Морфо-физиологические аспекты гуморальных и клеточных механизмов неспецифической резистентности организма

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА

03.00.13 - физиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

Плескова Светлана Николаевна

Нижний Новгород 2009

Список используемых сокращений

АПАК - альтернативный путь активации комплемента

АСМ - атомно-силовая микроскопия

АФК - активные формы кислорода

БЭ - буккальные эпителиоциты

ЗФР - забуференный физиологический раствор

КОЕ - колоние-образующие единицы

ЛЗХЛ -люминолзависимая хемилюминесценция

ЛПС - липополисахарид

МАК - мембраноатакующий комплекс

ПМЯЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты

СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия

СХЛ - спонтанная хемилюминесценция

ФИТЦ - флюоресцеина изотиоцианат

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭГТА - этиленгликоль тетраацетат

ЭДТА - этилендиамин тетраацетат

1. Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Неспецифическая резистентность является одним из центральных механизмов, поддерживающих физиологическую целостность организма (Ярилин, 1999). Это система «экстренного реагирования», подключающаяся к элиминации дестабилизирующих факторов до активации специфических компонентов защиты. Тем самым достигается выигрыш во времени, предоставляющий организму дополнительную возможность к настройке и реализации мощных адаптивных факторов. Этим, по-видимому, и обусловлена разноплановость и разнонаправленность реакций в системе неспецифической резистентности. Интерес к тонким молекулярным механизмам распознавания и взаимодействия между патогенами и системами защиты заставляет рассматривать эти механизмы на клеточном и гуморальном уровне. Традиционно принято делить совокупность реакций защиты на местный и системный иммунитет.

В реализации защитных функций местного иммунитета полости рта большая роль принадлежит лизоциму слюны - фактору, способному к прямому бактериолизу грамположительных микроорганизмов (Дорофейчук, 1968). Общепризнанность этой роли приводит к поиску практического приложения тестов по определению активности фермента. Среди клеточных факторов местного иммунитета можно выделить транзиторные и стационарные. В качестве стационарного клеточного фактора местного иммунитета полости рта необходимо особо отметить буккальные эпителиоциты - клетки на арене которых реализуются комплексные взаимодействия между представителями нормо- и патофлоры и осуществляются процессы реализации всего спектра защитных механизмов в системе неспецифической резистентности (Маянский и др., 1987).

С переходом на системный уровень число гомеостатических факторов значительно возрастает. Многие из них находятся в тесной кооперации и образуют целостные системы и сети, например, система альтернативного каскада комплемента, система лектинового пути комплемента, цитокиновая сеть. Последние годы ознаменовались всплеском интереса к функционированию системы альтернативного каскада комплемента, поскольку она способна не только регулировать реакции гуморально-клеточной кооперации, но и принимать непосредственное участие в поддержании гомеостатического баланса. Однако некоторые вопросы остаются практически не освещенными, в частности, в литературе мало сведений о степени активации системы альтернативного каскада в зависимости от вида и штамма микроорганизма.

Не меньшее значение принадлежит и факторам местного иммунитета, которые не только выполняют гомеостатическую и элиминационную роль, но и могут служить высокоинформативными индикаторами нарушений местного гомеостаза. Среди клеточных факторов системы неспецифической резистентности особую роль играют нейтрофильные гранулоциты (Маянский, 1989). Во-первых, эта фракция является превалирующей среди всех лейкоцитов крови, во-вторых, клетки находится в крови в преформированном состоянии, т.е. состоянии полной «боеготовности». В-третьих, нейтрофил является в определенном смысле убиквитарным для организма: он обнаруживается практически во всех тканях и органах в процессе острого воспаления. Экстренный и экстремальный характер деятельности нейтрофила нашел отражение и в особенностях клеточной морфологии.

Появившиеся в последние годы новые методы исследований позволяют не ограничиваться только визуализацией клеточных и тканевых объектов, или только регистрацией биохимических сдвигов в живых системах, но сочетают в себе морфологические и функциональные тесты (Dufrкne Y.F., 2001). Появление новой методологии особенно важно в настоящее время, поскольку возрастающая абиогенная и биогенная нагрузка на организм человека делает чрезвычайно актуальной оценку границ резистентности и адаптационных возможностей различных систем органов, в особенности тех, центральной задачей которых является обеспечение гомеостатического баланса всего организма. Указанные положения и явились основанием для наших исследований.

Цель исследования: изучить функциональную и морфологическую многовариантность реактивности местных и системных факторов врожденного иммунитета в ответ на биогенные и абиогенные воздействия.

Задачи исследования:

1. выявить вариабельность реактивности местного клеточного иммунитета в системе «буккальные эпителиоциты - микрофлора» и рассмотреть преимущества разных микроскопических методов в определении параметров колонизационной резистентности;

2. исследовать различия в функционировании лизоцима как гуморального неспецифического фактора местного иммунитета у здоровых детей и детей, страдающих кариесом и оценить возможности определения активности лизоцима слюны для использования в качестве прогностического критерия тяжести кариозного процесса;

3. изучить степень активации системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с разными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий и рассмотреть возможные причины вариабельности АПАК-реактивности;

4. разработать методику витального исследования нейтрофилов методом сканирующей зондовой микроскопии, выявить морфо-функциональные особенности клеток в зависимости от используемого буфера, сравнить морфологические параметры клеток, при использовании разных методов фиксации и изучить ригидность мембран нативных нейтрофильных гранулоцитов и нейтрофилов, находящихся под воздействием биотических и абиотических факторов;

5. определить структурные и физиологические особенности работы фагоцитов в системе «яд-гепарин»;

6. исследовать морфо-физиологические особенности нейтрофильных гранулоцитов под воздействием различных физико-химических факторов и охарактеризовать разновариантность реактивности нейтрофилов.

Научная новизна работы.

Впервые продемонстрировано, что поверхность буккальных эпителиоцитов не однородна по механическим свойствам, и на ее поверхности могут выявляться «мягкие» участки.

Впервые выявлено, что межштаммовая вариабельность бактерий в системе альтернативного пути активации комплемента выражена в большей степени, чем межвидовая. Возможность функциональной активности в качестве только опсонического или опсонического и мембранолитического фактора показана для АПАК на разных штаммах Proteus.

Впервые в России разработана оригинальная методика витального наблюдения за клетками в режиме реального времени методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) без использования фиксации. Показано, что механическое воздействие зонда не оказывает повреждающего действия на живую клетку. Впервые в мире определена ригидность мембраны нейтрофильного гранулоцита.

Впервые продемонстрирована проапоптотическая активность липополисахарида в отношении нейтрофильных гранулоцитов при совместном механо-биохимическом воздействии и продемонстрировано поэтапное отделение «апоптозо-подобных» телец от клеток в режиме реального времени. При воздействии пероксида водорода зарегистрирован новый механизм клеточной гибели - «мумификация» нейтрофила, связанная с повышением механической прочности клетки. Токсичность квантовых точек (CdSe/ZnS-МУК) впервые продемонстрирована на нейтрофилах и показан феномен разделения нейтрофилов по функциональной активности на три субпопуляции. Впервые продемонстрировано, что фагоциты в функционально активном состоянии более чувствительны к токсическому действию яда.

Теоретическая и практическая значимость работы. В представленной работе суммируются данные о многовариантности и разнонаправленности проявлений неспецифической защиты, которые отражаются в своеобразии морфологии и неоднозначности физиологического поведения различных факторов на клеточном и гуморальном уровне. Формулируется концепция о том, что хотя в ответ на альтерацию под давлением естественного отбора в системе неспецифической резистентности эволюция отобрала наиболее быстрые, эффективные и наименее энергоемкие реакции, тем не менее, спектр реализации этих реакций может быть достаточно широким. Для реакций неспецифической резистентности узкое нацеливание является не приемлемым, поскольку элиминирующая функция первой линии защиты должна срабатывать и в случае атаки на организм ранее не известных альтерирующих факторов. В таких условиях только наличие выбора варианта и силы ответа на повреждение поможет удержать организм на грани гомеостатического баланса.

В представленной работе показана межштаммовая вариабельность для альтернативного пути активации комплемента, продемонстрированы различия морфо-функциональных характеристик нейтрофильных гранулоцитов в реакциях как с традиционными альтерирующими факторами (липополисахарид, пчелиный яд, пероксид водорода), так и с недавно появившимися продуктами нанотехнологии - квантовыми точками. В случае превышения компенсаторного порога происходит гибель клеток системы неспецифической резистентности. В зависимости от характера и дозы биогенных и абиогенных дестабилизаторов отмечена вариабельность клеточной гибели, в частности, нами зафиксированы три варианта гибели нейтрофильных гранулоцитов: некроз, апоптоз, «мумификация».

Методы атомно-силовой микроскопии и сканирующей лазерной микроскопии были адаптированы для биологических исследований. Применение новой методологии позволило решить ряд практических задач: создать модель для оценки упруго-механических свойств клеток и на ее основе определить значения ригидности нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов, выявить токсическую активность квантовых точек (наноматериала, перспективного для биофотоники) и определить степень повреждения клеток при действии традиционного биологического токсиканта - пчелиного яда. Важными практическими приложениями работы являются выводы о протективной активности гепарина в отношении малых доз пчелиного яда и доказательство перспективности использования теста на активность лизоцима слюны в качестве прогностического критерия для оценки степени тяжести кариозного процесса у детей. Полученные теоретические знания дополнили курсы «Физиология человека», «Биомедицинские нанотехнологии», «Общая биотехнология», читаемые автором.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование режима микротвердости в методе сканирующей зондовой микроскопии выявляет наличие мягких областей на поверхности буккальных эпителиоцитов некоторых доноров. Но эти области не являются результатом контаминации микоплазмами и хламидиями.

2. Функциональная активность системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с бактериями проявляется неодинаково. Межштаммовая вариабельность более выражена, чем межвидовая. Возможна реализация только опсонической или опсонической и литической функций альтернативного каскада комплемента в отношении бактерий рода Proteus.

3. Исследование активности лизоцима слюны выявило различие в активности фермента у здоровых детей и детей, страдающих кариесом.

4. Метод СЗМ позволяет исследовать изменения морфологии нейтрофильных гранулоцитов in vitro в режиме реального времени, а исследование фиксированных препаратов методом СЗМ не требует длительной предварительной подготовки образцов, но искажает морфологические параметры (объем и высоту) клеток.

5. В процессе фагоцитоза нейтрофильными гранулоцитами образование псевдоподий и активация респираторного взрыва являются дискретными, разобщенными во времени процессами.

6. Ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов составляет 2,1 0,7 кПа при измерении методом СЗМ и расчете модуля Юнга.

7. Нейтрофильные гранулоциты реагируют однотипной реакцией набухания на значительное механическое давление, на изменения рН среды и на внесение некоторых биохимических агентов (липополисахарида). Наблюдается периодическое колебание параметров клетки (изменения высоты и объема) и механических свойств (ригидности клеточной мембраны). Гибель клеток под влиянием разных токсических агентов (липополисахарид, квантовые точки, пчелиный яд, экзогенный пероксид водорода в токсической концентрации) реализуется по разным механизмам, но всегда сопровождается резким падением респираторной активности нейтрофильных гранулоцитов.

8. Функциональные тесты (реакция люминолзависимой хемилюминесценции) в отношении исследования токсической активности пчелиного яда являются более чувствительными, чем морфологические. Угнетение респираторного взрыва происходит быстрее в том случае, если клетка активирована. И морфологические и функциональные тесты свидетельствуют о наличии у гепарина протективной активности в отношении малых доз пчелиного яда (1 - 10 мкг/мл).

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены: на 4 сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 1999), на 5 сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 2000), на 5 Международной конференции по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000» (г. Москва, 2000), на II Всероссийском симпозиуме «Хроническое воспаление» (г. Новосибирск, 2000), на Международном «Workshop Scanning Probe Microscopy» (г. Нижний Новгород, 2001), на Международном «Workshop Scanning Probe Microscopy» (г. Нижний Новгород - Казань, 2004), на Международном EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology (г. Оейраш, Португалия, 2004), на научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2004), на IV сессии научной молодежной школы-семинара «Промышленная безопасность и экология» (г. Саров, 2004), на международном форуме NSTI-Nanotech 2005 (г. Анахейм, США, 2005), на Международном FEBS-конгрессе «Molecules in Health and Diseases» (г. Стамбул, Турция, 2006), на международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics» (г. Нижний Новгород - Москва, 2007), на II Международном съезде общества цитологов (г. Санкт-Петербург, 2007), на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), на 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008), на Международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (г. Москва, 2008), X Международном форуме «Высокие технологии XXI века» (г. Москва, 2009).

2. Материалы и методы исследования

В работе было использовано 5 штаммов бактерий Staphylococcus aureus, 4 штамма S. epidermidis, 3 штамма Proteus vulgaris и 3 штамма P. mirabilis и штамм гриба Candida albicans 601 из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии Нижегородской государственной медицинской академии, штаммы протея выделены на базе клинической инфекционной больницы №2. Для исследования активности лизоцима использовали тест-культуру Micrococcus lisodeicticus, предоставленную Нижегородским НИИ детской гастроэнтерологии.

Исследования проведены на нейтрофилах, выделенных из венозной крови здоровых доноров (500 человек). Для изучения системы комплемента использовался пул сывороток здоровых доноров (в общей сложности 1250 человек). Для исследования активности лизоцима слюны использована ротовая жидкость 9 здоровых детей и 57 детей, с разной интенсивностью кариозного процесса. В исследовании колонизационной резистентности буккальных эпителиоцитов использованы клетки 25 доноров (из них клетки 15 доноров изучались методом сканирующей зондовой микроскопии). Для исследования перитонеальных макрофагов было взято 15 нелинейных мышей массой 20-22 г.

Определение АПАК - реактивности штаммов

Термин АПАК - реактивность отражает способность альтернативного пути активации комплемента подключаться к элиминации бактерий. Определение этого критерия проводили, используя оригинальную методику инактивирования сыворотки бактериями с использованием в качестве индикатора активности штаммов реакцию C3b - зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса. Принцип метода заключается в способности декстранов (сефадекса) активировать комплемент по альтернативному пути. Сефадекс G50, Fine взвешивали в ЗФР и инкубировали на водяной бане (100С, 60 мин). После трехкратного отмывания ЗФР гранулы ресуспендировали в растворе Хенкса (Маянский и др., 1991). Взвесь бактерий смешивали в равных объемах с пулом сывороток здоровых доноров. В контроле вместо взвеси микроорганизмов использовали ЗФР. Для исключения активации комплемента по классическому пути в систему добавляли ЭГТА - MgCl₂. Пробы инкубировали (37С, 60 мин), после чего бактерии осаждали центрифугированием (800g, 10 мин), а сыворотку использовали для изучения остаточной активности АПАК. Показатели АПАК - реактивности выражали в процентах по формуле:

(1 (N_опыт/ N _{контроль})) х 100% ,

где N _опыт и N _{контроль} - число позитивных гранул в опытной и контрольной пробах.

Получение липополисахарида из бактерий рода Proteus

Использовали метод экстракции ЛПС из бактерий ЭДТА (Григорьева и др., 1998; Live, Morrison, 1972).

Люминолзависимая хемилюминесценция

Взвесь нейтрофилов в среде Хенкса (0,5 * 10⁶ кл/мл) смешивали с 0,1 мл раствора люминола (Невмятуллин и др., 1987) и выдерживали 15 мин в жидкостно-стинциляционном счетчике «Бета-1» (КПО, «Медаппаратура», Киев). После регистрации спонтанной хемилюминесценции в каждый флакон вносили по 0,05 - 0,2 мл стимулятора.

Выделение нейтрофильных гранулоцитов

Кровь здоровых доноров стабилизировали гепарином (50 ед/мл) и разводили ЗФР в соотношении 1:1, наслаивали на двойной градиент фиколла-верографина и центрифугировали (200g, 45 мин). Нейтрофильное кольцо выделяли и дважды отмывали ЗФР (Подосинников и др., 1981). Остаточные эритроциты лизировали холодным изотоническим раствором NH₄Cl (12 мин, 0°С). Взвесь нейтрофилов отмывали от гемолизата ЗФР.

Получение буккальных эпителиоцитов

Забор буккального эпителия проводили с внутренней поверхности щеки от здоровых доноров в возрасте 20 - 35 лет. Клетки отмывали ЗФР дважды (40g, 5 мин), к осадку добавляли ЗФР, доводя концентрацию клеток до 10⁶ кл/мл. Полученную взвесь помещали на предметное стекло, готовили мазок и фиксировали метанолом (10 мин), затем красили азуром А (1%, 30 сек). Подсчитывали колонизацию 100 эпителиоцитов, рассчитывали число микробных клеток на один эпителиоцит (Маянский и др., 1987).

Приготовление мазков-отпечатков

Предметные стекла прикладывали к внутренней поверхности щеки, мазки высушивали на воздухе, фиксировали метанолом 10 мин и отмывали дистиллированной водой (Быкова и др., 1987).

Определение активности лизоцима слюны нефелометрически

Учитывали изменение коэффициента светопропускания микробной взвеси тест-культуры Micrococcus lisodeicticus под влиянием лизоцима по сравнению с показателем исходной микробной взвеси (Дорофейчук, 1968). Активность фермента определяли в процентах.

Прямая флюоресценция для выявления ДНК

Мазки окрашивали раствором метиленового зеленого (18-20°С, 30 мин), отмывали, высушивали и окрашивали Hoechst 33258 («Hoechst», USA), смешивали с красителем Гимзе в конечной концентрации (1 мг/мл, рН 7,2). Мазки микроскопировали под масляной иммерсией на люминесцентном микроскопе «Leica» («Microsystems Wetzlar GmbH», Германия) при л= 360 - 390 нм (Староверова, 2003).

Реакция иммунофлюоресценции с применением антител, меченных флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ)

На фиксированный мазок наносили 30 мкл раствора антитела-ФИТЦ, инкубировали во влажной камере (37°С, 20 мин). Не связавшиеся антитела для устранения неспецифического свечения смывали, препараты высушивали (18-20°С, 30 мин). Микроскопировали под масляной иммерсией с увеличением х 560 (ОАО «ЛОМО», Санкт-Петербург).

Исследования методом сканирующей зондовой микроскопии

Использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver BIO NT-MDT (Зеленоград), зонды с жесткостью 0,3 N/m, радиус закругления кончика зонда составлял 50 nm. Фиксированные препараты (способ сканирования в воздушной фазе) и живые клетки, находящиеся в растворе Хенкса (сканирование в водной фазе) исследовались как в контактном, так и в полуконтактном режимах.

Использование спектроскопии для определения ригидности клеточных мембран

Для оценки ригидности мембран использовали режим спектроскопии. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца (Hassan et al., 1998; Henderson, H. Oberleithner, 2000).

Исследование методом санирующей лазерной микроскопии

Клетки в витальном состоянии (жизнеспособность по трипановому тесту 99 %) в растворе Хенкса вносились в жидкостную ячейку и поддерживались в ней при 37° С. После проведения контроля, в систему добавляли квантовые точки.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили в пакетах Origin 5,0 Server и Bopstatistics 4.03 по общепринятой методике (Гланц, 1998). Рассчитывали выборочную среднюю и стандартное отклонение. Статистически значимыми различия между группами признавались, если р<0,05.

3. Результаты исследования и обсуждение

Для оценки морфо-функциональных изменений неспецифической резистентности исследовали факторы местного и системного иммунитета. Определялась их реактивность в ответ на внешнее раздражение и степень толерантности к нему. Первой линией обороны на пути антигена выступают факторы местного иммунитета. Гомеостатические процессы полости рта реализуются благодаря барьерной функции буккального эпителия, колонизационной резистентности, защитными свойствами ротовой жидкости (Боровский, Леонтьев, 1991). Лишь в случае несостоятельности этих факторов или в случае наличия у антигена мощного патогенного потенциала происходит инвазия альтерирующего агента в глубокие ткани организма. В этом случае подключается более мощный механизм стабилизации гомеостаза - системный врожденный иммунитет, важнейшим гуморальным фактором которого является система комплемента, а клеточным - нейтрофильные гранулоциты.

4. Особенности морфологии и колонизационной резистентности буккальных эпителиоцитов у разных групп доноров

Производилась оценка возможности визуализации микробного пейзажа буккальных эпителицитов (БЭ) методом СЗМ. Результаты сканирования продемонстрировали выявление на поверхности БЭ представителей нормальной микрофлоры (преимущественно стрептококков). Однако помимо объективности, СЗМ не имеет существенных преимуществ перед световой микроскопией в оценке естественной колонизации. Это объясняется тем, что поверхность клеток имеет собственную ворсинчатую структуру, которая не видна при использовании световой микроскопии, но четко выявляется при исследовании топографии зондом. При этом ворсинки клеток частично маскируют цепочки стрептококка на поверхности БЭ. Характер, величина и расположение ворсинок у доноров демонстрировали выраженную вариабельность.

Интересные результаты получены при использовании режима микротвердости (режим распределения твердо-упругих участков по поверхности клеток, где «мягкие» структуры выглядят более темными). У троих доноров (из 15) на апикальной поверхности выявлены более мягкие по сравнению с остальной поверхностью участки мембраны клетки, при этом колонизационная резистентность соответствовала нормальному состоянию полости рта (20 - 50 бакт/эпителиоцит). Размеры мягких участков варьировали от 0,1 мкм до 1,5 мкм. Выделенные области не имели соответствия структурам на топографическом изображении БЭ (рис. 1). Согласно исследованиям Борхсениус С.Н. и др. (2002) может наблюдаться контаминация клеток микоплазмами. Размеры микоплазм (около 0,3 мкм) попадают в диапазон выявленных «мягких» областей. Для того чтобы определить возможность микоплазменной, хламидиальной или вирусной контаминации проводилось окрашивание БЭ Hoechst 33258. Однако у всех исследуемых доноров была выявлена экстрануклеарная ДНК на поверхности клеток, поскольку Hoechst 33258 окрашивает любую ДНК, в том числе и ДНК микрофлоры. Поэтому для окончательного решения вопроса о контаминации микоплазмами и/или хламидиями клетки обрабатывали специфическими антителами, меченными ФИТЦ к микоплазмам и хламидиям, колонизирующим БЭ. Во всех препаратах не наблюдалось специфического свечения, характерного для ФИТЦ, что доказывает отсутствие микоплазменной и хламидийной контаминации. Одному из доноров была проведена ПЦР-диагностика, которая также исключила наличие микоплазм и хламидий.

Таким образом, применение сканирующей зондовой микроскопии позволяет проводить исследование морфологии БЭ с исключительно высоким разрешением, а использование режима микротвердости позволяет выявить мягкие области. Их образование не является результатом контаминации микоплазмами и/или хламидиями.

Рис. 1 Мягкие области на поверхности БЭ (темные фрагменты), полученные в режиме микротвердости: 1 (а), 2 (а) - поверхностная топография БЭ двух доноров, 1 (б), 2 (б) - сканы БЭ, полученные в режиме микротвердости

В работе Домарадского И.В. и др. (2002) постулируется наличие феномена транслокации бактериальных клеток через клетки эпителия: когда БЭ принуждаются к фагоцитозу, поскольку не являются профессиональными фагоцитами. Домарадский И.В. и др. (2002) приводят данные о том, что для БЭ характерен незавершенный фагоцитоз, приводящий к повреждению клеток и облегчающий транслокацию бактерий. Вероятнее всего зоны такого повреждения и были выявлены в режиме распределения микротвердости.

5. Функциональная активность лизоцима слюны

Для исследования лизоцима общепризнанным является нефелометрический метод, разработанный В.Г. Дорофейчук (1968). Была исследована слюна 68 детей в возрасте 6-7 лет. Клиницистами-стоматологами (Лукиных Л.М., Рацюк М.М.) было проведено разделение детей на 4 группы:

· 1 группа: здоровые дети (n=9),

· 2 группа компенсированная форма (n=7), у детей обнаруживался один зуб с начальным кариесом,

· 3 группа субкомпенсированная форма (n=39), у детей обнаруживался один зуб с глубоким кариесом или более одного с начальным;

· 4 группа декомпенсированная форма (n=13) в полости рта детей было более одного зуба с глубоким кариесом.

Показатели активности лизоцима слюны у детей колебались от 21% до 65%: наибольшие колебания наблюдались в субкомпенсированной и декомпенсированной группах, тогда как показатели в группах контроля и компенсированной были относительно равномерны. Показатели активности лизоцима равномерно разделились на два нормальных распределения внутри четвертой (декомпенсированной) группы. В одной подгруппе отмечены очень низкие, в другой - очень высокие показатели активности лизоцима, поэтому в дальнейшем проводили анализ этих подгрупп раздельно: соответственно обозначая их 4а и 4b.

Для оценки статистических различий между пятью независимыми группами (1, 2, 3, 4а и 4b) использовали однофакторный дисперсионный анализ. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Активность лизоцима слюны детей с разной интенсивностью кариозного процесса

Группа детей	Детей в группе (N)	Активность лизоцима слюны, % (Mm)
1 контрольная	9	42, 78 2, 65*
2 компенсированная	7	47, 29 4, 21*
3 субкомпенсированная	38	48, 11 1, 68*
4а декомпенсированная с низкими показателями активности лизоцима	4	34, 0 3, 29*
4b декомпенсированная с высокими показателями активности лизоцима	8	60, 62 0, 99*
F = 6.507 (вну= 61; меж=4) * р0,01

Представленные в таблице показатели активности лизоцима слюны в разных группах различимы, различия статистически значимы. Следовательно, функциональный тест по определению активности лизоцима слюны может быть использован в качестве скринингового метода, сигнализирующего о неблагоприятных изменениях в системе неспецифической резистентности, возникающих в результате развития кариозного процесса. Дети в подгруппе 4а имели очень низкие показатели активности лизоцима, что, по-видимому, свидетельствует об истощении резерва энзима при нарушении целостности тканей зуба. В подгруппе 4b напротив отмечается увеличение активности лизоцима слюны, сопряженное с увеличением тяжести кариозного процесса. Это может объясняться активным вовлечением механизмов резистентности в противостояние с разрушающими факторами, способствующими развитию кариеса, т.е. увеличивая концентрацию фермента, организм пытается компенсировать нарушения гомеостатического баланса полости рта.

Была поставлена задача визуального контроля разрушения клеток М. lysodeicticus под влиянием лизоцима слюны с использованием СЗМ. До взаимодействия с лизоцимом клетки имеют правильную форму, довольно часто образуют агрегаты. Их размеры составляют 1,3 - 1,5 мкм в диаметре, 0,5 - 0,6 мкм в высоту, что является стандартным для микрококка. После инкубации со слюной здорового ребенка при сканировании отмечается практически полное разрушение бактериальных клеток. Каждая из них «обволакивается» слюной и разрушается лизоцимом, что выявляется по уменьшению размеров: диаметр становится равным 0,6 - 0,8 мкм, а высота 0,1- 0,15 мкм. В случае инкубации со слюной ребенка с декомпенсированной формой кариозного процесса (функциональная активность по нефелометрическому тесту около 30 %) отмечается отсутствие лизированных бактерий. Размеры клеток составляют: диаметр 2,6 - 4,6 мкм; высота 0,3 - 0,4 мкм. Таким образом, клетки не разрушаются, а только набухают под влиянием лизоцима, что проявилось увеличением диаметра М. lysodeicticus. Метод СЗМ показывает, что слюна вначале обволакивает каждую клетку, затем под действием лизоцима происходит вначале набухание, а затем лизис М. lysodeicticus.

6. Функциональная активность системы альтернативного каскада комплемента в реакциях с бактериями

В системе АПАК тестировали 5 штаммов Staphylococcus aureus и 4 штамма Staphylococcus epidermidis. Результаты изучения АПАК-реактивности различных штаммов стафилококка суммированы в таблице 2.

Усредненные данные для штаммов золотистого и эпидермального стафилококка были практически одинаковы. В то же время среди изученных культур обнаружено два штамма, активность которых в системе АПАК была существенно ниже, чем у остальных стафилококков (р0,05). Причиной низкой реактивности могло быть экранирование

Таблица 2 АПАК-реактивность золотистого и эпидермального стафилококка

	Штаммы S.aureus	Штаммы S.epidermidis
	7M	86M	66M	CCM 885	1971	51-1	CCM 2124	31O2	178 M
АПАК-реактивность (%)	86,2 2,3 1	82,1 5,3 1	76,3 7,5	61,51,5	39,5 4,7	86,2 5,4 2	76,26,42	64,5 9,5	21,4 3,1
Среднее для вида (М)	69,215,6 %	63,220,4 %

¹ достоверность различий относительно штамма S.aureus 1971 (р0,05);

² достоверность различий относительно штамма S.epidermidis 178М (р0,05).

АПАК-активирующих центров белками. Однако термическая (100?С, 10 мин) и протеолитическая (трипсин) обработка не усиливала эффекта штаммов S. epidermidis 178M и S. aureus 1971 в системе альтернативного каскада. Можно предположить также негативное влияние сиаловых кислот, создающих условия для инактивации С3b. В опытах обработка малоактивных штаммов стафилококка нейраминидазой привела к увеличению АПАК-реактивности S.epidermidis 178M в среднем на 20% (с 20,5 ± 1,5% до обработки до 40,0 ± 1,0% после обработки (р0,05), тогда как активность S. aureus 1971 не менялась (41,5 ± 2,5% и 47,5 ± 0,5% соответственно до и после обработки (р>0,05). Это означает, что сиаловые кислоты действительно могут сглаживать АПАК - реактивность некоторых штаммов стафилококка, но это не единственный фактор, ограничивающий активацию альтернативного каскада.

Параллельно проводилось исследование трех штаммов Proteus mirabilis и трех - Proteus vulgaris. Инкубацию штаммов в системе АПАК проводили в течение 60 мин. Результаты по исследованию АПАК-реактивности двух видов протея были идентичными показателям АПАК-реактивности стафилококка (таблица 3).

Одной из причин «ускользания» штамма P.vulgaris 1418-1 от АПАК могло быть конкурентное экранирование активирующих центров компонентами, препятствующими сборке и стабилизации С3-конвертазы.

Таблица 3 Реактивность штаммов протея в системе АПАК

	Штаммы P.vulgaris	Штаммы P.mirabilis
	1418-1	298	856	1395	210	120
АПАК-реактивность штамма (%)	14,3±0,05	72,2±1,21	69,3±3,21	81,4±7,21	72,6±10,41	70,5±0,51
АПАК-реактивность вида (%)	51,7±25,1	74,5±4,3

¹ достоверность различий относительно штамма P.vulgaris 1418-1.

Наиболее действенным в плане активации альтернативного каскада является липополисахарид грамотрицательных бактерий, поэтому его структурные особенности или экранирование какими либо элементами могло привести к снижению АПАК-реактивности штамма. Поскольку наиболее выраженной антикомплементарной активностью обладают сиаловые кислоты (Edwards et al., 1982; Taylor, 1995), была исследована возможность их участия в снижении АПАК-реактивности P.vulgaris 1418-1. Показатели АПАК-реактивности до обработки нейраминидазой составили 12,0 ± 2,0%, после - увеличились до 32,0 ± 4,0% (р0,05), т.е. достоверно возрастали.

Другая возможность межштаммовой вариабельности может быть обусловлена различиями в строении ЛПС. На устойчивость бактерий к лизису в системе комплемента оказывает влияние длина полисахаридных боковых цепей О-антигена ЛПС: длинноцепочечные ЛПС препятствуют взаимодействию МАК с гидрофобными участками наружной мембраны, предупреждая бактериолиз. Бактерии с ЛПС, слабо связывающим С3 компонент комплемента, практически не фагоцитируются и являются наиболее вирулентными (Кудрина и др., 1997; Klink et. al., 1998).

Пять штаммов протея обладали сходной АПАК-реактивностью (табл. 3), т.е. в течение 60 мин связывали одинаковое количество С3 компонента комплемента. Представлялось интересным выяснение динамики АПАК-реактивности штаммов в зависимости от времени инкубации с сывороткой. Для исследования было отобрано 4 штамма протея, обладающих идентичной АПАК-реактивностью. Динамика расходования компонентов АПАК в течение разного времени инкубации с хелатированной сывороткой (от 10 до 60 мин) у разных штаммов протея происходит не одинаково (рис. 2).

Рис 2. Динамика АПАК-реактивности штаммов протея

Полученные данные могут свидетельствовать о различиях в эффекторных функциях АПАК. Есть свидетельства того, что лишь небольшое число грамотрицательных бактерий лизируются в результате сборки МАК. Поэтому возможность разрушения протея в системе альтернативного каскада оценивали по целому ряду реакций.

Вначале косвенную оценку проводили в реакции стимуляции нейтрофильных гранулоцитов штаммами бактерий, обработанными в системе АПАК. Стимуляцию (подавление) респираторной активности нейтрофилов под действием бактерий оценивали в системе ЛЗХЛ.

Использовали интактные бактерии (в качестве контроля) и бактерии, обработанные в режиме АПАК. Определяли значение пика хемилюминесценции (Iхл) и общей светосуммы (Sхл). Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 Люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов, стимулированных штаммами P. vulgaris и P.mirabilis

Штамм	Контроль	Активация нейтрофилов штаммами, проинкубированными в системе АПАК
		15 минут	30 минут	60 минут
	I хл	S хл	I хл	S хл	I хл	S хл	I хл	S хл
P. mirabilis 120	1,2 0,7	5,5 3,7	19,10,2*	87,40,8*	17,60,8*	70,64,9*	1,50,2	5,60,6
P. mirabilis 210	0,40,2	2,01,0	9,6 1,7*	34,312*	13,4 2,7	46,517,9	10,79,1	60,522,5*
P. vulgaris 296	0,8 0,1	3,30,2	6,61,1*	26,39,1*	4,10,3*	16,44,7*	2,71,0*	10,97,0
P. vulgaris 856	0,7 0,2	3,71,5	25,21,1*	110,40,8*	26,01,9*	110,40,8*	44,716,2	182,484,5

* - различия с контролем статистически значимы (p < 0,05).

Отмечается неоднозначность реакций протея в системе АПАК. Два штамма демонстрировали нарастание активирующей способности в отношении нейтрофильных гранулоцитов при увеличении времени инкубации в системе АПАК. Это связано с тем, что штаммы P. mirabilis 210 и P. vulgaris 856 не разрушаются МАК, а подключение системы альтернативного каскада комплемента к элиминации этих штаммов обусловлено реализацией опсонической функции. Т.е. С3b компонент откладывается на поверхности бактериальных клеток, способствуя усилению фагоцитоза, что и регистрировалось по увеличению респираторной активности нейтрофильных гранулоцитов.

Однако при инкубации нейтрофилов со штаммами P. mirabilis 120 и P. vulgaris 296 обработанными в системе АПАК отмечалась абсолютно другая динамика хемилюминесценции: в результате увеличения времени инкубации с сывороткой штаммы теряют способность активировать респираторную активность нейтрофилов. После 60 мин пребывания в системе АПАК штаммы не способны вызывать респираторный взрыв нейтрофилов, что регистрируется по практически идентичным показателям опытной и контрольной пробы. Мембранолитическая активность АПАК отмечается в работах разных авторов, в основном для бактерий, имеющих особую структуру ЛПС с короткими олигомерными О-специфическими боковыми цепями. В противном случае сорбированный на наружной части внешней мембраны МАК не достигает липидного бислоя и слущивается с поверхности клеточной стенки, сохраняя нативность клетки. Даже в случае фиксации МАК на цитоплазматической мембране образовавшийся канал может быть эндотирован клеткой, что позволяет сохранить ее жизнеспособность (Muller-Eberhard, 1988).

Для доказательства реализации литической стратегий АПАК в отношении двух штаммов бактерий рода Proteus проводилось изучение жизнеспособности после пребывания в системе АПАК. Для этого на среде Плоскирева определялось количество колониеобразующих единиц (КОЕ) до и после инкубации с хелатированной сывороткой. В таблице 5 представлены результаты подсчета КОЕ штаммов Proteus до инкубации с сывороткой (контроль), и после инкубации с ней (опыт).

Таблица 5 Число КОЕ бактерий рода Proteus до и после обработки в системе АПАК

P. vulgaris 296	P. vulgaris 856	P. mirabilis 120	P. mirabilis 210
контр	опыт	контр	опыт	контр	опыт	контр	опыт
344,75± 16,65*	81,21± 8,63*	198,88± 4,83	203,88± 4,98	314,33± 10,71*	114,51± 11,47*	219,86± 28,38	225,75± 18,95

* различия между контролем и опытом статистически значимы (р<0,001).

Представленные результаты доказывают, что в отношении P. vulgaris 296 и P. mirabilis 120 реализуется литическая функция АПАК (число КОЕ снижается в 3 раза), тогда как изменения жизнеспособности P. vulgaris 856 и P. mirabilis 210 не происходит, следовательно, эти штаммы только опсонизируются в системе АПАК, и в отсутствии других эффекторов не могут быть уничтожены.

Представленный результат был подтвержден исследованием морфологии бактериальных клеток методом СЗМ: клетки штаммов P. vulgaris 296 и P. mirabilis 120 набухали и лизировались, а бактерии штаммов P. vulgaris 856 и P. mirabilis 210 сохраняли целостность, но при этом окружались компонентами сыворотки - предположительно белками-опсонинами.

Таким образом, независимые эксперименты по подсчету КОЕ, изучению стимуляции нейтрофилов в ЛЗХЛ и исследованию морфологии бактериальных клеток доказывают реализацию двух стратегий АПАК в отношении грамотрицательных бактерий рода Proteus: лизиса или опсонизации. При этом суммарное расходование С3b компонента комплемента при реализации любого из механизмов в течение 60 мин одинаково.

Различия в активации АПАК у протея обусловлены, прежде всего, особенностями строения клеточной стенки, поэтому исследовали АПАК-реактивность ЛПС, выделенного из 4 изучаемых штаммов. ЛПС тестировался в реакции С3b-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса. Способность активировать комплемент при инкубации в сыворотке практически не отличается у ЛПС трех из четырех изучаемых штаммов и является достаточно низкой: P. vulgaris 296 - 28,7±7,2%; P. vulgaris 856 - 26,2±3,4%; P. mirabilis 120 - 41,5±1,5%, в то время как у ЛПС P. mirabilis 210 способность активировать АПАК была высокой и достигала уровня цельной бактериальной клетки: 80,0±0,9%.

В реакции ЛЗХЛ нейтрофилов стимуляцию клеток проводили ЛПС четырех видов бактерий рода Proteus. Вначале изучалась респираторная активность нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с экстрагированным ЛПС, а затем с ЛПС предварительно проинкубированным в системе АПАК. В качестве позитивного контроля жизнеспособности клеток выступал зимозан. Данные экспериментов суммированы в таблице 6.

Таблица 6 Хемилюминесцентная активность нейтрофилов, стимулированная липополисахаридом (ЛПС) штаммов протея

Стимулятор люминесценции	Индекс стимуляции
	Максимум люминесценции (I мах)	Суммарная светосумма (S)
Зимозан	166,31 ± 26,5	79,21 ± 1,94
ЛПС P. mirabilis 120	3,22 ± 0,62*	2,67 ± 0,51*
ЛПС P. mirabilis 210	1,05 ± 0,08*	1,06 ± 0,03*
ЛПС P. vulgaris 296	10,06 ± 0,83*	5,88 ± 0,05*
ЛПС P. vulgaris 856	3,99 ± 0,24*	2,92 ± 0,32*
ЛПС P. mirabilis 120 + АПАК	1,05 ± 0,06*	0,82 ± 0,13*
ЛПС P. mirabilis 210 + АПАК	1,31 ± 0,01*	0,65 ± 0,04*
ЛПС P. vulgaris 296 + АПАК	5,62 ± 0,59*	5,18 ± 0,21*
ЛПС P. vulgaris 856 + АПАК	1,84 ± 0,57*	1,22 ± 0,26*

* достоверность различий активности хемилюминесценции нейтрофилов после стимуляции их ЛПС штаммов до и после инкубации в сыворотке (р<0,05).

Представленные результаты показывают, что ЛПС разных штаммов обладает разной активностью в отношении респираторного взрыва нейтрофилов. Наибольшей она была у P. vulgaris 296. Однако в остальных случаях ЛПС протея слабо активировал респираторный взрыв, а ЛПС P. mirabilis 210 вообще не вызывал стимуляции нейтрофилов (образование АФК соответствовало уровню спонтанной хемилюминесценции). Наиболее интересным результатом исследования явились показатели активирующей способности ЛПС штаммов протея, после 60 мин инкубации в системе с избирательной активацией АПАК. После такой инкубации только ЛПС одного штамма P. vulgaris 296 сохранял высокий активирующий потенциал (хотя и в этом случае он снижался по сравнению с интактным ЛПС), тогда как у всех остальных штаммов достоверно снижалась активирующая способность.

Полученные данные интересно сравнить с работой А.Е. Платонова и др. (1999), где изучалось повреждение гранулоцитов человека под действием менингококкового липополисахарида. В этой работе показано, что повреждение и гибель гранулоцитов под влиянием ЛПС происходит только при условии наличия в системе интактного комплемента и не зависит от концентрации ЛПС и наличия антител к нему. Полученные нами результаты подтверждают данные исследования, поскольку после инкубации ЛПС с белками альтернативного каскада комплемента нейтрофилы теряли способность активироваться.

Особое внимание обратили на ЛПС штамма P. vulgaris 296, который не подавлял, а стимулировал кислородный взрыв нейтрофилов. В остальных трех случаях клетки поддерживали слабую респираторную активность на фоновом уровне. Имеются работы, подтверждающие возможность апоптоза нейтрофилов под влиянием связывания рецептора их мембран (CD14) с ЛПС (Van Oostveldt et al., 2002). Однако такое связывание не опосредовано белками комплемента, и, по-видимому, реализуется напрямую. В настоящее время вопрос о том, как координируется действие сывороточных белков, влияющих на связывание ЛПС с клеточными мембранами и сывороточных белков, опосредующих сигнальные функции ЛПС, остается не изученным.

Пока с уверенностью можно сказать только, что межштаммовые различия протея в системе АПАК обусловлены не только различиями в строении клеточной стенки бактерий, поскольку активаторная способность главного компонента клеточных стенок - ЛПС не соответствует реакциям с цельными бактериальными клетками.

7. Морфологические аспекты исследования нейтрофильных гранулоцитов в атомно-силовой микроскопии

Изменение морфологических параметров клеток проецируют на их физиологические свойства, что наряду с функциональной характеристикой дает полноценную информацию об участии в поддержании гомеостаза. На следующем этапе исследований проводили анализ сканированных образцов фиксированных и витальных нейтрофильных гранулоцитов методом СЗМ. Результаты сканирования отражают полиморфизм нейтрофилов. На препаратах, где происходит не только адгезия, но и распластывание нейтрофилов определяются границы клеток, полиморфное ядро, видны гранулы цитоплазмы. Особенно хорошо эти структуры выявляются на боковом сечении профиля клетки. Однако при исследовании живых препаратов наблюдали также нейтрофилы, плохо распластывающиеся на субстрате, где границы клетки выражены достаточно четко, но ядро определялось плохо и могло быть выявлено только по боковому сечению профиля клетки. Поскольку практически вся цитоплазма оказывается сконцентрированной возле ядра, гранулы цитоплазмы практически не идентифицируются. В случае фиксации метанолом границы клеток выражены отчетливо, всегда определяется сегментированное ядро и гранулы. Однако фиксированная клетка практически лишается воды, полностью распластывается по поверхности подложки (от чего становится четко выраженной топография ее внутренней структуры) и это резко изменяет морфологические параметры клетки (табл. 7).

Таблица 7 Морфологические параметры нейтрофильных гранулоцитов, измеренные методом СЗМ при использовании фиксации и без нее

	Нативные клетки (живые НГ)	Клетки, фиксированные метанолом	Клетки, фиксированные глутаровым альдегидом
Диаметр клеток (мкм)	14,55 ± 0,55*	16,72 ± 0,41*	18,25 ± 0,48*
Высота клеток (мкм)	2,13 ± 0,11**	0,66 ± 0,03**	1,03 ± 0,05**

* F = 15,11 (_вну = 138,1; _меж = 9,136) * р0,001 - различия между группами статистически значимы; **F = 99,26 (_вну = 214,1; _меж = 2,15) * р0,001 - различия между группами статистически значимы.

Большим преимуществом в исследовании фиксированных препаратов является то, что разрешение сканирующего зондового микроскопа в воздушной среде оказывается выше. При получении изображения методом СЗМ общепризнанным методом фиксации является обработка глютаровым альдегидом (Dufrкne, 2001). Однако мы не обнаружили преимуществ данного метода фиксации: поскольку при такой обработке клетка сохраняет воду и не распластывается по подложке ее изображение идентично изображению нативных нейтрофильных гранулоцитов, где четко определены границы клеток, однако ядро и гранулы не выявляются. Заметна только шероховатость мембраны, которая практически не выявляется при фиксации метанолом. Однако размеры нейтрофильных гранулоцитов при фиксации глютаровым альдегидом отличаются от нативных препаратов.

Любой метод фиксации искажает размеры клеток: при фиксации метанолом это по большей части отражается на высоте клетки, при фиксации глютаровым альдегидом на поперечных размерах клетки (табл. 7). В целом можно отметить, что хотя использование фиксированных препаратов имеет целый ряд преимуществ перед нативными пробами, морфологические параметры при исследовании фиксированных препаратов оказываются искаженными. Поэтому для изучения процессов, протекающих в клетке и морфологических изменений, сопровождающих эти процессы удобнее использовать исследования нефиксированных препаратов в жидкой фазе, а для визуализации детальных подробностей этих изменений лучше использовать методы фиксации, среди которых предпочтение нужно отдавать фиксации метанолом.

Метод АСМ не ограничивается наблюдением морфологии интактной клетки. Например, реализация такой эффекторной функции как фагоцитоз сопровождается у нейтрофила образованием псевдоподий, а их можно четко визуализировать. На рис. 3 представлено, как меняется морфология нейтрофильного гранулоцита при внесении в среду инкубации бактерий, опсонизированных в системе АПАК.

Параллельно этому эксперименту проводились опыты по исследованию ЛЗХЛ, где к суспендированным нейтрофилам добавляли опсонизированные S.aureus 7M, показатели хемилюминесценции снимали каждые 5 мин (рис. 4).



Рис. 3 Изменение морфологии нейтрофилов при инкубации с бактериальными клетками (фиксация метанолом): (а) морфология интактной клетки, (б) морфология нейтрофила через 5 минут, после инкубации с опсонизированным в системе АПАК S. аureus 7 М

Рис. 4 Кинетика респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов после стимуляции опсонизированным S.aureus 7М

Морфологические наблюдения показывают, что наиболее интенсивно псевдоподии формируются у нейтрофильных гранулоцитов на 5 - 10 мин наблюдения, тогда как пик респираторной активности достигается только на 25 - 40 мин. Оба процесса: и формирование активных форм кислорода и образование псевдоподий зависят от АТФ. Скорее всего, в течение респираторного взрыва энергетические ресурсы нейтрофила интенсивно перераспределяются в сторону гексозомонофосфатного шунта (для продукции свободных радикалов кислорода), а не в сторону гликолиза (для продукции АТФ, необходимой для активной сборки цитоскелета).

Поэтому вероятно, что увеличение продукции активных форм кислорода это фактор, который может ограничивать способность ПМЯЛ формировать псевдоподии in vitro, поскольку на этом этапе внутриклеточного метаболизма энергетические ресурсы клетки перераспределены на более эффективное внутриклеточное разрушение микроорганизма. В результате исследований показано, что две стадии фагоцитоза: формирование псевдоподий, захват чужеродных тел, втягивание внутрь мембраны и формирование активных форм кислорода - процессы не связанные между собой. Можно сказать, что приведенное исследование доказывает описанный ранее (Маянский, 1989) феномен функциональной дискретности нейтрофилов.

Особенности морфологии нейтрофильных гранулоцитов при исследованиях методом атомно-силовой микроскопии в различных буферных системах

Нейтрофилы в ходе реализации фагоцитоза вынуждены находиться не только в разном клеточном окружении, но и в средах с изменяющимися значениями рН, поэтому на следующем этапе наблюдения за нейтрофильными гранулоцитами исследовали живые клетки в физиологическом растворе (рН 7,2); в растворе Хенкса (рН варьировала от 7,2 до 8,2), в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), а также были предприняты попытки наблюдения за нейтрофилами в чрезвычайно неблагоприятных для них условиях: цитратном буфере (рН 5,0) и карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5). В физиологическом растворе в течение всего времени наблюдения клетка не меняла параметров ни в ответ на сканирование, ни в ответ на проведение спектроскопии, была «морфологически инертна». Замеры объема клетки также продемонстрировали незначительные колебания, не выходящие за пределы статистически значимых различий.

Принципиально иные результаты получены при сканировании клеток в фосфатно-солевом буфере, поскольку в нем нередко отмечалась атипичная морфология клеток. ПМЯЛ, инкубируемый в ФСБ, является морфологически нестабильным: клетка плохо распластывается по поверхности подложки, по краям выявлено образование утолщений (похожие атипично крупные гранулы мы отмечали в последующих сериях экспериментов, посвященных стрессовым воздействиям на нейтрофилы). Отсутствие распластывания по поверхности подложки нельзя объяснить отсутствием ионов Са²⁺, так как в предыдущей серии экспериментов сканирование в бедном физиологическом растворе не препятствовало хорошей адгезии нейтрофилов. Характерными являются еще два признака, свидетельствующие о том, что пребывание ПМЯЛ в ФСБ является неблагоприятным для клеток.

...