Нейропротективные эффекты и механизмы гипоксического прекондиционирования

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Одной из центральных проблем биологии и медицины является выяснение влияния внешней среды на организм, особенно при действии неблагоприятных повреждающих факторов. Решение этой проблемы имеет важное значение для раскрытия эндогенных защитных механизмов, лежащих в основе приспособительных реакций организма к факторам среды, с целью разработки новых эффективных способов повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям (гипоксии/ишемии, различным стрессорам и др.). Эти экстремальные воздействия приводят к структурно-функциональным повреждениям нейронов чувствительных образований мозга и развитию патологий, в частности, постгипоксических состояний и постстрессовых тревожно-депрессивных расстройств. Такие патологические состояния отличаются высокой распространенностью, их частота в мире неуклонно возрастает. Поэтому повышение устойчивости мозга к повреждающим факторам является крайне актуальной задачей. В настоящее время существует два подхода к решению этой задачи: использование медикаментозных (фармакологических) средств и немедикаментозных способов, направленных на мобилизацию эндогенных зволюционно приобретенных генетически-детерминированных защитных механизмов. Одним из наиболее эффективных немедикаментозных способов является прекондиционирование. Прекондиционирование - это предъявление кратковременных умеренных доз повреждающих факторов, повышающее резистентность мозга к неблагоприятным воздействиям. Выделяют несколько видов прекондиционирующих воздействий, в частности, гипоксическое/ишемическое, химическое (фармакологическое), термическое и др. Наиболее распространенный и достаточно хорошо изученный вид прекондиционирования - гипоксическое/ишемическое, впервые использованное на сердце в 1986 (Murry et al., 1986). Гипоксическое/ишемическое прекондиционирование активно применяется в кардиохирургии и кардиологии в качестве эффективного кардиопротективного способа (Ратманова, 2008; Rezkalla and Kloner, 2007).

Обнаружение и расшифровка феномена ишемической/гипоксической толерантности мозга - повышения резистентности нейронов путем «тренировки» прекондиционирующими умеренными гипоксическими/ишемическими воздействиями явилось одним из важнейших достижений нейробиологии конца XX столетия. На гиппокампе монгольских песчанок было продемонстрировано, что кратковременные воздействия сублетальной ишемией предотвращают гибель чувствительных пирамидных нейронов области СА1 в ответ на последующую глобальную ишемию (Kitagawa et al.,1990). Впоследствии этот феномен был воспроизведен в моделях гипоксии/ишемии на нейронах других уязвимых образованиях мозга различных животных (неокортексе, стриатуме), как in situ, так и in vitro (Самойлов и др., 2001; Kato et al., 1992; Miashita et al., 1994; Simon et al., 1993; Bruer et al., 1997; Hassen et al., 2004). В отличие от сердца, где гипоксическое/ишемическое прекондиционирование представляет собой одну из наиболее хорошо изученных кардиопротективных стратегий, механизмы толерантности мозга, индуцируемые гипоксическим/ишемическим прекондиционированием, исследован значительно хуже.

Согласно современным представлениям, в процессе формирования нейропротективных эффектов прекондиционирования выделяются две фазы. Начальная фаза - фаза индукции гипоксической толерантности мозга, обусловлена быстрой умеренной активацией глутаматергической сигнальной трансдукции и ключевых внутриклеточных регуляторных систем (кальциевой, фосфоинозитидной, цАМФ) (Самойлов и др., 1992, 1994; Самойлов, Мокрушин, 1997; Semenov et al., 2000; Самойлов и др., 2001; Semenov et al., 2002), а также умеренной активацией внутриклеточной прооксидативной системы (образование активных форм кислорода, свободных радикалов) (Ravati et al., 2000; Mori T et al., 2000; Furuichi T et al., 2005; Perez-Pinzon M et al., 2005). Инициация фазы индукции, очевидно, обусловлена изменениями как внутриклеточного редокс-состояния, содержания внутриклеточного кальция (Самойлов, 1999), так и регуляторной функции митохондрий (Лукьянова, 2008). Эти быстро индуцируемые прекондиционированием механизмы являются необходимым звеном для индукции отсроченных геном-зависимых механизмов (фаза экспрессии гипоксической толерантности), благодаря которым развивается полноценный протективный эффект гипоксического/ишемического прекондиционирования (Самойлов и др., 2003; Steiger and Hanggi, 2007; Obrenovitch, 2008). Однако до настоящего времени отсроченные геном-зависимые механизмы гипоксического/ишемического прекондиционирования исследованы недостаточно, а работы по этой проблеме носят разрозненный характер. Концептуальное осмысление имеющихся сведений осложняется тем, что эти данные получены в различных моделях ишемии и гипоксии. Требуется последовательное и комплексное изучение геном-зависимых механизмов протективных эффектов прекондиционирования в одной модели на всех уровнях, начиная от сигнальных каскадов и активности транскрипционных факторов и до экспрессии регулируемых ими генов и их продуктов. Необходимо также оценить характер протективного действия гипоксического прекондиционирования на структурно-функциональные повреждения мозга, индуцируемые не только тяжелыми гипоксическими/ишемическими, но и различными стрессорными воздействиями (т.е. кросс-толерантность), что несомненно имеет важное значение для определения возможного спектра применения этого вида прекондиционирования в клинической практике. Удобной экспериментальной моделью для подобного исследования является гипобарическая гипоксия, создаваемая в барокамере, поскольку она легко контролируется и дозируется, что создает возможности для ее применения в различных режимах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования явилось изучение нейропротективных эффектов и молекулярных механизмов, индуцируемых прекондиционирующим воздействием умеренной гипобарической гипоксии.

В основные задачи работы входило:

1. Разработать способ гипоксического прекондиционирования с применением умеренной гипобарической гипоксии на экспериментальных животных - крысах.

2. Определить выраженность протективных эффектов гипоксического прекондиционирования на структурно-функциональные повреждения мозга, вызываемые тяжелой гипоксией.

3. Охарактеризовать эффективность антидепрессивного и анксиолитического действия гипоксического прекондиционирования в моделях постстрессовых тревожно-депрессивных патологий у крыс.

4. Изучить молекулярные нейропротективные механизмы прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией при предъявлении тяжелой повреждающей гипоксии: влияние прекондиционирования на модификацию активности МАП-киназного каскада, факторов регуляции апоптоза семейства генов bcl-2, транскрипционных факторов, генов раннего и позднего действия и их продуктов, вовлекаемых во внутриклеточные процессы нейропластичности, выживания/гибели нейронов.

5. Исследовать гормон-зависимые механизмы нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования, включающие особенности функционирования гипофизарно-адренокортикальной, кортиколиберин-ергической и вазопрессинергической систем у прекондиционированных и непрекондиционированных животных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией оказывает выраженные нейропротективные эффекты, предотвращая структурно-функциональные повреждения мозга, вызываемые тяжелой гипоксией.

2. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией обладает выраженным антидепрессивным и анксиолитическим действием, корректируя формирование постстрессовых тревожно-депрессивных патологий.

3. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией вызывает активацию внутриклеточных молекулярных механизмов, повышающих резистентность мозга к повреждающим воздействиям. Ключевым звеном этих механизмов является кооперативная активация транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию про-адаптивных генов и их продуктов, играющих важную роль в процессах нейропротекции и нейропластичности.

4. В формирование протективных эффектов прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией вовлекаются гормон-зависимые механизмы регуляции адаптивных функций организма. Повышение стрессореактивности гипофизарно-адренокортикальной системы и стимуляция механизмов ее регуляции по принципу обратной связи, индуцируемые гипоксическим прекондиционированием, способствуют повышению адаптивных возможностей организма.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ Предложен новый оригинальный способ прекондиционирования с использованием умеренной гипобарической гипоксии, эффективно повышающий толерантность мозга к повреждающим факторам различной природы (тяжелая гипоксия, психоэмоциональный и травматический стресс). Впервые изучены как нейропротективное действие гипоксического прекондиционирования в условиях тяжелой гипоксии, так и его антидепрессивные и анксиолитические эффекты в экспериментальных моделях депрессии и тревожного расстройства. Установлено, что воздействие умеренной гипоксией в определенном режиме предотвращает структурно-функциональные повреждения нейронов мозга вслед за тяжелой гипоксией и препятствует развитию постстрессовых тревожно-депрессивных патологий у крыс, что свидетельствует об универсальности механизмов индуцируемого гипоксическим прекондиционированием повышения резистентности мозга к различным повреждающим воздействиям. Сравнительный анализ выраженности антидепрессивного и анскиолитического действия гипоксического прекондиционирования относительно эффективности известных фармакологических препаратов (антидепрессантов, анксиолитиков), проведенный в экспериментальных моделях депрессии и тревожных расстройств, впервые продемонстрировал широкие возможности использования гипоксического прекондиционирования для профилактики и лечения тревожно-депрессивных расстройств.

Впервые с использованием единой экспериментальной модели в значительной мере раскрыты нейрональные молекулярные механизмы, лежащие в основе нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования у крыс. Установлено, что гипоксическое прекондиционирование индуцирует базисные геном-зависимые механизмы адаптации, нейропластичности и нейропротекции, направленные на репрограммирование экспрессии участвующих в процессах выживания/гибели нейронов внутриклеточных регуляторных компонентов и проадаптивных белков в условиях предъявления повреждающих воздействий. В частности, прекондиционирующее воздействие модифицирует соотношение факторов регуляции апоптоза, обеспечивая преобладание антиапоптотических белков, а также способствует устойчивой кооперативной активации транскрипционных факторов CREB, NF-kB, NGFI-A, c-Fos, HIF-1 и их генов-мишеней, кодирующих белки, широко вовлекающиеся в адаптивные реакции - антиоксиданты, нейрогормоны, стероидные рецепторы, металлопротеазы. Кроме того, прекондиционирование, очевидно, предотвращает развитие нейродегенеративных процессов путем стимуляции неамилоидогенного процессинга белка-предшественника в-амилоида.

Получены новые данные о важной роли гормон-зависимых механизмов адаптации в формировании толерантности мозга, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием. Впервые показано, что прекондиционирование умеренной гипоксией предотвращает возникновение нарушений динамики активации гипофизарно-адренокортикальной системы и ее регуляции по механизмам обратной связи в условиях тяжелых патогенных воздействий (тяжелой гипоксии, психоэмоциональных и травматических стрессов). Обнаружено, что это осуществляется посредством индуцируемых прекондиционированием устойчивых модификаций механизмов нейроэндокринной регуляции (активности кортиколиберин- и вазопрессинергической систем мозга, стероид-рецептирующей функции гиппокампа), способствующих переводу эндокринной системы в новый режим функционирования. Этот режим характеризуется усилением стрессореактивности гипофизарно-адренокортикальной системы и потенциацией механизмов глюкокортикоидной обратной связи, что отражает повышение адаптивных возможностей гипофизарно-адренокортикальной системы и организма в целом в условиях действия повреждающих факторов.

В целом, полученные в данном исследовании новые сведения и сформулированные на их основе представления об универсальных принципах формирования толерантности мозга, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием, носят приоритетный характер и в значительной мере опережают аналогичные разработки как в России, так и за рубежом.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы нейробиологии, связанной с расшифровкой эндогенных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышение резистентности мозга и организма в целом к патогенному действию неблагоприятных факторов. Совокупность полученных данных имеет весомое значение для развития современных представлений о феномене толерантности и кросс-толерантности мозга, индуцируемой гипоксическим прекондиционированием, и раскрытие лежащих в основе ее формирования внутриклеточных процессов. На основании проведенных исследований обосновывается представление о том, что прекондиционирование - это воздействие, «подготавливающее» мозг и организм в целом к эффективному противодействию неблагоприятным факторам путем стимуляции молекулярных и гормональных механизмов адаптации. Это представление не только выявляет общность феномена прекондиционирования и «предупредительной сигнализации» по И.П.Павлову, но и вносит значительный вклад в понимание молекулярно-клеточных основ такого рода сигнализаций.

Большая теоретическая значимость проведенного исследования также связана с тем, что удалось не только установить широкий спектр нейропротективных эффектов предложенного способа гипоксического прекондиционирования на различных уровнях (от морфологических изменений нейронов до поведения и гормональных функций), но и выявить внутриклеточные каскадные механизмы, посредством которых реализуется нейропротективное действие гипоксического прекондиционирования. Эти сведения существенно расширяют современные представления о нейрональных механизмах фенотипической пластичности, лежащей в основе повышения адаптивных возможностей организма к экстремальным воздействиям.

Важное значение имеют новые факты, свидетельствующие об эффективности протективного действия гипоксического прекондиционирования от патологических последствий тяжелых психоэмоциональных и травматических стрессов. Эти сведения существенно углубляют представления об обусловленной им кросс-толерантности мозга, а также возможностях повышения устойчивости мозга к стрессам различной природы и механизмах, реализующих антидепрессивные и анксиолитические эффекты гипоксического прекондиционирования. Кроме того, полученные в ходе выполнения работы приоритетные данные о вовлечении базисных гормональных механизмов адаптации впервые раскрывают важную роль эндокринной и нейроэндокринной системы в формировании гипоксической толерантности.

Высокая практическая значимость работы определяется необходимостью разработки эффективных стратегий повышения толерантности мозга и профилактики развития неврологических и нервно-психических патологий, возникающих в результате действия внутренних и внешних повреждающих факторов. В проведенных исследованиях впервые был продемонстрирован высокий нейропротективный потенциал оригинального способа гипоксического прекондиционирования с использованием умеренной гипобарической гипоксии, что открывает широкие возможности для внедрения предложенного способа в медицинскую практику в качестве новой, эффективной немедикаментозной стратегии, направленной на комплексную активацию эволюционно-приобретенных, генетически детерминированных нейропротективных механизмов. Согласно результатам полученных исследований, способ гипоксического прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией может представлять несомненный интерес для практического применения с целью профилактики постгипоксических патологий, постстрессовых депрессивных и тревожных расстройств. Вместе с тем, выявленные эндогенные механизмы нейропротективного действия прекондиционирования могут способствовать созданию нового поколения эффективных фармакологических препаратов, оказывающих направленное действие на ключевые звенья внутриклеточных защитных механизмов.

Основные положения и выводы работы могут быть полезны при чтении лекционных курсов по физиологии, патофизиологии, нейробиологии и теоретическим основам адаптационной медицины для студентов биологических и медицинских специальностей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы исследования были представлены на: Российско-Польском симпозиуме «Механизмы внутриклеточной сигнальной трансдукции как основа нейрональной пластичности при адаптивных и патологических состояниях» (Санкт-Петербург, 2001); Третьей всероссийской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002); BioScience 2004: from molecule to organism (18-22 July 2004. Glasgow, UK); 7th International conference:”Protective strategies for neurodegenerative diseases” (August 14-17, 2004. Vancouver, Canada); Всероссийской научно-практической конференции по психоэндокринологии памяти профессора А.И.Белкина (Москва, 24-26 мая 2004), конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (14-16 марта 2005 г. Москва); Всероссийской конференции молодых ученых «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 12-14 октября 2005); Международном симпозиуме «Mechanisms of adaptive behavior» (Санкт-Петербург, декабрь 2005); научной сессии молодых ученых, посвященной 80-летию Института физиологии им.И.П.Павлова РАН «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург, декабрь 2005); VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (21-24 June, 2006, Moscow); International Congress "Molecular basis of neurological and psychiatric disorders", (September 6-10, 2006, Martin, Slovak Republic); Российской конференции «Современные принципы терапии и реабилитации психически больных» (Москва, 11-13 октября 2006); Третьей международной выставки МЕДБИОТЕК-2006 "Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине" (Москва, 4-5 декабря 2006), XX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 4-8 июня, 2007); Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию акад. В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2007); Российской конференции "Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии" (Москва, 9-11 октября. 2007); Российско-Польском симпозиуме в рамках Дней Польской Науки в России «Hypoxic, ischemic preconditioning of brain» (Санкт-Петербург, 11-14 декабря 2008 г.); международных рабочих семинаров “Neuroprotective mechanisms of hypoxic preconditioning” в Institute of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds (Leeds, UK, 2005, 2008); Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, сентябрь, 2008); VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (29 сентября - 02 октября 2009, Санкт-Петербург).

1. Материалы и методы

гипоксический гормон нейропротективный прекондиционирование

Работа проведена на 754 самцах крыс линии Вистар весом 200-250 г. Для создания условий тяжелой гипоксии животных помещали в барокамеру проточного типа и ступенчато понижали давление до 180 мм.рт.ст. (продолжительность воздействия - 3 часа). Прекондиционирование осуществлялось путем трехкратного воздействия умеренной гипобарической гипоксией (давление в барокамере - 360 мм рт.ст.) Крысы подвергались умеренной гипобарической гипоксии трижды (продолжительность воздействия - 2 часа), с интервалом 24 часа. Через сутки после последнего сеанса прекондиционирования крысы подвергались тяжелой гипоксии или различным формам стресса.

Для морфологических исследований животных декапитировали, быстро извлекали мозг и фиксировали его в 4% параформальдегиде, формалине или молекулярном фиксаторе FineFix (Milestone, Italy) в течение 24 часов. Далее после стандартных гистологических процедур проводки и заливки в парафин изготавливали и монтировали на стекла срезы толщиной 7 мкм на уровне -2.80 мм от брегмы (Paxinos, Watson, 1986). Окрашивание по методу Ниссля производили в водном 0.1% -растворе толуидинового синего. Для выявления апоптоза в нейронах мозга крыс использовали NeuroTACs Apoptosis Detection kit (R&D Systems, Abingdon, UK), основанный на TUNEL методе. Для иммуноцитохимического анализа депарафинизированные срезы подвергали высокотемпературной демаскировке в цитратному буфере, после чего инкубировали с первичными поликлональными антителами к NGFI-A, HIF-1, pERK, pJNK, p-p38, кортиколиберину, АDAM15, ADAM17 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA), sAPP, pCREB (1:50, 1:100, Sigma), NF-kB (1:100, Calbiochem, UK), c-Fos, вазопрессину (1:500, Abcam, UK), глюкокортикоидным рецепторам (1:100, Calbiochem, UK; Santa Cruz Biotechnology, USA), тиоредоксину-1 и Mn-/Cu,Zn-супероксиддисмутазам (1:2000, StressGen Biotechnologies Corp), тиоредоксину-2 (предоставленные проф. G.Spyrou, Sweden) при +4°С в течение ночи. Далее проводили визуализацию реакции с использованием вторичной системы детекции Vectastain ABC system (Vector Labs., USA) и диаминобензидина (DAB Substrate kit, Vector Labs, USA). Для контрстейнинга часть срезов дополнительно окрашивали красителем Blue Counterstain (TAGS, UK).

Радиоактивную гибридизацию in situ проводили по методу Kononen, Pelto-Huikko (1997). Гибридизационные пробы антиоксидантов, ранних генов и металлопротеаз, представлявшие собой 45-членные олигонуклеотиды, были любезно предоставлены профессорами M.Pelto-Huikko (University of Tampere, Finland) и Ari Huovilla (FinnMed, Tampere, Finland). Для РТ-ПЦР выделенные области мозга крыс хранились при -20 С в RNAlater (Ambion, USA). Тотальную РНК выделяли согласно протоколу Chromszynski и Sacchi (1987), возможную примесь ДНК удаляли инкубацией с ДНКазой I (1 час, 37 С), обратную транскрипцию РНК в кДНК производили с использованием Superscript reverse transcriptase (Gibco-BRL) с поли-dT праймерами, РНК-матрицу разрушали РНКазой Н. ПЦР-ампплификация кДНК производилась с праймерами ADAM15 и ADAM17, предоставленными проф. Ари Хуовила (FINNMEDI, Tampere, Finland) и охарактеризованными подробно в публикации Karkkainen et al., 2000. Использовали полимеразу Dynazyme II (Finnzymes, Finland). Результаты ПЦР анализировались в агарозном геле. Идентификация продуктов ПЦР была подтверждена рестрикционным анализом и/или прямым сиквенсингом, для чего после электрофореза ПЦР-продукты были очищены от агарозного геля, используя экстракционные реагенты QIAquick (Qiagen).

Для Вестерн блот-гибридизационного анализа с использованием антител к pJNK (1:1000) и p-р38 (1:1000), sAPP (1:1000) крыс декапитировали и быстро извлекали исследуемые отделы мозга. Белок экстрагировался из образцов, содержащих в каждой эксперименальной группе гомогенизированную ткань от 4-х животных с использованием буфера RIPA. Надосадочную жидкость отбирали после центрифугирования в течение 30 мин при 15 000g, 40С. Концентрацию белка в экстрактах определяли спектрофотометрически по методу Брэдфорда. После чего экстракты нервной ткани, содержащие искомые белки, разделяли электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле (система Лэмли), на трис-глициновом буфере (pH 8.3) в присутствии 0.1% SDS. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры, используя аппарат для проведения полусухого блотинга. Нитроцеллюлозные фильтры последовательно инкубировали в растворах, содержащих первичные и вторичные (коньюгированные с пероксидазой хрена) антитела, согласно протоколу (система ECL, фирма Amersham). Экспонирование мембран с рентгеновской плёнкой проводили при комнатной температуре 1-20 мин, в зависимости от интенсивности свечения.

В качестве моделей психоэмоциональных стрессов, вызывающих развитие постстрессовых патологий, использовали модель эндогенной депрессии - парадигму «выученной беспомощности» (ВБ) и модель посттравматического стрессового расстройства - «стресс-рестресс». Для выработки ВБ крыс подвергали неизбегаемому электрокожному раздражению в клетках размером 13х16х26 см с токопроводящим полом с переменными временными интервалами раздражения и отдыха так, чтобы каждая крыса в течение часа получила по 60 ударов током (1мА, 50 Гц) каждый длительностью 15 с. В парадигме «стресс-рестресс» (Liberzon et al., 1997) животные подвергались воздействию тяжелого травматического стресса состоящего из 2-часовой иммобилизации, 20-минутного вынужденного плавания и, после 15-минутного перерыва, эфирного стресса. Триггером для развития тревожного патологического состояния являлся рестресс, заключавшийся в 30-минутном иммобилизационном стрессе. Для фармакологической коррекции применяли антидепрессанты людиомил (Novartis Pharma, USA, 15 мкг/кг, трехкратно) и паксил (GlaxoSmithKline, UK, 20 мг/кг, трехкратно).

Поведение животных исследовали с использованием стандартных методов - «открытого поля» (Holl, 1936), приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) (Pellow et al., 1985), обучения условному рефлексу пассивного избегания (Ватаева и др.,2004).

О стрессореактивности ГАС судили по динамике ее активации в ответ на 20- и 30-мин иммобилизационный стресс. Для изучения регуляции ГАС по механизмам глюкокортикоидной обратной связи применяли классический дексаметазоновый тест (Zhukov, 1993) и собственную модификацию теста на быструю обратную связь (заявка на патент № 2009110630/14). Содержание кортикостерона в плазме крови определяли радиоиммунным методом с использованием собственных антисывороток (Ordyan et al., 2001).

Результаты иммуноцитохимических исследований и in situ гибридизации анализировались и обрабатывались количественно с помощью морфометрической установки, компьютерной системы анализа изображений и программ Image Pro-Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) и ВидеоТест Мастер Морфология (ООО “Видео Тест”, Санкт-Петербург). Данные обрабатывали статистически по критериям Стьюдента, Вилкоксона, Манна-Уитни или методами дисперсионного анализа ANOVA (программы Statistica 6.0, Statsoft Inc., USA; SPSS, SPSS Inc., USA), с достоверностью различий при p0.05. Применяли также методы post-hoc анализа, в частности тест Даннета для неоднородных выборок. Данные представлены в виде: среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

2. Результаты и обсуждение

Нейропротективные эффекты прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией.

Тяжелая гипобарическая гипоксия (ТГ) приводит к выраженным структурным повреждениям нейронов СА1, СА2, СА3, СА4 областей гиппокампа и неокортекса крысы. В гиппокампе и фронто-париетальном неокортексе непрекондиционированных (не-ГП) животных после ТГ обнаруживалось большое количество нейронов с признаками хроматолиза, вакуолизации цитоплазмы или гиперхроматоза, пикноза. К 7-суточному сроку после ТГ отмечалось снижение общего числа выживших нейронов в этих образованиях мозга, в частности, в СА1 гиппокампа потеря нейронов составляла 35%. Наряду с морфологическим анализом деструктивных изменений нейронов чувствительных областей после ТГ проводилась детекция поврежденных по типу апоптоза нейронов с применением метода TUNEL. У не-ГП крыс через 3 суток после ТГ обнаруживалось большое количество TUNEL-позитивных клеток во всех исследованных областях мозга - СА1, СА2-СА3, СА4 полях гиппокампа и фронто-париетальном неокортексе (рис.1). У прекондиционированных (ГП-) животных после ТГ значительно снижалось количество поврежденных и погибших нейронов во всех исследуемых образованиях мозга. Вместе с тем, нужно отметить, что как в гиппокампе, так и неокортексе встречались единичные диффузно локализованные гиперхромные и пикнотические нейроны. Экспозиция животных прекондиционирующей умеренной гипоксии существенно снижала количество TUNEL-позитивных клеток в ответ на ТГ (рис.1). Таким образом, ГП с использованием умеренной гипобарической гипоксии по предложенной схеме оказывает выраженный нейропротективный эффект, предотвращая повреждения и гибель нейронов чувствительных областей мозга, а также запуск апоптоза после воздействия ТГ.

Рис. 1. Количество TUNEL-позитивных клеток после ТГ у непрекондиционированных (n=8, черные столбики) и прекондиционированных (n=6, белые столбики) крыс

* - различия статистически достоверны по сравнению с контролем (Р?0,05).

Наряду с этим установлено, что ГП предотвращает не только структурные повреждения, но и нарушения высших функций мозга, в частности способствует сохранению следов памяти в условиях ТГ, что оценивали по показателям условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Воспроизведение навыка УРПИ, приобретенного за 60 мин до экспозиции ТГ, ГП-крысами практически не отличалось от контрольной группы, в то время как у не-ГП крыс ТГ значительно нарушала воспроизведение и удержание навыка. Таким образом, ГП предотвращало нарушения воспроизведения и удержания приобретенного навыка, возникающие вследствие действия ТГ.

Большую группу неблагоприятных факторов, доля которых неуклонно возрастает, составляют различные психоэмоциональные стрессы и психотравмирующие ситуации, которые в тяжелых случаях приводят к возникновению острых дезадаптивных состояний с последующим развитием постстрессорных патологий, в первую очередь тревожно-депрессивных. Нередко тревожно-депрессивные расстройства возникают вследствие влияния не психоэмоциональных, а физических повреждающих воздействий, в частности гипоксии/ишемии. Нами была выдвинута гипотеза о возможной кросс-толерантности мозга, формирующейся в результате ГП, к тяжелым патогенным формам психоэмоциональных стрессов. С целью проверки этого предположения мы исследовали устойчивость ГП-животных к тяжелым формам стресса - психоэмоциональному стрессу и травматическому стрессу в экспериментальных моделях «выученной беспомощности» и «стресс-рестресс», соответственно. Неизбегаемый неконтролируемый стресс в парадигме «выученной беспомощности» у не-ГПкрыс приводил к развитию устойчивого депрессивноподобного состояния (стойком снижении горизонтальной и вертикальной двигательной активности, увеличении времени замираний) в «открытом поле» (рис.2, А-В), увеличению тревожности в ПКЛ (рис.2, Г), а также повышению базального уровня кортикостерона в крови и нарушению торможения гипофизарно-адренокортикальной системы в дексаметазоновом тесте (рис.2, Д, Е). Введение антидепрессанта людиомила (15 мг/кг, в/б, 3 дня) эффективно корректировало депрессивноподобное состояние, индуцируемое у крыс в этой парадигме. Однако при этом отмечался ряд побочных эффектов антидепрессанта - резкое снижение груминга и редукция уровня кортикостерона в крови.

ГП полностью предотвращало развитие патологических последствий психоэмоционального стресса. ГП-крысы достоверно не отличались от контрольных особей по уровню двигательной активности, продолжительности замирания и коэффициенту тревожности (рис.2). Наряду с выраженным антидепрессивным эффектом на поведение, ГП восстанавливало нормальный уровень глюкокортикодов в крови и показатели дексаметазонового теста (рис.2), что свидетельствует о нормализации функции ГАС. При использовании ГП значение всех регистрируемых в эксперименте показателей нормализовалось, то есть ГП не оказывало нежелательных побочных эффектов.

Особую форму стресса представляет собой травматический стресс. Этим понятием определяют воздействия психотравмирующих стрессоров высокой интенсивности, несущие реальную или осознаваемую угрозу жизни. В результате такого сверхэкстремального воздействия развиваются острые или отсроченные тревожные патологии, объединяемые в группу посттравматических стрессовых расстройств (ПТСР).

В «стресс-рестресс» модели ПТСР предъявление животным, ранее пережившим тяжелый травматический стресс, кратковременного иммобилизационного стресса (рестресс) приводила к формированию у них устойчивого тревожного состояния, проявлявшегося в резком снижении центральной и общей двигательной активности в «открытом поле» и еще более значительном увеличении тревожности в ПКЛ (рис. 3). Антидепрессант паксил оказывал заметный анксиолитический эффект, в значительной мере предотвращая снижение двигательной активности в «открытом поле» на 1-е сутки после рестресса и возвращая к норме уровень тревожности в ПКЛ на 5-е сутки, однако одновременно с этим паксил вызывал ряд побочных эффектов. С целью изучения возможного протективного действия ГП нами применялись две схемы воздействия умеренной гипобарической гипоксией в отработанном режиме. В эксперименте 1 ГП производили перед первым (тяжелым травматическим) стрессом, а в эксперименте 2 ГП предшествовало второму стрессу (рестрессу). Было установлено, что ГП эффективно корректировало развитие экспериментального тревожного состояния у крыс в парадигме «стресс-рестресс», причем этот протективный эффект проявлялся в обоих экспериментах, хотя его выраженность была различной.

Рис. 2. Гипоксическое прекондиционирование предотвращает развитие депрессивноподобного состояния (А, Б, В, Г) и нарушения функции гипофиз-адреналовой системы (Д, Е) у крыс в парадигме «выученной беспомощности». А, горизонтальная двигательная активность в «открытом поле»; Б, вертикальная двигательная активность в «открытом поле»; В, время неподвижности в «открытом поле»; Г - уровень тревожности; Д, уровень кортикостерона в плазме крови; Е, величина подавления стрессорного уровня кортикостерона (Д) в дексаметазоновом тесте. ДЕКС, дексаметазон, 5 мкг/кг. ВБ, «выученная беспомощность» (n=7); ПК+ВБ, ВБ у прекондиционированных крыс (n=6); контрольная группа (n=8). * - различия достоверны по отношению к контролю (Р?0,05); **- различия достоверны по отношению к ВБ (Р?0,05)

В эксперименте 1 ГП полностью предотвращало развитие тревожного состояния, в то время как в эксперименте 2 анксиолитический эффект ГП оказался более значительным - уровень тревожности животных снижался ниже контрольного уровня (рис.3).

Кроме того, в отличие от антидепрессанта, ГП не снижало двигательную активность и не оказывало побочного эффекта на груминг в использованных тестах.

Рис. 3. Влияние ГП на поведение крыс в «открытом поле» (А) и приподнятом крестообразном лабиринте (Б) после стресса-рестресса в экспериментальной модели ПТСР. Эксперимент 1 -ГП предшествовало травматическому стрессу; эксперимент 2 - ГП предъявлялось перед рестрессом. ЛАц, центральная активность; ЛА, периферическая горизонтальная двигательная активность; центр, время пребывания в центре; ОР, время в открытых рукавах; ЗР, время в закрытых рукавах

Таким образом, ГП в предложенном нами режиме оказывает выраженное нейропротективное действие, предотвращая структурные и функциональные повреждения мозга в условиях тяжелых повреждающих воздействий различной природы. Исключительно важным как с теоретической, так и с практической точки зрения представляется тот факт, что нейропротективное действие ГП проявляется вне зависимости от модальности предъявляемого повреждающего фактора. Ранее было известно проявление кросс-толерантности мозга к гипоксии, ишемии и токсинам, то есть факторам, механизмы повреждающего действия которых, включающие оксидативный стресс, во многом родственны (Gidday et al. (1994, 1999), Tauskela et al., 2006). В нашей работе удалось впервые продемонстрировать эффективность гипоксического прекондиционирования мозга по отношению к действию принципиально других повреждающих факторов - психоэмоциональных и травматических стрессов, патогенное действие которых основано на расстройствах системных и неспецифических механизмов адаптации. Исходя из этого становится очевидным, что индуцируемая гипоксическим прекондиционированием кросс-толерантность мозга - явление универсальное, представляющее собой неспецифическое повышение резистентности нейронов мозга к различным вредным факторам.

Полученные результаты имеют важное как теоретическое, так и практическое значение. Прикладной аспект связан с тем, что наши данные существенно расширяют современные представления о терапевтическом потенциале гипобарической гипоксии, используемой в режиме ГП. Как хорошо известно, умеренная гипобарическая гипоксия - это естественное воздействие, встречающееся в условиях пребывания в горах на определенной высоте. Гипобарическая гипоксия в режиме долговременной адаптации (тренировки многократными сеансами слабой гипоксии) применяется в клинике для гипобаротерапии различных заболеваний, включающих бронхиальную астму, аллергию, сердечно-сосудистые заболевания (Колчинская, 1991; Ушаков и др., 2004). Используемый нами режим ГП умеренной гипобарической гипоксией имеет принципиальные отличия от этого способа так как вызывает срочную активацию эндогенных протективных механизмов, обеспечивающих повышение устойчивости мозга. В наших исследованиях показано, что ГП с использованием умеренной гипобарической гипоксии может использоваться не только для профилактики постгипоксических или постишемических нарушений, но и патологий, вызываемых различными формами стресса. Кроме того, существенным моментом является то, что ГП оказалось достаточно эффективным как в качестве превентивного воздействия, так и в качестве терапевтического средства для коррекции развития постстрессорных патологий у особей, переживших психотравматизацию. Все вышеизложенное свидетельствует о большом терапевтическом потенциале ГП и широких возможностях его использования в клинике в качестве немедикаментозного способа, повышающего устойчивость мозга к действию различных повреждающих факторов (гипоксии/ишемии, психоэмоциональных и травматических стрессов). Необходимо проведение тщательного изучения молекулярно-клеточных и гормональных механизмов, активируемых умеренной гипобарической гипоксией в режиме ГП и лежащих в основе ее протективного эффекта. В этом и заключается важнейший теоретический аспект исследуемой проблемы, поскольку раскрытие механизмов, активируемых ГП, должно внести существенный вклад в современные представления о ключевых эндогенных механизмах нейропротекции, на основании которых может быть разработана стратегия создания фармакологических средств нового поколения для профилактики и лечения неврологических и психиатрических болезней.

Молекулярно-клеточные механизмы повышения устойчивости мозга, активируемые гипоксическим прекондиционированием.

Согласно современным представлениям, процесс формирования толерантности мозга, индуцируемой прекондиционированием, включает фазы индукции и экспрессии. Быстро индуцируемые механизмы (фаза индукции), проявляемые в первые 60 мин, связаны с активацией протеинкиназ и протеаз и последующей посттрансляционной модификацией белков ионных каналов и рецепторов (Nakase et al., 2000; Steiger, Hangii, 2007; Shpargel, 2008). Фаза экспрессии, определяющая устойчивую толерантность, выявляемую через 24 часа и более, связана с экспрессией генов и синтезом «de novo» защитных белков (Самойлов и др., 2004; Kirino, 2002; Stenzel-Poore et al., 2007; Shpargel, 2008; Obrenovitch, 2008). Фаза экспрессии была описана во всех известных моделях прекондиционирования как in vivo, так и in vitro и ее длительность составляет от 7 до 14 дней (Ueda and Novak, 2005).

Ранее в лаборатории регуляции функций нейронов мозга Института физиологии им. И.П. Павлова РАН были детально исследованы нейрональные перестройки, происходящие в раннюю фазу формирования толерантности мозга, вызываемой ГП. В частности, на переживающих срезах обонятельной коры было показано, что предъявление кратковременной прекондиционирующей аноксии (2 мин) предотвращает подавление фокальных постсинаптических потенциалов, вызываемое долговременной аноксией (10 мин) (Самойлов, Мокрушин, 1998). Наряду с этим выявлено, что ГП нивелирует индуцируемые долговременной аноксией изменения содержания внутриклеточного связанного и свободного кальция, а также метаболизма фосфоинозитидов, отражающие патологическую гиперактивацию кальциевой и фосфоинозитидной регуляторных систем (Тюлькова и др., 1998; Самойлов и др., 2001; Semenov et al., 2002). Было предположено, что активация указанных быстро индуцируемых механизмов необходима для формирования отсроченных геном-зависимых механизмов, обеспечивающих развития долговременной толерантности (Самойлов и др., 2001).

Описанные выше работы послужили стимулом для проведения наших исследований, являющихся логическим продолжением этих работ и сфокусированных на изучении механизмов долговременной толерантности мозга. В используемой нами экспериментальной модели ГП умеренной гипобарической гипоксией, которая, как описано выше, оказывает выраженное долговременное нейропротективное действие, был исследован ряд отсроченных базисных молекулярных механизмов формирования толерантности мозга. Ставилась задача оценить роль в реализации описанных выше нейропротективных эффектов ГП ключевых внутриклеточных механизмов, участвующих в формировании адаптивных и патологических реакций нейронов наиболее чувствительных к гипоксии/ишемии, стрессорным воздействиям образований мозга (гиппокампа, неокортекса).

МАП киназы. Учитывая важную роль митоген-активируемых протеинкиназ (MAП киназ) в сигнальной трансдукции от плазмалеммы клеток в ядро и регуляции клеточной смерти или выживания (Pearson et al., 2001), нами была исследована экспрессия и распределение активных (фосфорилированных) форм MAП киназ (рJNK1/2, р-р38, рERK) в мозге вслед за ТГ у не-ГП и ГП-животных. Методом Вестерн-блот анализа выявлено повышение активности JNK1/2 в гиппокампе не-ГП крыс, а у ГП-крыс - ее подавление на 30 мин и 72 ч. после ТГ. Количественный иммуноцитохимический анализ показал, что у не-ГП и ГП-крыс экспрессия pJNK1/2 повышается или угнетается, соответственно, после ТГ преимущественно в нейронах дорзального (области СА1/СА2), но не вентрального (области СА3/СА4) гиппокампа (рис.4). В неокортексе ГП также нивелировало индукцию pJNK1/2 в ответ на ТГ.

Наряду с этим методами иммуноцитохимии и Вестерн блот анализа была выявлена отсроченная активация протеинкиназы р38 в ответ на ТГ, проявляющаяся в значительном повышении содержания в гиппокампе (СА1, СА3, СА4) фосфорилированной формы р-р38 к 72 часам после воздействия гипоксии. ГП предотвращало эту активацию. Как полагают, активация МАП киназ JNK и p38 в нейронах является важным звеном апоптотических каскадов (Dhanasekaran and Reddy, 2008).

Известно, что киназа ERK является одним из ключевых компонентов про-адаптивного сигналлинга в нейронах (Sweatt, 2004). У не-ГП крыс фосфорилированная форма ERK (pERK) практически отсутствовала через 30 мин.- 72 ч. после ТГ. У ГП крыс отмечалось появление единичных или собранных в группы иммунореактивных к pERK клеток, главным образом, в СА1/СА2, к 30 мин после ТГ. На сроках 3 ч. и 24 ч. иммунопозитивные клетки практически не выявлялись как у не-ГП, так и у ГП крыс, но на 72 ч. у ГП крыс обнаруживалось значительное количество иммунореактивных клеток в областях СА1/СА2. В СА3/СА4 встречались единичные клетки, иммунореактивные к pERK.

Рис. 4. Влияние прекондиционированной и непрекондиционированной тяжелой гипобарической гипоксии на экспрессию фосфорилированной JNK (pJNK) в гиппокампе крыс. А, Вестерн блот; Б, иммуноцитохимия. К, контроль; П, прекондиционирование; Г, тяжелая гипоксия. На графиках: светлые столбики - контроль (n=4), черные столбики - тяжелая гипоксия (n=4), заштрихованные столбики - прекондиционированная тяжелая гипоксия (n=4), 30 мин, 72 часа -- время после воздействия тяжелой гипоксии. * - различия достоверны по отношению к контролю, # - различия достоверны по отношению к тяжелой гипоксии

Таким образом, используемое прекондиционирующее воздействие эффективно подавляет экспрессию фосфорилированных форм JNK, р38 и активирует ERK вслед за ТГ, что может быть одним из важных факторов, способствующих переживанию нейронов чувствительных образований мозга. В экспериментах с использованием ишемического прекондиционирования также было показано, что подавление фосфорилирования JNK и активация ERK в дорзальном гиппокампе предотвращает повреждение уязвимых нейронов после тяжелой гипоксии/ишемии (Gu et al., 2000, 2001; Colangelo et al., 2004; Miao et al., 2005). Ингибиторы активности JNK (SP600125, AS6011245) также увеличивают постишемическое выживание нейронов гиппокампа, подавляя экспрессию рJNK (Carboni et al., 2004; Guan et al., 2005) и активацию путей апоптоза, опосредуемых рецепторами смерти и митохондрия-зависимыми механизмами (Carboni et al., 2005). Очевидно, что р38 также вовлекается в процесс гибели нейронов гиппокампа, хотя данные о повышении его активности вслед за ишемией противоречивы (Takagi et al., 2000; Wu et al., 2000; Sugino, 2000; Hicks et al., 2000; He et al., 2003), однако известно, что ингибитор р38 подавляет активность р38 и способствует редукции гибели нейронов в СА1 вслед за ишемией (Sugino, 2000).

Согласно современным представлениям, в механизмы нейропластичности, выживания/гибели нейронов мозга вовлекается ряд семейств активационных и индуцибельных транскрипционных факторов, в частности, CREB, NF-B, продукты ранних генов c-Fos, c-Jun, NGFI-A, HIF-1 и др. (Morgan and Curran, 1991; Robertson, 1992; Mattson and Camandola, 2001; Zhang et al., 2002; Kitagawa, 2007; Obrenovitch, 2008; Weidemann and Johnson, 2008).

Активационные транскрипционные факторы - CREB и NF-B.

В различных ишемических моделях показано, что прекондиционирование вызывает выраженную и пролонгированную активацию CREB, о чем свидетельствует его фосфорилирование по Ser113 и промоторная активность на CRE генов-мишеней (Mabuchi et al., 2001; Nakajima et al., 2002; Hara et al., 2003; Lee et al., 2004; Meller et al., 2005). Применение маскирующих CRE олигонуклеотидов или анти-CREB полностью нейтрализовало толерантность, индуцируемую ишемическим прекондиционированием (Hara et al., 2003; Lee et al., 2004).

Наряду с CREB, при ишемическом прекондиционировании было обнаружено увеличение ДНК-связывающей активности и транслокации в ядро другого фактора - NF-kB (Blondeau et al., 2001). Ингибирование трансактивации NF-kB как с использованием фармакологических ингибиторов, так и олигонуклеотидов-ловушек, нивелировало нейропротекцию, индуцированную прекондиционированием (Blondeau et al., 2001). В нашем исследовании впервые выполнен сравнительный анализ эффекта ГП на оба эти транскрипционных фактора при предъявлении гипоксического прекондиционирования. Исследована экспрессия активированной формы CREB (рCREB) и NF-B вслед за ТГ в неокортексе и гиппокампе ГП- и не-ГП крыс. Через 3 ч. и 24 ч. после ТГ у не-ГП крыс количество рCREB иммунореактивных клеток в неокортексе редуцировалось, составляя соответственно 50% и 25% от контрольных значений (рис.5).

Рис. 5. Количественная оценка изменений pCREB и NF-B иммунореактивности в неокортексе не-ГП (ТГ, n=6) и ГП крыс (ГП+ТГ, n=6) через 24 ч. после ТГ: общее количество иммунореактивных клеток. *, различия достоверны по сравнению с контрольными значениями

Принципиально иной паттерн иммунореактивности наблюдался у ГП-крыс. Заметное увеличение иммунореактивных клеток (примерно на 200%) было выявлено в неокортексе ГП-крыс через 3 ч. и 24 ч. после ТГ (рис.5). Большое количество иммунореактивных клеток появлялось в нижних слоях неокортекса, где в контроле они практически отсутствовали.

В гиппокампе контрольной группы животных практически отсутствовали рСREB-иммунопозитивные клетки в зонах гиппокампа СА1, СА2, СА3, СА4 и встречались лишь единичные - в зубчатой извилине. Воздействие ТГ не изменяло уровень рСREB- иммунореактивности ни через 3 ч., ни через сутки. Иной характер иммунореактивности был отмечен после ТГ у ГП-животных. В большинстве зон гиппокампа этих животных (СА2, СА3, СА4, зубчатая извилина) уже к 3 ч. сроку значительно возрастало количество иммунопозитивных клеток. К 24 ч. существенно повышалась интенсивность экспрессии рСREB в этих отделах гиппокампа.

У не-ГП животных количество иммунореактивных к NF-B клеток в неокортексе через 3 ч. после ТГ существенно не отличалось от контрольных значений, а к 24 ч. доля иммунореактивных клеток редуцировалась до 25%. Напротив, у ГП-крыс ТГ вызывала 6-кратное увеличение числа иммунореактивных клеток в неокортексе на 3-ч сроке. К 24 ч. число иммунореактивных клеток снижалось, но все еще оставалось существенно выше контроля (рис.5). В гиппокампе через 3 ч. после ТГ уровень экспрессии иммунореактивного NF-B незначительно повышался, однако к 24 ч. сроку уже вновь был неотличим от контроля. ГП-крысы реагировали на ТГ быстрым и значительным увеличением NF-B-иммунореактивности в гиппокампе, особенно в зонах СА1, СА2, СА3, к 3-ч сроку. К 24 ч. после ТГ уровень экспрессии NF-B у ГП-животных также снижался до контрольного уровня.

Обобщая вышеизложенные экспериментальные результаты по изменениям экспрессии активационных транскрипционных факторов рСREB и NF-B вслед за ТГ у не-ГП и ГП-крыс, следует отметить, что несмотря на различия в базальном уровне активности этих факторов в различных областях мозга (неокортекса и гиппокампа), отчетливо проявляются закономерности их экспрессии, активируемой ГП. В частности, важно отметить, что ГП вызывает устойчивую активацию обоих этих факторов в неокортексе и селективную - в различных отделах гиппокампа. Полученные данные представляют собой экспериментальное доказательство, подтверждающее современные представления о том, что устойчивая активация транскрипционных факторов CREB и NF-kB может быть важным этапом формирования долговременной толерантности мозга к гипоксии/ишемии и другим повреждающим воздействиям. Полагают, что в результате активации NF-kB происходит ап-регуляция нескольких ключевых регуляторов выживания, таких, в частности, как пептидный антиоксидант Mn-SOD и белки-ингибиторы апоптоза IAPs (Mattson and Meffert, 2006), а также продукты антиапоптотических генов bcl-2, bcl-xL (Ivanov et al., 1995; Grilli and Memo, 1998; Bui et al., 2001; Karin and Lin, 2002; Bentires-Alj et al., 2002). В свою очередь, рCREB активирует гены пептидных антиоксидантов, в частности, Trx-1 (Chiuch et al., 2005), анти-апоптотических генов bcl-2, bcl-xL (Riccio et al., 1990; Sugiura et al., 2004; Meller et al., 2005, Chiueh et al., 2005), а также гены c-fos, zif268(ngfi-a) (Hata et al., 1998; Sguambato et al., 1998). Последние относятся к семейству ранних генов, их продукты - белки c-Fos и NGFI-A, также являются транскрипционными факторами, регулирующими ряд поздних генов, вовлекаемых в адаптивные процессы, обучение и нейропластичность, контроль клеточной пролиферации и смерти.