Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов

По данным SDS-PAGE, ЛПС-профили мутантов B. pseudomallei Pfx^R Ofx^R фенотипов отличались от исходного штамма числом и количественной выраженностью отдельных ЛПС-паттернов практически во всех диапазонах профиля - наблюдалась реаранжировка высокомолекулярных ( > 150 kDa) паттернов и существенная редукция числа низкомолекулярных (25 kDa и менее) фрагментов, что мы рассматриваем как свидетельство наличия структурных модификаций биополимера, сопряженных с возрастанием устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы (рис. 7).

Рис. 7. SDS-PAGE ЛПС исходного штамма и полирезистентных мутантов B. pseudomallei. Окраска серебром. Штаммы: 1 - 56770; 2 - 56770 SMCP; 3 - 56770 SMPC; 4 - 56770 SMOC.

Логично предполагать, что изменения структуры ЛПС вносят свой вклад в изменение проницаемости клеточных оболочек мутантов B. pseudomallei и формирование устойчивости к отдельным антимикробным соединениям. Как было отмечено выше, структурные модификации ЛПС встречаются у мутантов различных видов бактерий с фенотипом множественной антибиотикорезистентности, часто, однако, изменения структуры ЛПС не являются ведущим фактором формирования резистентности, а скорее следствием комплексных адаптивных реакций клеток, тем не менее, дающим микроорганизмам дополнительные селективные преимущества (Chamberland et al., 1989; Rajyaguru, Muszynski, 1997; Ishikawa et al., 2002; Poole, 2002).

Экзополисахарид (капсульный полисахарид), продуцируемый многими видами грамотрицательных и грамположительных бактерий, является одним из важнейших факторов вирулентности (Pier et al., 1987; Cabral et al., 1987; May et al., 1991; Yu et al., 1995; Pier et al., 2001; Yu, Head 2002; Vuong et al., 2004), вместе с тем, неоднократно была показана роль экзополисахарида как экранирующего барьера в защите клеток бактерий от воздействия антибиотиков и антисептических соединений (Nickel et al., 1985; Morris et al., 1996; Vandenbroucke-Grauls, 1996; Desai et al., 1998; Ali et al., 2000; Hentzer et al., 2001; Campanac et al., 2002; Drenkard, Ausubel, 2002; Cunha et al., 2004; Arciola et al., 2005; Cerca et al., 2005). Подчеркнем также, что утрата способности продуцировать экзополисахарид также в отдельных случаях сопровождается повышением устойчивости микробов к некоторым группам антимикробных соединений, в частности, подобные особенности формирования резистентности к полипептидным антибиотикам были описаны у X. campestris, Sphingomonas spp. и E. coli (Pollock et al., 1994).

Исследования изменений продукции экзополисахарида у полирезистентных мутантов различных видов Burkholderia мы проводили с использованием двух методических подходов. Качественно способность продуцировать экзополисахарид оценивали методом, основанным на избирательном окрашивании экзополисахарид-негативных колоний микроорганизмов липофильным красителем судан черным В (Liu et al., 1998); для количественного соотнесения экзополисахарид-продуцирующей активности мутантных штаммов буркхольдерий за основу был взят метод окрашивания биопленок, формируемых бактериями на твердых субстратах (Ngwai et al., 2006). Результаты данной серии экспериментов приведены в таблице 3.

Табл. 3. Продукция экзополисахарида исходными штаммами и полирезистентными мутантами различных видов Burkholderia

При анализе данных, полученных в этой серии экспериментов, можно видеть, что дефекты в продукции экзополисахарида отмечались, прежде всего, у мутантных штаммов B. pseudomallei и B. mallei, имеющих высокий уровень устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы, тогда как у мутантов, при получении которых в качестве селективных факторов первыми были использованы препараты группы цефалоспоринов, вообще не было выявлено вариантов со сниженной продукцией экзополисахарида, напротив, все штаммы этой группы обладали даже несколько более высокими показателями формирования биопленок (табл. 3).

Характер варьирования продукции экзополисахарида у мутантов буркхольдерий, принадлежащих к различным фенотипическим классам резистентности, по-видимому, является отражением изменений в экспрессии различных секреторных систем бактерий, в том числе, задействованных в транспорте компонентов данной поверхностной структуры. В пользу этого свидетельствуют также результаты изучения спектров внеклеточных ферментов полирезистентных мутантов.

Приобретение фенотипа множественной антибиотикорезистентности в ряде случаев может сопровождаться функциональной модификацией секреторных систем клеток I, II и IV типа (Poole, 2001; Poole, 2002; Poole, 2004; Poole, 2005; Marquez, 2005), что, как правило, приводит к значительным изменениям отдельных фенотипических свойств микроорганизмов. Как отмечалось ранее, некоторые из таких полирезистентных вариантов обладают повышенным уровнем продукции экзополисахарида и большей биофильм-формирующей способностью. Модификации спектров секретируемых белков, вызванные изменениями экспрессии секреторных аппаратов I, II (gsp, general secretory pathway) и IV типов, также является характерной особенностью изолятов с множественной антибиотикорезистентностью (Poole et al., 1993; Schlor et al., 1997; Hayashi et al., 2000; Peng et al., 2005; Linares et al., 2005; Gil et al., 2006; Zhu et al., 2006; Posadas et al., 2007).

Для оценки возможных модификаций секреторной активности полирезистентных мутантов B. pseudomallei мы исследовали спектры их экстрацеллюлярных протеинов и вариабельности ферментативной активности культуральных супернатантов бактерий. Полученные результаты обозначили определенную закономерность в изменении специфической экстрацеллюлярной энзимной активности у штаммов B. pseudomallei с различными фенотипами резистентности (рис. 8).

Мутанты, имеющие фенотип множественной резистентности, в целом, характеризовались снижением энзимной активности культуральных фильтратов, по сравнению с исходными штаммами и «монорезистентными» производными. Отметим, что полирезистентные варианты с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолонового ряда не продуцировали внеклеточных липаз и лецитиназ, кроме того, Pfx^R Caz^R фенотип практически полностью утрачивал экстрацеллюлярную протеолитическую активность (рис. 8).

Рис. 8. Ферментативная активность культурального супернатанта исходного штамма B. pseudomallei и мутантов, селекционированных в последовательности Ofx^R - Caz^R (A), Pfx^R - Caz^R и Caz^R - Pfx^R. Показаны средние значения диаметров зон гидролиза субстратов.

Таким образом, наряду со сведениями о характерных перестройках белкового спектра наружных мембран клеток, результаты анализа экспрессии поверхностных углеводсодержащих биополимеров и секреторной активности полирезистентных вариантов буркхольдерий, приведенные в данном разделе работы, являются еще одним подтверждением комплексного изменения процессов клеточного транспорта у исследуемых микроорганизмов при формировании устойчивости к антимикробным соединениям множественного типа. Судя по всему, эти изменения выражаются в модификации проницаемости клеточных оболочек и активации механизмов активного выведения антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду. В число последних, по-видимому, вовлечены и sec-зависимые секреторные системы, ответственные за транспорт полипептидов и полисахаридных компонентов.

3. Эффлюкс-системы и развитие множественной антибиотикорезистентности burkholderia

Системы лекарственного эффлюкса патогенных Burkholderia. В последнее время у грамотрицательных и грамположительных бактерий интенсивно изучается один из механизмов множественной лекарственной устойчивости, представленный системами активного энергозависимого транспорта и выброса антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (multidrug efflux) (Ma et al., 1994; Nikaido, 1994; Nikaido et al., 1998; Kohler et al., 1999; Van et al., 2000; Borges-Walmsley, Walmsley, 2001; Markham, Neyfakh, 2001; Poole, 2001; Poole, 2004; Saidijam et al., 2006). Большинство из выявленных транспортных систем резистентности специфичны для довольно узкого ряда структурно сходных субстратов, однако идентифицированы и мультиэкспортеры (multidrug efflux pumps), «оперирующие» с широким набором даже структурно различных антибиотических соединений (Nikaido, 1998; Zgurskaya, Nikaido, 2000). Известные на сегодня бактериальные лекарственные мультитранспортеры принадлежат к 6 различным функциональным семействам транспортных протеинов: ABC (ATP binding cassette), MFS (Major Facilitator Superfamily), RND (Resistance / Nodulation / Division), SMR (Small Multidrug Resistance), MATE (Multidrug and Toxic Compound Extrusion), MET (Multidrug Endosomal Transporter) (Paulsen et al., 2001).

Мы использовали технику дифференциального дисплея мРНК для исследования экспрессии последовательностей геномов, гомологичных некоторым известным на сегодняшний день efflux-детерминантам MFS, SMR и RND семейств транспортных протеинов, у исходных и мутантных штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis в процессе селективного воздействия антимикробными препаратами фторхинолоновой и цефалоспориновой групп. Первичным этапом этого раздела исследований был сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, выполненный с использованием биоинформационного программного обеспечения на основе опубликованных в Genbank последовательностей геномов буркхольдерий группы «pseudomallei».

Исследование представленных в Genbank геномных сиквенсов штаммов B. pseudomallei K96243, B. pseudomallei 1710b, B. mallei ATCC23344 и B. thailandensis E264 показали наличие большого числа кодирующих последовательностей, гомологичных детерминантам лекарственных транспортеров MFS типа. Группирование кодируемых обозначенными генами протеинов по числу точных соответствий в участках их аминокислотных последовательностей с использованием алгоритма Clustal W (Thompson et al., 1994) и оценка их гомологии известным MFS-протеинам показала, что около половины MFS эффлюкс-транспортеров B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis принадлежит к DHA2 (Drug/Hydrogen Antiport) семейству вторичных транспортеров, при этом большая часть из них высокогомологична лекарственным мультитранспортерам QacA/EmrB субсемейства, а небольшую группу составляют гомологи Bcr/CflA субсемейства (рис. 9).

Рис. 9. ClustalW дендрограмма соответствия аминокислотных последовательностей MFS-транспортеров B. pseudomallei K96243, B. pseudomallei 1710b, B. mallei ATCC23344 и B. thailandensis E264. Указано количество TMS белков и их принадлежность к отдельным семействам и субсемействам MFS.

Принадлежащие к данным группам транспортные белки различных бактериальных видов, как сообщалось, осуществляют энергозависимый выброс структурно разнородных антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (Putman et al., 2000; Saidijam et al., 2006).

Несомненный интерес представляет также характер локализации детерминант MFS-транспортеров в геномах B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Кодирующие последовательности MFS-протеинов расположены в области генных кластеров тРНК, транскрипционных регуляторов систем транспорта компонентов полисахарида, флагеллярных генов, генов консервативного метаболизма, генных кластеров секреторных систем II и III типов. Отметим также наличие последовательностей IS-элементов и генов транспозаз в непосредственной близости от локусов многих MFS-транспортеров, что позволяет предполагать важную роль транспозиционных событий в формировании этих фрагментов геномов.

Последовательности геномов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, гомологичные SMR транспортерам EmrE/QacE группы, как показал проведенный анализ, расположены на хромосоме 1 у всех трех видов буркхольдерий и локализованы в области генных кластеров, кодирующих компоненты консервативных метаболических путей и АТФ-зависимых секреторных систем. Сравнение аминокислотных последовательностей EmrE микроорганизмов группы «pseudomallei», других буркхольдерий и видов отдаленой гетерологии продемонстрировало полную идентичность этих протеинов у B. pseudomallei и B. mallei и отличия от них по 9 аминокислотам у соответствующего белка B. thailandensis. Оказалось также, что белок EmrE B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis структурно более сходен c SMR-транспортерами B. phymatum, B. phytofirmans, B. xenovorans, видов Ralstonia, Serracia и Klebsiella, чем с EmrE B. cenocepacia и некоторых других видов буркхольдерий (рис. 10).

В отношении эффлюкс-детерминант, кодирующих транспортеры RND суперсемейства, анализ геномных сиквенсов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis показал, что большинство из трехкомпонентных RND эффлюкс-систем у данных видов буркхольдерий локализовано на хромосоме 1 в областях генных кластеров транспортных систем аминокислот и азотистых оснований, генов синтеза и транспорта фимбриальных структур, систем секреции сидерофоров и гемолизинов (гомологов HlyB-HlyD), генов пуринового и липидного обмена, генов контроля клеточного цикла. В большинстве случаев, последовательности RND эффлюкс-систем представлены оперонами, состоящими из дивергентно транскрибируемого гена транскрипционного регулятора, гена вспомогательного белка MFP семейства, гена транспортера и гена порина наружной мембраны.

Рис. 10. Аминокислотные последовательности EmrE различных видов Burkholderia и гетерологичных микроорганизмов. Оттенками выделены фрагменты с различной степенью идентичности аминокислотных последовательностей.

Проведенный анализ гомологии аминокислотных последовательностей обозначенных RND транспортеров буркхольдерий и протеинов - представителей различных групп RND суперсемейства (рис. 11) показал прнадлежность большинства предполагаемых эффлюкс-белков данной категории к HAE1 (Hydrophobe/amphiphile efflux-1) семейству транспортеров и максимальную степень сходства с лекарственными мультиэкспортерами AcrB/AcrD/AcrF и YegO/YegN типов (Tseng et al., 1999).

In silico исследование предполагаемых детерминант антибиотикорезистентности транспортного типа B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с использованием биоинформационных технологий продемонстрировало разнообразие генетических механизмов, посредством которых у них может реализовываться множественная устойчивость к антимикробным соединениям, а обозначенные по результатам анализа группы детерминант множественной резистентности были использованы при подборе олигонуклеотидных праймеров для детекции генов лекарственного эффлюкса в ПЦР и изучении их экспрессии в неселективных условиях и при воздействии антибиотиков.

Рис. 11. Clustal W дендрограмма гомологии аминокислотных последовательностей RND-транспортеров B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis и эффлюкс-протеинов различных семейств суперсемейства RND.

Набор праймеров для амплификации последовательностей эффлюкс-детерминант включал олигонуклеотиды, специфичные консервативным фрагментам CDS транспортеров MFS (QacA/EmrB группа гомологии), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF группа) типов (таб. 4). В последнем случае были использованы три пары праймеров для детекции участков кодирующих последовательностей, гомологичных идентифицированным ранее генам эффлюкс-транспортеров B. pseudomallei AmrB (Moore et al., 1999) и BpeB (Chan et al., 2004a), а также предполагаемых RND эффлюкс-транспортеров (BPSS1119/BMAA1045), структурно сходных с MexF P. aeruginosa (Kohler et al., 1997).

Табл. 4. Характеристика олигонуклеотидных праймеров, использованных для анализа дифференциальной экспрессии генов лекарственного эффлюкса Burkholderia

Дифференциальная экспрессия эффлюкс-детерминант при формировании множественной резистентности Burkholderia. Участие эффлюкс-транспортеров AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE групп в формировании антибиотикорезистентности множественного типа оценивали по результатам RT-PCR анализа мРНК транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в неселектвных условиях и на средах с субъингибирующими концентрациями антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов (рис. 12).

Рис. 12. RT-PCR анализ экспрессии эффлюкс-генов у исходных штаммов и полирезистентных мутантов буркхольдерий, выращенных в неселективных (A) и селективных (B) условиях. Треки 1 - 10: B. pseudomallei 56770, B. pseudomallei 56770 SMPC, B. pseudomallei 56770 SMCP, B. pseudomallei 56770 SMOC, B. mallei C-5, B. mallei C-5 SMP-150-2, B. mallei C-5 SMP-150-3, B. mallei C-5 SMC, B. thailandensis E264, и B. thailandensis E264 SMPC. Трек C: контроль, транскрипт gyrA.

В неселективных условиях исходные штаммы и большинство резистентных мутантов имели невысокий уровень конститутивной экспрессии AcrB/AcrD/AcrF транспортеров AmrB и BpeB, за исключением двух мутантов B. pseudomallei Ofx^R Caz^R и Caz^R Pfx^R фенотипов, у которых уровень экспрессии AmrB был существенно выше. Экспрессия BPSS1119/BMAA1045 в неселективных условиях была отмечена только у Caz^R Pfx^R мутанта B. pseudomallei. Рост в присутствии антибиотиков вызывал заметное возрастания количества мРНК BpeB, AmrB и BPSS1119/BMAA1045 и у диких, и у мутантных штаммов, при этом все же более выраженное возрастание экспрессии RND эффлюкс-детерминант наблюдалось у полирезистентных производных.

Уровень экспрессии эффлюкс-транспортеров QacA/EmrB был приблизительно одинаковым у исходных и мутантных штаммов при росте на средах, не содержащих антимикробных соединений; заметное увеличение мРНК данных эффлюкс-генов мы наблюдали у мутантных штаммов буркхольдерий с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы при культивировании на средах с пефлоксацином. Уровень мРНК QacE также оказался приблизительно одинаковым у большинства штаммов буркхольдерий, выращенных на неселективных средах. В селективных условиях мы отмечали увеличение экспрессии QacE, более выраженное у мутантных штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis.

Полученные результаты, таким образом, указывают на участие эффлюкс-систем различных типов в реализации множественной устойчивости буркхольдерий группы «pseudomallei» к антибиотикам фторхинолонового ряда, цефалоспоринам и другим антимикробным соединениям.

Отметим, что факты сочетанного действия эффлюкс-систем различных типов при развитии множественной устойчивости известны для ряда бактериальных видов, в том числе природнорезистентных (Germ et al., 1999; Lee et al., 2000). Повышенный уровень экспрессии гомологов QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF в отсутствии селективного воздействия, наблюдаемый нами у части мутантов, возможно, свидетельствует о генетически закрепленных нарушениях механизмов регуляции последовательностей, что, например, было показано в отношении гиперэкспрессии эффлюкс-оперона mexAB-oprM P. aeruginosa (Adewoye et al., 2002).

Экспрессия эффлюкс-последовательностей B. pseudomallei в гетерологичных системах. Еще одно подтверждение участия QacE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-систем B. pseudomallei в формировании устойчивости к антимикробным соединениям различных групп было получено в экспериментах по shotgun-клонированию в составе вектора pUC19 ДНК Caz^R Pfx^R мутанта B. pseudomallei. В качестве источника хромосомной ДНК был использован штамм B. pseudomallei 56770 SMCP, имеющий высокий уровень резистентности к цефалоспоринам, фторхинолонам, аминогликозидам и некоторым -лактамам, и отличающийся стабильным сохранением маркеров резистентности при длительном культивировании в неселективных условиях. Полученные рекомбинантные штаммы E. coli характеризовались резистентностью к пефлоксацину, имипенему и аминогликозидам (таб. 5).

Табл. 5. Рекомбинантные штаммы E. coli

Анализ спектра резистентности полученных рекомбинантных штаммов к антимикробным соединениям различных классов и снижение уровня их устойчивости в присутствии соединений - блокаторов мембранных каналов (верапамил) (рис. 13) указывали на ведущую роль механизмов лекарственного эффлюкса в формировании наблюдаемых фенотипов антибиотикорезистентности.

Рис. 13. Устойчивость рекомбинантного штамма E. coli DH1 LKp4 к пефлоксацину при воздействии блокатора мембранных каналов. Прерывистой линией показана выживаемость микробных клеток в присутствии верапамила (40 мкг/мл)

Продукты экспрессии клонированных последовательностей хромосомной ДНК B. pseudomallei - белки 32 и 48 kDa - были идентифицированы в иммуноблоттинге с иммуноглобулинами к общеклеточным антигенам B. pseudomallei (рис. 14).

Рис. 14. Иммуноблоттинг общеклеточных (A) и мембранных белков (B) полирезистентных мутантов B. pseudomallei и рекомбинантных штаммов E. coli.

Учитывая тот факт, что штамм B. pseudomallei 56770 SMCP отличается возрастанием уровня экспрессии эффлюкс-детерминант AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE типов, было проведено исследование экспрессии этих последовательностей у отобранных в результате скрининга рекомбинантных клонов методом дифференциального дисплея мРНК с ген-специфичными праймерами (рис. 15).

AB

Рис.15. Детекция мРНК эффлюкс-последовательностей B. pseudomallei amrB (A) и emrE (B) в рекомбинантных штаммах E. coli. Обозначения: М - маркерная ДНК (517, 460, 396, 350 п.н.); 1 - E. coli JM107 LKp1; 2 - E. coli DH1 LKp2; 3 - E. coli JM107 LKp3b; 4 - E. coli JM107 LKp3y; 5 - E. coli JM107.

Результаты секвенирования транскриптов и данные их сравнительного анализа с известными генами B. pseudomallei (рис. 16) подтвердили принадлежность клонированных последовательностей к эффлюкс-детерминантам AcrB/AcrD/AcrF и QacE типов.

Рис. 16. Сравнительный анализ генов amrB и qacE B. pseudomallei и секвенированных последовательности транскриптов рекомбинантного штамма E. coli JM107 LKp3b.

4. Изменчивость детерминант устойчивости к отдельным группам антимикробных соединений и геномная вариабельность полирезистентных штаммов буркхольдерий

Мутационные изменения ДНК-гиразы А у мутантов Burkholderia с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы. Исследования механизмов резистентности к хинолоновым антибиотикам и их фторированным производным у различных бактериальных видов демонстрируют значимую роль точечных мутаций в особом участке генов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, определяющем высокую резистентность к фторхинолонам - регионе QRDR (quinolone resistance determining region) (Baranwal et al., 2002; Ruiz, 2003). Мы провели анализ возможных мутационных изменений в QRDR ДНК-гиразы для оценки их значения в формировании резистентности исследуемых видов Burkholderia к препаратам фторхинолонового ряда.

Регион последовательности ДНК-гиразы А, мутационные изменения в котором определяют соответствующие аминокслотные замены во взаимодействующих с антибиотиком участках молекулы белка (QRDR), был предварительно определен нами путем поиска участка gyrA буркхольдерий, гомологичного известным QRDR ДНК-гираз, представленных в Genbank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). По результатам анализа аннотированных последовательностей gyrA B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis и известных последовательностей QRDR gyrA нами были подобраны праймеры для амплификации фрагмента гена, включающего предполагаемый QRDR (табл. 6).

Табл. 6. Характеристика олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации фрагмента gyrA видов Burkholderia, предположительно включающего QRDR

Поиск возможных мутационных изменений в предполагаемом QRDR ДНК-гиразы А буркхольдерий включал в себя несколько технологических этапов: амплификацию исследуемого фрагмента гена в ПЦР, анализ конформационного полиморфизма однонитевых цепей ампликонов (SSCP, single strand conformation polymorphism) и отбор вариантов с атипичными SSCP-профилями, секвенирование и сопоставление нуклеотидных последовательностей QRDR исходных штаммов и «кандидатных» мутантных последовательностей.

Изменения в SSCP-профиле QRDR gyrA были обнаружены у мутантных штаммов Pfx^R Caz^R и Ofx^R Caz^R мутантов B. pseudomallei и резистентных к фторхинолонам мутантов B. mallei (рис. 17). Секвенирование QRDR ампликонов из этих штаммов показало наличие единичных и двойных нуклеотидных замен в регионе gyrA 240 - 260 п.н., а трансляция in silico мутантных последовательностей gyrA позволила определить несколько типов аминокислотных замен в QRDR-области фермента (рис. 18).

Рис. 17. ПЦР-SSCP анализ амплифицированных фрагментов QRDR gyrA исходных штаммов и полирезистентных мутантов буркхольдерий. Электрофорез в 10 % полиакриламидном геле. Треки 1 - 9: B. pseudomallei 56770, B. pseudomallei 56770 SMCP, B. pseudomallei 56770 SMPC, B. pseudomallei 56770 SMOC, B. mallei C-5, B. mallei C-5 SMP-150-2, B. mallei C-5 SMP-150-3, B. thailandensis E264, и B. thailandensis E264 SMPC.

Аминокислотная замена Thr83Ile была общей для всех исследованных мутантных штаммов. Замены Gly81Cys и Asp87Tyr были обнаружены только у Pfx^RCaz^R и Ofx^RCaz^R мутантов B. pseudomallei, соответственно. Кроме того, у одного из мутантов B. mallei была выявлена нуклеотидная замена CT в 250 нуклеотидной позиции гена, не приводящая к аминокислотной замене, и классифицированная нами как silence-мутация. Интересно, что описанные в работе Maeda Y. et al., аминокислотные замены QRDR GyrA у резистентных к хинолонам природных изолятов B. glumae также затрагивают позицию 83 последовательности белка (Maeda et al., 2004).

Рис. 18. Нуклеотидные (А) и соответствующие аминокислотные (В) замены в области QRDR ДНК-гиразы А у мутантов буркхольдерий с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам фторхинолонового ряда.

Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют, что мутационные изменения мишеней действия антимикробных соединений (в данном случае, ДНК гиразы А), наряду с активацией систем лекарственного эффлюкса, также вносят свой вклад в формирование наблюдаемых фенотипов множественной антибиотикоустойчивости у B. pseudomallei и B. mallei. Отметим, что сочетание мутаций gyrA и механизмов активного выведения фторхинолонов из клеток неоднократно показано у различных бактериальных патогенов (Chen, Lo, 2003; Dewi et al., 2004; Ricci et al., 2004; Payot et al., 2004).

Детекция интегроноподобных последовательностей в штаммах B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Исследования систем генетического обмена возбудителей мелиоидоза и сапа (Меринова и др., 1990; Меринова и др., 1997; Меринова и др., 1998; Меринова и др., 2000) доказали возможность горизонтального переноса и приобретения данными микроорганизмами R-детерминант в составе мобильных генетических элементов. В настоящей работе определенное внимание было уделено поиску и первичной характеристике интегронов - генетических элементов, способных включать в свой состав индивидуальные генные кассеты (в том числе детерминанты антибиотикорезистентности) по механизму сайт-специфической рекомбинации (Hall, Collis, 1995; Rowe-Magnus, Mazel, 2001; Fluit, Schmitz, 2004; Nogrady et al., 2005).

Для скрининга сходных с интегронами последовательностей B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis был использован ПЦР-анализ с праймерами, специфичными фрагментам гена интегразы IntI1 и фланкирующим последовательностям области вставки генных кассет (Bass et al., 1999). Последующий электрофоретический анализ продуктов реакции показал наличие ампликонов размерами от 100 п.н. до 1200 п.н. у отдельных штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis (рис. 19).

Секвенирование и поиск гомологов в Genbank показали, что продукты амплификации ДНК из штамма B. thailandensis E299 представляют собой фрагменты последовательностей транспозаз/интеграз (рис. 20), а анализ геномных регионов буркхольдерий, имеющих максимальные показатели сходства с секвенированными ампликонами продемонстрировал наличие интегроноподобных структур, включающих ген транспозазы/интегразы и гены различной функциональной направленности, в том числе CDS, аннотированные как детерминанты лекарственной устойчивости (гены эффлюкс-транспортеров MFS и RND типов) (рис. 21).

Рис. 19. (А, В) - Амплификация интегроноподобных последовательностей из штаммов различных видов Burkholderia и гетерологичных микроорганизмов. Обозначения: 1 - штаммы B. pseudomallei; 2 - штаммы B. mallei; 3 - штаммы B. thailandensis; 4 - штаммы B. cepacia; 5 - штаммы P. aeruginosa. (С) - Реамплификация очищенных ампликонов. Обозначения: М - маркерная ДНК (pGEM DNA Marker, Promega); 1 - B. pseudomallei 140; 2, 3, 4, 5 - B. thailandensis Е2996 6, 7 - B. cepacia 25416; 8 - B. cepacia 3189.

Генетическая гетерогенность штаммов B. pseudomallei и родственных видов с различной чувствительностью к антимикробным соединениям. Заключительная часть нашего исследования была посвящена анализу перспектив молекулярного типирования штаммов буркхольдерий с различными спектрами антибиотикорезистентности. Мы апробировали техники типирования, основанные на амплификации полиморфных ДНК с произвольным праймером (RAPD) и ПЦР-анализе с праймером, специфичным консервативному региону интеграз intI1, для дифференциации штаммов B. pseudomallei дикого типа, селекционированных полирезистентных вариантов и транспозонных мутантов со сниженной устойчивостью к отдельным классам антибиотиков.

Типирование с использованием произвольного праймера (рис. 22) показало заметную межвидовую вариабельность RAPD-паттернов и их более консервативный характер у производных того или иного штамма.

Рис. 20. Нуклеотидная последовательность ампликона 640 п.н. B. thailandensis E299 (A) и гомологичные ей последовательности геномов представителей Burkholderiaceae (B).

Рис. 21. Фрагмент генома B. thailandensis E264 (NC_007651), содержащий полностью идентичный секвенированной последовательности ампликона 640 п.н. штамма B. thailandensis E299 участок ДНК (помечен прямоугольником).

Рис. 22. Дендрограмма сходства RAPD-профилей штаммов Burkholderia с различным уровнем устойчивости к антибиотикам.. UPGMA группирование матрицы дистанций несоответствия (dd). Штаммы B. pseudomallei: 1 - 57576 SMP; 2 - 57576 SMO; 3 - 57576 SMPC, 4 - 57576 SMCO; 5 - 57576 SMCP; 6 - 57576 SMRT21; 8 - 56770; 9 - 56770 SMPC; 10 - 56770 SMCP; 11 - 56770 SMOC; 17 - 57576; 18 - 57576 TTM6-1; 19 - 57576 TTM6-3; 20 - 57576 TTM7-1; 21 - 57576 TTM7-2; 22 - 57576 TTM9-1; 23 - 57576 TTM9-2; 24 - 57576 TTM9-3. Штаммы B. thailandensis: 12 - E264; 13 - E264 SMPO. Штаммы B. cepacia: 14 - 25416; 15 - 25416 SMPC.

Транспозонные мутанты B. pseudomallei со сниженной резистентностью к фторхинолонам и цефтазидиму были распределены в три достаточно обособленные друг от друга группы сходства RAPD-профилей, что может свидетельствовать о сходном характере генетических перестроек, вызванных инсерциями Tn5, внутри каждой из групп сходства. Интересно также, что две отдельные группы сходства RAPD-паттернов были образованы штаммами B. pseudomallei с преобладающей резистентностью к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму.

Также удалось обнаружить заметные различия в фингерпринтах содержащих интегразу фрагментов ДНК (рис. 23). Два из трех проанализированных мутантов B. pseudomallei, высокорезистентных к CAZ, PFX и OFX, оказались фактически идентичны по спектру ампликонов, тогда как один мутантный штамм оказался более сходен с исходным. Как и в случае RAPD-анализа, различные виды буркхольдерий формировали достаточно обособленные группы сходства ДНК-профилей. Полученные результаты, по нашему мнению, говорят о заметных геномных перестройках при развитии различных типов резистентности у B. pseudomallei и близкородственных бактерий, и, что может быть важно для дальнейшей разработки молекулярной эпидемиологии данных бактерий, свидетельствуют о возможности определения дополнительных молекулярных маркеров, ассоциированных с различными типами лекарственной резистентности.

Рис. 23. Дендрограмма сходства интегразосодержащих ДНК-профилей. UPGMA группирование матрицы дистанций несоответствия (dd). Штаммы B. pseudomallei: 2 - 57576; 3 - 57576 SMCO; 4 - 56770; 5 - 56770 SMCP; 6 - 56770 SMOC. Штаммы B. thailandensis: 7 - E264; 8 - E264 SMPO. Штаммы B. cepacia: 9 - 25416; 10 - 25416 SMPC.

Таким образом, настоящие исследования по интересующей нас проблеме позволили идентифицировать основные группы молекулярных механизмов, ответственных за реализацию множественной устойчивости бактерий группы «pseudomallei» к антимикробным соединениям и разработать комплекс методических подходов для их дальнейшего более детального анализа. На основе модельной системы, включающей штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам, а также технологий молекулярно-генетического анализа факторов резистентности проведено комплексное исследование механизмов множественной устойчивости патогенных буркхольдерий и показаны принципиальное участие в формировании резистентности множественного типа у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis процессов снижения проницаемости клеточных мембран, экспрессии систем активного выведения ингибиторов из клеток и мутационных изменений генов внутриклеточных мишеней антимикробных соединений, а также особенности развития полирезистентности, заключающиеся в сочетанном проявлении перечисленных механизмов.

Все это дает возможность наметить ближайшие перспективы работ в области функциональной и сравнительной геномики лекарственной резистентности патогенных буркхольдерий - изучение механизмов индукции и регуляции экспрессии отдельных эффлюкс-транспортеров, получение коллекций мутантов буркхольдерий с инактивированными генами лекарственного эффлюкса, сравнительный анализ экспрессии белков клеточных мембран штаммов с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием техники протеомных исследований, разработка систем анализа экспрессии детерминант антибиотикорезистентности на основе технологии cDNA-чипов.

Выводы

1. На основе модельной системы, включающей штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам, а также технологии молекулярно-генетического анализа факторов резистентности проведено комплексное исследование механизмов множественной устойчивости патогенных буркхольдерий. Показано сочетанное участие в формировании резистентности множественного типа у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis процессов снижения проницаемости клеточных мембран, экспрессии систем активного выведения ингибиторов из клеток и мутационных изменений генов внутриклеточных мишеней антимикробных соединений.

2. Развитие у штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis высокого уровня устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп сопровождается приобретением резистентности к антимикробным соединениям других классов (-лактамам, аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколу), ряду неспецифических ингибиторов (жирным кислотам, солям желчных кислот, детергентам, красителям), а также заметным снижением вирулентности полирезистентных вариантов для экспериментальных животных.

3. Установлено, что развитие лекарственной резистентности множественного типа у исследуемых видов буркхольдерий сопровождается существенными изменениями белкового состава мембран, являющимися показателем модификации их транспортных функций и проницаемости. В сравнении с исходными штаммами, у полирезистентных производных B. pseudomallei и B. thailandensis наблюдалась гиперпродукция мажорных мембранных белков 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и значительное снижение синтеза протеинов 45 и 49 kDa. Резистентные мутанты B. mallei характеризовались снижением продукции группы мембранных белков 21, 42, 45 и 70 - 100 kDa.

4. Показано, что инсерционные мутанты B. pseudomallei Bop^- с дефектами в продукции мембранных протеинов 21, 27, 48, 71, 110 kDa, индуцированными включением в хромосому транспозонов Tn9 и Тn5, отличаются снижением устойчивости к препаратам цефалоспоринового и фторхинолонового ряда. Инсерционный мутант с фенотипом Caz^S Pfx^R Ofx^R, чувствительный к цефтазидиму, полученный на основе полирезистентного варианта B. pseudomallei 57576 SMCP Caz^R Pfx^R Ofx^R, демонстрирует связь утраты устойчивости к антибиотику с изменением в продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa.

5. Структурные модификации ЛПС, выражающиеся в вариации высокомолекулярных ( > 150 kDa) и редукции низкомолекулярных (25 kDa и менее) фрагментов биополимера, снижение уровня продукции экзополисахарида и секреции экстрацеллюлярных ферментов с липазной, лецитиназной и протеолитической активностью указывают на комплексные адаптивные перестройки проницаемости клеточной оболочки и систем мембранного транспорта при развитии у буркхольдерий высокого уровня устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп.

6. Выявлены существенные различия в скорости накопления и количестве аккумулированного клетками штамма дикого типа и полирезистентных мутантов B. pseudomallei бромистого этидия (стуктурного аналога фторхинолоновых соединений). Установлено, что мутантные штаммы с преобладающей устойчивостью к препаратам фторхинолоновой группы обладают отчетливо меньшей проницаемостью мембран для ингибитора и максимальной скоростью его эффлюкса. Интенсивность выведения ингибитора из клеток возбудителя возрастает при повышении температуры инкубации и наличии в среде соединения - источника углерода, что свидетельствует об энергозависимом характере изученных процессов.

7. Установлено, что в присутствии верапамила - блокатора мембранного транспорта наблюдается снижение устойчивости исходных и мутантных штаммов B. pseudomallei к антимикробным соединениям фторхинолоновой группы, отдельным -лактамам, аминогликозидам, макролидам и хлорамфениколу, что подтверждает значимость механизмов эффлюкса в формировании множественной антибиотикорезистентности у возбудителя мелиоидоза.

8. При проведении сравнительного анализа in silico нуклеотидных последовательностей известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, выполненного с использованием биоинформационного программного обеспечения на основе опубликованных в Genbank последовательностей геномов буркхольдерий, были обозначены группы детерминант множественной резистентности и подобраны олигонуклеотидные праймеры для амплификации консервативных фрагментов генов лекарственных транспортеров MFS (QacA/EmrB), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF) групп.

9. На основе анализа дифференциально экспрессирующихся последовательностей эффлюкс-транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в неселектвных условиях и на средах с субъингибирующими концентрациями антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов, установлено участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei». Повышенный конститутивный уровень экспрессии QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-транспортеров у части полирезистентных мутантов позволяет предполагать наличие генетически закрепленных нарушениий в механизмах регуляции данных последовательностей.

10. Проведенное клонирование в E. coli на векторе pUC19 AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров возбудителя мелиоидоза и анализ их экспрессии в рекомбинантных клонах выявили участие этих детерминант в развитии резистентности у B. pseudomallei к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп.

11. Установлено, что полирезистентные мутанты B. pseudomallei и B. mallei с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам фторхинолонового ряда несут точечные мутации в QRDR ДНК-гиразы А, приводящие к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка. Показано, что замена Thr83Ile является общей для всех исследованных мутантных штаммов, тогда как замены Gly81Cys и Asp87Tyr обнаружены только у Pfx^RCaz^R и Ofx^RCaz^R мутантов B. pseudomallei. Нуклеотидная замена CT в позиции 250 gyrA, выявленная у одного из мутантов B. mallei, не приводит к аминокислотной замене в последовательности белка и может быть классифицирована как silence-мутация.

12. В результате ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, последующего секвенирования ампликонов и исследования гомологичных фрагментов хромосом буркхольдерий in silico установлено, что геномы штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis несут участки, структурно сходные с интегронами и представленные генами транспозаз/интеграз и кодирующими последовательностями детерминант лекарственной устойчивости - эффлюкс-транспортеров MFS и RND семейств. Наличие интегроноподобных структур свидетельствует о потенциальной возможности формирования множественной устойчивости у данных микроорганизмов за счет аккумуляции и горизонтального переноса R-детерминант различных типов.

буркхольдерия антибактериальный полирезистентность

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Антонов В.А., Меринова Л.К., Замараев В.С, Викторов Д.В. Анализ фенотипических свойств штаммов возбудителя сапа, несущих криптические плазмиды Pseudomonas pseudomallei // Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997, Саратов, 1997. - C.6-7

2. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Плеханова Н.Г. Особенности белкового состава наружных мембран штаммов Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei различной вирулентности // Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997, Саратов, 1997. - С.19-20

3. Попов С.Ф., Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Вязьмина Т.Н., Бакулина Н.Г., Курилов В.Я. Изучение состава капсульного вещества у возбудителей сапа и мелиоидоза // Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997, Саратов, 1997. - С.104-105.

4. Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Викторов Д.В., Тихонов Н.Г., Коваленко А.А Патент на изобретение № 96111507 «Способ получения протективного гликопротеина возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован Российским агентством по патентам и товарным знакам 27.04.1998)

5. Тихонов Н.Г., Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Плеханова Н.Г., Попов С.Ф. Внеклеточные и поверхностные антигены Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei как потенциальные факторы вирулентности // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология.Ветеринария. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С.191

6. Антонов В..А., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Замараев В.С., Захарова И.Б., Ткаченко Г.А. Влияние R-плазмид на отдельные фенотипические признаки штаммов возбудителя сапа и мелиоидоза // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология.Ветеринария. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - C.48-49

7. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Плеханова Н.Г., Меринова О.А., Попов С.Ф. Физико-химические и иммунобиологические свойства белков наружной мембраны Burkholderia pseudomallei // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология.Ветеринария. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С.67-68

8. Захарова И.Б., Викторов Д.В., Замараев В.С., Попов С.Ф. Анализ продуктов экспрессии фрагментов плазмиды pPM1 возбудителя мелиоидоза, клонированных в E.coli // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология.Ветеринария. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С.100-101

9. Ilyukhin V.I., Merinova L.K., Kislichkin N.N., Tikhonov N.G., Farber S.M., Viktorov D.V., Denissov I.I. Specific and crossed immunity to melioidosis // The 2th International Congress on Melioidosis Proceeding. - Bangkok, 1998. - P. 112

10. Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Тихонов Н.Г., Плеханова Н.Г., Попов С.Ф., Меринова О.А. Факторы вирулентности Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei // Проблемы особо опасных инфекций. - 1999. - вып. 79. - С.175-180.

11. Плеханова Н.Г., Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Демедюк Е.А. Экзопротеазы Burkholderia pseudomallei и их значение в патогенезе мелиоидозной инфекции // Проблемы особо опасных инфекций. - 1999. - вып. 79. - С. 181-186

12. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Плеханова Н.Г., Попов С.Ф., Меринова О.А. Идентификация и характеристика некоторых компонентов системы мембранного транспорта Burkholderia pseudomallei // Проблемы особо опасных инфекций. - 1999. - вып. 79. - С. 144-148

13. Viktorov D.V., Piven N.N., Zakharova I.B., Antonov V.A. Melioidosis vaccine: some approaches to development // First Global Conference on Vaccines & Immunization Proceeding. - Manchester, 1999. - P. 45-46

14. Денисов И.И., Тихонов Н.Г., Илюхин В.И., Викторов Д.В., Каплиев В. И. О генетической природе факторов патогенности возбудителя мелиоидоза // Волгогр. науч.-исслед. противочум. ин-т. - Волгоград, 1999. - 13 с. - депон. в ВИНИТИ, № 1991-В99

15. Меринова Л.К., Антонов В.А., Замараев В.С., Викторов Д.В. Мобилизация криптических плазмид возбудителя мелиоидоза в гетерологичные виды микроорганизмов // Мол. генет., микробиол., вирусол. - 2000. - № 2. - С. 43-47

16. Viktorov D.V., Seimova I.K., Zakharova I.B., Merinova L.K.. Merinova O.A. Burkholderia pseudomallei adaptive resistance to fluoroquinolones and cephalosporins // Problems on biological and ecological safety. International Conference Proceeding. - Obolensk, 2000. - P. 25-26

17. Антонов В.А., Замараев В.С., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Попов С.Ф. Изучение плазмид патогенных буркхолдерий // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье : сб.науч. тр. под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград: изд. «Принт» ВолГУ, 2000. - С.41-46

18. Илюхин В.И., Кисличкин Н.Н., Тихонов Н.Г., Плеханова Н.Г., Денисов И.И., Кисличкина И., Антонов В.А., Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Фарбер С.М. Перспективы применения Francisella tularensis 15 (LVS) для гетерологичной иммунизации и создания поливалентных рекомбинантных вакцин // // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье : сб.науч. тр. под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград: изд. «Принт» ВолГУ, 2000. - С.100-106

19. Попов С.Ф., Тихонов Н.Г., Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Авророва И.В. Иммунобиологические свойства капсульного вещества Burkholderia pseudomallei // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. - 2000. - № 6. - С.60-64

20. Пивень Н.Н., Рыбкин В. С., Плеханова Н. Г., Жукова С. И., Викторов Д. В., Авророва И. В., Демедюк Е. А., Дрефс Н. М., Попов С. Ф. Иммунотропные и иммуногенные свойства поверхностных и мембранных антигенов Burkholderia pseudomallei // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. - 2001. - №1. - С.29-33

21. Викторов Д.В., Пивень Н.Н. Активный мембранный транспорт и множественная антибиотикорезистентность бактерий // Мол. генет. микробиол. вирусол. - 2001. - № 3. - С.3-8

22. Viktorov D.V., Merinova L.K., Seimova I.K., Zakharova I.B. Burkholderia pseudomallei drug resistance and membrane proteins alterations // The 4^th World Melioidosis Congress Proceeding. - Perth, 2001. - P.60-61

23. Viktorov D.V., Zakharova I.B., Merinova L.K., Seimova I.K. Virulence and stability of Burkholderia pseudomallei spontaneous mutants with multi-drug resistance phenotype // Sci. J. Centr. Nat. Infect. Dis. - Ulaanbaatar, 2001. - P. 75-77

24. Avrorova I.V., Piven N.N., Zhukova S.I., Khrapova N.P.,Victorov D.V. Immunoreactivity of macroorganism by vaccination with Burkholderia pseudomallei protective antigens // Sci. J. Centr. Nat. Infect. Dis. - Ulaanbaatar, 2001. - P.17-20

25. Захарова И.Б., Викторов Д.В., Замараев В.С. Клонирование и экспрессия 7.55 т.п.н. KpnI фрагмента плазмиды pPM1 Burkholderia pseudomallei в Escherichia coli // Мол. генет. микробиол. вирусол. - 2002. - №2. - С.19-22

26. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Захарова И.Б., Меринова О.А., Попов С.Ф. Патент на изобретение № 2208445 «Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.07.2003)