Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов

03.00.07 - микробиология

03.00.15 - генетика

Викторов Дмитрий Викторович

Волгоград - 2009

1. Общая характеристика работы

Актуальность работы. Характерным и важным биологическим свойством патогенных буркхольдерий и близких им микроорганизмов является высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений. Наличие этого свойства создает значительные трудности для успешного лечения вызываемых ими заболеваний. Необходимо отметить, что биологические основы полирезистентности у большинства видов Burkholderia на сегодняшний день являются мало исследованными.

К настоящему времени накоплен довольно обширный материал об индивидуальной устойчивости различных видов буркхольдерий к антибактериальным агентам (Антонов и др., 1991; Desai et al., 1998; Kenny et al., 1999; Vorachit et al., 2000; Moore et al., 2001; Jenney et al., 2001; Nzula et al., 2002). Показано, что с одной стороны, препараты тетрациклинового, фторхинолонового, цефалоспоринового, карбапенемового рядов и некоторые другие соединения в опытах in vitro проявляют выраженное ингибирующее действие на клетки патогенных и условно-патогенных видов данной группы микроорганизмов, культивируемых на искусственных питательных средах, с другой - применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции бактерий в организме-хозяине нередко оказывается малоэффективным (Haussler et al., 1999; Inglis et al., 2004; Azizi et al., 2005). Кроме того, известно, что буркхольдерии как при культивировании на питательных средах в селективных условиях, так и в процессе лечения быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным препаратам, и нередко резистентность носит множественный характер (Rajyaguru, Muszynski, 1997; Ho et al., 2002). Сложность генетической организации (Cheng, Lessie, 1994; Rodley et al., 1995; Songsivilai, Dharakul, 2000; Nierman et al., 2004; Holden et al., 2004) позволяет говорить о высокой адаптивной «емкости» их геномов и предполагать наличие различных молекулярно-генетических механизмов, посредством которых реализуется множественная лекарственная резистентность. Последнее является основанием к тому, чтобы обозначает в качестве одного из приоритетных направлений в исследовании микроорганизмов рода Burkholderia изучение фундаментальных основ их устойчивости к антибактериальным агентам, в первую очередь, касающихся молекулярно-генетических механизмов формирования резистентности.

Развитие исследований в этом направлении будет способствовать пониманию основных генетических особенностей буркхольдерий, предопределяющих их повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость к воздействию специфических и неспецифических ингибиторов и защитных факторов макроорганизма. Следует отметить, что знание молекулярных механизмов развития резистентности к антимикробным соединениям имеет не только фундаментальное значение. Речь идет также о возможности получения важных с точки зрения современной теоретической и практической медицины фактов, которые могут быть положены в основу новых подходов к антибиотикотерапии инфекций, вызываемых микроорганизмами рода Burkholderia.

На сегодняшний день довольно детально изучены некоторые из молекулярно-генетических механизмов множественной лекарственной резистентности бактерий: аккумуляция и стабильное наследование отдельных R-детерминант генных кассет в составе интегронов (Ильина, 2003; Fluit, Schmitz, 2004), активный энергозависимый выброс антимикробных соединений из бактериальных клеток (multidrug efflux) (Putman et al., 2000; Poole 2001; Paulsen, Lewis 2001), снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поринов наружной мембраны (Poole, 2002). В рассматриваемом аспекте патогенные и филогенетически близкие им Burkholderia представляют собой весьма интересные объекты исследований, позволяющие анализировать особенности молекулярных механизмов, определяющих тот или иной тип устойчивости к ингибиторам, у близкородственных видов, эволюционирующих в различных экологических нишах.

Возможности современного изучения лекарственной резистентности определяются наличием молекулярно-биологических методов и модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих резистентность. Необходимыми элементами здесь являются специальные штаммы, несущие генетические детерминанты измененной чувствительности, а также методы молекулярного анализа R-детерминант - элементов транспортных систем клеток, ферментов инактивации/модификации, генов внутриклеточных мишеней действия антибиотиков и других. Клонирование генетических последовательностей буркхольдерий, определяющих различные спектры лекарственной резистентности, анализ их экспрессии в гетерологичных видах, а также разработка подходов, направленных на идентификацию дифференциально экспрессирующихся последовательностей генома в различных физиологических состояниях микроорганизма (Rivera-Marrero et al., 1998; Fleming et al., 1998; Benson et al., 2000), также входят в спектр необходимых методологических приемов при изучении генетических механизмов множественной лекарственной резистентности патогенных буркхольдерий и идентификации последовательностей геномов, маркирующих тот или иной спектр лекарственной резистентности.

Настоящая диссертация содержит обобщенные материалы исследований в этих направлениях, выполненных в лаборатории функциональной геномики ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ в рамках государственных НИР и исследовательских проектов, поддержанных грантами РФФИ 07-04-01568 и 07-04-08660. Результаты, отраженные в диссертации, получены как лично соискателем, так и в соавторстве с сотрудниками лаборатории, работавшими под его руководством, а также с сотрудниками лабораторий генетики и молекулярной биологии ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении основных закономерностей формирования множественной устойчивости к антибактериальным препаратам у буркхольдерий группы «pseudomallei» (B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis), идентификации и анализе ведущих молекулярных механизмов, ответственных за развитие полирезистентности.

Задачи исследования:

1. Создать коллекцию изогенных штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, отличающихся по спектру устойчивости и инсерционных мутантов со сниженным уровнем резистентности для использования в качестве моделей для изучения множественной лекарственной резистентности.

2. Изучить динамику формирования и стабильность наследования различных типов антибиотикорезистентности у B. pseudomallei и близкородственных видов. Исследовать у мутантных штаммов спектры перекрестной устойчивости к антимикробным препаратам различных классов.

3. Выявить закономерности развития множественной резистентности Burkholderia к антибиотикам на уровне транспортных мембранных систем, идентифицировать и охарактеризовать мембранные протеины, участвующие в формировании тех или иных типов устойчивости.

4. Разработать методические основы изучения транскрипционных профилей буркхольдерий и провести сравнительный анализ дифференциально экспрессирующихся последовательностей эффлюкс-детерминант различных типов при развитии множественной антибиотикоустойчивости у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis.

5. Клонировать в E. coli последовательности генома B. pseudomallei, кодирующие компоненты мембранных транспортных систем активного энергозависимого выброса антимикробных соединений из клеток и провести анализ их экспрессии в гетерологичной системе.

6. Исследовать геномный полиморфизм и вариации в структуре детерминант мишеней действия лекарственных препаратов при формировании резистентности к антибиотикам множественного характера, провести первичный структурный анализ элементов генома, способных к включению в свой состав генов антибиоткорезистентности, оценить перспективы молекулярного маркирования различных фенотипов антибиотикорезистентности у бактерий группы «pseudomallei».

Научная новизна

В настоящей работе на основе полученной коллекции мутантных полирезистентных штаммов с различными спектрами лекарственной устойчивости и мутантов со сниженным уровнем резистентности впервые проведено изучение особенностей формирования устойчивости множественного типа к антибиотикам у B. pseudomallei и родственных ей видов B. mallei и B. thailandensis.

Впервые изучены закономерности формирования и наследования резистентности к антибиотикам классов цефалоспоринов и фторхинолонов у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с последующим развитием у них множественной устойчивости к препаратам ряда аминогликозидов, в-лактамов и хлорамфеникола. Показано, что устойчивость к антимикробным препаратам различных классов у В. pseudomallei, B. mallei и В. thailandensis обусловлена как возрастанием экспрессии аппарата активного выброса антибиотиков (multidrug efflux), так и снижением проницаемости клеточной оболочки за счет утраты либо пониженной экспрессии отдельных поринов.

Изучены основные механизмы формирования резистентности Burkholderia к антибиотикам, реализующиеся на уровне транспортных мембранных систем; впервые продемонстрирована роль в развитии множественной резистентности транспортного типа мембранных белков 110, 71, 48, 39, 27 и 21 kDa. Разработана технология выделения и очистки порообразующих мембранных белков B. pseudomallei и получен патент на изобретение № 2208445 «Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.07.2003).

Исследовано соотношение изменения проницаемости клеточных мембран и активного энергозависимого транспорта лекарственных препаратов при развитии множественной резистентности у возбудителя мелиоидоза. У полирезистентных мутантов B. pseudomallei выявлено существенное снижение мембранной проницаемости для ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств - жирных кислот, солей желчных кислот, анионных и неионных детергентов, красителей. В экспериментах по оценке влияния соединения, блокирующего мембранные транспортеры, показана важная роль процессов энергозависимого выброса антимикробных соединений при формировании у B. pseudomallei резистентности множественного характера.

Охарактеризованы изменения биохимической активности, вирулентности и продукции поверхностных и внеклеточных биополимеров, имеющих значение факторов патогенности, в связи с развитием у B. pseudomallei полирезистентности. Показано, что приобретение фенотипа множественной резистентности к антибиотикам сопровождается существенной функциональной модификацией секреторных систем клеток возбудителя, выражающейся в структурных модификациях ЛПС, изменениях способности микроорганизма к секреции экзополисахарида и комплекса внеклеточных ферментов. Приоритетность исследований поверхностных и секреторных биополимеров B. pseudomallei, имеющих значение факторов патогенности, подтверждена патентами № 96111507 «Способ получения протективного гликопротеина возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован Российским агентством по патентам и товарным знакам 27.04.1998), № 2231364 «Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.06.2004), № 2255762 «Способ получения капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарной активностью» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 10.07.2005).

Впервые на основе известных последовательностей геномов буркхольдерий проведен сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей идентифицированных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis; обозначены группы детерминант множественной антибиотикорезистентности и подобраны олигонуклеотидные праймеры для амплификации консервативных фрагментов генов лекарственных транспортеров MFS (QacA/EmrB), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF) типов.

Осуществлена разработка методических подходов к изучению транскрипционных профилей исследуемых видов Burkholderia методом дифференциального дисплея мРНК с использованием генспецифических праймеров и проведено сравнительное исследование дифференциально экспрессирующихся генов эффлюкс-протеинов различных функциональных семейств у исходных штаммов и полирезистентных мутантов буркхольдерий, культивируемых в неселектвных условиях и при воздействии антибиотиков групп фторхинолонов и цефалоспоринов. Впервые показано сочетанное участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei» и выявлен повышенный конститутивный уровень экспрессии QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-транспортеров у части полирезистентных мутантов.

Впервые в Escherichia coli клонированы последовательности хромосомной ДНК полирезистентного мутанта B. pseudomallei 56770 SMCP, несущие детерминанты AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров и показано, что их экспрессия приводит к развитию резистентности рекомбинантных клонов к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп. Рекомбинантный штамм E. coli ZV1 (KM167), несущий клонированные последовательности эффлюкс-систем B. pseudomallei, защищен патентом на изобретение № 2280688 «Рекомбинантный штамм Escherichia coli ZV1 - носитель клонированной последовательности ДНК Burkholderia pseudomallei, детерминирующей синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину и стрептомицину» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.07.2006).

Впервые исследованы генетические вариации структуры (аллельного полиморфизма) гена ДНК-гиразы А у мутантных штаммов буркхольдерий с различными спектрами устойчивости к антибиотикам. Показано, что полирезистентные мутанты B. pseudomallei и B. mallei с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам фторхинолонового ряда несут точечные мутации в регионе гена ДНК-гиразы А, детерминирующем резистентность к фторхинолоновым соединениям (QRDR), приводящие к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка (Thr83Ile, Gly81Cys и Asp87Tyr). Секвенированные нуклеотидные последовательности QRDR диких и мутантных штаммов B. pseudomallei и B. mallei депонированы в Genbank NCBI (access. EU541544, EU541545, EU541546, EU541547, EU541548, EU541549, published 29.03.2008).

C использованием ПЦР-анализа и секвенирования установлено, что геномы исследуемых штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis несут последовательности, структурно сходные с интегронами - генетическими элементами, способными включать в свой состав индивидуальные генные кассеты по механизму сайт-специфической рекомбинации. Анализ геномных регионов буркхольдерий, имеющих максимальные показатели сходства с секвенированными ампликонами, продемонстрировал наличие структур, включающих ген транспозазы/интегразы и кодирующие последовательности, аннотированные как детерминанты лекарственной устойчивости - гены эффлюкс-транспортеров MFS и RND типов. Секвенированные нуклеотидные последовательности фрагментов обнаруженных структур депонированы в Genbank NCBI (access. AY772715, published 7.11.2004).

Впервые апробированы техники молекулярного типирования, основанные на амплификации полиморфных ДНК и фрагментов генома, содержащих гены интегразы, для анализа геномного полиморфизма штаммов B. pseudomallei дикого типа, селекционированных вариантов, высокорезистентных к цефтазидиму, пефлоксацину и офлоксацину, и транспозонных мутантов, характеризующихся сниженной устойчивостью к отдельным классам антимикробных соединений. Полученные результаты указывают на заметные геномные перестройки при развитии различных типов резистентности у B. pseudomallei и близкородственных бактерий, и демонстрируют возможность определения дополнительных молекулярных маркеров, ассоциированных с различными типами лекарственной резистентности у патогенных буркхольдерий.

При выполнении исследования разработана электронная библиографическая компьютерная база данных рег. № 2006620082 «Потенциальные агенты биотерроризма: возбудители особо опасных инфекций и биологические токсины», зарегистрированная в Государственном реестре баз данных Российской Федерации в 2006 г.

Разработанные в ходе выполнения работы методологические подходы легли в основу исследовательских проектов 07-04-01568 и 07-04-08660,получивших финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований.

Практическая ценность

Создана коллекция, представленная 14 мутантными штаммами B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с различными спектрами множественной лекарственной устойчивости и 10 инсерционными мутантами, недостаточными по продукции отдельных мембранных белков и имеющими сниженный уровень резистентности к препаратам классов фторхинолонов и цефалоспоринов. Полученный набор штаммов предназначен для изучения молекулярных механизмов формирования лекарственной резистентности и структурно-функционального анализа поверхностных биополимеров патогенных буркхольдерий. Отдельные полирезистентные варианты и инсерционные мутанты со сниженным уровнем устойчивости депонированы в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий РосНИПЧИ «Микроб» (ГКПБ «М»).

Получены рекомбинантные штаммы E. coli, несущие клонированные последовательности хромосомной ДНК B. pseudomallei - детерминанты резистентности транспортного типа к соединениям фторхинолоновой и аминогликозидной групп, предназначенные для структурно-функционального анализа эффлюкс-систем возбудителя мелиоидоза. Рекомбинантный штамм E. coli ZV1 (KM167) депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий (ГКПБ «М») РосНИПЧИ «Микроб».

В ходе анализа адаптивных модификаций поверхностных и секреторных систем клеток возбудителя мелиоидоза разработаны технологические приемы очистки, идентификации и детекции поверхностных и секреторных биополимеров B. pseudomallei, имеющих значение основных факторов патогенности микроба. По результатам исследований составлены методические рекомендации «Оценка иммунотропных и иммуногенных свойств поверхностных антигенов Burkholderia pseudomallei» (утверждены директором ВолгНИПЧИ 29.12.1998), методические рекомендации «Выделение, очистка и изучение некоторых иммунобиологических свойств белков клеточных мембран возбудителя мелиоидоза» (утверждены директором ВолгНИПЧИ 28.02.2001).

Предложен набор из 11 олигонуклеотидных праймеров, специфичных последовательностям сайтов связывания с рибосомой мРНК и консервативным фрагментам генов лекарственного эффлюкса буркхольдерий и осуществлена разработка способов анализа транскрипционных профилей патогенных Burkholderia в RT-PCR для выявления дифференциально экспрессирующихся последовательностей геномов при формировании различных фенотипов лекарственной устойчивости у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis.

Подобраны праймеры для амплификации участка гена ДНК-гиразы А буркхольдерий, включающего регион, детерминирующий устойчивость к хинолонам. Осуществлена разработка техники анализа аллельного полиморфизма gyrA, включающая этапы амплификации QRDR, анализа конформационного полиморфизма однонитевых цепей ампликонов (SSCP) и отбора вариантов с атипичными SSCP-профилями, секвенирования «кандидатных» мутантных последовательностей и определения характера и типа мутаций.

Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, вошли в материалы руководств «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004), «Опасные инфекционные заболевания. Учебное пособие» (Волгоград, 2006), «Методическое пособие для проведения практических занятий по лабораторной диагностике мелиоидоза с использованием штамма-имитатора Burkholderia thailandensis KM-161» (утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 16.07.2008).

Материалы диссертации используются при проведении лекционных и практических занятий в ВолгоградНИПЧИ в рамках учебных программ по первичной специализации и усовершенствованию специалистов: «Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму» (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 01.02.2001), «Программы курсов повышения квалификации врачей-бактериологов общей медицинской сети, центров госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения» (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 28.09.1999), а также при чтении лекций и проведении практических занятий учебных курсов «Молекулярная биология» и «Современные аспекты генодиагностики и биотехнологии» кафедры молекулярной биологии и генетики медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Штаммы B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis обладают выраженной способностью к формировнию резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп при культивировании на питательных средах с повышающимися концентрациями антибатериальных агентов.

2. Устойчивые к фторхинолоновым и цефалоспориновым соединениям мутанты буркхольдерий отличаются стабильным сохранением приобретенного фенотипа резистентности и развитием перекрестной устойчивости к отдельным -лактамам, аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколу и ряду неспецифических ингибиторов.

3. Формирование резистентности множественного типа у микроорганизмов группы «pseudomallei» сопровождается изменениями белкового состава клеточных мембран, являющимися показателем модификации транспортных функций и проницаемости поверхностных структур клеток. Гиперпродукция мажорных мембранных белков M_r 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и значительное снижением синтеза протеинов M_r 45 и 49 kDa у мутантов B. pseudomallei и B. thailandensis ассоциирована с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам.

4. Развитие резистентности множественного типа обусловливает комплексные адаптивные перестройки процессов мембранного транспорта и синтеза поверхностных структур клеток буркхольдерий, выражающиеся в структурных модификациях ЛПС, изменении продукции экзополисахарида и способности секретировать комплекс экстрацеллюлярных ферментов.

5. Включение Tn9 и Тn5 в хромосомные локусы детерминант мембранных протеинов 21, 27, 48, 71, 110 kDa B. pseudomallei приводит к снижению устойчивости инсерционных мутантов к препаратам цефалоспоринового и фторхинолонового ряда. Инсерционный мутагенез полирезистентного варианта B. pseudomallei демонстрирует связь утраты устойчивости к цефтазидиму с дефектами продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa.

6. Ведущая роль в формировании множественной антибиотикорезистентности B. pseudomallei принадлежит механизмам эффлюкса, что демонстрирует анализ динамики накопления и выброса стуктурных аналогов антимикробных соединений клетками штамма дикого типа и полирезистентных мутантов, а также снижением устойчивости исходных и мутантных штаммов B. pseudomallei к антибиотикам различных классов в присутствии соединений - блокаторов мембранного транспорта.

7. Сравнительный анализ in silico известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis является эффективным инструментом выбора последовательностей-мишеней и подбора олигонуклеотидных праймеров для оценки уровня экпрессии генов лекарственных транспортеров MFS, SMR и RND типов.

8. Участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE эффлюкс-детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei» подтверждается индукцией и возрастанием экспрессии данных лекарственных транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в присутствии антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов. Экспрессия клонированных последовательностей AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров возбудителя мелиоидоза в Escherichia coli приводит к появлению резистентности рекомбинантных клонов к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп.

9. Мутационные изменения ДНК-гиразы А, наряду со снижением проницаемости оболочки и активацией эффлюкс-систем, определяют развитие высокого уровня резистентности к соединениям фторхинолоновой группы у B. pseudomallei и B. mallei. Нуклеотидные замены в QRDR gyrA у мутантных штаммов приводят к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка (Thr83Ile, Gly81Cys и Asp87Tyr).

10. Геномы штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis несут участки, структурно сходные с интегронами и представленные генами транспозаз/интеграз и кодирующими последовательностями детерминант лекарственной устойчивости - эффлюкс-транспортеров MFS и RND семейств. Наличие интегроноподобных структур свидетельствует о потенциальной возможности формирования множественной устойчивости у данных микроорганизмов за счет аккумуляции и горизонтального переноса R-детерминант различных типов.

Апробация работы

Диссертация выполнена на основе 14 государственных плановых тем НИР, в 3 из которых соискатель являлся ответственным исполнителем, и в 3 - научным руководителем. Основные результаты исследований изложены в 62 опубликованных работах, в том числе в пяти патентах на изобретение и трех учебных пособиях.

Результаты исследований по теме диссертационной работы были представлены на международном конгрессе «Vaccine & Immunization» (Manchester, 1999), международной конференции «Problems of biological and ecological safety» (Оболенск, 2000), международных конференциях «Natural infectious diseases» (Ulaan Baator, 2001, 2002, 2003), IV и V межгосударственных научно-практической конференций «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003; Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), VI Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» (Москва, 2007), II, IV и VI всемирных конгрессах по мелиоидозу (The 2^nd World Melioidosis Congress, Bangkok, Thailand, 1998; The 4^th World Melioidosis Congress, Perth, Australia, 2001; The 6^th World Melioidosis Congress, Khon Kaen, Thailand, 2007), IХ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008).

2. Содержание работы

2.1 Анализ особенностей формирования множественной лекарственной резистентности у burkholderia pseudomallei и близкородственных микроорганизмов

Получение и характеристика мутантов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с фенотипом множественной антибиотикорезистентности. Приступая к выполнению данной работы, мы должны были, в первую очередь, сформировать определенный набор штаммов исследуемых видов микроорганизмов, несущих генетические детерминанты измененной чувствительности к тем или иным группам антибактериальных препаратов. При этом необходимо было учитывать то обстоятельство, что большинство микроорганизмов рода (в том числе, виды, относящиеся к группе «pseudomallei») характеризуются высокой природной устойчивостью к антибиотикам различным групп, являясь, по сути дела, природно полирезистентными. Таким образом, основными задачами начального этапа исследований мы считали подбор фенотипических маркеров устойчивости, анализ появления и наследования которых не был бы затруднителен в силу исходно высокого уровня резистентности штаммов микроорганизмов к соответствующему антибактериальному препарату, и селекцию клонов со стабильно сохраняющимися фенотипами резистентности. Исследования по получению коллекции полирезистентных вариантов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis включали в себя этапы оценки уровней устойчивости исходных штаммов микроорганизмов к антибиотикам различных групп, выбора подходящих селективных маркеров и схем получения резистентных вариантов, анализа динамики формирования и стабильности наследования новых фенотипов устойчивости, а также изучения перекрестной резистентности полученных вариантов к антимикробным соединениям других классов.

В качестве селективных агентов при анализе особенностей формирования различных профилей лекарственной резистентности у B. pseudomallei, B. thailandensis и B. mallei нами были избраны препараты групп цефалоспоринов III поколения (цефтазидим) и фторхинолонов (пефлоксацин, офлоксацин), отличающиеся высокой активностью в отношении всех имеющихся в нашем распоряжении штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Препараты этих классов антимикробных соединений стандартно используются в существующих схемах экстренной и пролонгированной терапии мелиоидоза (Inglis et al., 2006; Wuthiekanun, Peacock, 2006), наряду с этим, неоднократно были описаны случаи развития резистентности возбудителя к ним в ходе лечения (White et al., 1989; Dance et al., 1989; Dance et al., 1991; Chaowagul et al., 1997). Кроме того, установлено, что развитие устойчивости к отдельным группам антибиотиков довольно часто сопровождается формированием множественной резистентности. Это, в частности, отмечено для антибиотиков фторхинолонового ряда (Deguchi et al., 1997; Jalal, Wretlind, 1998; Zhang et al., 2001; Jellen-Ritter, Kern, 2001; Join-Lambert et al., 2001; Baucheron et al., 2002; Dewi et al., 2004; Wolter et al., 2004).

Первоначальные попытки получения резистентных к фторхинолонам и цефтазидиму мутантов исследуемых видов буркхольдерий на плотных и жидких питательных средах с двукратным приращением концентрации антибиотиков начиная с ингибирующей не увенчались успехом, что в конечном счете привело нас к выбору схемы селекции, предусматривающей постепенное плавное повышение концентраций антибактериальных агентов, начиная с субъингибирующих. Клоны B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, стабильно сохраняющие фенотип устойчивости к фторхинолонам или цефтазидиму, были использованы для селекции вариантов с множественной устойчивостью, при этом, для сохранения первичного фенотипического маркера резистентности применялась поочередная смена селектирующих агентов. В результате были отобраны Pfx^R Caz^R, Caz^R Pfx^R, Caz^R Ofx^R и Ofx^R Caz^R мутанты штаммов B. pseudomallei, Pfx^R Caz^R варианты B. thailandensis, тогда как селекционировать мутанты B. mallei, резистентные одновременно к антимикробным соединениям обеих групп (фторхинолоны и цефалоспорины) не удалось.

Анализ сохранения фенотипов резистентности мутантов при культивировании либо длительном хранении (6 и более месяцев) в неселективных условиях продемонстрировал, что наибольшей стабильностью отличается устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда, тогда как устойчивость к цефтазидиму имела тенденцию к снижению при культивировании резистентных вариантов вне селективного давления. Исследования спектров перекрестной устойчивости полученных мутантов показали, что у B. pseudomallei и B. thailandensis резистентность, первично индуцированная препаратами фторхинолонового ряда, а затем цефтазидимом, сопровождается возрастанием устойчивости к другим фторхинолонам, гентамицину, эритромицину, ампициллину и хлорамфениколу, тогда как индукция устойчивости в направлении «цефтазидим-фторхинолоны» приводила к более выраженному возрастанию резистентности к препаратам -лактамной и аминогликозидной групп. Интересно, что в работе Rajyaguru J.M. и Muszynski M. J. был получен во многом аналогичный результат на модели B. cepacia - резистентные мутанты, селекционированные хлорамфениколом, имели значительно возросший уровень устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы и цефтазидиму (Rajyaguru, Muszynski, 1997).

Несмотря на то, что не удалось выделить мутанты B. mallei с высоким уровнем устойчивости к обеим группам антимикробных соединений, тем не менее, отдельные резистентные к пефлоксацину варианты B. mallei имели отчетливо возросшую устойчивость к другим фторхинолоновым антибиотикам и незначительно увеличенную резистентность к отдельным аминогликозидам и хлорамфениколу. Данные о фенотипах резистентности исходных и полученных штаммов приведены в таблице 1.

Табл. 1. Резистентность исходных штаммов и селекционированных мутантов буркхольдерий к антибиотикам различных классов

Обозначения: PFX - пефлоксацин, OFX - офлоксацин, CIP - ципрофлоксацин, CAZ - цефтазидим, AMP - ампициллин, GEN - гентамицин, ERY - эритромицин, DOX - доксициклин, CML - хлорамфеникол.

Важно отметить, что варианты B. pseudomallei и B. mallei с измененной экспрессией эффлюкс-белков и компонентов секреторных систем оказались существенно аттенуированными для различных биологических моделей. Так, их вирулентность для золотистых хомячков оказалась снижена на 5-6 порядков (LD₅₀ > 10⁶ ж.м.к.), для белых мышей - практически утрачена (отсутствие гибели животных, инфицированных дозами 10⁸ ж.м.к.).

2.2 Изменение проницаемости и транспортных систем клеточных мембран при развитии множественной резистентности burkholderia

Экспрессия мембранных белков у мутантов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с различными фенотипами резистентности. Определенные характеристики полученных мутантных штаммов, а именно их перекрестная устойчивость к антимикробным соединениям, которые не использовались при селекции, позволили нам сделать предположение о возможной роли процессов снижения проникновения антибиотиков, либо их активного выброса в формировании наблюдаемых фенотипов резистентности и исследовать характер изменений систем мембранного транспорта у полученных полирезистентных вариантов буркхольдерий. Анализ изменений белкового состава клеточных мембран был начальным этапом исследований в данном направлении.

Сравнительное исследование в SDS-PAGE белков наружных мембран штаммов B. pseudomallei дикого типа и их резистентных к отдельным антибактериальным препаратам мутантов показало, что мутантные штаммы, в целом, характеризовались снижением уровня продукции мажорных мембранных протеинов и прекращением продукции отдельных белков с молекулярными весами в диапазонах 39 - 70 kDa и 27 - 30 kDa. Совершенно иной, по сравнению с «монорезистентными» вариантами, характер изменений экспрессии белков наружных мембран был обнаружен у мутантов B. pseudomallei со стабильно сохранямыми Pfx^R Caz^R, Caz^R Pfx^R, Caz^R Ofx^R и Ofx^R Caz^R фенотипами резистентности. У всех полирезистентных вариантов наблюдалась гиперпродукция мажорных белков 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и, вместе с тем, прекращение синтеза протеина 45 kDa, а также некоторое снижение продукции белка 49 kDa (рис. 1).

Рис. 1. SDS-PAGE (A) и иммуноблоттинг (B) белков наружных мембран исходного штамма B. pseudomallei 56770 и его полирезистентных мутантов. Штаммы: 1 - дикий тип; 2 - 56770 SMPC; 3 - 56770 SMCP; 4 - 56770 SMOC.

Характер изменений в продукции мембранных протеинов, сходный с выявленным у полирезистентных мутантов B. pseudomallei, наблюдался также у полирезистентных производных B. thailandensis и, в меньшей степени, у B. mallei, чьи мутанты, резистентные к фторхинолоновым антибиотикам, характеризовались прежде всего снижением количества мажорных мембранных белков 21, 42, 45 kDa и группы минорных протеинов 70 - 100 kDa. Проведенные исследования, таким образом, обозначили определенную закономерность в изменении экспрессии протеинов наружных мембран у видов Burkholderia при формировании полирезистентных фенотипов, выражающуюся, наряду с дефектами по отдельным белкам, в возрастании экспрессии группы мембранных протеинов - 110, 71, 48, 39, 27 и 21 kDa.

Известно, что снижение экспрессии или утрата поринов мембран является одной из общих, закономерных черт адаптивного ответа бактерий на воздействие антимикробных соединений (Livermore, 1984; Nikaido, 1989), имеющей, вместе с тем, свои отличительные особенности, как в зависимости от таксономической принадлежности микроорганизма, так и от физико-химических свойств и механизмов действия антибиотика (Guymon et al., 1978; Irvin et al., 1981; Angus et al., 1982; Parr et al., 1987; Bakken et al., 1987; Aronoff, 1988). Вместе с тем, анализ механизмов устойчивости к антибиотикам различных классов, в том числе хинолонам и их фторированным производным, у различных грамнегативных бактерий показывает, что ограничение поступления антибиотиков вследствие изменения экспрессии поринов наружной мембраны является первичным этапом процесса формирования резистентности, опосредованно приводящим к увеличению частоты мутаций по различным геномным локусам в целом, и дальнейшей селекции клонов с модифицированными мишенями действия препаратов (Cohen et al., 1989; Chamberland et al., 1989b), либо активированными системами выведения антибиотиков из клеток (Sabath, 1984; Ishii et al., 1991).

Суммируя полученные результаты и известные данные литературы, можно было предположить, что формирование устойчивости к антимикробным препаратам различных классов у В. pseudomallei, B. mallei и В. thailandensis обусловлено как возрастанием экспрессии аппарата активного выброса антибиотиков (multidrug efflux), так и снижением проницаемости клеточной оболочки за счет утраты, либо пониженной экспрессии отдельных поринов.

Получение и характеристика мутантов Burkholderia, дефектных по продукции мембранных белков. Для подтверждения выдвинутого предположения и более детальной оценки роли мембранных протеинов в реализации резистентности к антимикробным соединениям мы поставили перед собой задачу, используя техники мутагенеза, разработанные ранее для возбудителей мелиоидоза и сапа (Меринова и др., 1997; Меринова, 1998), получить мутанты исследуемых видов буркхольдерий, дефектные по продукции отдельных мембранных белков и провести анализ влияния утраты, либо снижения продукции мембранных протеинов на резистентность к отдельным группам антибиотиков. Кроме того, представлялось интересным получить мутанты со сниженной устойчивостью к тем или иным антибиотикам, используя в качестве исходных штаммов селекционированные полирезистентные мутанты, и исследовать возможные реаранжировки белковых спектров наружных мембран при утрате какого-либо фенотипического маркера резистентности

Мутанты патогенных буркхольдерий, недостаточные по продукции мембранных протеинов (Bop^-), были индуцированы включением в хромосому транспозонов Tn9 и Тn5. Полученные мутанты B. pseudomallei и B. mallei отличались дефектами, либо сниженной продукцией ряда мембранных белков (21, 27, 48, 71, 110 kDa) и уменьшением устойчивости к цефалоспориновым и фторхинолоновым антибиотикам (рис. 2, табл. 2). Естественно, приведенные данные не являются достаточными для оценки, как таковой, функциональной роли отдельных мембранных протеинов, тем не менее, они обозначают ряд мембранных белков, изменения в продукции которых оказывают влияние на уровень резистентности бактерий к антибиотикам различных групп.

Рис. 2. Белки наружных мембран клеток исходного штамма и инсерционных мутантов B. pseudomallei. Обозначения: 1 - B. pseudomallei 57576, 2 - B. pseudomallei 57576 TTM6, 3 - B. pseudomallei 57576 TTM7, 4 - B. pseudomallei 57576 TTM9.

Для подтверждения связи экспрессии отдельных мембранных протеинов и резистентности исследуемых микроорганизмов к антибактериальным препаратам мы предприняли попытку получения мутантов со сниженной устойчивостью к антибиотикам на основе полирезистентных мутантных штаммов.

Табл. 2. Устойчивость Tn5-индуцированных Bop^- мутантов B. pseudomallei к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп

Плазмида RP1::Tn9 Rep ts была передана в клетки мутанта B. pseudomallei 57576 SMCP Caz^R Pfx^R Ofx^R. Трансконъюганты от скрещивания тестировали на средах с цефтазидимом и пефлоксацином, отбирая клоны cо сниженной резистентностью. Удалось выделить клон (B. pseudomallei 57576 SMRT21), утративший резистентность только к цефтазидиму (Caz^S Pfx^R Ofx^R); МПК антибиотика для него составила 12 мкг/мл, что соответствовало уровню штамма дикого типа. Анализ в SDS-PAGE белков наружных мембран B. pseudomallei 57576 SMRT21 демонстрировал, что утрата устойчивости к цефтазидиму сопровождается дефектами продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa (рис. 3).

Таким образом, результаты серии экспериментов по получению и первичной характеристике инсерционных Bop^- мутантов показали, что отдельные протеины наружной мембраны (110, 71, 48, 27 и 21 kDa) могут непосредственно участвовать в процессах формирования у патогенных видов Burkholderia резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп.

Рис. 3. SDS-PAGE белков наружных мембран клеток B. pseudomallei 57576 SMCP (1) и B. pseudomallei 57576 SMRТ21 (2).

В целом, полученные результаты свидетельствовали в пользу того, что мембранные протеины, уровень продукции которых был ассоциирован с измененной чувствительностью к антибиотикам, являются компонентами транспортных систем, участвующих в активном выбросе антибатериальных препаратов из клеток во внешнюю среду либо обеспечивающих селективное проникновение антибиотиков в клетку извне.

Проницаемость клеточных мембран и эффлюкс антимикробных соединений у полирезистентных вариантов Burkholderia. Для дальнейшей оценки роли систем мембранного транспорта в развитии множественной антибиотикорезистентности мы провели сравнительные исследования проницаемости клеточных оболочек, процессов энергозависимого эффлюкса антимикробных соединений и их аналогов, и изменений в продукции и транспорте отдельных внеклеточных и поверхностных биополимеров у штаммов буркхольдерий, отличающихся чувствительностью к антибиотикам.

Известно, что наружные мембраны клеток грамотрицательных бактерий служат эффективным барьером, ограничивающим поступление из внешней среды различных соединений, ограничивающих жизнеспособность микроорганизмов (Nikaido, Vaara,1985; Vaara, 1992). Исходно низкая проницаемость поверхностных структур клетки для ряда антимикробных соединений является одной из составляющих внутренней, природной лекарственной резистентности (intrinsic resistance) у ряда видов бактерий. Активация эффлюкс-систем клетки также вносит свой вклад в реализацию резистентности к токсичным для микроба соединениям. Имея в своем распоряжении ряд штаммов с измененной чувствительностью к антибиотикам, мы попытались оценить соотношение снижения проницаемости мембран и процессов эффлюкса в феномене развития множественной лекарственной устойчивости у возбудителя мелиоидоза.

Изучение уровня устойчивости исходных и мутантных штаммов к ряду неспецифических ингибиторов, способных к эффективному проникновению через мембраны бактериальных клеток (жирные кислоты, соли желчных кислот, детергенты и красители) показали существенное снижение мембранной проницаемости полирезистентных мутантов B. pseudomallei для целого ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств. Для оценки составляющей активного эффлюкса в реализации резистентности к антибиотикам и неспецифическим ингибиторам мы исследовали влияние блокаторов мембранного транспорта на уровень устойчивости мутантов и штамма дикого типа к отдельным антибиотикам, а также процессы аккумуляции и выведения из клеток микроорганизмов бромистого этидия (EtBr), часто используемого в анализе транспортных мембранных систем в качестве структурного аналога антимикробных соединений фторхинолонового ряда (Kumar, Worobec, 2002; Godreuil et al., 2003; Brenwald et al., 2003; Xu et al., 2003; Rouquette-Loughlin et al., 2003; Li et al., 2004; Rafii et al., 2005; Martins et al., 2006).

Полученные нами результаты выявили существенную разницу в скорости накопления и количестве аккумулированного красителя в клетках штамма дикого типа и мутантов с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам, при этом мутантные штаммы с преобладающей устойчивостью к фторхинолоновым соединениям характеризовались отчетливо меньшей проницаемостью мембран для данного соединения (рис. 4). Анализ процессов эффлюкса EtBr показал, что максимальная скорость выброса ингибитора была у клеток полирезистентных мутантов (рис. 4).

Энергозависимый характер процесса выброса бромистого этидия клетками мутантного штамма B. pseudomallei был продемонстрирован в серии дальнейших экспериментов при исследовании влияния температуры и наличия источника энергии в среде на кинетику эффлюкса EtBr (рис. 5).

Рис. 4. Динамика накопления (А) и выброса (В) бромистого этидия клетками B. pseudomallei 56770 и мутантов с множественной антибиотикорезистентностью.

Рис. 5. Динамика выброса бромистого этидия клетками B. pseudomallei 56770 SMOC при различных температурах (А) и наличии источника энергии (В).

Взятые вместе, результаты проведенных исследований подтверждали значимую роль эффлюкса антимикробных соединений при формировании резистентности множественного характера, в связи с чем нами был проведен ряд дополнительных экспериментов по оценке влияния верапамила - соединения, блокирующего мембранные транспортеры (Ng et al., 1994; Banerjee et al., 1996; Choudhuri et al., 2002; Lee et al., 2003), на уровень резистентности исходного и мутантных штаммов B. pseudomallei к антибиотикам различных групп (рис. 6).

Рис. 6. Устойчивость штамма дикого типа B. pseudomallei 56770 (A) и его полирезистентныз производных B. pseudomallei 56770 SMPC Pfx^R Caz^R (B), B. pseudomallei 56770 SMCP Caz^R Pfx^R (C), B. pseudomallei 56770 SMOC Ofx^R Caz^R (D) к антибиотикам различных групп при воздействии блокатора мембранных каналов.

Как показал проведенный анализ, присутствие верапамила в целом приводило к снижению устойчивости исходных и мутантных штаммов к антимикробным соединениям, однако характер снижения отличался в каждом конкретном случае. Так, исследование динамики выживания клеток штамма дикого типа и мутантов под воздействием гентамицина продемонстрировала тенденцию к снижению числа жизнеспособных клеток в присутствии фиксированных концентраций верапамила, при этом у мутантных штаммов снижение выживаемости инокулума наблюдали лишь в определенных диапазонах концентраций антибиотика. Оценка влияния верапамила на выживаемость бактериального инокулума в присутствии фиксированных концентраций (субМПК по отношению к штамму дикого типа) антибактериальных препаратов различных групп в большинстве случаев также показала снижение количества жизнеспособных клеток, при этом угнетающее воздействие верапамила на рост культур полирезистентных мутантов хорошо прослеживалось на средах, содержащих препараты фторхинолоновой группы, тетрациклины и аминогликозиды. Отметим, однако, что набор антибиотиков, устойчивость к которым подавлялась верапамилом, для мутантных штаммов оказался существенно уже, чем для штамма дикого типа (рис. 6).

Изменения экспрессии поверхностных полисахаридов и систем секреции экзоферментов. Анализируя роль систем мембранного транспорта и изменения проницаемости клеточных оболочек в формировании антибиотикорезистентности у возбудителя мелиоидоза и близких ему видов Burkholderia, мы ставили перед собой в качестве одной из задач как можно более многоплановую оценку полирезистентных фенотипов у данной группы бактерий, в связи с чем нами были проведены исследования изменчивости некоторых поверхностных и внеклеточных биополимеров у полирезистентных мутантов B. pseudomallei, а именно изменений в структуре ЛПС, способности продуцировать экзополисахарид и внеклеточные ферменты «агрессии», то есть анализ модификации клеточных компонентов, причисляемых к факторам патогенности микроорганизма (Алексеев и др., 1984; Алексеев и др., 1994; Пивень, Илюхин, 2000; Brett, Woods, 2000).

Роль ЛПС, как внешнего барьера для различных антимикробных соединений, обусловлена его определенными физико-химическими характеристиками - анионными свойствами, числом межмолекулярных связей в коровом регионе и плотностью упаковки жирнокислотных цепей липида А (Snyder et al., 1999; Wiese et al., 1999). Барьерная функция ЛПС многократно подтверждена многочисленными исследованиями свойств мутантов различных видов бактерий, дефектных по продукции отдельных структурных компонентов ЛПС (Sukupolvi, Vaara, 1989; Plesiat, Nikaido, 1992; Vuorio, Vaara 1992; Helander et al., 1994; Helander et al., 1995; Plesiat et al., 1997; Plesiat, Vaara 1999; Nesper et al., 2001). Выявление возможных модификаций ЛПС при селективном воздействии антимикробных соединений, по нашему мнению, давало возможность более широко обозначить вероятные механизмы, лежащие в основе феноменологии множественной антибиотикорезистентности возбудителя мелиоидоза.