Морфо-физиологические аспекты гуморальных и клеточных механизмов неспецифической резистентности организма

Во-первых, нейтрофил формирует псевдоподии без внесения в среду каких-либо стимулирующих агентов и даже до проведения сканирования; во-вторых, на подложке отчетливо визуализируются гранулы различного диаметра (их количество увеличивалось на протяжении сканирования). Мы считаем, что появление этих гранул связано с разрушением части клеток, инкубируемых в ФСБ. Особенно серьезные изменения наблюдаются у ПМЯЛ после механического надавливания на нейтрофильный гранулоцит с силой 0,4 nN: клетка вначале несколько уменьшается в объеме, так, что даже визуализируются ядра, а затем постепенно «набухает», в конечном итоге увеличивая объем более чем в 2 раза. Таким образом, пребывание нейтрофильных гранулоцитов в ФСБ в процессе сканирования является неблагоприятным для клеток, несмотря на то, что значение рН на всем протяжении экспериментов поддерживалось на строго постоянном уровне.

При сканировании в забуференном растворе Хенкса, в том случае, когда значение рН поддерживалось на постоянном уровне (7,2) морфология клеток была стабильна на протяжении длительного времени наблюдения: объем и высота клеток не изменяются. Хотя нужно отметить, что буферность среды при обогащении ионного состава не предохраняет нейтрофил от значительного набухания при проведении спектроскопии. В том случае если не регулировать искусственно буферность системы значения рН в растворе Хенкса изменяются с 7,2 до 8,2. При таких условиях даже атравматичное сканирование клеток в неконтактном режиме может привести к значительному увеличению их объема.

Таким образом, изменение рН, равно как ионный состав среды оказывают значительное влияние на механические свойства клеток. В бедной ионами среде с постоянным значением рН (физиологический раствор) клетки не чувствительны ни к слабому (сканирование), ни к сильному (FS-спектроскопия) механическому воздействию. Обогащение ионного состава среды при постоянном рН делает клетку чувствительной к сильному механическому воздействию (FS-спектроскопия), что проявляется патологической реакцией набухания клетки. Изменения рН среды при обогащении ионного состава делают клетку максимально чувствительной к любому, даже слабому механическому воздействию.

Исследование клеток в неблагоприятных для жизнедеятельности буферах (в цитратном (рН 5,0) или карбонатно-бикарбонатном (рН 9,6)) показало, что в таких условиях ПМЯЛ утрачивает способность к адгезии, поэтому СЗМ-исследования не возможны. Кроме того, в карбонатно-бикарбонатном буфере клетки через 1 час оказывались полностью разрушенными.

8. Изучение ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов в атомно-силовой микроскопии

Метод СЗМ позволяет измерять локальные упругие свойства поверхности клеток. Теоретическое обоснование использования модуля Юнга, рассчитываемого по модели Герца для исследования эластичности «мягких» биологических объектов приводится в работах E. Hassan et al., 1998; R. Henderson, H. Oberleithner, 2000. Для нейтрофильных гранулоцитов исследование механических свойств имеет первостепенное значение, поскольку процессы диапедеза и миграции в тканях и процесс фагоцитоза сопровождаются комплексными упруго-механическими реакциями. Помимо рецепторных взаимодействий, которые к настоящему времени достаточно полноценно исследованы и охарактеризованы, в рекогносцировочных реакциях нейтрофилов большое значение принадлежит перестройкам цитоскелета, активации хемо- и механорецепторов. В приведенном исследовании, используя модель Герца, определяли ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов, а также оценивали, насколько спектроскопические измерения способны изменить морфологию нейтрофильного гранулоцита. Зонд подводили к поверхности клетки и надавливали на мембрану с силой от 0,4 до 4 nN. Кантилевер начинает испытывать силу упругого сопротивления со стороны мембраны клетки.

В результате получали кривую FS-спекроскопии, отображающую взаимосвязь между приложенной силой и величиной прогиба мембраны под зондом, по которой вычисляли модуль Юнга. Первоначально проводили измерение модуля Юнга на нативных клетках в 25 независимых экспериментах (клетки брали от разных доноров, FS-спектроскопию каждой клетки проводили не менее 3-х раз, значение модуля Юнга оценивали как среднее из этих измерений). Результаты исследования показали, что ригидность мембран нейтрофилов составляла в среднем 2,1 0,7 кПа. Поскольку при проведении спектроскопии воздействие зонда на клетку оказывается более значительным, чем в процессе сканирования было сделано предположение, что оно может изменять морфологию клеток.

Проведенная серия экспериментов по исследованию морфологии клеток после спектроскопических измерений (в забуференном растворе Хенкса, как наиболее физиологичном для нейтрофилов) продемонстрировала реакцию набухания клетки в ответ на механическое воздействие силой от 0,4 до 2 nN. При этом отмечается зависимость степени набухания от величины приложенной силы. Резкое увеличение объема отмечено вследствие применения сил, превышающие те, что воздействуют на ПМЯЛ в физиологических условиях. В частности, в работе K.E. Edmondson et al. (2005) продемонстрировано, что сила сопротивления нейтрофилам со стороны эндотелиоцитов составляет 100 pN, что в 4 раза меньше силы, используемой нами при FS-спектроскопии. Однако, при проведении экспериментов in vitro использование сил меньше, чем 0,4 не целесообразно, поскольку при таком воздействии вязкие свойства мембраны преобладают над упругими, в результате чего не удается получить удовлетворительной FS-кривой. Нужно отметить также высокую степень резистентности клеток к набуханию: увеличение объема более чем в 3 раза от первоначального не вызывает некроза клеток и позволяет проводить наблюдения за нейтрофилами в течение 2,5 часов.

Вероятнее всего набухание клеток можно объяснить кратковременным раздражением механорецепторов, вследствие чего открываются механочувствительные ионные каналы, вызывающих трансмембранный инфлюкс ионов внутрь клетки с последующим ее набуханием. Первоначальное набухание клетки вызывает открывание новой порции каналов. На эту роль могут претендовать, в частности TRPV4 (transient receptor potential) катионные каналы, поскольку они являются чувствительными к нагреванию, химическому воздействию и осмотическому увеличению объема клеток (Gьller et al., 2002; Vriens et al., 2004).

Такая петля позитивной обратной связи вызывает еще большее нарастание клеточного объема, что и продемонстрировано в нашей серии экспериментов. Факт, что в реакции задействованы именно кальциевые каналы подтверждается отсутствием набухания клетки при проведении спектроскопии в физиологическом растворе (среде без Ca ²⁺). По данным J. Vriens et al. (2004) гипоосмотического увеличения объема клеток в отсутствие экстрацеллюлярного кальция не происходит.

Было сделано предположение, что увеличение объема клетки оказывает непосредственное влияние на ригидность мембран нейтрофилов. Для подтверждения или опровержения этого предположения проводили спектроскопические исследования в течение всего процесса набухания. Результаты наблюдения представлены в таблице 8.

Приведенные результаты попадают в диапазон доверительного интервала, а различия между ними не являются статистически значимыми. Таким образом, спектроскопия существенно изменяет морфологию нейтрофилов у доноров, но не влияет на ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов. В случае необходимости исследования воздействия различных веществ на клетки, необходимо проводить морфологические и спектроскопические исследования в независимых экспериментах. Сам по себе результат, показывающий независимость ригидности мембран от объема клетки доказывает, что объемно-морфологические характеристики клетки не влияют на упругие свойства мембран.

Таблица 8 Ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов в процессе проведения спектроскопических исследований

р>0,05 - разница между значениями не является статистически значимой.

9. Морфо-физиологические особенности нейтрофильных гранулоцитов на фоне действия биотических и абиотических агентов

Нейтрофильные гранулоциты могут находиться в кровяном русле в стадиях праймирования, «преактивации» и покоя (Сапрыкин, Кузнецов, 2001). Любое физико-химическое воздействие вызывает активацию клетки. Однако для проявления реактивности необходимо, чтобы этот стимул обладал адекватной силой воздействия, поскольку слабое воздействие вызовет лишь кондиционирование клетки, сопровождающееся биохимическими перестройками, но не идентифицирующееся морфологически и функционально. Такой стимул может спровоцировать развитие толерантности. Тогда как чрезмерная сила воздействующего фактора может привести к срыву адаптации и гибели клеток. Границы устойчивости нейтрофильных гранулоцитов к экзогенному воздействию были определены в реакциях с биогенными факторами (пчелиный яд, гепарин, ЛПС) и абиогенными раздражителями (Н₂О₂ и квантовыми точками).

10. Морфо-физиологические особенности работы фагоцитов в системе «Яд-Гепарин»

Для оценки влияния гепарина на респираторную активность нейтрофилов производили исследование люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов до и после внесения гепарина (в спонтанном тесте и после стимуляции опсонизированным зимозаном). Дыхательная активность нейтрофилов показала незначительную стимуляцию спонтанной и стимулированной хемилюминесценции при использовании самых малых доз гепарина (0,05 МЕ/мл). Интересным фактом является то, что при увеличении концентрации гепарина его стимулирующий эффект полностью элиминируется, сменяясь некоторым подавлением дыхательной активности, которое выявлялось как в спонтанном, так и в стимулированном тесте. Затем в систему с нейтрофильными гранулоцитами вносили пчелиный яд. Результаты экспериментов представлены на рис. 5.

Концентрации яда: 1 - 1 мкг/мл, 2 - 10 мкг/мл, 3 - 100 мкг/мл.

Лишь малые дозы яда (1 мгк/мл) на начальном этапе обладают стимулирующей активностью, которая быстро сменяется подавлением клеточного дыхания. Увеличение дозы ведет к резкой супрессии дыхательной активности уже на 5 мин, а к 20 мин она падает до критического уровня. Эта тенденция характерна как для спонтанной, так и для стимулированной хемилюминесценции.

Рис.5. Влияние пчелиного яда на стимулированную зимозаном (а) и спонтанную (б) хемилюминесценцию нейтрофилов. По оси ординат - относительные значения хемилюминесценции, опыт/контроль.

Интересной особенностью, отмеченной в ходе экспериментов, является то, что на активированные клетки пчелиный яд оказывает более выраженное воздействие: клетки в состоянии активации быстро и эффективно уничтожаются пчелиным ядом. В качестве объяснения повышенной чувствительности клетки к яду в стадии активации можно сделать предположение о суммации повреждающего действия экзогенного (яд) и эндогенного (активные формы кислорода) воздействия. Клетка, находящаяся в состоянии физиологического покоя гораздо более резистентна к токсическому воздействию, и при наиболее низкой концентрации (1 мкг/мл) даже проявляется незначительный стимулирующий эффект.

Исследование возможного протекторного действия гепарина показало, что функциональные характеристики клетки могут быть защищены гепарином только в случае малых концентраций яда (1, 10 мгк/мл) и только когда клетка не находятся в физиологически активной фазе. Протективная активность гепарина отмечалась только при спонтанной хемилюминесценции: в течение сорокаминутного наблюдения за клетками, предварительно проинкубированными с комплексом «яд - гепарин» (концентрация яда не превышала 10 мгк/мл) не отмечено достоверного снижения дыхательной активности клеток по сравнению с уровнем контроля.

В случае увеличения концентрации яда в комплексе до 100 мгк/мл гепарин уже не мог компенсировать разрушающего и/или ингибирующего действия яда.

В работе М.Б. Звонковой (2002), при рассмотрении взаимодействия пчелиного яда с гепарином, отмечается, что гепарин in vitro вступает в прямое химическое взаимодействие с основным компонентом пчелиного яда - мелиттином, тогда как другой компонент пчелиного яда - фосфолипаза А комплекса с гепарином не образует. Именно это наблюдение может объяснить ингибирование дыхательной активности стимулированных клеток. Известно, что основной мишенью фосфолипазы А являются глицерофосфолипиды клеточных мембран, но респираторный взрыв нейтрофилов сопровождается резким изменением метаболического профиля клеток, переориентированного на синтез активных форм кислорода с участием НАДФ. Т.е. это мембранозависимый процесс, но мембраны повреждаются не связанной гепарином фосфолипазой А, что сопровождается снижением синтеза энергетически активных молекул, а следовательно, и снижением величины респираторного взрыва. Это уменьшение дыхательной активности при стимуляции клеток, предварительно проинкубированных в системе «яд - гепарин» и наблюдалось в наших экспериментах.

Помимо функциональных тестов была сделана морфологическая оценка клеток (перитонеальных макрофагов мыши) под действием пчелиного яда. Исследования производили методом сканирующей зондовой микроскопии. Были получены результаты о неизменности морфологии перетонеальных макрофагов после инкубации с гепарином. Тестирование пчелиного яда проводили на тех же клетках. Концентрация пчелиного яда, взятого в эксперимент составила 1; 10 и 100 мкг/мл (рис.6).

Рис. 6. Морфология перитонеальных макрофагов мыши, фиксированных метанолом: (а) интактные клетки; (б) клетки, фиксированные после инкубации с пчелиным ядом (10 мкг/мл) в течение 10 мин; (в) клетки, зафиксированных после 20 мин инкубации с комплексом «яд-гепарин» (100 мкг/мл - 5 МЕ/ мл соответственно)

Только на мазках, приготовленных после инкубации перитонеальных макрофагов с минимальной из испытуемых доз пчелиного яда (1 мкг/мл) отмечалась неизменность клеточной морфологии. В остальных случаях влияние на макрофаги пчелиного яда выражалось в резком изменении морфологии клеток: макрофаги имели «рваные» края и расплывчатые очертания, внутренняя область клетки, где должно располагаться ядро оказывалась вогнутой. В дальнейшем было проведено исследование протективной активности гепарина. Конечная концентрация компонентов в комплексах «яд-гепарин» составляла соответственно: 1 мкг/мл - 0,05 МЕ/мл, 10 мкг/мл - 0,5 МЕ/мл; 100 мкг/мл - 5 МЕ/мл. Нужно отметить, что в случае определения только морфологических параметров гепарин оказывает гораздо более выраженный протективный эффект: даже максимальная концентрация яда - 100 мкг/мл при инкубации с 5 МЕ/мл гепарина, по всей видимости, формировала настолько прочное комплексное соединения, что морфологические параметры клеток практически не изменялись.

Границы клеток не нарушались и имели четкие очертания, хотя в некоторых случаях, (например, при увеличении концентрации яда до максимального) отмечалось появление псевдоподий. Таким образом, и использование функционального теста (респираторная активность нейтрофилов в реакциях ЛЗХЛ) и оценка морфологических параметров клеток (методом АСМ) показывают однозначный результат по цитотоксическому действию пчелиного яда и протективному эффекту гепарина. При этом нужно признать, что функциональный тест является более чувствительным и реагирует на незначительные изменения в биохимическом окружении клеток, тогда как морфологическая структура достаточно долго поддерживается в стабильном состоянии, проявляя изменения только при достаточно «грубом» (высокие концентрации пчелиного яда) патологическом воздействии.

11. Морфо-функциональная характеристика нейтрофильных гранулоцитов в системе с липополисахаридом

ЛПС - один из наиболее мощных активаторов нейтрофилов. Но в отсутствии сывороточных белков ЛПС не способен индуцировать респираторный взрыв в нейтрофилах, что обусловлено физиологической функцией полиморфноядерных лейкоцитов: акцептировать на своей поверхности ЛПС. Связывание ЛПС на нейтрофильном гранулоците обуславливается рецептором СD14, что может приводить к апоптозу ПМЯЛ. K. Van Oostveldt et al. (2002) показали, что ЛПС (от 1 до 10 мкг/мл) способен связываться с CD14 и инициировать процесс апоптоза, сопровождающийся утратой фагоцитарной и респираторной активности клеток. Однако реализовать программу апоптоза удается не всегда, поскольку высокие концентрации ЛПС индуцируют шеддинг рецептора с поверхности нейтрофильных гранулоцитов (Sohn et al., 2007). Поэтому ряд исследователей регистрируют антиапоптотический эффект бактериальных эндотоксинов (Yamamoto et al., 1993; Lee et al., 1993; Hiroi et al., 1998; Sweeney et al., 1998; Винокуров и др., 2006).

В нашем исследовании была поставлена цель: исследовать изменения морфологии нейтрофильных гранулоцитов под действием ЛПС методом СЗМ. В эксперимент были взяты два вида ЛПС: выделенный из штамма P. mirabilis 210, поскольку он вызывал подавление респираторной активности нейтрофилов и стандартизованный ЛПС штамма E.coli O127:B8 (Sigma, USA). Контрольные измерения (в отсутствии ЛПС) показали, что клетки не изменяют своей морфологии в течение длительного времени инкубации (измерения проводили до 180 мин). После добавления к нейтрофилам (5 * 10⁶ кл/мл) ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл) уже спустя 15 мин наблюдаются значительные изменения морфологии клеток, выражающиеся в увеличении размеров клеток, т.е. значительном «набухании» рис. 7. Такие изменения могут приводить к критическому увеличению объема, заканчивающемуся некротической гибелью части клеток. Однако некроз регистрировался лишь у незначительной части клеток, большинство из них сохраняли жизнеспособность в течение длительного времени. Наблюдения за единичными клетками в течение длительного времени показали, что ПМЯЛ претерпевает изменения, сходные с описываемыми для апоптоза: в частности набухание клеток сменяется уменьшением объема, а впоследствии такие периодические изменения объема будут сопровождаться фрагментацией и отделением ядерного материала от клетки, что демонстрируется рис. 8.

Рис. 7. Изменение морфологии нейтрофильных гранулоцитов на первых минутах после внесения ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл): (а) контрольный скан интактных клеток; (б) клетки через 15 мин после инкубации с ЛПС

Поскольку дополнительные доказательства апоптоза не проводились такие формирования, мы обозначали как «апоптозоподобные» тельца. Изменения объема, площади и высоты отдельных клеток также демонстрировали постоянное колебание параметров.

Изменениями морфологии не ограничивались реакции клеток на введение ЛПС P. mirabilis 210. Измерение ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов (в серии независимых экспериментов) показало значительные колебания модуля Юнга, т.е. отмечались моменты, когда жесткость мембраны повышалась в 11 раз по сравнению с контролем. Результаты замеров ригидности мембран нейтрофилов, рассчитанной по модели Герца представлены в таблице 9.

Рис. 8. Изменение морфологии нейтрофильных гранулоцитов на поздних стадиях наблюдения за клетками после внесения ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл): (а) через 70 мин после инкубации с ЛПС; (б) через 80 мин после инкубации с ЛПС; (в) через 90 мин после инкубации с ЛПС

Таблица 9 Значения модуля Юнга, изменяющиеся в ходе инкубации нейтрофилов с ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл)

* - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

На всем протяжении эксперимента значения ригидности ни разу не опускались ниже уровня контроля, а, напротив, поддерживались на достаточно высоком уровне, что является косвенным доказательством реализации клеткой апоптотической программы (Elmore, 2007). Для сравнения аналогичная серия экспериментов была проделана с ЛПС E.coli O127:B8. Морфология нейтрофильного гранулоцита постоянно изменялась, но общая направленность изменений соответствовала тем, что отмечались при внесении ЛПС P. mirabilis 210, хотя первоначальное набухание клеток было не столь выраженным. Фрагментация ядра клетки отмечалась через 90 мин после внесения ЛПС. Аналогичные с действием ЛПС штамма P. mirabilis 210 колебания упругости мембраны нейтрофильного гранулоцита отмечены и как результат реакции на ЛПС E.coli O127:B8. Показатели ригидности не разу не снижались ниже контрольного уровня.

Таким образом, несмотря на разнонаправленность влияния на респираторную активность нейтрофильных гранулоцитов (ЛПС P. mirabilis 210 ингибировал, а ЛПС E.coli O127:B8 не изменял этого параметра) ЛПС разных штаммов вызывают сходные изменения морфологии клеток и свойств мембран. Отделение от клеток «апоптозоподобных» телец и значительное увеличение ригидности клеточных мембран заставляют предположить, что в данном случае наблюдается апоптоз нейтрофильных гранулоцитов. Против этого предположения выступает только факт первоначального (на первых минутах наблюдения) увеличения объема клеток после внесения ЛПС. Однако анализ литературных данных показывает, что дегидратационное сокращение объема клеток отнюдь не является облигатным признаком апоптоза. В частности, в работе А.А. Веренинова и др. (2004) показано, что сочетание определенных индукторов и типов клеток приводит к апоптозу без дегидратационного уменьшения объема клеток, тогда как остальные признаки апоптоза (конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптозных телец, выпадение из популяции S-фазных клеток) сохраняются. По литературным данным ЛПС является антиапоптотическим агентом. Однако видимого противоречия удается избежать, если, во-первых, учитывать, что в случае проведения СЗМ экспериментов нейтрофильные гранулоциты адгезируются на поверхности подложки, а такая реакция сама по себе обладает кондиционирующим эффектом. В литературных источниках приводятся данные об инкубации нейтрофилов с ЛПС в пробирках, что исключает адгезию клеток. Можно предположить, что первоначальная активация клетки приводит к изменению реакции на ЛПС. Во-вторых, нельзя сбрасывать со счетов и воздействие зонда на механорецепторы нейтрофилов, которое хотя и не вызывает изменения морфологии клеток, но может трансформировать реакцию клеток на тот или иной (в том числе биохимический) стимул.

12. Динамические исследования жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системах с пероксидом водорода

При исследовании воздействия пероксида водорода на нейтрофилы было показано, что метод СЗМ имеет ограничения, поскольку при добавлении пероксида в концентрации более 25 мкМ с высокой интенсивностью идет реакция по разложению перекиси до Н₂О и О₂. При этом активно выделяющиеся пузыри кислорода укрупняются и оседают на зонде. Это препятствует сканированию, так как изменяется амплитуда колебаний зонда.

Наблюдение за нейтрофильными гранулоцитами в течение 120 минут при внесении Н₂О₂ в концентрациях от 3 мкМ до 25 мкМ, показало, что возможно два варианта изменения клеточной морфологии. В первом случае клетка размягчается и сдирается зондом с поверхности подложки. В данном случае речь идет о некротической гибели клеток (рис. 9).

Во втором случае клетки «мумифицировались» и практически не изменяли своих параметров в ответ на сканирование, что вероятнее всего также обусловлено гибелью клеток (рис. 10).

Этот вариант гибели клеток не встречался еще не в одной серии экспериментов. Его уникальность заключается в чрезвычайной жесткости мембраны клетки. О том, что мембрана видоизменяется настолько, что морфология клетки становиться неизменной свидетельствует и тот факт, что усиление механического давления на клетку со стороны зонда никак не влияет на изменение её параметров. Постоянное увеличение силы давления проводилось с 2,2 nN до 16,2 nN и в конечном итоге составило значительную силу, в 6,5 раз превышающую оптимальную силу надавливания на интактные клетки в процессе сканирования.

Рис. 9. Некротическая гибель клеток после внесения пероксида водорода в концентрации 3,1 мкМ (изображения получены в физиологическом растворе в режиме реального времени методом АСМ)

Рис. 10. «Мумификация» клеток после внесения пероксида водорода в концентрации 3,1 мкМ (изображения получены в физиологическом растворе в режиме реального времени методом АСМ).

Поскольку исследование взаимодействия нейтрофилов с Н₂О₂ методом СЗМ имеет ограничения, то для изучения её влияния в больших концентрациях клетки инкубировали с Н₂О₂ разной концентрации и делали фиксированные мазки по Романовскому-Гимзе. В данном случае обнаруживалась гибель ПМЯЛ по двум классическим путям: некрозу и апоптозу. Некроз-апоптотическое соотношение было подсчитано в серии независимых экспериментов с окрашиванием клеток. Суммарные значения приведены в таблице 10. В результате зафиксировали значительное увеличение некротической гибели клеток, в то время как апоптоз нейтрофилов сохранялся приблизительно на одном уровне при разных концентрациях Н₂О₂ и не превышал уровня 15,9±5,0 %.

Таким образом, главным результатом в ходе исследования влияния на нейтрофилы пероксида водорода методом СЗМ является выявление нетипичной для нативных, а также некротически и апоптотически гибнущих клеток структурной перестройки мембран, характеризующейся крайне высокой жесткостью.

Таблица 10 Некроз-апоптотические соотношения гибели нейтрофильных гранулоцитов при внесении разной концентрации Н₂О₂

13. Динамические исследования жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системах с квантовыми точками

Поскольку при всех вариантах поступления наночастиц в организм человека они неизбежно оказываются в крови, то изучение реакции клеток крови на наноматериалы является первоочередной задачей. Для исследования влияния квантовых точек на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов первоначально оценивалась жизнеспособность интактных клеток. Для этого в течение 10 часов нейтрофилы, изолированные из кровяного русла и находящиеся в ЗФР в концентрации 500 тыс. кл/мл в термостатируемой ячейке конфокального микроскопа, наблюдали в режиме реального времени. За все время наблюдения клетки демонстрировали высокую степень активности: быстрое передвижение гранул в цитоплазме, миграционная активность, образование псевдоподий. Тест с трипановым синим показал значение жизнеспособности нейтрофилов - 99% как в начале наблюдения за клетками, так и по окончании процесса.

В дальнейшем к нейтрофильным гранулоцитам добавляли квантовые точки (CdSe/ZnS, покрытые меркапто-уксусной кислотой с эмиссией 620 нм). Моделировалось две ситуации. Во-первых, клетки инкубировали с квантовыми точками (0,1 мг/мл) в течение разных временных интервалов в пробирках, после чего высаживали на стекло, где происходила спонтанная адгезия к подложке и клетки фиксировали метанолом. Во-вторых, клетки вносили в термостатируемую жидкостную ячейку (37єС), после чего происходила спонтанная адгезия и в течение 2 часов наблюдали за интактными клетками. После этого в систему вносили квантовые точки.

В первой серии экспериментов зафиксировали ярко выраженный цитотоксический эффект квантовых точек, даже в том случае, когда клетки не праймированы адгезией к субстрату, а фототоксическое воздействие исключено условиями проведения эксперимента. Инкубация нейтрофилов с квантовыми точками в течение 5 мин не являлась опасной, поскольку границы клеток четко контурируются, определяется ядро, видна только голубая автофлюоресценция, но уже через 10 мин клетки начинают постепенно поглощать квантовые точки, при этом четко отмечается зависимость между заполненностью клеток квантовыми точками и структурой мембраны, т.е. эмиссия в красной области спектра (л=620нм), характерная для квантовых точек, кореллирует с отсутствием у клеток ядра и разрушением мембраны. Через 30 и 60 мин после инкубации с CdSe/ZnS-МУК (0,1 мг/мл) количество поврежденных клеток постепенно нарастает, однако самые серьезные изменения происходят при инкубации нейтрофилов с квантовыми точками в течение 90 мин и более: отмечается образование клетками множественных сетевых контактов, при этом размеры формируемых структур размеры типичных псевдоподий.

Клетки коадгезируют, образуя крупные конгломераты некротизированных образований, идентифицируемых в виде ярко-красного свечения. Четко идентифицируется отсутствие ядер клеток в агрегатах и деструкция мембраны. Дополнительную информацию дает использование метода АСМ: клетка сохраняет целостность мембраны и ядро, однако образует псевдоподии, не характерные для нейтрофильных гранулоцитов, т.к. фрагменты псевдоподий на некоторых участках выглядят как «расплавленные», в отличие от всегда четко структурированных псевдоподий, формируемых клетками при фагоцитозе микроорганизмов. Таким образом, происходит поглощение квантовых точек несмотря на их абиотическую природу. Процесс поглощения реализуется в короткие промежутки времени (к 10-й мин эксперимента более 30% клеток оказываются заполненными квантовыми точками).

Такая же концентрация квантовых точек была использована при инкубации с клетками, адгезированными и распластанными на субстрате. Обнаружено, что квантовые точки в концентрации 0,1 мг/мл образуют крупные конъюгаты, а для клеток отмечались следующие феномены. Во-первых, наблюдается активное поглощение квантовых точек нейтрофильными гранулоцитами, хотя активное образование псевдоподий трудно напрямую ассоциировать с поглощением конъюгатов. Во-вторых, клетки, поглотившие квантовые точки, сохраняют способность к хемотаксису, быстро двигаются по направлению друг к другу и активно обмениваются квантовыми точками. По всей видимости, полученные нами после фиксации мазков агрегаты, и являются следствием такого направленного движения клеток по направлению друг к другу. В-третьих, нейтрофилы еще больше укрупняют конъюгаты квантовых точек, и пытаются экскретировать их на одном из полюсов.

Достаточно продолжительное время клетки еще сохраняют высокую подвижность, но через 60 мин она сменяется характерным истончением мембраны по периферии, свидетельствующем о гибели клеток. В-четвертых, у части нейтрофилов наблюдается эффект «избегания» квантовых точек, когда они не просто активно выводят конъюгаты квантовых точек либо в среду, либо передавая их другим клеткам, но формируют выпячивание мембраны в месте концентрации CdSe/ZnS-МУК (рис. 11).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 11. Углубление участка мембраны нейтрофильного гранулоцита в месте концентрации квантовых точек CdSe/ZnS-МУК (0,1 мг/мл). Изображение получено на конфокальном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M LSM 510 META (Германия), увеличение объектива х100

В данном случае, вероятнее всего наблюдается сочетанное токсическое воздействие квантовых точек и света, поскольку наблюдение в конфокальном микроскопе ведется при постоянном освещении низкой интенсивности. Через 100 мин после внесения квантовых точек неизбежно наступает «вскипание» клетки. Морфологические признаки такого «вскипания» не однородны. В основном можно выделить две группы клеток. Первая группа характеризуется быстрым некрозом, в результате которого при микроскопии визуализируется только «тень» клетки. Вторая группа начинает образовывать не характерные для нативного нейтрофила крупные гранулы, быстро концентрирует весь цитоплазматический материал в центре клетки, после чего периферическая часть истончается и клетка формирует характерные «волдырчатые» тени. Смертельность CdSe/ZnS в концентрации 0,1 мг/мл подтверждена и в отношении клеток линии HeLa и в отношении человеческих гепатоцитов, однако в этих работах авторы фиксировали цитотоксический эффект в течение 24 часовой инкубации (Shiohara et al., 2004).

Обсуждая механизмы цитотоксичности, авторы отмечают, что кадмий вызывает гибель клеток в концентрации 100 - 400 мМ, поскольку ионы токсиканта способны связывать сульфгидрильные группы многих, в том числе митохондриальных белков. При этом тиогруппы инактивируются, что приводит к митохондриальной дисфункции и гибели клеток по механизму некроза. Морфологическое описание некротической гибели гепатоцитов полностью соответствуют тем, что наблюдались в наших экспериментах в отношении нейтрофильных гранулоцитов, т.е. после воздействия квантовыми точками, покрытыми меркапто-уксусной кислотой, обнажается гранулированная цитоплазма, границы клеток становятся нечеткими и расплывчатыми, ядро не определяется и формируются очевидные волдырчатые структуры.

В следующей серии экспериментов нами была взята концентрация квантовых точек равная 0,03 мг/мл. Через 20 мин после внесения в ячейку квантовых точек CdSe/ZnS-МУК (0,03 мг/мл) наблюдалось постепенное концентрирование квантовых точек в одном из компартментов у 28 ± 1,9 % из исследуемых клеток. Однако образования псевдоподий у данных нейтрофилов за все время наблюдения не происходило. Формирование изображения в режиме 3D показало, что в данном случае квантовые точки заполняют объем клетки, концентрируясь в ней (рис. 12).

Рис. 12. Аккумулирование квантовых точек в объеме нейтрофилов первого типа: 3D изображение. Светлый цвет - границы клетки, темный цвет - аккумулированные квантовые точки (бар: 5 мкм)

Через 45 мин после добавления CdSe/ZnS-МУК у 10 ± 2 % нейтрофилов появлялась высокая степень двигательной активности. Морфология клеток существенно изменялась: в распластанной части клетки визуализировались атипично крупные гранулы. Клетки формировали псевдоподии, однако не поглощали квантовые точки (рис. 13).

Через 100 мин от начала инкубации с квантовыми точками четко выделялись три типа клеток: (1) клетки «аккумулировавшие» в своем объеме квантовые точки - 28,0 ± 1,9 %; (2) клетки, не поглощавшие квантовых точек - 10,0 ± 2 % и (3) клетки, окруженные ореолом квантовых точек - 59,0 ± 2,2% (рис. 13). Возникновение «ореола» происходило в разное время наблюдения за клетками (от 40 до 90 мин).

Рис. 13 Три субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов, различаемые по способности поглощать квантовые точки (квантовые точки обозначены белым цветом). (а) клетки «аккумулировавшие» в своем объеме квантовые точки; (б) клетки, не поглощавшие квантовые точки; (в) клетки, окруженные ореолом квантовых точек

Интересной особенностью является сходство морфологической градации клеток с результатами, полученными В. П. Сапрыкиным и С.Л. Кузнецовым (2001). Представленные авторы, используя метод электронной микроскопии, разделяют все нейтрофилы крови на три субпопуляции: (1) клетки с хорошо выраженной зернистостью цитоплазмы - 58,0 ± 1,0 %; (2) клетки с умеренно выраженной зернистостью цитоплазмы - 30,0 ± 1,2 % и (3) нейтрофилы с отсутствием зернистости цитоплазмы - 12,0 ± 0,9 %.

Таким образом, процентное соотношение практически идентично тому, что получено в ходе наших экспериментов. По-всей вероятности, праймированные нейтрофилы (12% по Сапрыкину - Кузнецову или 10% по нашим данным) меняют структуру цитоплазматической мембраны таким образом, что она становится непроницаемой для квантовых точек. В пользу того, что клетки, не поглощавшие квантовых точек обладают высокой физиологической активностью говорит тот факт, что на всем протяжении эксперимента они проявляли высокую подвижность, формировали атипично крупные гранулы, активно перемещавшиеся внутри цитоплазмы. Таким образом, можно констатировать функциональную неоднородность нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с квантовыми точками: выделено три субпопуляции клеток, различающихся по способности к интернализации и накоплению квантовых точек.

Выводы

1. При использовании режима микротвердости методом сканирующей зондовой микроскопии обнаружены мягкие области на поверхности буккальных эпителиоцитов - эти области не являются следствием активности микоплазм или хламидий.

2. Оценка активности лизоцима слюны по нефелометрическому тесту показала перспективность использования метода для скрининговых исследований тяжести кариозного процесса в полости рта. У детей с компенсированной и субкомпенсированной формой кариозного процесса отмечалось достоверное повышение активности лизоцима слюны по сравнению с контрольным уровнем, а при декомпенсированной форме кариеса активность лизоцима либо сильно возрастает - 60,52±0,99%, либо выражена очень слабо.

3. Установлено, что межштаммовая вариабельность АПАК-реактивности намного выше межвидовой. Обнаружено, что низкая активность некоторых штаммов бактерий в системе альтернативного каскада комплемента (Staphylococcus epidermidis 178M, Proteus vulgaris 1418-1) определяется комплексом поверхностных факторов, среди которых определенную роль играют сиаловые кислоты.

4. Выявлено, что альтернативный каскад комплемента может вызывать бактериолиз некоторых штаммов грамотрицательных микроорганизмов, тогда как в отношении других штаммов того же вида реализуется только опсоническая функция.

5. Определено, что липополисахарид бактерий рода Proteus слабо стимулирует респираторную активность нейтрофилов, а предварительная инкубация ЛПС в системе альтернативного каскада приводит к практически полной потере активирующей способности ЛПС.

6. Продемонстрирован феномен функциональной дискретности процессов образования псевдоподий и респираторного взрыва в ходе реализации нейтрофильным гранулоцитом программы фагоцитоза: образование псевдоподий происходит на 5-й минуте процесса, тогда как максимум респираторного взрыва достигается на 25-й минуте.

7. Пчелиный яд в концентрациях от 1 до 100 мкг/мл обнаруживает ярко выраженную токсическую активность, проявляющуюся как в изменении морфологических параметров клетки (разрушение мембран), так и в подавлении функциональной активности (респираторного взрыва нейтрофилов в реакциях хемилюминесценции). Гепарин в концентрации 5 МЕ/мл проявляет протективную активность и в комплексе с пчелиным ядом нивелирует токсическую активность, определяемую по изменению морфологии. Меньшей протективной активностью гепарин обладает в отношении функциональных свойств клеток: способность поддерживать респираторную активность на уровне контроля клетки обнаруживали только при низких концентрациях яда в комплексе «яд-гепарин» (1 мкг/мл и 10 мкг/мл) и только в том случае если клетки находились в состоянии функционального покоя.

8. Показано, что состав и рН буфера являются критичными для наблюдения за нейтрофильными гранулоцитами в витальном состоянии методом СЗМ. Оптимально наблюдения вести в физиологическом растворе (рН 7,2), либо в забуференном растворе Хенкса (рН 7,2). В фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), в небуферном растворе Хенкса (рН меняется в ходе эксперимента с 7,2 до 8,2) клетки демонстрируют реакцию набухания, свидетельствующую о неблагоприятном окружении для клетки.

9. Установлено, что ригидность мембран нейтрофилов, измеренная с помощью модуля Юнга и рассчитанная по модели Герца составляет 2,1 0,7 кПа. Проведение спектроскопии приводит к реакции набухания клеток, что отражается на морфологических параметрах нейтрофилов, но не влияет на ригидность их мембран. Поэтому исследование изменений клеточной морфологии и определение ригидности мембран нужно проводить в сериях независимых экспериментов.

10. Доказано, что инкубация нейтрофильных гранулоцитов с ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл) и с ЛПС E.coli O127:B8 (25 мкг/мл) вызывает сходные изменения в морфологии клеток, общая направленность которых: образование «апоптозоподобных» телец и увеличение ригидности мембраны свидетельствуют о реализации нейтрофильными гранулоцитами программы апоптоза.

11. В реакциях с экзогенным пероксидом водорода (концентрация от 3 до 25 мкМ/мл) отмечено два варианта клеточной гибели: некроз и не описанный ранее механизм «мумификации», сопровождающийся субнормальным увеличением ригидности мембраны. В результате исследования высоких концентраций экзогенного пероксида водорода зафиксировано значительное увеличение некротической гибели клеток, в то время как апоптоз нейтрофилов сохраняется приблизительно на одном уровне при разных концентрациях Н₂О₂ и не превышает уровня 15,9±5 %.

12. Зафиксирована токсическая активность квантовых точек CdSe/ZnS в отношении нейтрофильных гранулоцитов, которая может быть усилена фототоксичностью. В результате инкубации с квантовыми точками обнаружена функциональная гетерогенность нейтрофильных гранулоцитов: они разделялись на три фракции - (1) клетки, накапливающие квантовые точки в одном из компартментов, (2) клетки, окруженные ореолом квантовых точек, и (3) клетки, не поглощавшие квантовых точек.

резистентность лизоцим гранулоцит нейтрофил

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Плескова С.Н. Функциональные изменения в системе альтернативного каскада комплемента, инициированные стафилококком / С.Н. Плескова // Нижегородский медицинский журнал. - 2000. - №2. - С. 25-28.

2. Плескова С.Н. Принцип стандартизации оценки функциональной активности альтернативного пути активации комплемента / С.Н. Плескова, А.Н. Маянский //Иммунология. - 2000. - №4. - С. 61-62.

3. Плескова С.Н. Стандартизация методов изучения ингибиторной активности в системе альтернативного пути активации комплемента / С.Н. Плескова, А.Н. Маянский // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - С. 25.

4. Плескова С.Н. Кондиционирование альтернативного каскада комплемента в системе со стафилококком / С.Н. Плескова, А.Н. Маянский //Иммунология. - 2001. - №5. - С. 30-33.

5. Плескова С.Н. Исследование морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов методом сканирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, М.Б. Звонкова, Ю.Ю. Гущина // Морфология. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 2005. - Т.127. - №1. - С. 60 - 62.

6. Гущина Ю.Ю. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии / Ю.Ю. Гущина, С.Н. Плескова, М.Б. Звонкова // Поверхность. Рентгеновские, синхронные и нейтронные исследования. - 2005. - №1. - С. 48 - 53.

7. Плескова С.Н. Использование метода сканирующей зондовой микроскопии в биомедицинских исследованиях / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Вестник Нижегородского университета. Серия биология. Выпуск 1 (7). Электромагнитные поля и излучения в биологии и медицине. - Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2004, С. 127 - 134.

8. Плескова С.Н. Исследование морфологии и ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов в режиме реального времени методом сканирующей зондовой микроскопии / С. Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова, А.Е. Хомутов //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - т. 141. - №6. - С. 712 - 715.

9. Плескова С.Н. Исследование морфологической структуры буккальных эпителиоцитов / С. Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова, А.Е. Хомутов // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Биология. Выпуск 1 (11). - Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2006, С. 170 - 173.

10. Pleskova S. N. Research of neutrophils reaction on the lipopolisaccharides by atomic force microscopy / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // The FEBS Journal. - 2006. - V. 273, Р. 110.

11. Плескова С.Н. Особенности морфологии нейтрофилов, исследованные методом сканирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина // Цитология. - 2007. - т. 49. - № 9. - С. 783 - 784.

12. Плескова С.Н. Различия в функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с квантовыми точками / С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, Ю.Ю. Гущина, Е.А. Сергеева, Т.А. Здобнова, С.М. Деев, И.В. Турчин// Принята к печати в журнал «Морфология».

Статьи, опубликованные в иностранных изданиях:

13. Pleskova S.N. Morphological investigation of human blood neutrophil phagocytosis in vitro by AFM/ S.N. Pleskova, M.I. Zaslavskaja, Yu.Yu. Guschina, I.A. Koksharov, Yu.G. Erastova // Physics of low-dimensional structures, ѕ (2001) pp. 229 - 236.

14. Pleskova S.N. Investigation of the influence of complement system on the various strains of Proteus by methods of atomic force microscopy and luminol-dependent chemiluminescence / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova// Physics of low-dimensional structures, Ѕ (2004) pp. 77 - 81.

Статьи в сборниках научных трудов:

15. Плескова С.Н. Проявление активности протея в системе альтернативного каскада комплемента / С.Н. Плескова, И.А. Зубарева, Е.Н. Сулимова// Сборник научных работ «Актуальные проблемы медицины», Томск, 2004 г., т. 3, №2 C.302 - 304.

16. Плескова С.Н. Изучение литической активности лизоцима слюны в отношении Micrococcus lysodeikticus методом санирующей зондовой микроскопии / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина, М.Б. Звонкова // Сборник научных работ «Актуальные проблемы медицины», Томск, 2004 г., т. 3, №2 С. 304 - 305.

17. Рацюк М.М. Изменение активности лизоцима и биохимических показателей ротовой жидкости на фоне проведения профилактических мероприятий/ М.М. Рацюк, С.Н. Плескова// Сборник научных статей «Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической стоматологии» - 2005. - 169-175 с.

18. Гущина Ю.Ю. Морфометрический АСМ-анализ клеток крови в норме и при альтерациях / Ю.Ю. Гущина, С. Н. Плескова, В.Н. Крылов, Н.А. Преснухина, М.И. Заславская, И.А. Кокшаров // «Электромагнитные поля и излучения в биологии и медицине: межвузовский сборник научных трудов». - Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2006. - 24 - 34 с.

19. Весновских Е.Ю. Гибель нейтрофильных гранулоцитов по механизмам апоптоза и некроза при внесении Н₂О₂ разной концентрации / Е.Ю. Весновских, С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина //Межвузовский сборник научных трудов «Современный мир, природа и человек», Томск, 2007 г., т. 4, №4, с. 62.

Статьи, опубликованные в материалах международных конференций и конгрессов:

20. Плескова С.Н. Нарушения в системе альтернативного пути активации комплемента, ассоциированные со стафилококком / С.Н. Плескова // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000». - Вып. 4. - 2000. - 58-59 с.

21. Koksharov I.A. Discreteness of erythrocyte membrane functional states: 2-fold transitions in response to an oxidative activation / I.A.Koksharov, A.G. Sanin, Yu.Yu. Guschina, M.I. Zaslavskaja, S.N. Pleskova, A.A. Mironov // Proceedings of the Scanning Probe Microscopy - 2001 Workshop 26 - February - 1 March 2001, Nizhny Novgorod, Russia pp. 179 - 181.

22. Звонкова М.Б. Изучение структурно-морфологических параметров эпителиальных клеток трахеи и интестинального тракта методом сканирующей зондовой микроскопии / М.Б. Звонкова, С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина// 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука ХХI века», Сборник тезисов, 2004 г.

23. Pleskova S.N. Influence of methods of fixing on structural and morphological parameters of human cells of blood reveal by scanning probe microscopy / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // Proceedings of the Scanning Probe Microscopy - 2004 Workshop 2 6 May 2004, Nizhny Novgorod, Russia pp. 256 - 258.

24. Guschina Yu. Yu. Influence of methods of fixing on structural and morphological parameters of human cells of blood reveal by scanning probe microscopy / Yu. Yu. Guschina, S. N. Pleskova, M. B. Zvonkova // Abstracts EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology 2004 7 - 9 July, Oeiras, Portugal p. 15

25. Pleskova S.N. Investigated of the factor nonspecific defenses of oral cavity (lysozyme and buccal epithelium) by scanning probe microscopy / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // Abstracts EMBO/FEBS Workshop AFM applications in Biology 2004 7 - 9 July, Oeiras, Portugal p. 17

26. Pleskova S.N. Apoptosis of the Human Neutrophils under a Lipopolisaccharide (LPS) of Proteus mirabilis Condition Observed in Real Time by Atomic Force Microscopy (AFM) / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, M. B. Zvonkova // NSTI-Nanotech 2005, ISBN 0-9767985-0-6 Vol.1, pp. 377 - 380.

27. Pleskova S.N The influence of quantum dots on the morphology of neutrophil granulocytes / S. N. Pleskova, Yu. Yu. Guschina, I.V. Balalaeva // Proceedings of International symposium “Topical problems of biophotonics” 4 - 11 august, 2007, Nijny Novgorod - Moskow, p. 182 - 184.

28. Плескова С.Н. Изменения нейтрофильных гранулоцитов в средах с разными значениями рН при механическом воздействии на клетки / С.Н. Плескова, Ю.Ю. Гущина // Materiaіy IV Miкdzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji 1 - 15 czerwca 2008, Tym 16, Przemyњl, Nauka I studia, 2008. - s. 45 - 47.

29. Весновских Е.Ю. Морфологические изменения нейтрофилов, исследованных методом сканирующей зондовой микроскопии / Е.Ю. Весновских, С.Н. Плескова // Материалы II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» 15 - 16 сентября, Казань, с. 154 - 155.

30. Гиматдинова Э.Р. Цитотоксический эффект квантовых точек на нейтрофильные гранулоциты / Э.Р. Гиматдинова, С.Н. Плескова // Материалы II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» 15 - 16 сентября, Казань, с. 155 - 156.

31. Весновских Е.Ю. Морфологические изменения нейтрофилов / Е.Ю. Весновских, С.Н. Плескова // Сборник тезисов Пущино - 2008, 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, с. 123 - 124.

32. Гиматдинова Э.Р. Морфологическая неоднородность нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками / Э.Р. Гиматдинова, С.Н. Плескова // Сборник тезисов Пущино - 2008, 12-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, с. 172 - 173.

33. Плескова С.Н. Проявление токсичности квантовых точек в реакциях с нейтрофилами / С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, Ю.Ю.Гущина, Э.Р. Гиматдинова, Е.А. Сергеева // I Международный конгресс по нанотехнологиям, конференция «Нанотехнологии в онкологии», Москва. - 2008.

Статьи в региональных изданиях и материалах конференций:

34. Плескова С.Н. Характеристика альтернативного пути активации комплемента в системе с нейтрофильными гранулоцитами в состоянии апоптоза / С.Н. Плескова, М.И. Заславская, А.Н. Маянский // Тезисы докладов II Всероссийского симпозиума «Хроническое воспаление», 2000. - 59-60 с.

35. Плескова С.Н. Особенности антиопсонической активности различных штаммов стафилококка / С.Н. Плескова // Материалы 65-й конференции молодых ученых и студентов. - Курск: КГМУ. - 2000. - с. 50-51.