Парентеральные вирусные гепатиты в сибирских регионах России

В то же время не было показано статистически значимой зависимости между наличием гемотрансфузий в анамнезе, их количеством и временем их выполнения (до 1994 года и после) и инфицированием вирусом гепатита G.

Наличие и, главное, широкое использование вакцины против гепатита В в настоящее время является огромным успехом мирового здравоохранения. Число хронически инфицированных HBV людей в мире оценивается в 350 миллионов человек, и все они являются возможным источником заражения для остальной популяции, при этом вирус гепатита В в 100 раз более контагиозен, чем ВИЧ. Наше исследование также показало, что самым значимым фактором защиты против HBV инфекции является вакцинация (OR=0.48). Следующий раздел диссертации посвящен более подробному анализу факторов иммунной защиты в отдаленные сроки после вакцинации такой группы риска как сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», которые вели активную работу с материалом, инфицированным HBV.

2. Исследование напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В

Для определения состояния поствакцинального иммунитета мы учитывали уровень анти-HBs IgG и индекс специфической стимуляции лимфоцитов методом ELISPOT. Концентрацию анти-HBs IgG определяли с помощью тест-системы «ВектоHBsAg-антитела» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). ELISPOT-анализ проводили с использованием набора INF- BD™ ELISPOT Set (BD Biosciences, США). В качестве клеток-эффекторов использовали лимфоциты периферической крови, в качестве специфического антигена - природный HBsAg («Внутрилабораторный контроль HBsAg» ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), в качестве неспецифического митогена - фитогемоагглютинин (ФГА, Sigma, США). Регистрацию и обработку результатов реакции ELISPOT проводили на AxioCam, Stemi 2000C с помощью программы AxioVision Rel. 4.5 «Carl Zeiss» (Германия). Определяли отношение спотов (ИФН-г-продуцирующих клеток) в экспериментальной (стимулированной специфическим антигеном) лунке к количеству спотов в контрольной (не стимулированной) лунке. Кратность превышения была обозначена как индекс специфической стимуляции лимфоцитов. Ответ считали положительным, если наблюдался ответ на митоген (контроль системы), индекс специфической стимуляции был больше 2, и регистрировалось более чем 20 спот-формирующих единиц на 10⁶ лимфоцитов.

Результаты, полученные при анализе образцов крови вакцинированных сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», получивших в 2002 году полный курс вакцины Engerix, приведены в Табл. 5. Как видно из данной таблицы, 22.4% вакцинированных имеют антитела к HBcAg, что свидетельствует об инфекции вирусом гепатита В. Существовали ли эти антитела до вакцинации или были индуцированы после, сказать не представляется возможным, так как обследование на маркеры HBV до вакцинации не проводилось. Если предположить, что инфицирование произошло до вакцинации, то при наличии достаточного уровня анти-HBs IgG (>10 МЕ/л) и отсутствии HBsAg, 22.4% данной выборки могли бы не подвергаться вакцинации как имеющие естественный иммунитет вследствие бессимптомной инфекции HBV (в Анкете эти сотрудники указали, что ранее вирусным гепатитом не болели). Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения обследования на наличие маркеров HBV инфекции перед вакцинацией.

В группе вакцинированных, не содержащих анти-HBc IgG (45 человек, Табл.2.1), протективный уровень антител к HBsAg (>10МЕ/л) был выявлен у 27 человек, т.е. эффективность иммунизации вакциной Engerix в данной группе через 5 лет составила 60.0%, при этом только 16 человек из 27 имели уровень анти-HBs IgG >100 МЕ/л.

Таблица 5. Выявление показателей гуморального и клеточного иммунитета у сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» через 5 лет после полного курса иммунизации вакциной Engerix в 2002 г.

При анализе индекса специфической стимуляции лимфоцитов в этой группе было установлено, что только у 13 человек (48.1%) (Рис. 5, сектор Б) из 27 вакцинированных (Рис. 2.1, сектор Б и Г), имеющих протективный уровень анти-HBs IgG (>10 МЕ/л), присутствует клеточная составляющая иммунитета (индекс стимуляции 2 и более). В группе, где концентрация защитных антител была ниже протективного уровня (Рис. 2.1, сектор А и В), положительный индекс стимуляции лимфоцитов определялся в 72.2% случаев (Рис. 2.1, сектор А), что достоверно выше (p < 0.05), чем в группе с протективным уровнем антител к HBsAg (Рис. 2.1, сектор Б). Это согласуется с данными о том, что иммунологическая память формируется независимо от уровня антител, так как обусловлена в основном Т-клеточным звеном иммунитета [Селиашвили и др., 2006; Banatvala et al., 2000].

Доля лиц с положительным индексом стимуляции лимфоцитов растет по мере снижения уровня анти-HBs IgG. Так в группе с уровнем антител более 100 МЕ/л положительный индекс стимуляции лимфоцитов имеют меньше половины вакцинированных, 7 человек из 16 (43.8%), а в группе с уровнем антител 10-100 МЕ/л - больше половины вакцинированных, 6 человек из 11 (54.5%). Возможным объяснением полученных данных является сбалансированность иммунного ответа на уровне индивидуального организма: в случае доминирования цитокинсекреторной активности Т-хелперов 1-го типа происходит снижение активности Т-хелперов 2-го типа, которые регулируют стимуляцию гуморального иммунитета [Bertoletti et al., 1997].

Рис. 9. Соотношение показателей клеточного (индекс специфической стимуляции лимфоцитов) и гуморального (уровень анти-HBs IgG) иммунного ответа в группе вакцинированных. Сектор А: анти-HBs IgG < 10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов ?2; сектор Б: анти-HBs IgG >10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов ?2; сектор В: анти-HBs IgG <10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов ?2; сектор Г: анти-HBs IgG >10 МЕ/л, индекс стимуляции лимфоцитов ?2

Таким образом, оказалось, что через 5 лет из группы вакцинированных, не имеющих анти-HBc IgG, 27 человек (60.0%) имеют протективный уровень антител к HBsAg, 26 человек (58.0%) имеют положительный индекс стимуляции лимфоцитов (2 и более), и оба положительных ответа имеют 13 человек (28.8%). В целом из 45-ти вакцинированных 5 лет назад 40 человек имеют хотя бы один положительный показатель протективности, что составляет 89.0% и существенно превышает уровень оценки, сделанный только на основе количества анти-HBs IgG (60.0%).

В группе вакцинированных с анти-HBc IgG (Табл. 2.1) выявлена тенденция к увеличению количества образцов с протективным уровнем антител к HBsAg (77.0%), что может быть обусловлено аддитивным эффектом вакцинации и перенесенной инфекции. У трех человек, имеющих анти-HBc IgG, антитела к HBsAg оказались ниже протективного уровня - эти лица требуют усиленного наблюдения с целью исключения развития хронического гепатита В. Увеличение частоты выявления положительного индекса стимуляции лимфоцитов в этой группе (6 человек из 10 и 3 человека из 3-х) оказалось недостоверно на уровне значимости p < 0.05.

2.1 Оценка необходимости ревакцинации при различном соотношении показателей иммунного ответа

Результаты исследования напряженности гуморального иммунитета и состояния клеточного иммунитета через 5 лет после полного курса вакцинации против гепатита В показали, что кроме общепринятого критерия оценки эффективности вакцинации против гепатита В - уровень анти-HBs IgG, при решении вопроса о ревакцинации необходимо учитывать и Т-клеточную составляющую иммунитета - определение HBsAg-стимулированной продукции ИФН-г лимфоцитами методом ELISPOT. Совокупность этих данных позволит более адекватно оценить эффективность вакцинации и принять решение о ревакцинации. Из представленных данных следует, что положительный индекс специфической стимуляции лимфоцитов встречается чаще при низком уровне антител, что позволяет определить состояние иммунитета у вакцинированных со слабым гуморальным ответом и в отдаленный период, когда содержание анти-HBs IgG становится ниже 10 МЕ/л.

Анализ полученных нами данных и данных литературы позволил сформулировать следующий алгоритм вакцинации и ревакцинации против гепатита В:

1. Проведение перед вакцинацией обследования на наличие маркеров гепатита В (HBsAg, анти-HBc IgG, анти-HBs IgG) .

2. Проведение обследования после полного курса вакцинации против гепатита В с целью определения ее эффективности:

при уровне анти-HBs IgG ниже 10 МЕ/л провести оценку клеточного иммунитета (ELISPOT), при индексе стимуляции <2 рекомендовать проведение дополнительной вакцинации;

при уровне анти-HBs IgG >10 МЕ/л - рекомендовать скрининг уровня анти-HBs IgG через 5 лет и при снижении данного показателя ниже протективного (10 МЕ/л) определять состояние клеточного иммунитета c целью оценки необходимости ревакцинации.

Одним из предикторов успеха при создании вакцины против гепатита В явилось наличие высокоиммуногенной консервативной детерминанты «а» в поверхностном белке вируса - HBsAg. Выявлению и конструированию таких детерминант в поверхностных гликопротеинах Е1 и Е2 вируса гепатита С посвящена следующая часть работы.

3. Изучение антигенного профиля поверхностных белков Е1 и Е2 HCV

3.1 Пептидное сканирование антигенных детерминант нативных поверхностных белков Е1 и Е2 HCV

В работе использовали коллекцию из 45 сывороток крови хронически инфицированных HCV пациентов ГУЗ Государственный Новосибирский Областной Клинический Диагностический Центр, г. Новосибирск. В коллекцию входили образцы, содержащие HCV трех генотипов - 1b, 2a/2c и 3a, которые наиболее широко распространены на территории России и, в частности, в г. Новосибирске. Каждая генотипическая группа сывороток включала 15 образцов.

Cканирование антигенно-значимых детерминант поверхностных белков HCV проводили методом ИФА с использованием набора синтетических пептидов, перекрывающих полную последовательность гетеродимера Е1Е2 (192-809 а.о.) (PepScan анализ). Набор состоит из 76 пептидов, рассчитанных на основе структуры штамма H77 HCV, генотип 1а и синтезированных в фирме Mimotopes (Австралия). Пептиды имеют длину 20 а.о. с перекрыванием в 12 а.о., благодаря чему при сканировании каждая последовательность представлена 2-3 раза.

Для увеличения репрезентативности антигенных профилей и нивелирования колебаний неспецифических фоновых значений оптической плотности (ОП) индивидуальных сывороток нами была проведена теоретическая оценка антигенной активности каждой аминокислоты тестируемых Е1 и Е2 белков HCV (ОПак) с учетом количества пептидов, в которых она участвует в PepScan анализе, и среднего значения ОП для каждого пептида внутри группы сывороток одного генотипа. Такой подход позволил также преодолеть ступенчатый характер пептидного анализа (в нашем случае размер «ступени» составляет 8 а.о.) и картировать антигенные детерминанты в соответствии с позициями определенных аминокислот на полипротеине Е1Е2 HCV. Суммированные по разным генотипам HCV результаты расчета представлены на Рис. 10.

Как следует из Рис. 10 общие высокоиммуногенные эпитопы выявлены в следующих позициях а.о.: 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440, 680-690 (Е2 белок). В позициях 340-350, 490-500 и 560-580 а.о. также регистрируются общие, но существенно слабее реагирующие эпитопы. Широкое варьирование границ большинства эпитопов свидетельствует о высокой изменчивости белков Е1 и Е2, однако способность антител, индуцированных разными генотипами HCV, реагировать с одинаковыми пептидами свидетельствует также и о возможности создания на основе этих пептидов универсальных иммуногенных конструкций для разработки вакцин против HCV.

Рис. 10. Антигенные профили поверхностных белков HCV трех разных генотипов, построенные на основе расчета активности отдельных аминокислот Е1Е2 полипротеина HCV в пептидном анализе. Вдоль оси абсцисс указаны позиции а.о. в полипротеине Е1Е2, вдоль оси ординат указаны рассчитанные для каждой аминокислоты значения ОПак. Генотипы HCV указаны в рамках в правом верхнем углу рисунка, «ВГС отр.» обозначает значения ОП негативных на присутствие маркеров HCV сывороток человека (n=6, отрицательный контроль), «среднее» на нижнем рисунке обозначает среднее значение ОП для всех генотипов HCV. Все расчеты проводили в среде программного обеспечения «LabView».

Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях а.о. 280-290, 410-430 и 520-540 (Рис. 10). Так, в частности, в районе 280-290 а.о. белка Е1 выявлена ранее не описанная в литературе антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с субтипа сибирских изолятов HCV.

Выявленные нами межгенотиповые различия антигенного профиля поверхностных белков HCV свидетельствуют о необходимости генотипирования изолятов при изучении свойств поверхностных белков Е1 и Е2 и некорректности в ряде случаев распространения данных, полученных для отдельного генотипа, на вирус гепатита С в целом (как следует из Рис. 10, среднее).

3.2 Получение и анализ рекомбинантных белков Е1 и Е2 HCV

Рис. 11. Схематическое изображение мембран-связанных поверхностных белков HCV и структура конструкта, использованного в нашей работе.

A - процессинг структурных белков HCV от N до C конца: Сore, E1, E2 и P7; стрелками указаны сайты разрезания пептидазами клетки. Цветные боксы - полноразмерные белки Е1 и Е2 с указанием краевых позиций а.о. в полипротеине HCV; полые боксы - необходимые для их функциональной активности фрагменты Сore (для E1) и E1 (для E2) [Bian et al., 2009].

В - структура встраиваемого фрагмента генома HCV.

Белки Е1 и Е2 являются поверхностными гликопротеинами HCV и относятся к трансмембранным белкам I типа с высокогликозилированным N-терминальным эктодоменом (5 сайтов гликозилирования для Е1 и 11 - для Е2) и С-терминальным гидрофобным якорем. Процессинг Е1 и Е2 белков и формирование нековалентного гетеродимера происходит на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) (Рис. 3.2А).

Трансмембранные домены гликопротеинов Е1 и Е2 HCV играют определяющую роль в формировании и субклеточной локализации Е1Е2 гетеродимера, который является функционально активной формой поверхностных белков HCV и обеспечивает проникновение вируса в клетку [Lavie et al., 2007]. Несмотря на то, что в последние годы была разработана система культивирования HCV с использованием выделенного в Японии JFH-1 клона, способного размножаться в клетках гепатомы человека Huh7.5 [Kato et al., 2006], выделение и изучение свойств поверхностных белков HCV в этой системе проводить затруднительно вследствие низкого уровня репродукции вируса. Лучшими кандидатами для экспрессии генов поверхностных белков HCV являются вирусные векторы, поскольку гликозилирование белков и образование Е1Е2 комплексов в этом случае происходит наиболее близким к природному образом.

Для продукции препаративных количеств Е1 и Е2 белков нами были использованы два вируса: Синдбис вирус (альфавирус с РНК геномом позитивной полярности) и вирус осповакцины (ортопоксвирус с ДНК геномом). Эти два вируса совершенно различны по скорости репликации, внутриклеточной локализации и механизмам синтеза и процессинга белков, что позволяет выбрать наиболее адекватную природной систему экспрессии. В обоих случаях проводили ко-экспрессию генов белков Е1 и Е2 HCV с целью обеспечения возможности образования Е1Е2 гетеродимера. При конструировании в расчет было принято также то, что для правильного процессинга Е1 белка необходим С-концевой фрагмент Core, а для процессинга Е2 белка - примыкающий к нему С-концевой фрагмент Е1 (Рис. 3.2А) [Bian et al., 2009; Dubuisson et al., 2003]. Таким образом встраиваемая конструкция состояла из фрагмента гена Core, кодирующего 21 а.о. С-концевой части этого белка, полноразмерной копии гена белка Е1 (192-383 а.о. по последовательности полипротеина штамма Н77, генотип 1а) и усеченного с С конца гена белка Е2 (384-715 а.о.), у которого был удален гидрофобный трансмембранный домен и введены шесть остатков гистидина (E1E2T-HIS) (Рис. 11В).

Рекомбинантный вирус осповакцины со встройкой Е1Е2 фрагмента генома HCV в структурную часть гена тимидинкиназы (rVV-E1E2) был получен нами из американской лаборатории вирусных гепатитов (CBER, FDA).

Для конструирования рекомбинантного вируса Синдбис была использована двух-плазмидная система: плазмида SinRepЕ1Е2Т-His, несущая гены всех неструктурных белков вируса Синдбис со встройкой последовательности Е1Е2T-HIS и вспомогательная плазмида DH-BB helper, несущая встройку генов структурных белков вируса Синдбис [Bredenbeek et al., 1993]. Синтез функционально активных РНК, представляющих фрагменты генома вируса Синдбис (структурная и неструктурная часть) осуществляли in vitro с помощью SP6 РНК полимеразы, под контролем промотора которой клонированы гены вируса Синдбис в плазмидных ДНК. Рекомбинантный вирус Синдбис (rSin-E1E2) получали совместной электропорацией клеток препаратами РНК SinRepЕ1Е2Т-His и DH-BB helper. Образующиеся вирионы содержат рекомбинантную субгеномную РНК вируса Синдбис SinRepЕ1Е2Т-His и не способны формировать полноценное потомство вследствие отсутствия генов структурных белков. Такой подход обеспечивает безопасность работы с системой экспрессии вируса Синдбис поскольку в нативном состоянии данный вирус патогенен для человека. Однократная абортивная инфекция клеток BHK-F вирусом rSin-E1E2 способна эффективно направлять экспрессию генов рекомбинантных белков HCV, встроенных в субгеномную РНК вируса Синдбис.

Продукцию рекомбинантных белков осуществляли в клетках почки китайского хомячка BHK-F вследствие инфекции их рекомбинантными вирусами осповакцины или Синдбис. Не смотря на высокую репродуктивную способность rVV-E1E2 и rSin-E1E2, уровень продукции Е1 и Е2 белков оказался невысок и составлял приблизительно 1.25 х10^-12 г/клетка в случае осповакцины и 2.1 х10^-12 г/клетка в случае Синдбис вируса, что не превышает 1% от общего белка клетки. В связи с этим нами был разработан многостадийный метод выделения комплекса Е1Е2 гликопротеинов HCV.

Мы использовали ранее описанный принцип очистки высоко гликозилированных белков [Maertens et al., 2006] и особенность Е1 и Е2 белков HCV, связанную с наличием преимущественно маннозных остатков в их гликозидных цепочках [Flint et al., 2000]. Такой тип модификации позволяет использовать на первом этапе очистки Е1 и Е2 белков HCV иммобилизованный на агарозе GNA-лектин, обладающий высокой аффинностью к маннозным сахарам. «His-tag» технологию использовали на втором этапе очистки Е1Е2 гетеродимера. Все фракции, выделенные на хроматографе, анализировали в Western blot на присутствие белков Е1 и Е2 HCV с использованием моноклональных антител анти-E1 (МКА Е1 A4) и анти-E2 (МКА Е2 A11) [Dowd et al., 2009] (любезно предоставлены Dr. Marian Major, США).

Анализ очищенных препаратов белков, экспрессированных в системе вируса осповакцины (VV-E1E2) представлен на Рис. 12, а в системе вируса Синдбис (SIN-E1E2) - на Рис. 13.

Рис. 12. Иммуноблот и электрофоретический анализ очищенного препарата Е1Е2 белков HCV, полученных в системе рекомбинантного вируса осповакцины. Слева - маркер молекулярных весов (BioRad, Kaleidoscope Prestained Standards, Cat 161-0324). А - связывание с МКА E1 A4; В - связывание с МКА Е2 A11; С - 10% SDS-ПААГ, окраска по Laemmly. 1 и 2 - два препарата очищенных белков VV-Е1Е2: 1 - нанесен1 м г; 2 - нанесено 0.2 мг белков

Рис. 13. Иммуноблот и электрофоретический анализ очищенного препарата Е1Е2 белков HCV, полученных в системе рекомбинантного вируса Синдбис. Слева - маркер молекулярных весов. А - связывание с МКА E1 A4; В - связывание с МКА Е2 A11; С - 10% SDS-ПААГ, окраска по Laemmly. 1 - очищенный препарат белков VV-E1E2 (положительный контроль); 2 и 3 - два препарата очищенных белков SIN-Е1Е2.

Как следует из Рис. 12 и 13, при анализе белков в SDS-ПААГ видимая полоса формируется только белком Е2, однако Western blot анализ выявляет и присутствие белка Е1 (Рис. 12А и 13А), который выделяется в составе нековалентного комплекса с Е2. Во всех препаратах белков в иммуноблоте с МКА А4 Е1 регистрируется также полипротеин Е1Е2 с Мв около 100 кДа. Таким образом полученные нами очищенные препараты Е1Е2 белков представлены белком Е2, нерасщепленным полипротеином Е1Е2 и гетеродимером Е1Е2, что наиболее ценно с точки зрения природного фолдинга этих белков и последующего изучения их иммуногенных и протективных свойств.

При сравнении Рис. 12 и 13 хорошо видны различия в уровне гликозилирования белков в двух системах экспрессии. В препаратах белков VV-E1E2 наблюдаются отдельные четкие полосы, соответствующие полностью гликозилированным формам белков E1 (35 кДа), E2 (72 кДа) и комплексу E1E2 (Рис. 12). Белки, экспрессированные в системе вируса Синдбис, не полностью гликозилированы, что выражается в наличии серии полос в иммуноблоте (Рис. 13). Это особенно наглядно выявляется в случае белка E1, где можно наблюдать до четырех полос, соответствующих 4-м сайтам гликозилирования данного белка [Dubuisson et al., 2003].

Оценку иммуноадекватности выделенных нами рекомбинантных белков нативным аналогам проводили в ИФА и Western blot анализе с использованием фрагмента коллекции HCV-позитивных сывороток человека, описанных в разделе 3.1: по 13 образцов 1b и 2a/2c генотипов и 11 образцов 3a генотипа HCV. Все тестированные сыворотки распознавались как позитивные в ИФА с использованием в качестве антигена VV-E1E2. Белки SIN-E1E2 распознают все сыворотки только в случае генотипа 3a HCV и не распознают 5 сывороток в группе с генотипом 2a/2c и 3 сыворотки в группе с генотипом 1b.

Таким образом, по результатам ИФА рекомбинантные белки, экспрессированные в системе вируса осповакцины, являются более компетентными для иммуноанализа (100% узнавания), чем белки из системы Синдбис вируса (78% узнавания). Еще в большей степени различия между рекомбинантными белками проявились в Western blot анализе, в котором система экспрессии вируса Синдбис обеспечивала только 46% узнавания HCV-позитивных сывороток против 100% в системе вируса осповакцины.

3.3 Вируснейтрализующая активность иммуногенных эпитопов рекомбинантных белков Е1 и Е2

Для оценки иммуногенных и протективных свойств рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV проводили иммунизацию мышей линии BALB/c очищенными препаратами белков. Позитивные сыворотки объединяли в пулы (VV-AB и SIN-AB, соответственно) и анализировали в PepScan анализе с набором пептидов, описанным в разделе 3.1 (Рис. 14). Главный линейный эпитоп, узнаваемый обоими пулами сывороток, был локализован в позиции а.о. 632-667 (Рис. 14A) с сравнимым титром антител (~10⁶) (Рис. 14Б). Сыворотки SIN-AB узнавали только 3 основных линейных эпитопа (а.о. 496-515, 512-547 и 632-667), в то время как 10 больших линейных детерминант узнавалось VV-AB пулом сывороток в полноразмерной последовательности Е1Е2 полипротеина.

Рис. 14. ИФА иммунных сывороток крови мышей с набором синтетических пептидов, перекрывающих последовательность полипротеина Е1Е2 HCV (PepScan).А - результаты PepScan анализа сывороток мышей в разведении 1:300; В - титры антител для каждого эпитопа в обеих сыворотках, полученные методом предельных 4-х кратных разведений в диапазоне от 1:200 до 1:3276800 (Рис. 5-13 B) в PepScan анализе

Вируснейтрализующую активность сывороток (Рис. 15) оценивали с использованием высоковирулентного клона HCV J6/JFH1 с генотипом 2а, способного к многопассажной репликации в клетках Huh-7.5 [Lindenbach et al., 2005]. Для оценки перекрестной межгенотиповой вируснейтрализующей активности использовали химерные вирусы с поверхностными белками генотипов 1a (химера 1а/2а) и 1b (химера 1b/2a). Работа проводилась в американской лаборатории вирусных гепатитов (FDA, USA) в рамках проекта Международного научно-технического центра № 3255-п, руководителем которого являлась автор представленной диссертации.

Рис. 15. Нейтрализация 1а/2а и 1b/2а химерных вирусов и 2а J6/JFH1 клона иммунными сыворотками мышей VV-AB и Sin-AB. NMS - нормальная мышиная сыворотка. Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в единицах «ингибирующая доза 50» (ID50). ID50 рассчитывали как максимальное разведение, способное нейтрализовать 50% вируса [Zhang et al., 2007]. Расчет средних значений и стандартного отклонения проводили с использованием пакета программ Origin для уровня значимости Р < 0.05.

Из Рис. 15 следует, что пул сывороток VV-AB обладает существенно большей нейтрализующей и перекрестной активностью, чем SIN-AB. Самые существенные различия между сыворотками были выявлены в случае генотипа 2а HCV (J6/JFH1), в котором ID50 титр для VV-AB составил 295.7 в сравнении 109.3 для SIN-AB, т.е. больше в 2.7 раза. Средний ID50 титр для нормальной мышиной сыворотки (NMS) в этих же экспериментах составил 21.47.

Для картирования вируснейтрализующих детерминант рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV нами было проведено блокирование иммунных мышиных сывороток пептидами, соответствующими четырем наиболее иммуногенным эпитопам белков VV-E1E2 и SIN-E1E2: а.о. 264-318; 496-515; 512-547 и 632-667 (Рис. 16). На первом этапе тест вирусной нейтрализации проводили с химерой 1a/2a HCV, последовательность Е1 и Е2 белков которой гомологична рассчитанным и синтезированным пептидам.

Как следует из Рис. 16A и B наибольший вклад в нейтрализацию вируса вносят пептиды, соответствующие районам а.о. 264-318 и 496-515. Эти районы представляют новые ранее не описанные вируснейтрализующие эпитопы белков Е1 и Е2 HCV. Суммарное блокирование сывороток двумя пептидами, соответствующими данным эпитопам (Рис. 3.7С), приводило к практически полной отмене нейтрализующей активности SIN-AB и редукции ID50 титра до уровня неспецифической нейтрализации нормальной мышиной сывороткой и контрольным пептидом Flu. В случае VV-AB эффект был выражен в меньшей степени, что свидетельствует о наличии других вируснейтрализующих детерминант в Е1Е2 рекомбинантных белках, синтезированных в системе вируса осповакцины. Из проведенного анализа также следует, что наибольший иммунный ответ как в случае VV-E1E2, так и в SIN-E1E2 формируется к не нейтрализующим эпитопам, локализованным в районах a.о. 512-547 и a.о. 624-667.

Рис. 16. Снижение титра ID50 иммунных сывороток мышей после блокирования специфическими пептидами. Блокирование антител к специфическому пептиду осуществляли как описано в работе [Major et al., 1999], используя 1-5мг небиотинилированных пептидов в 100мкл сыворотки. Оценку блокирования осуществляли с использованием соответствующего биотинилированного пептида в ИФА. В качестве негативного контроля использовали пептид Flu (Mimotopes, Австралия) в той же концентрации как HCV-специфичные пептиды.

Анализ перекрестной межгенотиповой активности вируснейтрализующих эпитопов проводили с использованием VV-AB сыворотки и трех вариантов HCV - 2а (J6/JFH1 клон), химеры 1а/2а и 1b/2а. Кроме выявленных нами двух новых вируснейтрализующих эпитопов в позициях а.о. 264-318, а.о. 496-515 и не нейтрализующего доминантного эпитопа в позиции а.о. 624-667 нами были проанализированы три другие, ранее описанные в литературе, иммунодоминантные эпитопы, выявленные в VV-E1E2 белках (Рис. 17).

Рис. 17. Анализ перекрестной активности эпитоп-специфичных антител в сыворотке VV-АB для 1а, 1b и 2а генотипов HCV. Активность рассчитывали как % снижения титра ID50 до и после блокирования специфическими пептидами

Как следует из Рис. 17 блокирование антител к пептиду а.о. 624-667 оказывало слабый эффект на нейтрализацию всех трех тестированных вирусов, что соответствует данным, представленным на Рис. 17. Блокирование антител к выявленному нами новому эпитопу а.о. 264-318 вызывало ~20% - ную редукцию ID50 титра для 1a и 1b HCV, но не влияло на нейтрализацию 2a вируса, что свидетельствует о неконсервативности этого района в случае 2а генотипа. Блокирование антител к хорошо изученным районам белка Е2 в позициях а.о. 390-410 (HVR1) и 448-483 существенно редуцировало нейтрализацию 1a вируса, но не влияло на нейтрализацию 1b или 2a вирусов, что очевидно является следствием высокой вариабельности этих районов. Напротив, район а.о. 412-419 (EPI) является высоко консервативным между генотипами [Zhang et al., 2007], и блокирование антител к этому району приводило к снижению нейтрализации вируса на 50% для всех тестированных генотипов 1a, 1b и 2a. Блокирование антител к эпитопу в позиции а.о. 496-515 также существенно снижало нейтрализацию всех трех вирусов на 30-50%. Этот район консервативен между тремя исследуемыми генотипами и представляет новый универсальный вируснейтрализующий эпитоп.

Выводы

Впервые на территории Сибири проведено крупномасштабное (n=5605) молекулярно-эпидемиологическое исследование парентеральных вирусных гепатитов B, C и G, по результатам которого созданы три электронные базы данных в международном формате EpiInfo.

С использованием этих баз данных проведен анализ частоты встречаемости, генотипического разнообразия и факторов риска парентеральных вирусных гепатитов B, C и G среди представителей разных групп населения Новосибирской, Иркутской областей и Алтайского края в период 2001- 2003 гг.

Частоты выявления иммунологических маркеров HBV инфекции: среди пациентов поликлиники (n=500) положительными на HBsAg оказались 3.6% пациентов, анти-HBc IgG выявлены у 24.0%; в общей группе медработников (n=500) HBsAg встречался с частотой 5.4%, анти-HBc IgG обнаружены у 22.4% респондентов; частота выявления HBsAg среди всех пациентов МГНД (n=500) составила 8.4%, антитела к HBcAg встречались у 49.9% пациентов; в группе больных острыми гепатитами Новосибирской (n=1509), Иркутской областей (n=888) и Алтайского края (n=1044) HBsAg встречался с частотой 48.8, 20.6 и 36.5% соответственно; в группе больных хроническим гепатитом (n=164) только 25.6% имели серологические маркеры HBV инфекции.

Частоты выявления иммунологических маркеров HCV инфекции: 48.0% - среди пациентов Муниципального наркологического диспансера, 5.6% - среди посетителей поликлиники и 5.2% - у медицинских работников больниц Новосибирской обл. В группе больных острыми гепатитами Иркутской, Новосибирской областей и Алтайского края анти-HCV имели 17.2, 21.0 и 35.1% соответственно. В группе больных хроническим гепатитом - 69.5%.

Отрицательными в ИФА на маркеры гепатитов оказались 14.6% больных острым гепатитом и 11.6% больных хроническим гепатитом. Доля таких пациентов растет с увеличением возраста и составляет 8.8% среди лиц моложе 25 лет и 51.4% в возрастной группе старше 60 лет. ПЦР анализ позволил определить этиологию гепатита в 32.7% и 78.9% случаев в группах с острым и хроническим гепатитом соответственно.

На территории сибирских регионов преобладает генотип D HBV, доля которого в обследованных популяциях составила 97.6% (генотип А - 1.6% и генотип С - 0.8%).

Генотипическое разнообразие изолятов HCV (n=818), циркулирующих в Сибири, ограничено четырьмя субтипами: 1b, 2a, 2c, 3a, среди которых превалируют субтипы 1b (54.6%) и 3а (36.9%), субтипы 2а и 2с встречаются с частотой 7.9%. Выявлено четыре рекомбинантных изолята генотипов 2k/1b (2) и 2a-2c/1b (2). Генотипическое разнообразие HCV не одинаково в разных возрастных группах. С ростом среднего возраста респондентов происходит снижение доли генотипа 3 с 40% в группе 18-25 лет до 5% среди лиц старше 50 лет и увеличение доли генотипа 1 с 52% в группе 18-25 лет до 90% среди лиц старше 50 лет.

Частота встречаемости РНК HGV среди пациентов МГНД (n=500) составила 33.6%. Частота ко-инфекции с HCV составляла 42.9%, (ОR=2.26). Все генотипированные изоляты HGV (n=78) относятся ко 2 генотипу, найден только один изолят 4 генотипа.

Общим и наиболее значимым фактором риска парентеральных гепатитов В, С и G, а также смешанных инфекций В+С и С+G в Сибири является внутривенное употребление наркотиков (OR=1.74-175.3). Основной путь заражения - использование общих шприцев и игл (OR=2.26). Среди наркотических препаратов внутривенного употребления наибольшее распространение имеет «ханка» (80.57%), вторым по значимости является героин (45.85%). Употребление героина (OR=1,4) является менее опасным фактором, чем употребление «ханки» (OR=2.4).

Половой путь передачи HBV, HGV и, что особенно важно, HCV оказался статистически значимым во всех исследованных сибирских регионах. Факторами риска являлись: количество половых партнеров больше или равно 3 в последние 6 месяцев до заболевания (OR=1.68-2.88), половые контакты с ПИН и партнерами с гепатитом в анамнезе (OR=1.66-2.25).

Инвазивные медицинские процедуры также являлись факторами риска заражения гепатитами В и С в 2001-2002 гг: переливание крови (OR=2.45-11.3), эндоскопия и зондирование (OR=1.3-1.6). Хирургические операции и большое количество инъекционных процедур (>10) при госпитализациях достоверно увеличивали риск гепатита С (OR=1.31 и 2.5), но не являлись факторами риска в отношении гепатита В.

Низкий социально-экономический статус был ассоциирован с повышенным риском инфицирования HBV, HCV и HGV, но набор факторов варьировал для разных гепатитов. Гепатиты В и G - статус безработного (OR=4.46 и 2.0); гепатиты В и С - пребывание в тюрьме (OR=2.5 и 3.25), наличие татуировок (OR=1.5 и 2.16), употребление крепких напитков (OR=1.4 и 1.32). Гепатит В - посещение маникюрного кабинета (OR=1.65) и бытовые контакты (OR=1.63).

Вакцинация против HBV инфекции является достоверно значимым фактором защиты (OR=0.47) в группе медработников, где выборка вакцинированных на момент нашего исследования была наиболее высока (n=135).

Оценка состояния клеточного и гуморального иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации против вирусного гепатита В показала, что протективный уровень анти-HBs IgG (>10МЕ/л) через 5 лет после полного курса вакцинации имеют только 60% вакцинированных, при этом 48.1% из них обладают и клеточным иммунитетом (индекс HBsAg-стимуляции лимфоцитов более 2-х). В группе вакцинированных с отсутствием протективного уровня антител число лиц с клеточным иммунитетом достоверно выше и составляет 72.2%.

Пептидное сканирование Е1 и Е2 белков сибирских изолятов HCV генотипов 1b, 2а/2с и 3а (n=45) выявило консервативные высокоиммуногенные эпитопы в позициях а.о.: 250-260, 315-325 (Е1 белок), 390-400, 430-440, 680-690 (Е2 белок). Наибольшие межгенотиповые различия были зарегистрированы в позициях а.о. 280-290 (Е1), 410-430 и 520-540 (Е2).

Проведен сравнительный функциональный анализ рекомбинантных гликопротеинов Е1 и Е2 HCV, полученных в клетках млекопитающих с помощью двух вирусных систем экспрессии - вирусы Синдбис и осповакцины.

Показано, что:

иммунохимические свойства Е1 и Е2 HCV белков из системы вируса осповакцины в большей степени соответствуют природным аналогам, чем белки вируса Синдбис - связывание с HCV-позитивными сыворотками человека в ИФА и иммуноблот анализе составляло (100 и 78)% и (100 и 46)%, соответственно;

белки, экспрессированные вирусом осповакцины, обладали большей иммуногенностью для мышей и большим разнообразием антигенного профиля (10 детерминант) по сравнению с белками вируса Синдбис (3 детерминанты);

мажорные иммуногенные эпитопы рекомбинантных белков индуцировали антитела, не обладающие нейтрализующими свойствами.

Выявлены два новых вируснейтрализующих эпитопа в позициях а.о. 264-318 (Е1) и 496-515 (Е2), первый из которых оказался генотип-специфическим, а второй обладал перекрестной активностью. Пептиды, соответствующие данным эпитопам, могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов анти-HCV вакцин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazdantseva A.A., Shustov A.V., Gavrilova I.V., Nesterov A.E., Streltsova M.A., Paltsev A.I., Loktev A.V., Maksyutov A.Z., West E., Netesov S.V. and Ryder R.W. The prevalence and risk factors of hepatitis C virus and hepatitis B virus infections among health care workers in Novosibirsk region hospitals. // Antiviral Therapy. - 2000. - Vol. 5 (Suppl. 1). - P. 31-32.

2. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Стрельцова М.А., Пальцев А.И., Локтев А.В., Максютов А.З., Акинфеева Л.А., Торшин В.П., West T.E., Нетесов С.В., Ryder R.W., Онищенко Г.Г. Частота встречаемости маркеров гепатита C и факторы риска у персонала больниц Новосибирской области. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2002. - № 2. - С. 26-32.

3. Баяндин Р.Б., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С., Нетесов С.В. Генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирской области. // Инфекционные болезни. - 2004.- № 3. - С. 39-44.

4. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С., Zelicoff A.P., Нетесов С.В. Частоты встречаемости маркёров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди некоторых групп населения Новосибирской области. // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии (ЖМЭИ). - 2004. - № 5. - С. 20-25.

5. Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Шустов А.В., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов С.В. Этиология острых гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Инфекционные болезни. - 2005. - Т. 3. - № 1. - С. 26-31.

6. Качко А.В., Ершов А.Е., Гаврилова И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Букин В.Н., Комиссарова М.А., Нетесов С.В. Частота встречаемости РНК HGV/GBV-C и факторов риска у пациентов наркологического диспансера Новосибирска. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭИ). - 2005. - № 2. - С. 25-30.

7. Shustov A.V., Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Grazhdantseva A.A., Gavrilova I.V., Akinfeeva L.A., Rakova I.G., Aleshina M.V., Bukin V.N., Orlovsky V.G., Bespalov V.S., Robertson B.H., Netesov S.V. Molecular epidemiology of the hepatitis C virus in Western Siberia. // J. Med. Virol. - 2005. - Vol. 77(3). - P. 382-389.

8. Мануйлов В.А., Нетесова И.Г., Осипова Л.П., Шустов А.В., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Нетесов С.В. Генетическая вариабельность изолятов вируса гепатита В у населения Шурышкарского района Ямало-Ненецкого Автономного Округа. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2005. - № 4. - С. 30-34.

9. Гаврилова И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алёшина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П., Нетесов С.В. Факторы риска заражения больных гепатитом С в инфекционных больницах Новосибирска. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - №6. - C. 28-33.

10. Матрос О.И., Гранитов В.М., Кочнева Г.В., Шустов А.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Чуб Е.В., Нетесов С.В.. Особенности вирусных гепатитов в Алтайском крае в первые годы XXI века: клиника и эпидемиология. // Российские медицинские вести. - 2005. - № 3. - С. 57-60.

11. Терновой В.А., Чаусов Е.В., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Изучение генетического разнообразия вируса гепатита А в Западной Сибири. // Вопросы вирусологии. - 2006. - № 51(1). - С.23-27.

12. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Святченко В.А., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Киселев Н.Н., Сахарова Е.Г., Нетесов С.В. Выявление вируса гепатита Е при остром гепатите в Сибири. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 3. - С.36-40.

13. Баяндин Р.Б., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Локтев В.Б., Гранитов В.М., Нетесов С.В. Частота обнаружения маркеров, генотипы вируса и факторы риска гепатита В у пациентов инфекционного отделения городской больницы Барнаула. // Инфекционные болезни. - 2007. - Т.5. - № 1. - С.5-10.

14. Гаврилова И.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Баяндин Р.Б., Нетесов С.В. Распространенность, генотипическое разнообразие и факторы риска гепатита C среди больных с хроническими вирусными гепатитами в Новосибирской области. // Инфекционные болезни. - 2007. - Т. 5. - № 3. - С. 9-15.

15. Чуб Е.В., Кочнева Г.В., Гранитов В.М., Нетесов С.В. Рекомбинанты вируса гепатита С типа 2k/1b у населения Алтайского края. // Инфекционные болезни. - 2007. -Т.5. - № 4. - С. 5-11.

16. Гражданцева А.А., Носарева О.В., Нестеров А.Е., Сиволобова Г.Ф., Локтева Л.И., Aлейников Р.П., Кузубов В.И., Кочнева Г.В. Изучение показателей иммунитета при вакцинации против гепатита В. // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2008. - № 5. - C. 40-46.

17. Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Лупан Т.А., Разумов И.А., Швалов А.Н., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Выделение и иммунохимическая характеризация поверхностных гликопротеинов Е1 и Е2 вируса гепатита С, экспрессированных в клетках млекопитающих. Достижения современной биотехнологии. // Сборник научных трудов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под ред. д.м.н., проф. Дроздова И.Г. - 2008. - Новосибирск. - С. 250-259.

18. Кочнева Г.В., Чуб Е.В., Гранитов В.М., Матрос О.И., Клиновенко Н.Г., Хорошилова И.А., Нетесов С.В. Обнаружение природных рекомбинантных вариантов вируса гепатита С в Алтайском крае и Новосибирской области. // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Юбилейный сборник научных работ, посвященный 50-летию кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет». - 2009. - Барнаул. - С. 147-153.

19. Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Major M., Чуб Е.В., Швалов А.Н., Юдин П.В., Нетесов С.В., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Полноразмерный пептидный анализ антигенного профиля поверхностных белков сибирских изолятов вируса гепатита C. // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12. - № 1-2. - С. 115-124.

20. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Пальцев А.И., Максютов А.З., Акинфеева Л.А., Торшин В.П., Райдер Р.У. Факторы риска и генотипическое разнообразие изолятов вируса гепатита С у персонала больниц Новосибирской области // IV Конф. по вирусным гепатитам В, С и Д. - Москва. - 2001. - C. 15.

21. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева A.A., Гаврилова И.В., Aкинфеева Л.A., Ryder R.W. Влияние характеристик серологической тест-системы на результат эпидемиологического исследования // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Тезисы 2-й науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 62.

22. Шустов А.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Кочнева Г.В., Гаврилова И.В., Баяндин Р.Б., Акинфеева Л.А., Зеликов А. Распространенность и факторы риска заболевания вирусными гепатитами В и С среди медицинских работников больниц Новосибирской области // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Тезисы 2-й науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 63.

23. Shustov A.V., Sivolobova G.F., Grazdantseva A.A., Kochneva G.V., Gavrilova I.V., Bayandin R.B., Akinfeeva L.A., Zelicoff A., Netesov S.V. The Prevalence and Risk Factors of HCV and HBV Infections Among Health Care Workers in Novosibirsk Region Hospitals // XIIth International Congress of Virology. Abstracts. - 2002. - P. 343.

24. Нетесов С.В., Шустов А.В., Гаврилова И.В., Терновой В.А., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Маркович Н.А., Гранитов В.М., Губанова Л.И., Сахарова Е.Г. Вирусные гепатиты в Западной Сибири за сорок лет в сравнении с данными по России и другим странам // Сборник трудов V Российской научно-практической конференции «Гепатит B, C и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики». - Москва. - 2003. - С. 206-207.

25. Шустов А.В., Гаврилова И.В., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Фаворов М.О., Робертсон Б.Дж., Нетесов С.В. Генотипы вирусов А, В и С, циркулирующих среди населения Западной Сибири // Сборник трудов V Российской научно-практической конференции «Гепатит B, C и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики». - Москва. - 2003. - С. 352-353.

26. Shustov A.V., Gavrilova I.V., Ternovoi V.A., Rudzevich T.N., Chub E.V., Bayandin R.B., Kochneva G.V., Grazhdantseva A.A., Sivolobova G.F., Favorov M.O. and Netesov S.V. Genotypes of hepatitis A, B, and C viruses circulating in the population of Western Siberia // 6-ой ежегодный съезд Европейского Общества Клинической Вирусологии и 8-ая Конференция по Современной ситуации в области Хронических Вирусных Гепатитов. - Лион (Франция). - 2003.

27. Гаврилова И.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Алешина М.В., Сахарова Е.Г., Толоконская Н.П. Частота встречаемости маркеров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди пациентов инфекционных больниц г. Новосибирска // Материалы международного междисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». -Судак (Украина). - 2004. - С. 87-88.

28. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Бондаренко Т.Ю., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А. Генетическое разнообразие вируса гепатита А в Сибири // Материалы международного междисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». -Судак (Украина). - 2004. - С. 154 - 155.

29. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Ракова И.Г., Алешина М.В., Гаврилова И.В., Чуб Е.В., Акинфеева Л.А., Орловский В.Г., Сахарова Е.Г., Гранитов В.М., Губанова Л.И. Предварительные итоги сторожевого надзора за острыми вирусными гепатитами в трех городах Западной Сибири: Новосибирске, Барнауле и Иркутске // Материалы международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». - Сосновка, Новосибирская обл. - 2004. - Новосибирск: ЦЭРИС, 2004. - С. 301-302.

30. О.И. Матрос, Г.В. Кочнева, Е.В. Чуб, Г.Ф. Сиволобова, А.А. Гражданцева, А.В. Шустов, В.М. Гранитов, С.В. Нетесов. Генотипическое разнообразие изолятов вируса гепатита С в Алтайском крае // Сборник трудов 5-ой всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». - Москва. - 2004. - Т. 1. - С. 254-256.

31. Баяндин Р.Б., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С., Нетесов С.В. Генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В среди некоторых групп населения Новосибирска // Тезисы 1-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва. - 2004. - С. 21-22.

32. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Выявление случаев гепатита Е в западной Сибири // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Сосновка (Новосибирская обл.). - 2005. - С. 78.

33. Чуб Е.В., Шустов А.В., Кочнева Г.В., Нетесов С.В. Генотипы изолятов вируса гепатита С у больных острыми гепатитами в г. Барнауле Алтайского края и выявление ВГС-рекомбинантов // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Сосновка (Новосибирская обл.). - 2005. - С. 80.

34. Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Шустов А.В., Плясунов И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М., Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г. Молекулярное разнообразие геномов вирусов гепатитов А, В, С, Е и его диагностическое, клиническое и эпидемиологическое значение // Материалы Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск. - 2005. - С. 62.

35. Баяндин Р.Б., Шустов А.А., Ершов А.Е., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Акинфеева Л.А., Ракова И.Г., Алешина М.В., Букин В.Н., Орловский В.Г., Беспалов В.С.. Гранитов В.М.. Нетесов С.В. Частота встречаемости маркеров, генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирска и Барнаула // Тезисы III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». - Новосибирск. - 2006. - С. 37.

36. Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Плясунова И.В., Чуб Е.В., Баяндин Р.Б., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Акинфеева Л.А., Гранитов В.М.. Сахарова Е.Г., Губанова Л.И., Орловский В.Г., Нетесов С.В. Этиология гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. // Тезисы III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». - Новосибирск. - 2006. - С. 44.

37. Баяндин Р.Б., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Частота встречаемости маркеров, генотипическое разнообразие изолятов и факторы риска инфекции вирусом гепатита В у отдельных групп населения Новосибирска и Барнаула // Материалы Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». - Минск. - 2007. - С. 82-83.

38. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Выявление случаев гепатита Е в Западной Сибири // Материалы международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков». - Алматы (Казахстан). - 2006. - С. 223-224.

39. Чуб Е.В., Kurbanov F., Mizokami M., Кочнева Г.В., Нетесов С.В. Обнаружение рекомбинантных вариантов вируса гепатита C в Сибири и разработка ПЦР-системы для их идентификации // Материалы Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». - Минск. - 2007. - С. 83-84.

40. Кочнева Г.В., Баяндин Р.Б., Мануйлов В.А., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Нетесов С.В. Молекулярно-генетическое разнообразие изолятов вируса гепатита в и факторы риска передачи вирусного гепатита В в регионах Азиатской части России» // Материалы Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». - Санкт-Петербург. - 2008. - С. 435.