Первая отечественная кандидатная анти-ВИЧ/СПИД-вакцина: иммунологический мониторинг и испытания

Размещено на http://www.allbest.ru/

Первая отечественная кандидатная анти-ВИЧ/СПИД-вакцина: иммунологический мониторинг и испытания

«14.00.36 - аллергология и иммунология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Гудима Георгий Олегович

Москва, 2009 г.

Диссертация выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Научные консультанты: академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор Р.М.Хаитов;

доктор биологических наук, профессор Э.В.Карамов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин;

доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе;

доктор медицинских наук, профессор Л.П.Сизякина.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится « 23 » сентября 2009 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «______» _______________ 2009 года

Ученый секретарь

совета по защите докторских и

кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук Сеславина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Пандемия ВИЧ-инфекции/СПИДа представляет собой один из величайших глобальных кризисов нашего времени и важнейшей проблемой мирового здравоохранения. Со времени выделения СПИД как самостоятельного заболевания (1981 г.) [Gottlieb. et al., 1981; Mazur et al., 1981] в мире, по оценкам ВОЗ, официально зарегистрировано около 60 миллионов ВИЧ-инфицированных человек, из них около 30 миллионов умерло от СПИДа. Ежегодно около 2,7 миллиона человек становятся инфицированными и около 2,5 миллионов умирают от этого заболевания [WHO/UNAIDS Report on the global AIDS epidemic, 2008]. По скорости прироста новых случаев ВИЧ-инфекции Россия входит в тройку лидеров (вместе со странами Юго-Восточной Азии и Африки). В 2008 году число зарегистрированных ВИЧ-инфицированных лиц в нашей стране превысило 490 тысяч человек [Информационный бюллетень Федерального центра СПИД, 2008 г.]. По оценкам экспертов ВОЗ/UNAIDS, в России общее число людей, инфицированных ВИЧ, может составлять около 930 тысяч человек [WHO/UNAIDS Report on the global AIDS epidemic, 2008].

Несмотря на огромные усилия мирового сообщества, пандемию ВИЧ-инфекции остановить не удается. ВИЧ-инфицированным требуется антиретровирусная терапия (АРТ) в течение всей жизни пациента. Однако АРТ не является средством предупреждения ВИЧ-инфекции (но препятствует передаче ВИЧ от матери к плоду) и не блокирует распространение вируса в организме человека даже в случае начала АРТ на ранних этапах инфекции [Fauci et al., 1998]. При этом раннее начало АРТ не предотвращает формирование латентного резервуара ВИЧ-инфекции. Кроме того АРТ, помимо тяжелых побочных эффектов препаратов, сопровождается образованием устойчивых форм вируса.

Наиболее преспективной стратегией контроля пандемии ВИЧ-инфекции/СПИДа признается создание эффективной вакцины [Хаитов Р.М., 1992; Esparza J, Osmanov S., 2003; Карамов Э.В., Сидорович И.Г., Хаитов Р.М., 2008]. Вакцинация является наиболее эффективной технологией здравоохранения, которая существует для контроля эпидемических инфекционных заболеваний. Применение вакцин привело к уничтожению оспы и позволило значительно приблизиться к уничтожению полиомиелита и кори. Миллионы жизней были спасены благодаря вакцинации. В этой связи для мирового сообщества в целом и для российских ученых в частности очевидна актуальность скорейшей разработки безопасной, эффективной и доступной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины. По оценкам экспертов International AIDS Vaccine Initiative (IAVI), создание вакцины, применение которой снизило бы число новых случаев инфицирования на 20-80%, позволило бы предотвратить около 30-70 миллионов случаев инфицирования в течение 15 лет [IAVI Policy Brief, IAVI, 2006].

Эта задача тем более важна, что достоверно не выявлено случаев выздоровления при ВИЧ-инфекции (как самопроизвольного выздоровления, так и выздоровления в результате применения АРТ). В случае ВИЧ-инфекции/СПИДа традиционные методы получения вакцин оказались неприменимы. Фактически создание эффективной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины представляет собой комплексную научную проблему, неотделимыми составляющими которой являются фундаментальные исследования, биотехнологические разработки, лабораторные исследования и клинические испытания. Понимание механизмов защитного ВИЧ-специфического иммунного ответа в сочетании с возможностью быстро, стандартизованно и точно тестировать кандидатные вакцины в клинических испытаниях с участием добровольцев позволит разработать рациональный и успешный подход к созданию профилактических и лечебных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин [Карамов Э.В., Сидорович И.Г., Хаитов Р.М., 2008; AIDS Vaccine Blueprint, 2008].

Клинические испытания анти-ВИЧ/СПИД-вакцин имеют двойственный характер: с одной стороны, это регламентированное испытание вакцинных препаратов c участием добровольцев, а с другой - научное исследование, которое позволяет получить информацию, необходимую для понимания механизмов протективного иммунного ответа против ВИЧ и выявления коррелятов иммунной защиты, а также дает возможность отработать схемы иммунизации и провести необходимую доработку препарата. При этом организация клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, в частности, формирование когорт добровольцев, имеет дополнительные особенности и трудности по сравнению с испытаниями других вакцин [Jefferys, Harrington, 2004; Newman et al., 2004].

Важность клинических исследований как неотъемлемого компонента работ по созданию вакцин была в очередной раз подтверждена на международной конференции «AIDS Vaccine 2008» [AIDS Vaccine Blueprint 2008. Global HIV Vaccine Enterprise - IAVI, 2008]. В итоговых документах конференции подчеркивалось, что проведение клинических исследований в различных эпидемиологических условиях, в различных популяциях и и регионах, в которых циркулирует широкий спектр изолятов ВИЧ, является жизненно необходимым. Также важно поддерживать и развивать инфраструктуру клинических испытаний, что обеспечило бы надлежащее проведение клинических исследований.

Необходимость создания вакцины против ВИЧ/СПИДа ставит перед исследователями беспрецедентно сложную задачу - получить протективный иммунный ответ на высоковариабельный патоген с помощью вакцинации при заболевании, когда не обнаружен естественный механизм выздоровления за счет потенциала собственной иммунной системы, а клетки самой иммунной системы являются мишенью инфекционного агента. Иначе говоря, требуются принципиально новые подходы к созданию вакцин. Это не только обусловливает особые сложности на этапе синтеза кандидатных препаратов, проверки их иммуногенности, но и создает большие проблемы при испытаниях таких вакцин. Известно, что весьма авторитетные международные научные коллективы потерпели неудачу именно на этапе клинических испытаний.

Таким образом, для противодействия ВИЧ-инфекции должна быть создана принципиально новая вакцина. Научные усилия и материальные ресурсы, направленные на создание вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа, можно без преувеличения назвать чрезвычайными. В настоящее время около 30 кандидатных вакцинных препаратов включены в клинические испытания, проходящие в различных странах мира. К их числу относится и конъюгированная полимер-белковая рекомбинантная вакцина ВИЧРЕПОЛ - единственная на настоящий момент российская кандидатная анти-ВИЧ/СПИД-вакцина, которая успешно прошла доклинические исследования и была включена в клинические испытания I фазы, которые и стали предметом настоящего исследования.

«ВИЧРЕПОЛ» представляет собой оригинальный вакцинный препарат нового поколения. Он испытан в лабораторных исследованиях на животных, но его действие у человека не изучено. Клинические испытания вакцины «ВИЧРЕПОЛ» имеют важное значение для формирования методической базы клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в России, так как ранее в нашей стране испытаний вакцин этой группы не проводилось. Зарубежный опыт испытаний кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин может быть использован лишь частично, так как вакцина «ВИЧРЕПОЛ» и принцип ее конструирования не имеют аналогов в мире. Учитывая, что в России вслед за кандидатной вакциной «ВИЧРЕПОЛ» готовятся к включению в клинические испытания и другие кандидатные вакцины, необходимость формирования комплекса приемов и методов («инфраструктуры») для оценки анти-ВИЧ/СПИД-вакцин приобретает особую актуальность и важность.

Настоящая работа посвящена важнейшей части исследований по созданию анти-ВИЧ/СПИД-вакцин - клиническим испытаниям.

Таким образом, актуальность настоящей работы определяется важностью разработки отечественной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины, необходимостью исследования безопасности и иммуногенности оригинальной отечественной конъюгированной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в клинических испытаниях, необходимостью формирования в России системы испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Цели работы:

1. Обобщение и анализ международного опыта проведения клинических испытаний кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин и с учетом его - разработка рекомендаций по проведению клинических испытаний кандидатной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ», в том числе подготовка пакета нормативной документации для проведения I фазы клинических испытаний.

2. Организация и проведение I фазы клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в соответствии с Российскими и международными стандартами надлежащей клинической практики (GCP) и на примере этого иследования - формулировка рекомендаций по формированию основы инфраструктуры испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в России.

3. Исследование безопасности, переносимости и иммунологической активности кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ» у человека.

Задачи работы:

1. Проанализировать международный опыт клинических испытаний кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин.

2. На примере испытаний кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ» разработать комплект типовой нормативной документации по испытаниям анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в соответствии со стандартами GCP с учетом результатов лабораторных исследований и доклинических испытаний.

3. Сформировать когорту добровольцев, мотивированных для участия в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин.

4. Оценить безопасность и переносимость кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ», определить безопасную иммунизирующую дозу.

5. Исследовать уровень и продолжительность гуморального иммунного ответа на кандидатную вакцину «ВИЧРЕПОЛ».

6. Исследовать уровень и продолжительность клеточноопосредованного иммунного ответ на кандидатную вакцину «ВИЧРЕПОЛ».

7. По итогам испытаний подготовить отчет для представления в ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора на экспертизу и согласование.

8. Подготовить рекомендации по организации II фазы клинических испытаний отечественных кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

вичрепол вакцина кандидатный доза

Впервые в России осуществлены клинические исследования оригинальной отечественной конъюгированной полимер-белковой рекомбинантной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины. Заложены основы инфраструктуры клинических испытаний новой группы вакцинных препаратов в нашей стране: кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа.

Впервые показана безопасность и переносимость конъюгированной полимер-белковой рекомбинантной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины у человека.

Впервые получены данные об иммуногенности конъюгированной полимер-белковой рекомбинантной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины у человека. Выявлен дозозависимый характер иммунного ответа - по мере повышения дозы вакцины возрастал титр антител и увеличивалось количество добровольцев со специфическим иммунным ответом.

Впервые показано, что конъюгированная полимер-белковая рекомбинантная вакцина «ВИЧРЕПОЛ» не вызывает при иммунизации добровольцев увеличения количества CD4⁺-Т-клеток, то есть обладает дополнительными характеристиками безопасности, связанными с отсутствием повышения возможного риска ВИЧ-инфекции у вакцинированных добровольцев. Актуальность этого аспекта безопасности анти-ВИЧ/СПИД-вакцин стала очевидной после выявления повышенной восприимчивости к ВИЧ-инфекции добровольцев, иммунизированных кандидатной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины MRK-Ad5, активирующей пролиферацию CD4⁺-Т-лимфоцитов, в процессе клинических исследований, которые были остановлены по этой причине.

Индукция иммунного ответа против антигена p24 свидетельствует о перспективах применения вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в качестве потенциального иммунотерапевтического средства у ВИЧ-инфицированных пациентов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые в России разработана методическая основа и подготовлен комплект нормативной документации по проведению клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин («Протокол клинических испытаний…», «Брошюра исследователя», «Информация для добровольца и Форма информированного согласия», «Индивидуальная карта добровольца» и др.), соответствующий стандартам GCP. Документация успешно прошла экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Федеральном комитете по МИБП, Федеральном Комитете по этике и утверждена Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Разработанные документы могут быть использованы в качестве типовых для организации последующих клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в России.

Впервые в России сформирована когорта добровольцев, мотивированных для участия в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Когорта включена в клинические испытания вакцины «ВИЧРЕПОЛ», стабильна, имеет перспективы для расширения. Тем самым заложены основы для дальнейших клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в Российской Федерации.

Полученные данные о безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины «ВИЧРЕПОЛ» дают основания для продолжения клинических исследований, что будет способствовать дальнейшему развитию и совершенствованию инфраструктуры клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в России.

Подготовлены методические рекомендации по организации II фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (в соответствии с планом работ по выполнению Постановления Правительства Российской Федерации от 25 декабря 2007 г. №1905-р и в рамках Государственного контракта №22.050.08.0 от 20 марта 2008 г. по теме «Разработка экспериментальных технологий для создания кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД», шифр «КВ ВИЧ - 08»).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Впервые в отечественной практике сделано обобщение мирового опыта клинических испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа, подготовлены рекомендации и пакет нормативных документов по проведению I фазы клинических испытаний первой отечественной кандидатной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (подготовлена и опубликована монография).

2. Впервые в России сформирована когорта ВИЧ-неинфицированных добровольцев, мотивированных на участие в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Когорта стабильна, имеет перспективы для расширения и включена в I фазу клинических испытаний кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ».

3. Показана безопасность и хорошая переносимость кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ» во всех исследованных дозах (2,5 - 50,0 мкг по белку).

4. Кандидатная вакцина «ВИЧРЕПОЛ» при иммунизации добровольцев индуцировала образование ВИЧ-специфических антител. Эффект зависел от дозы вакцины, максимальный титр антител наблюдался после 4-й иммунизации. В качестве безопасной иммунизирующей дозы вакцины «ВИЧРЕПОЛ» может быть рекомендована доза не менее 50 мкг по белку.

5. При иммунизации вакциной «ВИЧРЕПОЛ» не наблюдалось значимых изменений показателей Т-клеточного иммунного ответа (абсолютное количество CD4⁺-Т-клеток и CD8⁺-Т-клеток, соотношение CD4⁺/CD8⁺, а также количество антиген-специфических ИФН-г-продуцирующих клеток в периферической крови не отличались от нормы). Это может рассматриваться как дополнительная характеристика безопасности вакцины «ВИЧРЕПОЛ», связанная с отсутствием повышения риска ВИЧ-инфекции после иммунизации (повышенная восприимчивость иммунизированных добровольцев к ВИЧ-инфекции была обнаружена в клинических исследованиях кандидатной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины MRK-Ad5, активирующей пролиферацию CD4⁺-Т-лимфоцитов).

6. Отчет о результатах I фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» успешно прошел экспертизу и согласование в ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора. Рекомендовано продолжать исследование и переходить ко II фазе клинических испытаний. Вакцина «ВИЧРЕПОЛ» включена в международный рейтинг-лист перспективных кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин Global HIV Vaccine Enterprise и IAVI.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на V, VI, VII, VIII, IX, X Конгрессах «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (2002 г., 2004 г., 2005 г., 2007 г., 2008 г. - Москва; 2009 г., Казань); II и III Объединенных иммунологических форумах (2004 г., Екатеринбург; 2008 г., Санкт-Петербург), 2-й Всероссийской школе по иммунотерапии (2005 г., Анапа); XXII-XXVII Конгрессах Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (EAACI) (2003, Париж, Франция; 2004 г., Амстердам, Голландия; 2005 г., Мюнхен, Германия; 2006 г., Вена, Австрия; 2007 г., Гетеборг, Швеция; 2008 г., Барселона, Испания); XVIII-XX Конгрессах Всемирной аллергологической организации (IAACI/WAO) (2003 г., Ванкувер, Канада; 2005 г., Мюнхен, Германия; 2007 г., Бангкок, Таиланд); XII и XIII Международных Конгрессах по иммунологии (ICI/IUIS) (2004 г., Монреаль, Канада; 2007 г., Рио-де-Жанейро, Бразилия); XV-XVII Конгрессах Европейской Федерации иммунологических обществ (EFIS/ECI) (2003 г., Родос, Греция; 2006 г., Париж, Франция; 2009 г., Берлин, Германия); XV, XVI, XVII, XVIII Международных конференциях по СПИДу (2004 г., Бангкок, Таиланд; 2006 г., Торонто, Канада; 2007, Сидней, Австралия; 2008 г., Мехико, Мексика); Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов (2004 г., Суздаль); 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (2004 г., Москва); Симпозиуме «Современные иммунобиологические препараты» (2004 г., Москва); Международном конгрессе «Иммунитет и болезни. От теории к терапии» (2005 г., Москва); IV международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (2005 г., Бенидорм, Испания); 4-м Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2007, Москва); Международных конференциях «AIDS Vaccine 2007» (Сиэттл, США) и «AIDS Vaccine 2008» (Кейптаун, ЮАР); Рабочем совещании по вакцинопрофилактике ВИЧ (20-21 февраля 2009 г., Новосибирск).

По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, в том числе: 1 монография; 23 статьи в научной печати, из них 17 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций; 43 публикации в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты работы использованы в «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, ГНЦ социальной и судебной психиатрии им.В.П.Сербского, ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, МСЧ №163 ФМБА России, Московского областного центра профилактики и борьбы со СПИД и инфекционными заболеваниями.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 537 страницах машинописного текста, содержит 73 таблицы, 21 рисунок. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», а также три приложения. Библиография включает 684 источника, в том числе 60 отечественных и 624 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемый препарат. Вакцина ВИЧ/СПИД полимер-белковая рекомбинантная конъюгированная жидкая для внутримышечного введения “ВИЧРЕПОЛ” представляет собой стерильный очищенный с помощью аффинной и ионообменной хроматографии и гельфильтрации химерный белок rec(24-41), полученный рекомбинантным методом, копирующий аминокислотные последовательности фрагмента внутреннего белка р17, полноразмерного внутреннего белка р24 и иммунореактивного фрагмента трансмембранного белка gp41 ВИЧ 1 типа; конъюгированный с Полиоксидонием (N-оксидированное производное поли-1,4-этиленпиперазина) - водорастворимым высокомолекулярным иммуностимулятором. Антиген получен в системе E.coli.

Отношение белок:полиоксидоний w/w (по весу) в препарате составляет 1:10. Консервант - мертиолят 0,01 %.

В испытаниях использована серия вакцины, проконтролированная в ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора.

Дизайн исследования

В открытом несравнительном рандомизированном клиническом исследовании I фазы изучали безопасность, переносимость и иммуногенность возрастающих доз вакцины “ВИЧРЕПОЛ” (от 2,5 до 50 мкг по белку). Каждая доза была испытана с участием трех ВИЧ-серонегативных здоровых добровольцев (всего планировалось участие в исследовании 15 добровольцев) (табл.1). При отсутствии связанных с вакцинацией неблагоприятных явлений 3 степени и выше в течение 72 часов после 2-й иммунизации последовательно переходили к более высоким дозам (5, 10, 25, 50 мкг по белку) (табл.2).

Табл. 2

Клинические испытания вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (I фаза): критерии включения в исследование / исключения из исследования

Табл. 2

Схема иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ»

Оценка безопасности и переносимости

Оценка безопасности и переносимости вакцины «ВИЧРЕПОЛ» проводилась на основании регистрации побочных реакций, неблагоприятных явлений и отклонений от нормы результатов клинико-лабораторных анализов. Регистрировали наличие или отсутствие у добровольцев после введения вакцины субъективных жалоб и объективных проявлений (зуд, отек в месте введения вакцины, жар, повышение температуры тела, отек Квинке, анафилаксия и т.д.). Возможную связь побочных реакций и неблагоприятных явлений с применением вакцины «ВИЧРЕПОЛ» оценивали по следующим критериям:

· клинические проявления

· клинико-лабораторные показатели

· иммунологические показатели.

Оценка иммуногенности

Гуморальный иммунный ответ:

· Антитела, связывающиеся с белками rec(24-41), rec24 и rec41 в ИФА;

· Антитела, связывающиеся с твердой фазой (планшетом с сорбированными антигенами ВИЧ) лицензированного в России теста для определения антител к ВИЧ в ИФА;

· Антитела, связывающиеся с белками культурального ВИЧ-1 - gp41, p24 и p55 (предшественником р24) в иммуноблоте.

· Нейтрализующие антитела против ВИЧ-1, культивируемого в трансформированной клеточной линии.

Клеточный иммунный ответ:

· Лимфопролиферативный ответ на белки rec(24-41), rec24 и rec41;

· Определение абсолютного количества CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоцитов и соотношения CD4⁺/CD8⁺;

· Определение антиген-специфической продукции интерферона-г Т-клетками.

Формирование когорты добровольцев

Когорта добровольцев для участия в клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» формировалась в соответствии со стандартами GCP и соблюдением принципов биоэтики, на основе добровольности, информированности, конфиденциальности, анонимности. К участию в клинических испытаниях привлекались здоровые ВИЧ-неинфицированные добровольцы (мужчины и женщины) в возрасте 20-50 лет, которые могли участвовать в исследовании в течение 13 месяцев (12 визитов в центр клинических испытаний). Для добровольцев были обеспечены: страхование, бесплатное медицинское сопровождение, дифференциальная диагностика ложной ВИЧ-сероположительности с выдачей индивидуального документа с подтверждением участия в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцины и отсутствия ВИЧ-инфекции, консультирование о предотвращении ВИЧ-инфекции, вознаграждение. Добровольцы включались в клиническое исследование в соответствии с критериями включения/исключения (табл.1) после подписания формы информированного согласия.

Формирование когорты добровольцев являлось одной из задач клинического исследования и более подробно описано в разделе «Результаты и обсуждение».

Клинико-лабораторное обследование добровольцев

Клинико-лабораторное обследование добровольцев было проведено в лицензированной клинико-диагностической лаборатории. Клинические исследования крови и мочи были проведены на сертифицированных приборах «АВХ Micros-60», «Horiba АВХ Diagnostic» и «PocketChem UA PU-4210 Arkray» (Франция). Биохимические исследования проводили на сертифицированном биохимическом анализаторе «Cormay Livia» («Cormay», Венгрия). В качестве биохимических показателей безопасности были использованы уровни АсАТ, АлАТ, креатинина. Эти параметры являются общепринятыми в мировой практике оценки безопасности анти-ВИЧ/СПИД-вакцин [Belshe et al, 1994]

Получение сывороток. Забор крови проводили в сроки, указанные в Протоколе испытаний. Кровь собирали в пробирки, выдерживали 1 час при 37°С, затем переносили в холодильник на 4°С на 30 мин, центрифугировали 10 мин (1000-1500 об/мин). Отбирали сыворотку в микропробирку и помещали в на хранение при -20°С до исследования.

Определение анти-ВИЧ-антител в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с использованием диагностической системы для определения антител к ВИЧ1/2 «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» (кат. I-150) (НПО «Диагностические тест-системы», Нижний Новгород). В основе определения антител лежит непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. В качестве твердофазного иммуносорбента в тест-системе используется смесь рекомбинантных белков: gp160, gp 120, gp41 (env ВИЧ-1); р17, р24 и р15 (gag ВИЧ-1), gp120 и gp41 (env ВИЧ-1 группы 0), р17 и р24 (gag ВИЧ-1 группы 0), gp40 и gp38 env ВИЧ2, сорбированных в лунках полистиролового планшета.

Реакцию ставили согласно инструкции предприятия-изготовителя.

Результат считали положительным, если его оптическая плотность (ОП) превышала ОП крит., рассчитанную по формуле:

ОП крит. = ср. знач. ОП К (-) + 0,2,

где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе, величина которого указана в рабочей инструкции и паспорте на препарат; ОП К (-) - оптическая плотность негативного образца, входящего в состав набора.

В соответствии с международной практикой испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин [Gilbert et al., 2005], для сравнения данных, полученных на различных этапах исследования, результаты были нормализованы и выражены в виде отношения

ОП _иссл. / ОП _крит.

Определение антител к вакцинному антигену препарата «ВИЧРЕПОЛ» в сыворотках крови иммунизированных добровольцев. Определение проводили с помощью твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием сорбированных на твердой фазе рекомбинантных антигенов, входящих в состав активной субстанции вакцины «ВИЧРЕПОЛ». В качестве твердофазного иммуносорбента использовали антигены rec p24, rec gp41, rec (24-41), сорбированные на твердой фазе (в лунках полистиролового планшета). Антиген rec(24-41) представляет собой активную субстанцию вакцины «ВИЧРЕПОЛ». Антиген rec p24 копирует полноразмерный белок р24 ВИЧ1 и повторяет N-концевую часть вакцинного антигена rec(24-41). Антиген rec gp41 копирует N-концевой фрагмент gp41 ВИЧ1 и воспроизводит С-концевую часть вакцинного антигена rec(24-41). Антигены в концентрации 8 мкг/мл сорбировали по отдельности на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» (Германия) в 0,05 М растворе карбонантно - бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора антигена в лунку. Выдерживали 48 часов при комнатной температуре во влажной камере. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Планшеты подсушивали, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаги. Готовили ряд последовательных двоичных разведений сывороток на 0,01 М фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% раствора Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,02% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-АТ). Образцы вносили по 100 мкл в лунку в трех параллелях для каждого разведения, и выдерживали 60 мин при 37° С. По окончании инкубации, лунки пятикратно отмывали ФСБ-Т для удаления несвязавшихся антител, внося в каждую лунку не менее 350 мкл отмывающего раствора. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами мыши против IgG человека. Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-АТ вносили по 100 мкл в лунку. Инкубировали 60 мин при 37° С. После этого лунки вновь промывали пятикратно ФСБ-Т. Реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2 % раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере. Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15-минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра-ридера при длине волны 492 нм.

Результат считали положительным, если ОП в анализируемой лунке превышала ОП крит., рассчитанную по формуле:

ОП крит. = ср. знач. ОП К(-) + 0,2,

где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА, ОП К(-) - оптическая плотность ВИЧ-негативного образца из коммерческого набора New LAV Blot I фирмы «Bio-Rad» (США) в разведении 1:10.

Определение антител против антигенов ВИЧ-1 в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с помощью иммуноблота. Исследование проводили с применением коммерческой тест-системы New LAV Blot I Assay (HIV-1 Ab confirmation, Western Blot) («Bio-Rad», США, кат. №72251) согласно инструкции предприятия-изготовителя, приложенной к набору. Антигенной основой тест-системы являются белки культурального вируса ВИЧ-1, сорбированные на нитроцеллюлозе.

Реакцию учитывали, сравнивая расположение полосок на стрипе с образцом, приложенным к тест-системе.

Выявление вирусного белка р24 в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с помощью ИФА. Определение проводили с применением коммерческих тест-систем «ВектоВИЧ-1 р24-антиген-подтверждающий тест (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Принцип метода заключается во взаимодействии антигена р24 ВИЧ-1 из исследуемых образцов с моноклональными антителами, иммобилизованными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся антиген выявляют с помощью биотинилированных анти-ВИЧ-1 кроличьих антител и конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. Реакцию ставили согласно инструкции предприятия-изготовителя, приложенной к тест-системе.

Результат анализ считали положительным, если значение ОП в соответствующей лунке было равно или превышало критическое значение (ОПкрит), которое вычислялось по формуле:

ОПкрит = ОПср К (-) + 0,07,

где ОПср К (-) - среднее значение оптической плотности негативного образца

Определение генома ВИЧ. Определение генома ВИЧ в плазме крови добровольцев проводили с помощью обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени. Определение генома ВИЧ было проведено в лицензированной лаборатории с применением набора, соответствующего по характеристикам набору «Roche Amplicor».

Выделение лимфоцитов. Цельную кровь собирали в пробирки с К2 ЭДТА (VACUTEST® с К2 ЭДТА, BD). Разбавляли средой RPMI 1640 в соотношении 1:1 и наслаивали на фиколл-урографин. Центрифугировали 20 мин (2000 об/мин) при комнатной температуре. По окончании центрифугирования собирали лимфоциты и переносили в среду RPMI 1640 для удаления примеси фиколла-урографина и тромбоцитов. Центрифугировали 15 мин (1000 об/мин), удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в среде RPMI 1640. Повторяли отмывку. Осадок ресуспендировали в полной питательной среде (ППС) (10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 0,5 М HEPES, RPMI 1640).

Криохранение лимфоцитов. Лимфоциты в ППС центрифугировали 20 мин при 1000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в среде для замораживания (10% DMSO в FCS), переносили в криопробирки. Помещали криопробирки в контейнер для замораживания Mr.Frosty (C1562, «Sigma», США), контейнер помещали в морозильную камеру при - 80 єС.

Постановка реакции лимфопролиферации. Для работы были использованы свежевыделенные клетки. Клетки подсчитывали в гемацитометре. В лунку 96-луночного плоскодонного планшета вносили лимфоциты (200000/лунку) и антигены или rec (24-41), или rec p24, или rec gp41 (рабочая концентрация 10 мкг/мл) в ППС. Положительным контролем реакции служила стимуляция лимфоцитов ФГА (рабочая концентрация 20 мкг/мл). Реакцию ставили в 3-х параллелях. Инкубировали планшеты в 5% атмосфере СО₂ при 37 ⁰С. Через 48 часов в лунки вносили ³Н-тимидин, оставляли еще на 24 часа, после чего переносили содержимое лунок на нитроцеллюлозные фильтры. Включение ³Н-тимидина определяли на в-счетчике в толуоловом сцинтилляторе. Индекс пролиферации (ИП) определяли по формуле:

ИП=CPM_{антиген}/CPM_{спонтанная пролиферация},

где CPM_{антиген} - сигнал клеток, стимулированных антигеном,

CPM_{спонтанная пролиферация} - сигнал клеток, инкубированных в ППС (спонтанная пролиферация).

Определение CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоцитов и соотношения CD4⁺/CD8⁺. Кровь для определения CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов забирали из кубитальной вены пациента в 9-10 ч утра, натощак, в гепаринизированную пробирку из расчёта 20 МЕ гепарина на 1 мл крови. Кровь разводили средой 199 в соотношении 1:3 и наслаивали на фиколл-пак (с=1,077 г/мл). Центрифугировали пробирки 40 мин при 400g. Собирали интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки (МНК). Дважды отмывали МНК средой 199 при 200g 10 мин и доводили до концентрации 5 х10⁶/мл. МНК вносили в лунки круглодонного планшета в количестве 50 мкл на лунку, по 3 лунки на каждого пациента (№1 - контроль, №2 - CD4, №3 - CD8). В лунки №2 и №3 вносили по 5 мкл мышиных моноклональных антител против CD4 и CD8 человека, соответственно («Сорбент», Москва). Пробы инкубировали 30 мин при +4⁰С. Для отмывки в лунки вносили по 150 мкл среды 199 и осаждали клетки центрифугированием в течение 5 мин при 200g. Отмывку повторяли. Во все лунки (№№1-3) вносили вторичные антитела (овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши), меченые ФИТЦ, по 0,5 мкл на лунку (50 мкл раствора антител, разведённых в 100 раз). Инкубировали 30 мин при +4⁰С. Пробы двукратно отмывали, фиксировали 1% р-ром параформальдегида в ФСБ и хранили до исследования при +4⁰С не более 72 ч. Анализ образцов проводили на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США), оснащённым аргоновым лазером с длиной волны излучения 488 нм, с использованием программного обеспечения CellQUEST. Определяли количество CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток, а также соотношение CD4⁺/CD8⁺.