептида в составе фага

Кa, М-1

SA-8/III-1

A

K

I

H

F

Y

S

3.9x106

SA-7/IV-1

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/III-2

D

K

I

H

F

K

S

5.6x106

SA-7/IV-2

G

Y

K

P

T

F

S

1.1x107

SA-8/III-3

V

N

K

P

H

F

H

7.0x106

SA-7/IV-3

G

Y

K

P

T

F

S

1.1x107

SA-8/V-1

A

Y

I

H

F

L

P

1.4x107

SA-7/IV-4

S

K

I

H

F

H

P

8.0x106

SA-8/IV-2

S

E

I

H

L

M

G

5.0x106

SA-7/IV-5

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/IV-3

A

K

I

H

F

H

S

4.5x106

SA-7/IV-6

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/IV-4

H

K

P

H

F

P

S

2.6x106

SA-7/IV-7

N

K

I

H

F

Y

P

6.6x106

SA-8/IV-5

A

L

Q

I

H

T

M

3.9x106

SA-7/IV-8

G

K

I

H

F

F

R

7.0x107

SA-8/IV-6

A

Q

I

H

F

L

P

4,0x106

SA-7/IV-9

S

K

I

H

F

L

S

9.4x106

SA-8/IV-7

D

N

P

H

Y

T

T

3.6x106

SA-7/IV-10

S

K

I

H

F

H

P

8.0x106

SA-8/IV-8

G

K

P

H

F

T

T

3.4x106

SA-7/IV-11

G

K

I

H

F

H

P

9.8x106

SA-8/IV-9

S

F

H

I

Y

F

L

7.5x106

SA-7/IV-12

S

K

I

H

F

P

E

1.8x107

SA-8/IV-10

S

K

I

H

F

H

T

5.0x106

SA-7/IV-13

C

K

I

H

F

F

R

1.7x108

SA-8/IV-11

R

K

P

H

F

T

G

6.8x106

SA-7/IV-14

D

K

I

H

F

Y

P

1.0x107

SA-8/IV-12

L

K

L

H

F

N

T

4.2x106

SA-7/IV-15

R

Y

Y

P

Y

F

P

1.1x107

SA-8/IV-13

A

K

I

H

F

Y

S

5.8x106

SA-7/IV-16

A

K

I

H

F

P

P

1.5x107

SA-8/IV-14

R

K

I

H

F

H

P

3.6x106

SA-7/IV-17

E

K

P

H

F

L

V

9.8x106

SA-7/IV-18

A

K

I

H

F

L

P

7.0x106

SA-7/IV-19

H

K

I

H

F

L

P

1.5x107

SA-7/IV-20

R

K

L

H

F

L

P

9.3x106

SA-7/IV-21

S

K

I

H

F

Y

H

5.3x106

Примечание: в таблице жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, совпадающие со структурой предполагаемого эпитопа для антител; подчеркнуты аминокислотные остатки, являющиеся гомологичной заменой аминокислотного остатка в структуре предполагаемого эпитопа для антител.

С целью определения структуры консенсусных мимотопов для антител вычисляли и анализировали частоту встречаемости каждого аминокислотного остатка (а.о.) в пептидах, представленных отобранными фагами. Таким образом, консенсусный мимотоп для антитела SA-7 определили а.о. XKIHFFP. Cовмещение консенсусного мимотопа для антитела SA-7 со структурой полноразмерного Fas позволило предположить, что эпитоп для этого антитела определяют а.о. экстраклеточной части Fas 130--134. Из 6 а.о. консенсусной мимотопной последовательности три остатка совпали со структурой предполагаемого эпитопа. Консенсусный мимотоп для антитела SA_8 определяли а.о.: XKIHFХS. Совмещение консенсусного мимотопа с аминокислотной последовательностью полноразмерного Fas позволило сделать предположение, что эпитоп для антитела SA_8 определяют а.о. 94--99 экстраклеточной части Fas. Четыре из семи а.о. консенсусного мимотопа соответствовали структуре полноразмерного Fas, а остаток изолейцина между остатками лизина и гистидина может считаться гомологичной заменой остатку аланина в структуре предполагаемого эпитопа для антитела SA_8.

Надо отметить, что структуры консенсусных мимотопов для МА SA-7 и SA-8 сходны между собой, поэтому мы определяли константы аффинности всех отобранных фагов по отношению к МА, на которых проводили селекцию. Для фагов, специфичных к антителу SA-8, не было обнаружено прямой корреляционной зависимости между числом а.о. в мимотопной последовательности, совпадающих со структурой предполагаемого эпитопа, и значением константы аффинности (табл. 6). В то же время для фагов, специфичных к антителу SA-7, было показано, что константы аффинности фаговых частиц, в составе которых были представлены пептиды ХKХХFFХ (3 совпадающих остатка из 7), были одними из самых высоких - 7.0х10⁷ M^-1. Для фагов, экспонирующих мимотопную последовательность СKХХFFХ (четыре совпадающих аминокислотных остатка из семи), определили самую высокую константу аффинности-1.7х10⁸ М^-1. Видимо, остаток цистеина очень важен для взаимодействия антитела SA-7 с Fas, поэтому в предполагаемый эпитоп, узнаваемый МА SA-7, мы включили остаток цистеина. Таким образом, мы предположили, что эпитоп для МА SA-7 определяется а.о. 129--134 экстраклеточной части Fas.

Были синтезированы гексапептиды: пептид №1, соответствующий предполагаемому эпитопу для антитела SA-8 -- 94-99: KAHFSS, и пептид №2, соответствующий предполагаемому эпитопу для антитела SA-7 -- 129-134: CKPNFF. Для подтверждения структуры эпитопов, узнаваемых антителами, были проведены эксперименты по конкурентному ингибированию синтетическими пептидами № 1 и № 2 взаимодействия антител SA-7 и SA_8 с полноразмерным Fas (рис. 3).

Из рисунка 3 видно, что пептид №1, соответствующий предполагаемому эпитопу для МА SA-8, предпочтительно ингибирует взаимодействие антитела SA-8 с полноразмерным Fas, а на взаимодействие МА SA-7 с Fas значительного влияния не оказывает. В то же время пептид №2, соответствующий предполагаемому эпитопу для МА SA-7, предпочтительно ингибирует взаимодействие антитела SA-7 с полноразмерным Fas. Отсюда мы сделали заключение, что пептид №1 специфичен к антителу SA-8, а пептид №2 специфичен к антителу SA-7.

Таким образом, была определена структура эпитопов для МА SA-7 и SA-8 против полноразмерного человеческого Fas. Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о. Fas 129_134 -- CKPNFF, а для антитела SA_8 - а.о. Fas 94 - 99 -- KAHFSS.



Рис. 3. Конкурентное ингибирование взаимодействия антител SA-7 и SA-8 с Fas пептидами № 1 и № 2

Изоформы sFas являются результатом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas, состоящей из 9 экзонов. Идентифицировано несколько вариантов сплайсированной мРНК Fas с делециями различных экзонов, при этом основной изоформой растворимого Fas является FasExo6Del, в которой делетирован только трансмембранный домен, ее экспрессия на несколько порядков превышает суммарную экспрессию остальных минорных изоформ (Cascino I. и соавт., 1995, 1996). Все изоформы sFas содержат а.о., соответствующие первому и второму экзонам полноразмерного транскрипта fas. Эпитоп для МА SA-8 определяют а.о. 94-99, кодируемые нуклеотидами второго экзона fas, т.о. МА SA-8 взаимодействует со всеми изоформами sFas. Делеция третьего экзона происходит при вырезании из полноразмерной мРНК Fas нуклеотидов 391-529, т.е. удаляются а.о. 131_200 первичной аминокислотной последовательности полноразмерного Fas. Эпитоп для антитела SA-7 определяют а.о. 129_134 полноразмерного Fas, кодируемые нуклеотидами, находящимися на границе второго и третьего экзонов fas, поэтому МА SA-7 не способно взаимодействовать с изоформами sFas с делецией а.о., соответствующих третьему экзону.

Таким образом, сэндвич-ИФА на основе антител SA-7 и SA-8 должен детектировать основную изоформу sFas - FasExo6Del и три минорных изоформы: FasExo4Del; FasExo4,6Del; и FasExo4,7Del.

sFas, IL-6, VEGF в сыворотке крови и содержание рецепторов эстрогенов в опухолях при новообразованиях молочной железы

Нами проведено определение концентрации sFas и IL-6 в сыворотке крови 119 больных РМЖ и у 22 больных ДОМЖ в сравнении с соответствующими показателями 55 практически здоровых женщин. Результаты данного исследования показаны в таблице 7.

Таблица 7. Показатели sFas и IL-6 в сыворотке крови больных новообразованиями молочной железы и практически здоровых людей

Категории обследованных	Количество пациентов	sFas, нг/мл	IL-6, пг/мл
		M±m, медиана	Пределы колебаний	M±m, медиана	Пределы колебаний
Контроль	55	0.8±0.1 0.81	0.3-1.2	1.0±0.1 0.94	1.0-2.0
РМЖ	119	1.9±0.1 1.72	0.4-5.8	1.8±0.1 1.65	0.1-9.7
ДОМЖ	22	1.7±0.3 1.23	0.4-2.4	2.0±0.3 1.96	0.7-3.2

Примечание: р2vs1=0.0004; р3vs1=0.001; р3vs2>0.05; р5vs4=0.01, р6vs4=0.02

Частота выявления sFas в сыворотке крови у больных РМЖ и ДОМЖ (59% и 73%, соответственно) была достоверно выше, чем у практически здоровых женщин (37%). Концентрация sFas в сыворотке крови больных была достоверно выше, чем в контрольной группе, при этом не было выявлено достоверных различий в показателях sFas между больными РМЖ и ДОМЖ. Частота выявления IL-6 у практически здоровых женщин составила 73%, а в группах больных ДОМЖ и РМЖ IL-6 был выявлен у всех пациенток. Медианы концентрации IL-6 достоверно не различались между больными РМЖ и ДОМЖ, но при этом достоверно превышали соответствующий показатель группы контроля. Уровни sFas и IL-6 в сыворотке крови достоверно не зависели от возраста больных РМЖ (r=-0.05) и больных ДОМЖ (r=0.19), однако была выявлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией sFas и возрастом в группе больных папилломой (r=-0.85).

У 119 больных первичным РМЖ определяли концентрацию sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови, а также содержание РЭ в ткани опухоли и проводили анализ определяемых показателей в зависимости от основных клинико-морфологических критериев заболевания. В нашем исследовании рецептороположительными (РЭ+) мы считали опухоли, в которых содержание РЭ было 10 и более фмоль на 1 мг общего белка цитозольной фракции (фмоль/мг белка). Опухоли, содержащие РЭ в количестве ниже 10 фмоль/мг белка, считали рецепторотрицательными (РЭ-). Из 119 первичных опухолей при РМЖ в 102 случаях уровень РЭ был выше нуля (86%), однако РЭ+-опухолей было всего 67 (56%). Результаты проведенных исследований представлены в таблице 8.

Содержание РЭ в первичных опухолях изменялось в широких пределах, при этом не выявили корреляционной связи уровня РЭ в опухоли с возрастом больных (r=0.20).

Показатели sFas, VEGF и IL-6 в сыворотке крови больных РМЖ были достоверно выше, чем в группе контроля (р<0.001), при этом не выявлено зависимости показателей sFas, IL-6 и VEGF от возраста ни в контрольной группе, ни в группе больных РМЖ.

Таблица 8. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при раке молочной железы

Исследуемые показатели	Практически здоровые люди	Рак молочной железы
	Частота выявления, %	Диапазон колебаний	Mm, медиана	Частота выявления, %	Диапазон колебаний	Mm, медиана
РЭ, фмоль/мг	-	-	-	56	10.1-382.5	73.9±8.6; 46.9
sFas, нг/мл	47	0.3 - 1.2	0.8±0.1; 0.8	59	0.5-2.6	1.9±0.1; 1.7
IL_6, пг/мл	73	0.2 - 2.0	1.0±0.1; 0.9	100	0.6-2.9	1.8±0.1; 1.6
VEGF, пг/мл	100	15.0-315.0	179.0±13.4 154.0	100	35.6-1090.0	312.8±27.2; 263.9

Был проведен анализ показателей рецепторного статуса опухоли и sFas, IL_6 и VEGF в сыворотке крови больных в зависимости от стадии заболевания (табл. 9).

Таблица 9. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при различных стадиях РМЖ

Исследуемые показатели	Стадия РМЖ и количество обследованных больных (n)
	Ia, n=22	IIa, n=46	IIb, n=20	IIIa, n=14	IIIb, n=13	IV, n=4
	Частота выявления, медиана
РЭ, фмоль/мг	52% 70.3	62% 75.9	60% 42.0	34% 25.6	30% 21.8	не было выявлено
IL_6, пг/мл	0.9	1.7	1.5	1.5	1.8	2.0
sFas, нг/мл	63% 1.7	68% 2.2	58% 1.7	55% 1.5	40% 1.8	не был выявлен
VEGF, пг/мл	173.6	267.4	265.0	286.2	306.4	447.5

IL-6 и VEGF были выявлены у всех больных. Прогрессирование РМЖ характеризовало снижение частоты выявления sFas в сыворотке крови, при этом концентрация sFas достоверно не изменялась. В отличие показателей sFas, медианы концентрации IL_6 и VEGF достоверно повышались с увеличением стадии заболевания. Корреляционный анализ не выявил зависимости между показателями IL_6 и VEGF, но при этом была обнаружена отрицательная корреляционная связь между уровнями sFas и IL-6 при III-IV стадии заболевания (r=-0.54). Было также отмечено, что с увеличением стадии заболевания наблюдается снижение частоты выявления и содержания РЭ в опухолях (р=0.08).

Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и РЭ-статуса опухолей были проанализированы в зависимости от гистологического строения опухолей, данные анализа приведены в таблице 10.

Таблица 10. Показатели sFas, IL-6 и VEGF в сыворотке крови и гормональной чувствительности опухоли при РМЖ в зависимости от гистогенеза новообразования

Морфология опухолей	РЭ	IL-6	sFas	VEGF
	% выявле...

Подобные документы

• Изучение показателей углеводного обмена при панкреатите

  Поджелудочная железа и ее роль в обмене веществ. Механизмы нарушения функциональной деятельности поджелудочной железы при панкреатите. Определение билирубина в сыворотке крови у больных панкреатитом. Показатели активности альфа-амилазы в сыворотке крови.
  
  дипломная работа [72,7 K], добавлен 20.02.2016
  

• Динамика биохимических показателей при анемии различных гинекологических патологий

  Причины дефицита железа в организме. Исследования крови при анемии. Клинические проявления железодефицитной анемии. Определение содержания креатинина в сыворотке крови. Общий белок и белковые фракции. Определение содержания мочевины в сыворотке крови.
  
  дипломная работа [226,6 K], добавлен 10.11.2015
  

• Реактивные изменения крови. Картина крови при различных заболеваниях

  Рассмотрение изменений количества эритроцитов, тромбоцитов, скорости оседания крови при различных состояниях организма. Изучение изменений крови на примере острой пневмонии. Сравнительный анализ показателей заболеваемости болезнями органов дыхания детей.
  
  дипломная работа [144,5 K], добавлен 25.07.2015
  

• Биохимические показатели крови и мочи в диагностике острого и хронического пиелонефрита

  Эпидемиология, этиология и патогенез острого и хронического пиелонефрита. Изменения биохимических показателей крови, показателей азотистого и белкового обмена. Морфологическое исследование элементов осадка мочи. Определение креатинина в сыворотке крови.
  
  курсовая работа [166,8 K], добавлен 03.11.2015
  

• Общий белок, его значение и методы определения

  Классификация белков - высокомолекулярных органических азотсодержащих соединений, состоящих более чем из 20 видов альфа-аминокислот. Физиологическая функция белков плазмы крови: альбумины, глобулины. Методы определения общего белка в сыворотке крови.
  
  реферат [25,8 K], добавлен 19.01.2011
  

• Психологические нарушения у онкологических больных

  Общее понятие об онкологических заболеваниях, факторы риска их возникновения. Психические нарушения, апатический и астенический синдромы у онкологических больных на диагностическом, предоперационном и послеоперационном этапах; способы борьбы со стрессом.
  
  контрольная работа [24,8 K], добавлен 18.02.2013
  

• Сестринский процесс при заболеваниях крови

  Заболевания крови и органов кровообращения как одна из основных причин заболеваемости и смертности. Сестринский процесс при заболеваниях системы крови и в гематологическом отделении. Действия медсестры при решении проблем с патологией системы крови.
  
  реферат [28,9 K], добавлен 25.09.2010
  

• Роль карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в гемостазе у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

  Система гемостаза. Механизмы свертывания крови. Нарушения системы гемостаза у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде. Механизм образования активных форм пептидов. Метод определения активности карбоксипептидазы N и содержания белка.
  
  дипломная работа [144,2 K], добавлен 10.02.2011
  

• Активность церулоплазмина в крови больных первичной рожей

  Исследование роли свободнорадикальных процессов в патогенезе ряда бактериальных инфекционных болезней. Определение содержания церулоплазмина в сыворотке крови у больных рожей в зависимости от периода заболевания и степени тяжести патологического процесса.
  
  статья [15,4 K], добавлен 01.09.2013
  

• Изменение биохимических показателей при вирусных гепатитах

  Характеристика вирусных гепатитов с фекально-оральным механизмом передачи и передающихся половым и парентеральным путем. Оценка состояния обмена билирубина, активности ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Корреляция биохимических показателей.
  
  дипломная работа [219,5 K], добавлен 13.01.2015
  

• Биохимический контроль крови в лечении больных с почечной патологией методом гемосорбции

  Биохимические и клинические показатели сыворотки крови при заболеваниях почек. Динамика активности трансаминаз; концентрации креатинина, билирубина, электролитов и глюкозы у больных почечной недостаточностью в условиях применения метода гемосорбции.
  
  дипломная работа [336,1 K], добавлен 03.11.2015
  

• Нарушение баланса магния, хлора, фосфора и ОПН

  Норма концентрации магния в плазме. Гипомагниемия, изменчивая клиническая картина при дефиците магния. Норма концентрации неорганического фосфора в сыворотке крови у взрослых людей. Биологическая роль фосфора, гипофосфатемия. Нарушение баланса хлора.
  
  реферат [21,4 K], добавлен 07.09.2009
  

• Динамика биохимических показателей течения беременности нормальной и осложненной гестозами

  Основные показатели биохимического анализа крови. Гестозы второй половины беременности. Оценка степени их тяжести. Определение и динамика содержания общего белка, мочевины, креатинина, глюкозы, фибриногена и трансаминаз в сыворотке и плазме крови.
  
  дипломная работа [50,5 K], добавлен 10.11.2015
  

• Рекомендации IFCC по регистрации результатов определения глюкозы в крови

  Особенности распределения глюкозы в крови. Краткая характеристика сути основных современных методов определения глюкозы в крови. Методики усовершенствования процесса измерения уровня глюкозы в крови. Оценка гликемии при диагностике сахарного диабета.
  
  статья [24,8 K], добавлен 08.03.2011
  

• Оптимизация работы сестринского персонала при опухолевых заболеваниях головного мозга

  Опухолевые заболевания головного мозга, их классификация. Клиника опухолевых заболеваний головного мозга. Понятие о сестринском процессе. Виды сестринских вмешательств. Психологическая работа медицинской сестры с пациентами с опухолью головного мозга.
  
  курсовая работа [66,4 K], добавлен 23.05.2016
  

• Особенности состава и метаболизма опухолевых клеток

  Содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток и изменение числа хромосом. Атипизм обмена нуклеиновых кислот и углеводов. Изменение изоферментного спектра. Накопление в крови эмбриональных белков и ферментов. Изменение функционирования регуляторных систем.
  
  презентация [1,1 M], добавлен 15.09.2015
  

• Учение о группах крови

  История открытия антигенов системы резус. Группы крови, расовые особенности и заболеваемость. Методы определения групп крови. Формирование групп крови у плода. Инструкция по применению цилоклонов анти-А, анти-В для определения групп крови человека АВО.
  
  контрольная работа [36,8 K], добавлен 24.06.2011
  

• Патофизиология опухолевых процессов

  Виды злокачественных и доброкачественных опухолей, их биологические особенности, атипизм размножения. Частота выявления болезни. Причины ее возникновения. Цитологическая и гистологическая дифференцировка опухолевых клеток. Их взаимодействие с организмом.
  
  презентация [25,4 K], добавлен 12.04.2014
  

• Развитие онкогенетики

  Характеристика процесса образования злокачественных опухолей, причины их возникновения. Модифицирующее влияние полиморфных аллелей на риск развития онкологических болезней. Лечение опухолевых заболеваний с использованием методов медицинской генетики.
  
  реферат [31,3 K], добавлен 22.08.2011
  

• Сестринская деятельность за больными при онкологических заболеваниях органов пищеварения

  Виды онкологических заболеваний органов пищеварения. Биологические свойства опухолей. Полипозы кишечника, рак пищевода, желудка, толстой кишки. Симптомы, диагностика и лечение заболеваний. Ведение пациентов в предоперационном и послеоперационном периодах.
  
  курсовая работа [315,5 K], добавлен 09.11.2015
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам