Первая отечественная кандидатная анти-ВИЧ/СПИД-вакцина: иммунологический мониторинг и испытания

В настоящем исследовании в качестве диапазона нормальных значений были приняты: абсолютное количество CD4⁺-лимфоцитов - 600-1600; абсолютное количество CD8⁺-лимфоцитов - 300-800; соотношение CD4⁺/CD8⁺ - 1,0-2,5 [Пинегин Б.В. и соавт., 2001].

Следует учитывать, что результаты количественной оценки субпопуляций лимфоцитов, не соответствующие нормативным показателям, еще не свидетельствуют о наличии патологии, и наоборот, нормальные показатели субпопуляций лимфоцитов могут наблюдаться у пациентов с отклонениями в функционировании иммунной системы. Поэтому в первую очередь следует обращать внимание не на отклонение показателей относительно нормальных значений, а на соответствие характера отклонения показателя клинической картине заболевания [Пинегин Б.В. и соавт., 2001].

Исследование антиген-специфической продукции интерферона-г лимфоцитами периферической крови (ELISPOT-анализ с применением набора BD № 551849, «Becton Dickinson», США). Для исследования использовали замороженные лимфоциты. Накануне проведения реакции лимфоциты, находящиеся в среде для замораживания, размораживали в водяной бане при 37 єС. Быстро переносили в ППС и ценрифугировали 20 мин при 1000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в ППС, центрифугировали 20 мин при 1000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, лимфоциты разводили ППС до концентрации 1 млн/мл. Оставляли на ночь в 5% атмосфере СО2 при 37єС. Выживаемость лимфоцитов определяли по включению красителя трипанового синего. Содержание живых клеток определяли в гемацитометре. Реакцию проводили с применением коммерческих тест-систем BD № 551849 («Becton Dickinson», США) согласно инструкции предприятия-изготовителя, приложенной к набору. Результаты учитывали на анализаторе ELISPOT («AELVIS», EC).

Постановка реакции нейтрализации. В исследованиях нейтрализационных свойств образцов сывороток иммунизированных добровольцев в качестве методической основы использовали стандартные протоколы, утвержденные ВОЗ [End Point Neutralization Assay. WHO Guidelines for Standart HIV Isolation Procedures 1994, 1998 update] с небольшими модификациями. Испытания проводили в вирус-клеточной системе МТ4 - HIV-1_IIIB.

NI=(OD_NegSer - OD_TestedSer)/(OD_NegSer - OD_CellControl) х 100%

где OD_negSer - средняя (из трех повторов) оптическая плотность контроля инфекции с негативной сывороткой в ИФА; OD_TestSer - средняя (из трех повторов) оптическая плотность проб с исследуемой сывороткой; OD_СellControl - средняя оптическая плотность контроля клеток [Burton et al., 2004].

Статистическая обработка данных. При статистическом анализе полученных результатов определяли среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего арифметического. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента [Гланц C. Медико-биологическая статистика. 1998 г.].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клинические испытания вакцины “ВИЧРЕПОЛ» представляют собой очередной этап исследований по разработке анти-ВИЧ/СПИД, начатых в нашей стране в рамках МНТП «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего». Научный план программы предусматривал формирование единой системы, включающей разработку, доклинические испытания и клинические испытания кандидатных вакцинных препаратов против ВИЧ-инфекции/СПИДа. Вакцина «ВИЧРЕПОЛ» стала первой российской кандидатной анти-ВИЧ/СПИД-вакциной, которая была включена в клинические испытания, а сами эти испытания стали первым в нашей стране клиническим исследованием вакцин этой группы. Фактически они стали основой формирования инфраструктуры клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин в России. Эта инфраструктура включает научные институты - разработчики вакцинных препаратов; когорты добровольцев, привлекаемых к участию в клинических испытаниях; центры клинических испытаний, которые имеют соответствующее оснащение и квалифицированный персонал, осуществляют набор и медицинское сопровождение добровольцев, их иммунизацию, проведение необходимых анализов и обработку полученных образцов. Принципиальной частью инфраструктуры клинических испытаний являются контролирующие и экспертные органы, которые осуществляют экспертизу всех этапов клинического исследования - от создания протокола клинических испытаний до приема заключительного отчета о проведенном клиническом исследовании.

В России накоплен большой опыт испытаний вакцинных препаратов, существуют соответствующие учреждения и службы, имеется нормативно-правовая база. Однако клинических испытаний вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа в нашей стране ранее не проводилось. В связи с этим, важной задачей организации клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» стала разработка программы испытаний, необходимой документации и методических приемов, адаптированных именно для анти-ВИЧ/СПИД-вакцин.

Это было тем более важно потому, что вакцина «ВИЧРЕПОЛ» относится к конъюгированным полимер-белковым вакцинам - новому оригинальному классу вакцинных препаратов, не имеющих аналогов в мировой практике. В процессе решения этой задачи была проведена отработка методических приемов информативного контроля экспериментальных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа, пригодных как для клинических испытаний соответствующих кандидатных препаратов, так и для их лабораторных исследований (доклинических испытаний).

Был подготовлен комплект документации, полностью соответствующий нормативным требованиям «Надлежащей клинической практики (GCP)», которая принята в Российской Федерации в качестве государственного стандарта. В комплект вошли: «Протокол клинических испытаний», «Брошюра исследователя», «Информация для добровольца», «Форма информированного согласия», «Индивидуальная карта добровольца», «CV главного исследователя», страховой полис. Документы успешно прошли экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Комитете по медицинским иммунобиологическим препаратам, Комитете по этике при Федеральном органе контроля качества лекарственных средств и были утверждены. На основании положительных решений перечисленных инстанций Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития было выдано разрешение на проведение I фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ».

В соответствии с Российскими и международными нормативными требованиями к проведению клинических исследований с участием человека в качестве субъекта исследования, в протоколе клинических испытаний был предусмотрен полный комплекс мероприятий по защите прав добровольцев, в том числе вопросы конфиденциальности участия в клинических испытаниях и медицинское страхование исследования. Особое внимание было уделено вопросу защиты добровольцев от возможных неблагоприятных последствий, связанных с временной ложной ВИЧ-положительностью (наличие антител против ВИЧ), обусловленной действием исследуемой вакцины. С этой целью в протокол клинических испытаний был включен алгоритм дифференциальной диагностики, позволяющий отличить иммунный ответ, вызываемый вакцинацией, от иммунного ответа, вызываемого ВИЧ-инфекцией. Добровольцу выдавалась справка, в которой подтверждалось его участие в клинических испытаниях, проводимых в соответствии с официальным разрешением Росздравнадзора, а также подтверждалось отсутствие у него ВИЧ-инфекции, несмотря на наличие анти-ВИЧ-антител.

Формирование когорты добровольцев

Формирование когорт добровольцев является одним из наиболее трудных и ответственных аспектов организации клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. На этапе I фазы клинических испытаний задача привлечения добровольцев осложняется низкой мотивацией здоровых ВИЧ-неинфицированных людей для участия в испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, а также бытующим среди подавляющего большинства населения настороженного или отрицательного отношением ко всему, что связано с ВИЧ-инфекцией, в том числе и к участию в клинических испытаниях. В связи с этим приобретала особую важность объективная информация об исследуемом препарате, положении дел в области исследования анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, отсутствии опасности инфицирования через вакцину, а также о важности разработки вакцин для борьбы с эпидемией ВИЧ-инфекции/СПИДа. Кроме того, одним из необходимых условий включения добровольца в клинические испытания является возможность выполнения им протокола исследования, то есть регулярного посещения центра клинических испытаний в течение длительного времени (13 месяцев, 12 визитов в соответствии с «Протоколом клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ»).

В Российской Федерации уже была попытка формирования когорты добровольцев в связи с исследованиями в области ВИЧ-инфекции. Такая когорта была собрана в Санкт-Петербурге для эпидемиологических исследований. Однако важно отметить, что при организации клинических исследований анти-ВИЧ/СПИД-вакцин характерной и принципиально важной особенностью формирования когорт является мотивация добровольцев к участию в клинических испытаниях. Как показали зарубежные исследования и наш опыт, этот фактор существенно затрудняет привлечение добровольцев.

Рис. 1 Формирование когорты добровольцев для участия в клинических испытаниях вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (I фаза)

При формировании когорты добровольцев для клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (рис.1) только около 20% (65 человек) от общего числа обратившихся лиц (298 человек) были приглашены на собеседование. Остальные либо отказались, либо не подходили по критериям включения/исключения (например, были ВИЧ-инфицированными или по каким-либо причинам не могли выполнять протокол исследования). После личного собеседования были отобраны 17 добровольцев, которые после соответствующего медицинского обследования и подписания информированного согласия были включены в клиническое исследование. Двое участников впоследствии (после 3-го визита) вышли из исследования по собственному желанию без объяснения причин. Остальные 15 добровольцев полностью завершили протокол клинических испытаний. Таким образом, стабильность когорты составила 87%, что является высоким показателем.

30 человек, которые принципиально были готовы к участию в I фазе клинических испытаниях вакцины «ВИЧРЕПОЛ», отложили свое участие в них по объективным причинам и выразили желение принять участие в последующих клинических испытаниях. Тем самым были заложены основы формирования когорты добровольцев на перспективу - для проведения II фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (разумеется, следует понимать, что к моменту набора добровольцев в клиническое исследование желание участвовать может и измениться). Наиболее эффективным оказалось привлечение добровольцев из дискордантных пар (один партнер инфицирован ВИЧ, другой - нет).

Важным аспектом формирования когорты стало исследование мотивов участия и отказа от участия в клинических испытаниях. Основной причиной (мотивом) для участия добровольцев в клинических испытаниях было стремление помочь ВИЧ-инфицированным людям (65%), в том числе из близкого окружения (41%). Далее следовало желание внести вклад в научные исследования по созданию анти-ВИЧ/СПИД-вакцин (35%). Возможность получить иммунную защиту против ВИЧ-инфекции была отмечена как основной мотив в 18% случаев. Бесплатная страховка и медицинское обследование, а также получение вознаграждения не были определяющим причинами для участия в клинических испытаниях (4%) (табл. 3).

20% (13 из 65) отказались от участия в клинических испытаниях на этапе отбора. В качестве причин отказа названы (в порядке убывания): сомнение в безопасности вакцины и опасение получить ВИЧ-инфекцию (61%), боязнь побочных эффектов (30%), опасение ложной ВИЧ-позитивности в результате вакцинации (15%), невозможность выполнять протокол испытаний (7%), низкое вознаграждение (2%). В 15% случаев причины отказа не объяснялись. 30 человек не отказались от участия в клинических испытаниях, но приняли решение включиться в них в будущем (II фаза клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» или I фаза испытаний других кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа). Преимущественными причинами такого решения были планируемая беременность или временная невозможность выполнять протокол испытаний.

Табл. 3

Мотивы участия и отказа от участия в клинических испытания вакцины «ВИЧРЕПОЛ»

Некоторые ВИЧ-инфицированные добровольцы, которые не могли быть включены в клинические испытания I фазы, высказали желание принять участие в испытаниях терапевтических свойств вакцины «ВИЧРЕПОЛ». Таким образом, создается основа когорты для клинических исследований в области терапевтической вакцинации. Однако необходимо отметить, что для подобных исследований потребуется тщательная проработка критериев включения/исключения, связанная, в частности, с такими параметрами, как динамика вирусной нагрузки, состояние иммунной системы, прием антиретровирусных препаратов.

Таким образом, в процессе проведения I фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» была создана первая в России стабильная когорта добровольцев для клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, а также заложены основы формирования когорт добровольцев для участия в дальнейших клинических исследованиях как вакцины «ВИЧРЕПОЛ», так и других кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин и микробицидов.

Безопасность и переносимость вакцины «ВИЧРЕПОЛ»

Основным результатом I фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» следует считать достижение первичной конечной точки исследования: была продемонстрирована безопасность и хорошая переносимость исследуемого препарата для человека.

В процессе проведения испытаний ни у одного добровольца не было зарегистрировано кратковременных и отсроченных неблагоприятных явлений, которые могли бы быть связаны с иммунизацией и послужить причиной вывода добровольца из клинического исследования.

Все добровольцы отмечали хорошую переносимость вакцины. Неприятных субъективных ощущений в результате вакцинации не отмечалось, за исключением небольшой болезненности в момент инъекции. Также не были отмечены такие неблагоприятные явления, как боль в месте введения вакцины, покраснение в месте введения вакцины; затвердение в месте введения вакцины, повышение температуры, озноб, тошнота, недомогание, миалгия, артралгия, головная боль, сыпь, лихорадка и др. (перечень включен в Протокол клинических испытаний).

На протяжении всего срока исследования отклонения клинических лабораторных показателей от нормы обнаруживались достаточно редко (табл.4). При клиническом анализе мочи отмечено 4 случая появления оксалатов (у 2 добровольцев) и фосфатов (у 4 добровольцев). При биохимическом анализе крови у некоторых добровольцев были зафиксированы случаи транзиторного повышения уровня трансаминаз (повышение уровня АлАТ - 16 случаев у 7 добровольцев; повышение уровня АсАТ - 16 случаев у 4 добровольцев).

Выявленные отклонения не имели связи с вакцинацией, не нарастали прогрессивно в течение вакцинации и не потребовали исключения добровольцев из исследования. Важно отметить, что средние значения основных биохимических показателей безопасности (уровни креатинина в сыворотке крови, уровни трансаминаз) в каждой группе во время каждого визита соответствовали диапазону нормальных величин или же были близки к ним (рис. 2).

Табл. 4

Частота зафиксированных отклонений общеклинических показателей от нормы при иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ»

(а) Средние уровни креатинина

(б) Средние уровни АлАТ

(в) Средние уровни АсАТ

Рис. 2 Средние значения основных биохимических показателей безопасности при иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ»

Таким образом, вакцина «ВИЧРЕПОЛ», вводимая в дозах 2,5, 5, 10, 25 и 50 мкг по белку, обладает высоким профилем безопасности, хорошо переносится добровольцами, и ее можно характеризовать как безопасную и переносимую.

Вопросы безопасности являются первостепенно важными для вакцинных препаратов. Требования безопасности находятся в числе приоритетных и применительно к кандидатным анти-ВИЧ/СПИД-вакцинам. В этом случае подтверждение безопасности важно не только как необходимый этап клинических испытаний кандидатного препарата, но также имеет особое значение для организации клинических исследований анти-ВИЧ/СПИД-вакцин как таковых. Это связано с существующим стойким массовым представлением о том, что в состав вакцин входит ВИЧ или его компоненты, и, следовательно, существует опасность заражения добровольца через вакцину. Международные исследования показали, что причиной около 60% случаев отказа от участия в клинических испытаниях является боязнь получить ВИЧ-инфекцию через вакцинацию. В настоящем клиническом исследовании при формировании когорты добровольцев 61% случаев отказа были обусловлены этой причиной.

Демонстрация безопасности вакцины «ВИЧРЕПОЛ» была вполне ожидаемым результатом. Безопасность полиоксидония в качестве иммуностимулятора-носителя вакцинных антигенов была ранее подтверждена как в клинических исследованиях, так и многолетней практикой его медицинского применения. Безопасность этого соединения в составе вакцины была подтверждена клиническими испытаниями и практикой применения вакцины «Гриппол», которой вакцинировано уже более 80 миллионов человек. Безопасность рекомбинантных белков ВИЧ как вида антигенов, которые используются при конструировании субъединичных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, также была продемонстрирована в многочисленных клинических исследованиях. Безопасность и ареактогенность вакцины «ВИЧРЕПОЛ» была показана в доклинических испытаниях и подтвердилась в клинических исследованиях.

Наблюдаемая в клинических испытаниях безопасность и хорошая переносимость вакцины «ВИЧРЕПОЛ» является основой для планирования дальнейших клинических исследований этого препарата.

Иммуногенность (антигенная активность) вакцины «ВИЧРЕПОЛ»

Также важным итогом I фазы клинических испытаний является достижение вторичной конечной точки исследования: получены данные, указывающие на иммуногенность вакцины «ВИЧРЕПОЛ» у человека.

Гуморальный иммунный ответ

Образование антител в ответ на иммунизацию вакциной «ВИЧРЕПОЛ» в различной степени было отмечено во всех исследуемых группах (рис.3). По мере повышения дозы вакцины возрастал титр антител и увеличивалось количество добровольцев со специфическим иммунным ответом. Наиболее выраженный гуморальный иммунный ответ наблюдался после иммунизации высокими дозами вакцины (25 и 50 мкг по белку). При этом важно отметить, что значимые уровни антител были выявлены после иммунизации даже низкими дозами вакцины (2,5 и 5 мкг по белку). В ряде случаев иммунореактивность в иммуноблоте регистрировалась даже тогда, когда антитела не выявлялись в ИФА.

Иммунизация вакциной «ВИЧРЕПОЛ» приводила к индукции антител, которые были специфичны к рекомбинантным антигенам (rec(24-41), rec p24, rec gp41). Кроме того, индуцированные вакциной антитела специфически взаимодействовали с соответствующими антигенами ВИЧ (p24, p55, gp41). Максимальный уровень образования антител наблюдался после 4-й иммунизации. Антительный ответ был достаточно продолжительным и наблюдался в течение 6 месяцев после последней иммунизации.

При создании протокола иммунизации вакциной «ВИЧРЕПОЛ» был использован накопленный опыт международных клинических испытаний кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. В частности, как было показано ранее [Belshe et al., 1994; Gorse et, al., 1995; Graham et al., 1996, 2001], увеличивающиеся промежутки между иммунизациями приводят к более выраженному эффекту, чем частые (ежемесячные) иммунизации. При этом, если 4 последовательные иммунизации приводили к усилению иммунного ответа, 5-я иммунизация иммунный ответ не усиливала. В схеме иммунизации вакциной «ВИЧРЕПОЛ» промежуток между 1-й и 2-й иммунизациями составлял 4 недели, между 2-й и 3-й иммунизациями - 8 недель, между 3-й и 4_й иммунизациями - 12 недель.

Рис. 3 Динамика образования антител при иммунизации добровольцев различными дозами вакцины «ВИЧРЕПОЛ»

Титры антител, индуцированных при иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ» (среднее геометрическое титра антител, GMT, составляло 10 - 100,8) (табл.5), превышали таковые, обнаруженные в зарубежных клинических исследованиях кандидатных субъединичных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин на основе рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 (значение GMT составляло 11 - 32) [Keefer et al., 1996; Graham et al., 1996, 2001], или соответствовали им. Важно отметить, что наличие в составе вакцины «ВИЧРЕПОЛ» иммуностимулятора полиоксидония, химически связанного с белком-антигеном, позволяет использовать для иммунизации низкие дозы вакцины. Максимальная доза вакцины, используемая в настоящем клиническом исследовании, составляла 50 мкг по белку. Эта доза в 5-10 раз ниже тех, которые применялись в зарубежных исследованиях при иммунизации субъединичными анти-ВИЧ/СПИД-вакцинами. В частности, в III фазе клинических испытаний кандидатной вакцины AIDSVAX доза препарата составила 600 мкг (по 300 мкг каждого рекомбинантного белка), а в ряде других клинических исследований были применены дозы 500 и даже 1000 мкг [Graham, 2000]. При этом в состав кандидатных вакцин входили различные адъюванты (гидроокись алюминия, MF59 - сквален в виде водной эмульсии, QS21 - cоединение из группы сапонинов, интерлейкины, факторы роста), но ни в одном препарате адъювант не был химически соединен с антигеном.

Табл. 5

Минимальный и максимальный титры антител, индуцированных при иммунизации добровольцев вакциной “ВИЧРЕПОЛ» в ИФА для антигенов rec(24-41), rec p24 и rec gp41

Таким образом, вакцина «ВИЧРЕПОЛ» индуцировала образование специфических антител, взаимодействующих как с антигенами вакцины, так и с антигенами ВИЧ. Так как при этом практически не наблюдалось образования антител против антигенов ВИЧ, не входящих в состав вакцины, спектр индуцируемых антител легко позволял отдифференцировать эффект вакцинации от антителообразования, индуцируемого ВИЧ-инфекцией.

В процессе исследования образцов сывороток иммунизированных добровольцев были выявлены в основном антитела, которые связывали рекомбинантные белки rec(24-41), rec p24 (в ИФА), а также белки культурального вируса - p24 и его предшественник p55 (в иммуноблоте). Одной из задач последующих клинических исследований будет совершенствование протокола иммунизации с целью усиления образования антител против gp41.

Индукция образования антител против р24 при иммунизации вакциной «ВИЧРЕПОЛ» заслуживает специального внимания. р24-специфическому иммунному ответу придается особое значение при разработке терапевтических вакцин против ВИЧ-инфекции. Терапевтическая вакцинация представляет собой важное направление в исследованиях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Основной целью терапевтической вакцинации является элиминация ВИЧ-инфицированных клеток, что приводит к уничтожению вируса в резервуарах, которые недоступны для действия антиретровирусных препаратов. Несмотря на ряд первоначальных неудач, исследования в этой области значительно расширились. В качестве терапевтических вакцинных препаратов исследуются кандидатные вакцины на основе рекомбинантных белков и пептидов, вирусные векторы и ДНК-вакцины, вакцины на основе дендритных клеток, а также препараты, содержащие инактивированный ВИЧ (например, Remune). В частности, было обнаружено, что индукция р24-специфических CD8⁺-Т-клеток при терапевтической иммунизации ВИЧ-инфицированных пациентов рекомбинантной анти-ВИЧ-вакциной на основе вируса оспы канареек (vCP1433) могла приводить к продолжительному сохранению низкой вирусной нагрузки после планового прерывания АРТ и существенному увеличению периода времени между курсами АРТ [Tubian et al., 2005]. Важность и перспективность исследований терапевтической вакцинации против ВИЧ-инфекции/СПИДа подчеркнул лауреат Нобелевской премии Л.Монтанье [Montagnier L., 2008].

Индукция иммунного ответа против антигена р24 свидетельствует о потенциальной возможности применения вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в качестве иммунотерапевтического средства у ВИЧ-инфицированных пациентов. В пользу этого говорит также успешное использование полиоксидония для превенции ВИЧ-инфекции в дискордантных парах [Кузина Т.Н. и соавт., 2002, 2008; Сизякина Л.П. и соавт., 2004].

Исследование нейтрализующей активности антител, индуцированных вакциной «ВИЧРЕПОЛ»

Нейтрализующая активность образцов сывороток добровольцев, иммунизированных вакциной «ВИЧРЕПОЛ», была проверена выборочно - в 4_й и 5-й группах. В образцах сывороток добровольцев 20.1.4, 24.1.5, 26.1.5, 29.1.5 была выявлена нейтрализующая активность, которая составляла соответственно 44,4%, 26,4%, 26,0%, 29,7% при разведении сыворотки 1:10. Ранее, в доклинических исследованиях вакцины «ВИЧРЕПОЛ» было обнаружено, что сыворотки иммунизированных животных были способны нейтрализовать ВИЧ в культуре in vitro (индекс нейтрализации составил 54,9%). Одной из задач последующих клинических исследований будет совершенствование протокола иммунизации с целью усиления образования антител против gp41.

Клеточный иммунный ответ

Иммунизация всеми исследованными дозами вакцины «ВИЧРЕПОЛ» не сопровождалась достоверным изменением индекса антиген-специфической пролиферации лимфоцитов периферической крови у вакцинированных добровольцев. Хотя в отдельных случаях и были выявлены относительно высокие значения индекса лимфопролиферации (3,2-3,5), в целом его значения до и после иммунизации не отличались достоверно (рис.4). Это наблюдение является важным свидетельством в пользу безопасности вакцины «ВИЧРЕПОЛ», так как чрезмерная активация пролиферации существенно увеличивает вероятность инфицирования лимфоцитов ВИЧ.

Рис. 4 Антиген-специфический лимфопролиферативный ответ при иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ» (индекс пролиферации, M±m)

Рис. 5 Динамика абсолютного количества CD4⁺-Т-клеток и CD8⁺-Т-клеток при иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ»

Рис. 6 Соотношение CD4⁺/CD8⁺ при иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ»

Иммунизация вакциной «ВИЧРЕПОЛ» не приводила в значимым изменениям показателей Т-клеточного иммунного ответа.

Несмотря на то, что в отдельных случаях у индивидуальных добровольцев обнаруживались отклонения абсолютного количества CD4⁺-Т-клеток и CD8⁺-Т-клеток от нормальных значений, средние уровни CD4⁺-Т-клеток и CD8⁺-Т-клеток в каждой группе соответствовали норме (рис.5).

Среднее значение иммунорегуляторного индекса (соотношение CD4⁺/CD8⁺) также соответствовало диапазону нормальных значений во всех группах добровольцев (рис.6).

В периферической крови иммунизированных добровольцев не было выявлено антиген-специфических ИФН-г-продуцирующих клеток.

Оценка количества CD4⁺-Т-клеток является стандартным тестом для прогнозирования прогрессии ВИЧ-инфекции в СПИД, для формулировки дифференциального диагноза у симптоматического пациента, а также для принятия решения о применении антиретровирусной терапии и профилактике оппортунистических инфекций (патогенов). Этот параметр считается наиболее надежным индикатором для прогноза развития заболевания. Определение количества CD4⁺-Т-клеток и CD8⁺-Т-клеток также важно для оценки иммунного ответа, индуцируемого кандидатными вакцинами.

Опыт клинических испытаний кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, стимулирующих Т-клеточный иммунный ответ, показал, что индуцированное вакциной возрастание количества Т-клеток, в том числе и CD4⁺-Т-клеток, может являться серьезным фактором риска ВИЧ-инфекции у вакцинированных добровольцев, так как создается потенциальный резервуар для вируса. Как было обнаружено в клиническом исследовании HVTN 502/Merck 023 («STEP»), количество ВИЧ-инфицированных в группе реципиентов кандидатной вакцины MRK-Ad5 было выше, чем в группе реципиентов плацебо. В качестве одной из причин такого результата эксперты рассматривают повышение уровня CD4⁺-Т-клеток у иммунизированных добровольцев, которые имели предсуществующий иммунитет против аденовируса (рекомбинантный аденовирус серотипа 5 является вектором в кандидатной вакцине MRK-Ad5). По мере анализа материалов, собранных в процессе клинического исследования «STEP», накапливаются все новые данные в пользу этого предположения.

Вслед за остановкой клинических испытаний кандидатной вакцины MRK_Ad5 было остановлено еще несколько действующих и запланированных испытаний кандидатных вакцин, предназначенных для индукции клеточноопосредованного иммунного ответа, в том числе клиническое исследование PAVE 100 (фаза II b), к участию в котором предполагалось привлечь 8500 добровольцев.

На международной конференции «AIDS Vaccine 2008» (13-17 октября 2008 г., Кейптаун, ЮАР), которая была организована под эгидой Global HIV Vaccine Enterprise, активно обсуждался вопрос о необходимости с особой осторожностью подходить к клиническим испытаниям анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, ожидаемым эффектом которых является системная индукция ВИЧ-специфических Т-клеток. Некоторые исследователи даже ставили под сомнение целесообразность дальнейшей разработки таких кандидатных вакцин. В этой связи данные о том, что вакцина «ВИЧРЕПОЛ» не вызывала существенных изменений показателей клеточного иммунитета, могут являться важной дополнительной характеристикой безопасности этого препарата с точки зрения отсутствия риска повышения восприимчивости иммунизированных добровольцев к ВИЧ-инфекции.

Выбор безопасной вакцинирующей дозы

Как показали результаты проведенного клинического исследования, все пять исследованных доз вакцины «ВИЧРЕПОЛ» (2,5 - 50,0 мкг по белку) были безопасны и хорошо переносились добровольцами. Ни одна из дозировок вакцины не вызывала неблагоприятных побочных эффектов. Иммунный ответ, зарегистрированный при иммунизации добровольцев, зависел от дозы вакцины. В 1-й и 2-й группах (иммунизирующие дозы 2,5 и 5,0 мкг по белку соответственно) образование антител в ответ на вакцину наблюдалось у одного добровольца из каждой группы, в 3-й группе (иммунизирующая доза 10,0 мкг по белку) значимые уровни образования антител были обнаружены у двух добровольцев, а в 4-й и 5-й группах (иммунизирующие дозы 25,0 и 50,0 мкг по белку соответственно) индуцированное вакциной образование антител наблюдалось у всех добровольцев. Наиболее выраженный иммунный ответ наблюдался в 5-й группе. При этом у двух добровольцев в этой группе (24.1.5 и 29.1.5) обнаруживались наиболее высокие в настоящем исследовании титры антител против вакцинных антигенов, а также против антигенов ВИЧ. Таким образом, в качестве безопасной иммунизирующей дозы вакцины «ВИЧРЕПОЛ» может быть рекомендована доза 50 мкг по белку.

Достижение первичной и вторичной конечных точек клинических испытаний I фазы - демонстрации безопасности вакцины и получения данных о ее иммуногенности - дает основание для планирования последующих клинических исследований II фазы. Отчет о результатах I фазы клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» успешно прошел экспертизу и согласован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора. Рекомендовано продолжить исследования и переходить ко II фазе клинических испытаний, предметом которых и станет иммуногенность вакцины «ВИЧРЕПОЛ».

Клиническое исследование вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в 2005 году было зарегистрировано в международном Реестре клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин International AIDS Vaccine Initiative (индекс регистрации - HVRF-380-131004), а вакцина «ВИЧРЕПОЛ» была включена в международный рейтинг-лист перспективных кандидатных вакцинных препаратов Global HIV Vaccine Enterprise - основной международной организации, координирующей исследования в области разработки анти-ВИЧ/СПИД-вакцин.

На международной конференции «AIDS Vaccine 2008» (13-17 октября 2008 г., Кейптаун, ЮАР), был опубликован обновленный рейтинг-лист Global HIV Vaccine Enterprise, куда вакцина «ВИЧРЕПОЛ» была включена в числе 22 перспективных кандидатных анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, отобранных из 150 препаратов-претендентов. Также вакцина «ВИЧРЕПОЛ» вошла в обновленный международный Реестр клинических испытаний IAVI.

ВЫВОДЫ

1. Сформирована первая в Российской Федерации стабильная когорта добровольцев, мотивированных для участия в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Часть когорты в соответствии с «Протоколом исследования» была включена в I фазу клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ», другая часть является основой для проведения последующих клинических испытаний II фазы. Когорта имеет перспективы для расширения.

2. Превалирующие мотивы участия добровольцев в клинических испытаниях имели альтруистический характер: помощь ВИЧ-инфицированным людям и вклад в научные исследования. Прагматические мотивы (бесплатное медицинское обследование и получение вознаграждения) не имели определяющего значения. Наиболее эффективным привлечение добровольцев было среди дискордантных пар (один из партнеров ВИЧ-инфицирован, другой - нет).

3. Вакцина «ВИЧРЕПОЛ» является безопасной, хорошо переносится при введении, не вызывает неблагоприятных побочных эффектов.

4. Иммунизация вакциной «ВИЧРЕПОЛ» вызывала образование ВИЧ-специфических антител, которые взаимодействовали как с рекомбинантными белками (rec(24-41), rec p24), так и с белками культурального ВИЧ-1. При этом в основном выявлялись антитела, связывающиеся с белком р24 и его предшественником р55. Антительный ответ был достаточно продолжительным и наблюдался в течение 6 месяцев после последней иммунизации.

5. Иммунный ответ, вызываемый вакциной «ВИЧРЕПОЛ», носит дозозависимый характер. С повышением дозы вакцины возрастает как величина индивидуального иммунного ответа (уровень антител к ВИЧ в крови добровольцев), так и число добровольцев со специфическим иммунным ответом.

6. Индукция иммунного ответа против антигена р24 свидетельствует о потенциальной возможности применения вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в качестве иммунотерапевтического средства у ВИЧ-инфицированных пациентов.

7. Сыворотки добровольцев, иммунизированных вакциной «ВИЧРЕПОЛ», обладали нейтрализующей активностью. Задачей дальнейших исследований станет разработка протокола иммунизации, приводящей к индукции максимально значимых титров антител против gp41.

8. При иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ» не выявлено антиген-специфической пролиферации лимфоцитов в периферической крови. Это является важным свидетельством в пользу безопасности вакцины «ВИЧРЕПОЛ», так как чрезмерная активация пролиферации существенно увеличивает вероятность инфицирования лимфоцитов ВИЧ.

9. При иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ» не обнаруживалось значимых изменений показателей Т-клеточного иммунитета: абсолютное количество CD4⁺-Т-клеток и CD8⁺-Т-клеток, соотношение CD4⁺/CD8⁺, а также количество антиген-специфических ИФН-г-продуцирующих клеток в периферической крови оставались в пределах нормы. Отсутствие активации CD4⁺-Т-клеток под влиянием вакцины «ВИЧРЕПОЛ», может рассматриваться как дополнительный фактор безопасности вакцины (активация CD4⁺-Т-клеток под влиянием вакцинирующего препарата рассматривается как фактор, потенциально повышающий восприимчивость иммунизированных добровольцев к ВИЧ-инфекции и выделяется в руководящих документах ВОЗ/UNIAIDS как самостоятельный аспект безопасности анти-ВИЧ/СПИД-вакцин).

10. В качестве безопасной иммунизирующей дозы вакцины «ВИЧРЕПОЛ» может быть рекомендована доза 50 мкг по белку.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хаитов Р.М., Решетников А.В., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Гудима Г.О. Клинические испытания первой отечественной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины. 2009, М., «ГЭОТАР-Медиа», 680 с.

2. Гудима Г.О., Игнатьева Г.И., Николаева И.А., Сидорович И.Г., Хаитов Р.М. Пандемия ВИЧ/СПИД: контроль, анти-ВИЧ-вакцины, современное состояние проблемы и перспективы в России. Физиология и патология иммунной системы, 2004, №1, с. 30-35.

3. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Шевалье А.Ф., Коробова С.В., Игнатьева Г.А., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Апрятин С.А., Гудима Г.О., Воробьева М.С., Хаитов Р.М. Перспективы контроля пандемии ВИЧ/СПИДа: вакцины и микробициды. Физиология и патология иммунной системы, 2004, №2, с. 62-73.

4. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Шевалье А.Ф., Коробова С.В., Игнатьева Г.А., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Апрятин С.А., Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Савинова И.В., Иванова А.С., Гудима Г.О., Воробьева М.С. Перспективы контроля эпидемии ВИЧ/СПИДа в России: первая отечественная вакцина против ВИЧ/СПИД ВИЧРЕПОЛ готова для проведения I фазы клинических испытаний. Физиология и патология иммунной системы, 2004, №2, с. 74-84.

5. Nikolaeva I., Korobova S., Chevalier A., Ignatjeva G., Karamov E., Kornilaeva G., Pavlova T., Vorobjova M., Savinova I., Nekrasov A., Ivanova A., Gudima G.O., Khaitov R., Sidorovich I. HIV Epidemic Profile in Russia and Preparing for Clinical Trials of the First Russian HIV Vaccine “VICHREPOL”. XV International AIDS Conference, (July 11-16, 2004, Bangkok, Thailand). Medimond International Proceedings, 2004, v.3, p. 157-160.

6. Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Николаева И.А., Карамов Э.В., Коробова С.В., Хаитов Р.М. Клинические испытания анти-ВИЧ/СПИД-вакцин: современное состояние проблемы. Цитокины и воспаление, 2005, т.4, №3, 63-69.

7. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Гудима Г.О., Шевалье А.Ф., Карамов Э.В., Коробова С.В., Хаитов Р.М. Перспективы иммунотерапии ВИЧ-инфекции и СПИДа, анти-ВИЧ/СПИД-вакцины и микробициды. Цитокины и воспаление, 2005, т.4, №3, с. 82-88.

8. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Гудима Г.О., Шевалье А.Ф., Карамов Э.В., Коробова С.В., Хаитов Р.М. Иммунотерапия ВИЧ-инфекции и СПИДа. Физиология и патология иммунной системы, 2005, №8, с. 80-89.

9. Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Николаева И.А., Карамов Э.В., Коробова С.В., Хаитов Р.М. Первая отечественная анти-ВИЧ-вакцина на стадии клинических испытаний. Физиология и патология иммунной системы, 2005, №8, с. 107-116.

10. Гудима Г.О., Николаева И.А., Сидорович И.Г., Коробова С.В., Игнатьева Г.А., Ольховик Е.И., Воробьева М.С., Чеканова Т.А., Хаитов Р.М. Формирование единой системы испытаний иммуногенов и вакцинирующих препаратов против ВИЧ/СПИД и разработка программы I фазы клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцины ВИЧРЕПОЛ. Физиология и патология иммунной системы, 2005, №8, с. 117-121.

11. Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Коробова С.В., Гудима Г.О., Николаева И.А., Гасанов В.А., Киселев А.В., Игнатьева Г.А., Скляров Л.Ю., Истамов Х.И., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Хаитов Р.М. Пути повышения иммуногенности вакцин против ВИЧ/СПИДа. Физиология и патология иммунной системы, 2005, №9, с. 17-23.

12. Николаева И.А., Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф.,Игнатьева Г.А., Коробова С.В., Гасанов В.А., Киселев А.В., Истамов Х.И., Ефремов Е.Е., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Воробьева М.С., Чеканова Т.А., Петрова Т.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Разработка тест-систем для диагностики и мониторинга результатов иммунизации и лечения больных СПИДом. Физиология и патология иммунной системы, 2005, №12, с. 3-11.

13. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Гудима Г.О., Шевалье А.Ф., Коробова С.В., Игнатьева Г.А., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Хаитов Р.М. Перспективы контроля пандемии ВИЧ-инфекции/СПИДа - гуманитарной катастрофы современности. Медицина экстремальных ситуаций, 2006, №2, с. 5-11.

14. Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Николаева И.А., Гудима Г.О., Карпенко Л.И., Расщепкина М.Н., Волкова Р.А., Коробова С.В., Некрасова Н.А., Бажан С.И., Сидорович И.Г., Ильичев А.А., Бектимиров Т.А. Разработка информативных методов контроля на доклиническом уровне первых отечественных вакцин-кандидатов против ВИЧ/СПИД. Физиология и патология иммунной системы, 2006, №3, с. 21-28.

15. Чеканова Т.А., Карпенко Л.И., Плясунова О.А., Воробьева М.С., Некрасова Н.А., Бажан С.И., Расщепкина М.Н., Гудима Г.О., Николаева И.А., Коробова С.В., Бектимиров Т.А., Ильичев А.А., Карамов Э.В., Сидорович И.Г. Изучение специфических показателей иммунного ответа у мышей при введении первых отечественных экспериментальных вакцин против ВИЧ/СПИД. Физиология и патология иммунной системы, 2006, №4, с. 15-19.

16. Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Расщепкина М.Н., Бектимиров Т.А., Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Николаева И.А., Коробова С.В. Кандидат-вакцина против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ». Адаптация различных модификаций ИФА и иммунного блоттинга для отработки и стандартизации тестов подлинности и специфической активности препарата. Вопросы вирусологии, 2006, т.51, №4, с. 42-45.

17. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Николаева И.А., Гудима Г.О. Приматы как модель для создания и оценки анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Использование других экспериментальных моделей. Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях. Материалы Всероссийской научной конференции (8-10 августа 2006 г., Сочи-Адлер). Краснодар, «Наука Кубани», 2006, с. 27-32.

18. Хаитов Р.М., Гудима Г.О. Основные тенденции современной иммунологии и новые подходы к созданию вакцин против опасных и широко распространенных заболеваний (ВИЧ-инфекция, малярия, туберкулез). Российский Аллергологический Журнал, 2007, №6, с. 49-56.

19. Хаитов Р.М., Решетников А.В., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Гудима Г.О. Подготовка когорт добровольцев для клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин: настоящее и будущее. Физиология и патология иммунной системы, 2007, №11, с. 3-16.

20. Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Решетников А.В., Хаитов Р.М. Клинические испытания и их вклад в совершенствование анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Физиология и патология иммунной системы, 2007, №12, с. 3-19.

21. Хаитов Р.М., Гудима Г.О. Перспективные подходы к разработке вакцин против опасных и широко распространенных заболеваний (ВИЧ-инфекция, малярия, туберкулез) и основные направления современной иммунологии. Физиология и патология иммунной системы, 2007, №12, с. 20-27.

22. Хаитов Р.М., Решетников А.В., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Гудима Г.О. Подходы к формированию когорт добровольцев для участия в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Иммунология, 2008, т.29, №2, с. 68-79.

23. Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Решетников А.В., Хаитов Р.М. Опыт клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин. Иммунология, 2008, т.29, №5, с. 252-263.

24. Хаитов Р.М., Решетников А.В., Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Карамов Э.В. Анализ проведения клинических испытаний вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИДа в зарубежных странах и в России. Социология медицины, 2008, №1 (12), с. 32-44.

25. Апрятин С.А., Рубан С.В., Николаева И.А., Вазыхова Ф.Г., Запорожко Л.В., Мамчик Т.А., Гудима Г.О., Сидорович И.Г. Влияние генетических факторов ВИЧ1 и человека на течение ВИЧ-инфекции. Cовременные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. М., ВИНИТИ, 2002, т.II, с. 565.

26. Nikolaeva I.A., Apryatin S.A., Ruban S.V., Vazykhova F.G., Gudima G.O., Sidorovich I.G. Association between CCR5 genotype (heterozygous 32-bp deletion and m303 mutation) and the course of HIV disease. Allergy, 2003, v.58., suppl.74, p. 320.

27. Sidorovich I., Apryatin S., Nikolaeva I., Ruban S., Vazykhova F., Zaporozhko L., Gudima G.O. Molecular and immunological profile of current HIV1 epidemic in Russia. Immunology Letters, 2003, v.87, no.1-3, p. 194.

28. Бектемиров Т.А., Воробьева М.С., Расщепкина М.Н., Чеканова Т.А., Сидорович И.Г., Николаева И.А., Гудима Г.О., Коробова С.В., Игнатьева Г.А. Доклиническое изучение кандидат-вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ». Аллергия, астма и клин. иммунол., 2003, №9, с. 136-140.