Нейропротективные эффекты и механизмы гипоксического прекондиционирования

Ранние гены и их продукты - индуцибельные транскрипционные факторы. Большую группу транскрипционных факторов составляют белки, кодируемые ранними генами семейств fos, jun, zif. Предполагают, что индуцибельные гены c-fos and ngfi-a являются ключевыми элементами «кода третичных мессенджеров» (от англ. third messenger code), который реализует клеточные ответы на внешние сигналы на уровне генома (Morgan, Curran, 1991; Richardson et al., 1992; Robertson, 1992). Нами исследовалась у не-ГП и ГП крыс вслед за ТГ экспрессия представителей этих семейств ранних генов, играющих важную роль в процессах нейрональной пластичности, обучения, выживания/гибели нейронов мозга. Установлено, что ТГ оказывает двухфазный эффект на транскрипцию гена zif268 (ngfi-a) в структурах переднего мозга. Быстрая продукция ngfi-a мРНК, выявляемая на 3 ч сроке, сменяется продолжительной (через 24-72 ч.) и выраженной редукцией ее уровня в наиболее чувствительных отделах мозга (неокортексе, СА1 гиппокампа (рис.6), а также пириформной коре и неостриатуме). В более устойчивой зоне - зубчатой извилине гиппокампа - после первоначальной индукции (на 3 ч) к 24 ч сроку после ТГ уровень ngfi-a мРНК понижался, однако оставался выше контрольного уровня (рис.6). У ГП-крыс паттерн экспрессии ngfi-a мРНК после тяжелой гипоксии существенно модифицировался, в частности, отсутствовала прогрессирующая редукция уровней ngfi-a мРНК в уязвимых образованиях, а пик экспрессии этого гена смещался на более поздний срок (24 ч) (рис.6).

Рис. 6. Количественная оценка динамики экспрессии ngfi-a мРНК в мозге непрекондиционированных (черные столбики) и прекондиционированных (серые столбики) крыс в ответ на тяжелую гипоксию. По оси Х - время после тяжелой гипоксии; A, неокортекс; Б, СА1; В, зубчатая извилина. *, различия достоверны по сравнению с тяжелой гипоксией, p0.05

Интерес представляют данные о динамике экспрессии в нашей парадигме двух представителей генов jun семейства - c-jun и junB, находящихся, как полагают, в антагонистических отношениях, определяющих гибель/выживание клеток (Sheng, Greenberg, 1990; Sommer et al., 1995). Как и в случае ngfi-a мРНК, ранняя экспрессия junB мРНК вслед за ТГ затем сменяется ее подавлением в чувствительных образованиях мозга (СА1-СА3 гиппокампа, неокортексе, стриатуме и др.). У ГП крыс в СА1 и зубчатой извилине отмечается схожая картина с экспрессией ngfi-a - подавление к 3 ч и существенное увеличение к 24 ч. Принципиально иные изменения после ТГ были выявлены для гена c-jun - уровни c-jun мРНК в исследованных структурах мозга градуально нарастали к 72 ч. ГП в значительной мере ингибировало устойчивую и нарастающую оверэкспрессию c-jun, способствуя нормализации уровней его мРНК в гиппокампе.

Наряду с этим нами была исследована экспрессия в мозге крыс мРНК гена, кодирующего субъединицу гетеродимера гипоксия-индуцибельного фактора-1 (HIF-1), являющегося важнейшим белком внутриклеточного сигналлинга при гипоксии (Weidemann and Johnson, 2008). В контроле в различных образованиях мозга обнаруживалась невысокая экспрессия мРНК hif-1. На раннем сроке после ТГ наблюдалась тенденция к незначительному снижению уровня мРНК hif-1 в большинстве исследуемых структур, включая неокортекс и гиппокамп, однако затем выявлялась ее ап-регуляция в различных отделах мозга, достигающая максимальной интенсивности на отдаленных сроках - к 72 часам. У ГП крыс выявлена заметная ап-регуляция гена hif-1 на ранних сроках. Вместе с тем, происходило подавление отсроченной экспрессии HIF-1 мРНК, выявленной после ТГ у не-ГП крыс.

Таким образом, ТГ индуцировала специфический паттерн экспрессии ранних генов, который существенно модифицировался при предварительном применении ГП. Однако к настоящему времени накоплено много фактов о том, что в ряде случаев на посттранскрипционном уровне нарушается «сцепка» между экспрессией мРНК и последующей ее трансляцией. В частности, подавление экспрессии белков транскрипционных факторов на фоне оверэкспрессии их генов описано после тяжелой ишемии (Kiessling et al., 1993). В связи с этим, функциональная трактовка вышеизложенных данных о модификациях паттерна экспрессии генов невозможна без оценки изменений, происходящих на уровне трансляции белка и посттрансляционных процессов, в частности, фосфорилирования - в тех случаях, когда это необходимо для активации данного фактора. Поэтому наряду с экспрессией мРНК ранних генов нами были проанализированы эффекты ТГ и ГП на уровни продуктов этих генов - индуцибельных транскрипционных факторов. Нами были исследованы изменения экспрессии белков NGFI-A, c-Fos и фосфорилированной (активной) формы c-Jun в чувствительных к гипоксии областях мозга крыс. У контрольных животных выявляется умеренная реактивность к белку NGFI-A нейронов гиппокампа и неокортекса. У не-ГП крыс ТГ вызывает подавление иммунореактивности к NGFI-A в исследуемых образованиях мозга на сроках 3 час и 24 час после воздействия. Напротив, у ГП-животных в этих образованиях мозга отмечается выраженное усиление по сравнению с контролем экспрессии NGFI-A к 3 час после ТГ (рис. 7). К 24 час повышенная иммунореактивность сохраняется.

Рис. 7. Гистограммы, иллюстрирующие NGFI-A-иммунореактивность в СА1 области гиппокампа (I) и неокортексе (II) контрольных животных (светлые столбики, n=8), непрекондиционированных животных (черные столбики, n=5), прекондиционированных животных (серые столбики, n=6) после тяжелой гипоксии. По оси Х - время после тяжелой гипоксии; a, общее число иммунопозитивных клеток; b, количество интенсивно NGFI-A-реактивных клеток; Показатели контрольной группы приняты за 100%; *, различия с контролем достоверны, p0.05; #, различия с тяжелой гипоксией достоверны, p0.05

Иммунореактивность к белку c-Fos у контрольных животных в гиппокампе и неокортексе проявляется слабо. У не-ГП животных через 3 и 24 часа после ТГ иммунопозитивные к c-Fos клетки в гиппокампе и неокортексе либо отсутствуют либо встречаются редко, в основном, в медиальной части СА1. Вместе с тем, у ГП-крыс до 24 ч. после воздействия тяжелой гипоксии обнаруживается повышенный в значительной степени уровень экспрессии c-Fos в нейронах исследуемых образований мозга, особенно в СА4 и зубчатой извилине гиппокампа, неокортексе.

Обобщая полученные нами данные и имеющиеся в литературе сведения, можно заключить, что эффект гипоксического/ишемического прекондиционирования на экспрессию ранних генов и их белков выражается в значительной ап-регуляции нейрональной экспрессии белков NGFI-A и c-Fos, нейропротективная роль которых в настоящее время убедительно показана. Так, имеется много данных о том, что ап-регуляция с-Fos и NGFI-A вовлечена в механизмы выживания нейронов мозга при тяжелых формах ишемии/гипоксии. В частности, установлено, что после тяжелой ишемии происходит индукция экспрессии с-Fos и NGFI-A в переживающих нейронах зубчатой извилины и СА3 гиппокампа, но отсутствует в гибнущих нейронах области СА1 (Takemoto et al., 1995; Cho et al., 2001; Kiessling et al., 1993, Tseng et al., 1997). Обнаружена индукция с-Fos до 24 час после неонатальной гипоксии/ишемии в переживающих нейронах зубчатой извилины и СА3 гиппокампа (Ness et al., 2008). Также показано, что вслед за фокальной ишемией (1-4 часа) происходит экспрессия с-Fos и NGFI-A только в выживающих нейронах пограничной с очагом зоны, но не в гибнущих нейронах в очаге инсульта (Johansson et al., 2000).

Рис. 8. Изменения экспрессии рс-Jun в гиппокампе крыс в различные сроки после тяжелой гипоксии (черные столбики) и прекондиционированной тяжелой гипоксии (заштрихованные столбики). Светлые столбики - контроль. По оси Х - время после тяжелой гипоксии; А - СА1, Б - СА2, В - СА3, Г - СА4, * - различия достоверны по отношению к контролю, # - различия достоверны по отношению к тяжелой гипоксии. В каждой группе n=6

При иммуноцитохимическом изучении характера иммунореактивности активной (фосфорилированной) формы другого фактора из семейства АР-1 - c-Jun, у не-ГП крыс обнаружено выраженное увеличение экспрессии pc-Jun в областях СА1, СА2 с пиком на 24 час после ТГ (Рис. 8). В области СА1 отмечается устойчивое повышение экспрессии до 72 час. В вентральном гиппокампе (СА3/СА4) эти изменения значительно менее выражены. У ГП-крыс экспрессия pc-Jun, индуцируемая ТГ, подавляется (Рис. 8). Полагают, что устойчивая активация c-Jun, являющегося одним из ключевых эффекторов смерти клеток и участвующего в контроле путей апоптоза, связанных с рецепторами смерти в плазмалемме и митохондриями, вносит существенный вклад в развитие апоптоза и смерти клеток (Lin 2003; Zablocka e.a., 2003; Vlahopoulos, Zoumpourlis, 2004). У ГП-крыс экспрессия pc-Jun, индуцируемая ТГ, подавляется (Рис. 8).

Как уже отмечалось, ГП существенно изменяло динамику экспрессии гена hif-1, кодирующего регуляторную субъединицу другого важного транскрипционного фактора - HIF-1, способствуя более ранней его индукции и предотвращая отсроченную оверэкспрессию этого гена после ТГ. Аналогичный эффект ГП, однако с иным временным профилем, выявлялся и на уровне экспрессии продукта этого гена - белка HIF-1. Ранее HIF-1 считали фактором периферической адаптации, реализующим свое про-адаптивное влияние за счет стимуляции эритропоэза, ангиогенеза и васкуляризации, утилизации глюкозы и др. Однако в последние годы появляется все больше работ о вероятной нейропротективной роли HIF-1 в мозге, где нервными и глиальными клетками продуцируется не только сам этот белок, но и его основная транскрипционная мишень - цитокин эритропоетин, оказывающий в мозге протективный эффект (Paschos et al., 2008). Более того, установлено, что нарушения активации HIF-1 связано с возникновением ряда неврологических патологий. В частности, недостаточная активация HIF-1-зависимого каскада способствует развитию постишемических расстройств и амиотропного латерального склероза (Brown and Robberecht, 2001; Oosthuyse et al., 2001), в то время как его чрезмерная и длительная активация, согласно современным представлениям, формирует патогенетический базис болезни Альцгеймера (Shi et al., 2000; Zhang et al., 2007), а у нокаутных мышей с дефицитом HIF-1 в мозге гипоксическая толерантность после ГП не формируется (Taie et al., 2009). Это полностью согласуется с результатами наших исследований, свидетельствующими, что поддерживающаяся отсроченная экспрессия HIF-1 как на уровне мРНК, так и на уровне белка носит патологический характер и связана с развитием патологии (как постгипоксической, так и постстрессорной). Напротив, быстрая но преходящая активация транскрипционного фактора HIF-1, весьма вероятно, является важным звеном нейропротективных механизмов, активируемых ГП.

Таким образом, ГП значительно модифицирует паттерн экспрессии ранних генов в ответ на ТГ, а также индуцирует кооперативную ап-регуляцию про-адаптивных транскрипционных факторов (NGFI-A, c-Fos, HIF-1) и подавляет ТГ-индуцированную активацию c-Jun, являющегося важным звеном про-апоптотических каскадов, в частности, JNK каскада.

Факторы регуляции апоптоза семейства генов bcl-2. Ключевую роль в процессах, определяющих гибель или выживание клетки, играет соотношение про- и антиапоптотических факторов, включающих белки семейства генов bcl-2 (Fadeel, Orrenius, 2005). Выше были изложены результаты наших морфологических исследований, свидетельствующие о том, что ГП предотвращает структурные повреждения нейронов и очевидно препятствует запуску апоптоза в условиях ТГ. Для того, чтобы оценить возможный вклад факторов-регуляторов апоптоза в эти процессы нами были изучены изменения уровней про - и анти-апоптотических белков (Bax и Bcl-2, Bcl-xL, соответственно) в гиппокампе и неокортексе ГП- и не-ГП крыс в различные периоды после ТГ.

В уязвимых образованиях мозга (СА1-СА4 гиппокампа, неокортекс) не-ГП животных ТГ индуцировала значительное повышение числа Bax-иммунореактивных клеток (рис.9). Это повышение проявлялось уже через 3 ч после экспозиции ТГ, достигая максимальных значений к 24 ч., и сохранялось до 72 ч. Наибольшая амплитуда ТГ-индуцированной экспрессии Bax (сверх 500% от контроля) наблюдалась в СА4 области Аммонового рога. У ГП-крыс доля гиппокампальных и неокортикальных клеток, экспрессирующих Bax-иммунореактивность после ТГ статистически не отличалась от контрольных значений (рис.9). В менее уязвимом к гипоксии отделе гиппокампа - зубчатой извилине, достоверных изменений выявлено не было.

Рис. 9. Эффект тяжелой гипоксии (черные столбики) и прекондиционированной тяжелой гипоксии (белые столбики) на экспрессию Bax в гиппокампе и неокортексе крыс. *, изменения достоверны относительно контроля, р0,05.; по оси Х - время после тяжелой гипоксии

В отношении иммунореактивности к Bcl-2 были обнаружены противоположные изменения. Экспрессия Bcl-2 в уязвимых образованиях гиппокампа (СА1-СА4) и неокортексе либо не изменялась, либо в некоторой степени снижалась после экспозиции ТГ. Однако ГП заметно повышало количество Bcl-2-иммунопозитивных клеток в этих отделах мозга вслед за ТГ (рис.10). Выявленная ап-регуляция была быстрой, поскольку уже к 3 ч после ТГ наблюдался резкий скачок Bcl-2-иммунореактивности в гиппокампе и неокортексе, которая впоследствии нарастала в некоторых областях (СА1, СА4) или снижалась - в других (СА2, СА3, неокортекс). Уровни иммунореактивного Bcl-2 в гиппокампе оставались повышенными вплоть до 72 ч. Принципиально иной эффект был зарегистрирован в устойчивой к гипоксии зубчатой извилине, где экспрессия Bcl-2 в гранулярных клетках имела тенденцию к повышению в отдаленные сроки после ТГ и не изменялась при предварительном ГП (рис.10). Характер изменения экспрессии другого антиапоптотического белка - Bcl-xL был сходен с паттерном экспрессии Bcl-2, хотя проявлялись временные особенности его экспрессии. Обобщая вышеизложенные результаты можно заключить, что ГП вызывает оверэкспрессию Bcl-2 и Bcl-xL, а также модифицирует соотношение факторов регуляции апоптоза в гиппокампе и неокортексе вслед за ТГ. У не-ГП животных после ТГ наблюдается сдвиг соотношения Bax/Bcl-2,Bcl-xL в сторону преобладания про-апоптотического белка Bax, а у ГП особей это соотношение меняется в пользу антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL, что очевидно препятствует запуску апоптоза в гиппокампе и неокортексе у этих животных.

Изменения уровней Bax, Bcl-2, Bcl-xL также были зарегистрированы в различных моделях ишемии и ишемического прекондиционирования. Показано, что в протекции, создаваемом ишемическим прекондиционированием, ведущая роль принадлежит ап-регуляции Bcl-2, Bcl-xL на фоне редукции Bax (Wu et al., 2003). Обнаружно, что прекондиционирующая 5-мин ишемия переднего мозга повышала толерантность нейронов региона СА1 за счет подавления высвобождения цитохрома с из митохондрий (участвующего в механизмах индукции апоптоза) посредством увеличения соотношения Bcl-2/Bax (Nakatsuka et al., 2000), а введение анти-Bcl-2 олигонуклеотидов предотвращало развитие ишемической толерантности (Shimizu et al., 2001).

Рис. 10. Эффект тяжелой гипоксии (черные столбики) и прекондиционированной тяжелой гипоксии (белые столбики) на экспрессию Bcl-2 в гиппокампе крыс. *, изменения достоверны относительно контроля, р0,05.; по оси Х - время после тяжелой гипоксии

Аналогичный механизм, включающий изменение баланса про- и антиапоптотических факторов, был выявлен для нейропротективного эффекта химического прекондиционирования с использованием 3-нитропропионовой кислоты. Установлено, что прекондиционирующие аппликации 3-нитропропионовой кислоты вызывали повышение Bcl-2 иммунореактивности в нейронах СА1, СА3, СА4 полей гиппокампа, но не СА2 и зубчатой извилины (Brambrink et al., 2004). Гипотермия, используемая в качестве физического прекондиционирующего воздействия, также снижала экспрессию Bax в ответ на ишемию (Eberspacher et al., 2003). Формирование толерантности мозга в модели гипербарической оксигенации сопровождалось значительным повышением экспрессии Bcl-2 (Wada et al., 2001). Воздействие интервальной гипобарической гипоксией (5000м, 6 ч ежедневно, 42 дня), приводящее к кардиопротекции от повреждающего действия ишемии/реперфузии, также существенно увеличивает соотношение Bcl-2/Bax (Dong et al., 2003). Как указывалось выше, ГП в ответ на ТГ индуцирует в чувствительных образованиях мозга экспрессию активационных и индуцибельных транскрипционных факторов, мишенями которых являются семейства генов bcl-2, гормональных рецепторов, стресс-белков (Hsp70), а также генов позднего действия, экспрессия которых также обеспечивает про-адаптивные внутриклеточные молекулярные перестройки, лежащие в основе формирования толерантности мозга. Нами были изучены изменения экспрессии вслед за ТГ у не-ГП и ГП-животных нескольких групп поздних генов (мишеней исследуемых транскрипционных факторов) и их продуктов, вовлекаемых в нейропротективные и нейродегенеративные процессы.

Пептидные антиоксиданты. В основе деструктивного действия большинства повреждающих факторов лежит мощное усиленное образование свободных радикалов, индуцирующих внутриклеточный окислительный стресс. Поэтому «первая линия» защиты от свободно-радикальных повреждений связана с активностью эндогенных антиоксидантных систем, наиболее важными из которых являются митохондриальные (Freeman, 1982; Koehler et al., 2006). В 1997 году G.Spyrou и коллегами был обнаружен новый митохондриальный антиоксидант - тиоредоксин-2 (Trx2) (Spyrou et al., 1997). На основании выполненного нами картирования (Rybnikova et al., 2000) было установлено, что Trx2 мРНК широко экспрессируется в нейронах во всех отделах мозга крыс, причем наиболее интенсивно - во фронтальном, фронто-париетальном неокортексе, гиппокампе, пириформной коре, клетках Пуркинье мозжечка, и др. После ТГ в ряде структур, в том числе СА1 поле гиппокампа и неокортексе, наблюдалось умеренное (до 130%) увеличение экспрессии к 3-24 ч, которое в большинстве случаев нивелировалось к 72 ч (в стриатуме, миндалине, неокортексе и СА3 гиппокампа), либо снижалось ниже контрольного уровня (СА1 гиппокампа) (рис.11).

Рис. 11. Изменения экспрессии Trx2 мРНК в гиппокампе (поле СА1) и неокортексе прекондиционированных (n=6, серые столбики) и непрекондиционированных (n=6, черные столбики) животных после тяжелой гипоксии. По оси Х - время после тяжелой гипоксии (ч.); *, дотсоверные отличия от контроля; #, достоверные отличия от непрекондиционированных животных

Воздействие ГП существенно усиливало экспрессию мРНК Trx2 в большинстве областей мозга, за исключением зубчатой извилины. Так к 24-72 ч в пириформной коре, неокортексе, стриатуме, миндалине экспрессия повышена по сравнению с контролем на 50-120%. В зоне СА1 гиппокампа, где ТГ редуцировала экспрессию мРНК Trx2 в отсроченный период до 80%, ГП устраняло этот эффект (рис. 11). Схожие качественные изменения активности были выявлены относительно другого митохондриального антиоксиданта - Mn-супероксиддисмутазы (Mn-SOD), однако в целом выраженность изменений уровней ее мРНК значительно ниже, чем для Trx2. Таким образом, выявлено, что ГП, повышающее резистентность нейронов мозга, в различной степени способствует индукции генов митохондриальных антиоксидантов в чувствительных образованиях мозга в ответ на тяжелое повреждающее воздействие. В дальнейшем в наших совместных исследованиях с С.А. Строевым и коллегами было обнаружено, что ГП выраженно усиливает экспрессию митохондриальных и цитозольных белков-антиоксидантов (Trx1/2, Mn/Cu,Zn-SOD) после ТГ (Stroev et al., 2004; Строев и др., 2005).

Металлопротеазы АDAM. Другую обширную группу исследуемых генов позднего действия составляют гены семейства ADAM (a disintegrin and metalloprotease), кодирующие белки, участвующие в нормальных и патологических процессах в ЦНС - факторы нейрональной пластичности, протеолиза, а также -секретазы - ферменты процессинга белка-предшественника -амилоида (АРР) (обзоры Turner, Nalivaeva, 2007; Duffy MJ et al., 2009). Семейство металлопротеаз-дисинтегринов ADAM обнаружено сравнительно недавно, поэтому с использованием методов РТ-ПЦР и гибридизации in situ мы детально исследовали общий уровень экспрессии и региональную локализацию некоторых представителей этого семейства, потенциально важных для формирования механизмов нейропротекции, в областях взрослого и развивающегося мозга на примере грызунов (Karkainen et al., 2000; Rybnikova et al., 2002). В результате было установлено, что среди всех исследованных генов (adam 1,2,3,4,5,7,9,10,11,12,15,17,19,21,22,23) в мозге грызунов обнаруживаются лишь мРНК adam 1,9,10,11,12,17,19,23, однако их базальные уровни достаточно низкие. Наиболее интенсивно в отсутствии стимуляции экспрессируются гены, кодирующие -секретазы ADAM17 и ADAM10, и дисинтегрин ADAM15. Причем для ADAM17, известного также как фермент ТАСЕ, выявлен специфический паттерн базальной экспрессии гена. В пределах переднего мозга определяемые количества его мРНК выявляются лишь в гиппокампе и пириформной коре. Методом иммуноцитохимии нам удалось установить, что в гиппокампе белок ADAM17 распределен неравномерно - наибольшее его количество обнаруживается в клетках СА2 зоны гиппокампа и, в меньшей степени, в неокортексе (V слой) и стриатуме.

На сердце недавно показано, что белки ADAM вовлекаются в механизмы ишемического прекондиционирования (Ichikawa et al., 2004). Однако практически отсутствуют данные о вовлечении их в механизмы гипоксического повреждения и прекондиционирования в различных образованиях мозга. Методами РТ-ПЦР и иммуноцитохимии нами исследованы изменения экспрессии генов и белков двух представителей этого семейства - ADAM15 и ADAM17, у ГП- и не-ГП животных. ТГ длительно (до 72 ч.) подавляла экспрессию гена adam17 в гиппокампе и пириформной коре и в отсроченный период - в париетальном неокортексе. У ГП-крыс на раннем сроке (3 ч.) также отмечалось понижение уровня ADAM17 мРНК в гиппокампе, однако к суткам оно нивелировалось. Кроме того, в этот период проявлялась ап-регуляция гена adam17 в различных областях неокортекса и пириформной коре. Вслед за ТГ также наблюдалось отчетливое снижение содержания белка ADAM17 в структурах мозга, наиболее выраженное в вентральном гиппокампе. ГП значительно изменяло характер ADAM17-иммунореактивности в исследуемых образованиях мозга крыс после ТГ. У ГП-крыс на всех сроках после ТГ обнаруживалось не снижение, а увеличение содержания иммунореактивного белка, однако динамика несколько различалась в гиппокампе и неокортексе. В CA1 и зубчатой извилине гиппокампа ГП-крыс происходило быстрое и резкое повышение экспрессии ADAM17 уже к 3 ч., достигающее максимальных значении к суткам, которое затем несколько снижается к 3-х дневному сроку, однако остается существенно выше контрольных значений. В неокортексе иммунореактивность к ADAM17 постепенно нарастала к 3 суткам. Это свидетельствует о том, что ГП стимулирует -секретазную активность нейронов мозга, способствуя образованию растворимых (непатогенных) форм -амилоида, что препятствует развитию нейродегенеративных процессов (Turner et al., 2003).

Распределение белка ADAM15 в мозге крыс в целом не отличалось от локализации ADAM17. Наиболее высокие базальные уровни ADAM15 выявлялись в СА1, СА2, СА3 полях гиппокампа, неокортексе и пириформной коре. Однако в отличие от adam17, экспрессия которого редуцировалась после ТГ, ген adam15 демонстрировал выраженную активацию в некоторых областях мозга в ответ на ТГ. В частности, экспрессия мРНК adam15 устойчиво ап-регулировалась в гиппокампе и областях неокортекса через 3-24 ч после ТГ, затем следовала некоторая редукция уровней мРНК ADAM15 в этих структурах мозга. Экспрессия белка ADAM15 также индуцировалась в ответ на ТГ, причем динамика была сходной в различных областях гиппокампа и неокортексе. Как в гиппокампальных областях СА1-СА4, так и в неокортексе максимальный уровень белка достигался к 24 часам после ТГ.

ГП нивелировало ап-регуляцию adam15 мРНК вслед за ТГ. Наряду с этим у ГП-крыс отмечалась более заначительная редукция уровней мРНК ADAM15 к 3-м суткам, причем в отличие от не-ГП животных, в данном случае down-регуляция затрагивала не только неокортекс и гиппокамп, но и другие образования мозга - гипоталамусе, таламусе и пириформной коре. Эффект ГП на ТГ-индуцированную экспрессию ADAM15, также как и его мРНК, в целом сводился к нивелированию ап-регуляции экспрессии на ранних сроках и потенцированию редукции - на поздних. В частности, ГП либо полностью предотвращало индукцию ADAM15 в ответ на ТГ (в СА1, СА2, неокортексе), либо значительно снижало величину реакции (в СА3 и зубчатой извилине). К 3 суткам уровень ADAM15 иммунореактивности в исследуемых областях мозга ГП-крыс понижался значительнее, чем у не-ГП животных. Таким образом, выявлены существенные различия в экспрессии как мРНК генов adam15 и 17, так и их белков ADAM15 и ADAM17 в различных образованиях мозга у не-ГП и ГП крыс в ответ на ТГ, что отражает очевидно различное функциональное предназначение белков семейства ADAM в процессах повреждения и выживания нейронов мозга.

Белок-предшественник в-амилоидного пептида. Как уже упоминалось, повышение продукции ADAM17 способствует стимуляции -процессинга белка-предшественника -амилоидного пептида (АРР). -амилоидный пептид - это 40-43-аминокислотный нейротоксичный фрагмент протеолиза АРР, образующийся в результате последовательного расщепления в- и г-секретазами. В норме преобладает другой путь процессинга АРР, связанный с последовательным расщеплением б- и г-секретазами. б-секретазы атакуют АРР внутри последовательности -амилоида, предотвращая таким образом его образование. Кроме того, в результате б-процессинга высвобождается растворимый N-концевой эктодомен АРР (sAPP), обладающий собственными нейротрофическими, нейропротективными свойствами и участвующий в процессах пластичности (Turner et al., 2003). Показано, что sAPP усиливает долговременную посттетаническую потенциацию (простую форму обучения), а в поведенческих экспериментах sAPP улучшает память (Meziane et al., 1998; Bour et al., 2004).

Накопление -амилоида в ткани мозга с образованием амилоидных бляшек приводит к нейротоксичности и нейродегенеративным процессам, в том числе связанным с патогенеза болезни Альцгеймера (Selkoe, 2001). При этом одной из самых распространенных причин возникновения спорадических форм этого заболевания является ишемия мозга (Pluta and Amek, 2008). В настоящее время ишемическая теория патогенеза болезни Альцгеймера, подкрепленная обширными экспериментальными доказательствами, является одной из доминирующих (Pluta 2004, 2006, 2007). Учитывая тот факт, что в нашей модели ГП обнаружена гиперпродукция -секретазы ADAM17 после ТГ, было сделано предположение, что у ГП-животных, вероятно, повышается -процессинг АРР с образованием его растворимой формы. Поэтому нами были исследованы изменения содержания sAPP в гиппокампе и неокортексе ГП и не-ГП животных после ТГ.

Установлено, что у не-ГП крыс ТГ снижала уровень sАРР в Аммоновом роге гиппокампа к 24 ч. (рис.12), в то время как у ГП-животных происходило значительное повышение содержания sАРР как в СА1, СА2, СА3 областях гиппокампа, так и в неокортексе (рис.12). В зубчатой извилине изменений иммунореактивного sAPP не выявлено.

Таким образом, проведенные серии экспериментов позволили в значительной степени раскрыть молекулярно-клеточные механизмы долговременных нейропротективных эффектов ГПс использованием умеренной гипобарической гипоксии. Установлено, что реализация протективного действия ГП, приводящего к формированию устойчивой гипоксической толерантности мозга, представляет собой многоуровневый процесс, требующий не только вовлечения внутриклеточных сигнальных каскадов и транскрипционных факторов, но и модификаций активности генов раннего и позднего действия и экспрессии их продуктов. В основе этого процесса лежит индуцируемое ГП репрограммирование внутриклеточных механизмов гибели/выживания нервных клеток мозга при повреждающих воздействиях (тяжелой гипоксии, психоэмоционального и травматического стресса), приводящее к повышению адаптивных возможностей мозга, связанного с оверэкспрессией продуктов про-адаптивных генов и подавлением образования белков, вовлекаемых в процессы повреждения нейронов.

Рис. 12. Изменения числа sAPP-иммунопозитивных клеток в гиппокампе и неокортексе непрекондиционированных (черные столбики) и прекондиционированных (серые столбики) крыс вслед за тяжелой гипоксией. Белые столбики - контроль. А, СА1; Б, СА2; В, СА3; Г, неокортекс. *, изменения достоверны по отношению к контролю (р0,05); **, различия между тяжелой гипоксией и прекондиционированной тяжелой гипоксией достоверны (р0,05)

Гормон-зависимые механизмы нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования. В процессах адаптации к патогенным воздействиям большую роль играют механизмы эндокринной регуляции. Как упоминалось выше, антидепрессивные и анксиолитические эффекты ГП в наших экспериментах сопровождались нормализацией гормональных показателей у экспериментальных животных. На этом основании было выдвинуто предположение о том, что, наряду с описанными выше молекулярно-клеточными, гормон-зависимые механизмы регуляции адаптивных функций организма могут представлять собой важное звено протективных механизмов, индуцируемых ГП. С целью экспериментальной проверки этого предположения мы исследовали параметры функции гипофизарно-адренокортикальной системы (ГАС), а также экспрессию гормональных (глюкокортикоидных) рецепторов и нейрогормонов (кортиколиберина и вазопрессина) у ГП-крыс в используемых нами экспериментальных моделях.

Тяжелая гипобарическая гипоксия (ТГ) индуцировала умеренную активацию ГАС с постепенным повышением уровня кортикостерона в крови к 24 ч. (Рис.13). Трехкратное ГП значительно модифицировало реакцию ГАС на ТГ. В этом случае наблюдалась резкая активация ГАС с 5-кратным подъемом уровня кортикостерона уже на 3 ч., с последующим снижением уровня гормона (Рис.13). Сходная динамика реакции ГАС, с пиком на 3 ч., но с меньшей амплитудой, обнаруживалась и после самого ГП. При этом трехкратное ГП вызывало заметную активацию ГАС с 3-х кратным повышением уровня гормона на пике, а однократный сеанс прекондиционирующей умеренной гипоксии, недостаточный для создания нейропротекции, индуцировал лишь незначительное повышение уровня кортикостерона в крови в 3-х часовой период (Рис.13). Через 24 ч. после ГП (то есть в тот период, когда производилась экспозиция ТГ) уровень кортикостерона в крови оставался достоверно повышенным (рис.13), однако в последующем нормализовывался и на 5-й - 10й день не отличался от контроля.

Установлено, что наряду с повышением базального уровня глюкокортикоидов, ГП значительно модифицировало реактивность ГАС на иммобилизационный стресс. Так, у прекондиционированных крыс, по сравнению с контрольными, наблюдалось резкое повышение стрессореактивности ГАС, особенно выраженное на ранних сроках после начала действия стрессора (рис.14). При этом пик активности ГАС смещался уже к 20 мин и существенно возрастал по амплитуде, однако несмотря на это к 24-часовому сроку уровень кортикостерона возвращался к норме.

Рис. 13. Изменения активности ГАС после тяжелой гипоксии (ТГ), тяжелой гипоксии у прекондиционированных крыс (ГПТГ), одно- и трехкратного прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией (ГП(1) и ГП(3), соответственно). По оси Y - уровень кортикостерона в плазме крови, по оси Х - время после воздействия. *, изменения достоверны относительно ТГ, p0.05

Рис. 14. Кривая стрессореактивности ГАС. По оси Y - содержание кортикостерона в плазме крови, нмоль/л., по оси Х - время после стресса. *, изменения достоверны относительно контрольной группы крыс (пунктирная линия), p0.05

Учитывая выраженность изменений на раннем сроке, в следующей серии экспериментов применяли тест на быструю стрессореактивность ГАС, отличающийся от классического большей длительностью иммобилизационного стресса (30 мин) и более ранними точками забора крови - 0, 10, 30, 60 мин после начала стрессирования. Установлено, что у ГП-крыс, в отличие от контрольных, стрессорный уровень кортикостерона (около 600 нмоль/л) достигался уже на 10-й минуте. Затем наблюдалось дальнейшее значимое повышение стрессорного выброса глюкокортикоидов, вплоть до 60 мин. Его амплитуда у ГП-животных достигала свыше 900 нмоль/л, в то время как у контрольных она едва превышала показатель 400 нмоль/л.

Таким образом, трехкратное ГП существенно повышало как базальную активность ГАС в ранний период, так и ее реактивность при предъявлении ТГ и иммобилизационный стресс. При этом сохранялась двухфазная динамика уровня глюкокортикоидов в крови, характеризующая нормальную регуляцию ГАС по механизму глюкокортикоидной отрицательной обратной связи. Это свидетельствует о том, что использованное ГП оптимально активизирует гормональные механизмы повышения адаптивных возможностей. Быстрая активация ГАС в ответ на стресс, во многом предопределяющая адаптацию к стрессору, является индикатором того, что гомеостатические защитные механизмы организма работают эффективно (Derijk RH, de Kloet ER., 2008).

Следует отметить, что после ТГ, приводящей к гибели 50% животных и значительным структурным и функциональным повреждениям мозга у выживших крыс, двухфазная динамика ГАС нарушалась. Содержание кортикостерона в крови крыс, подвергнутых ТГ, градуально возрастало к суткам, что свидетельствует о нарушении торможения ГАС по принципу обратной связи и ее переходу в дезадаптационный режим. Трехкратное ГП оказывало выраженный протективный эффект, нормализуя фазность реакции ГАС (активация-торможение). Вероятно, ГП оказывает такое комплексное действие на функцию ГАС за счет модификации ее регуляции на различных уровнях, включающих нейросекреторные центры гипоталамуса и механизмы глюкокортикоидной обратной связи.

Глюкокортикоидные рецепторы. В основе глюкокортикоидного торможения ГАС по принципу отрицательной обратной связи лежит взаимодействие циркулирующих в крови глюкокортикоидов с кортикостероидными рецепторами гиппокампа, в особенности его вентральных отделов (Sapolsky et al., 1990) Главную роль в опосредовании глюкокортикоидного торможения играют стероидные рецепторы II типа - глюкокортикоидные, ГР (Keller-Wood and Dallman, 1884; De Kloet, 1991). Поддержание экспрессии ГР на высоком уровне имеет решающее значение для обеспечения работы механизмов обратной связи. Поэтому можно полагать, что нормализация обратной регуляции ГАС, описанная нами у ГП-животных, связана с модификациями уровня ГР в гиппокампе. С целью выяснения этого вопроса методом количественной иммуноцитохимии исследовали уровни ГР в гиппокампе ГП-крыс. Значимые изменения ГР-иммунореактивности после ГП были выявлены в вентральном гиппокампе - СА3, СА4 и зубчатой извилине. В частности, число ГР-иммунопозитивных клеток достоверно увеличивалось в гиппокампальных полях СА3 и СА4 (до 363 и 250% на 2-е сутки, соответственно), однако это повышение нивелировалось к 11-ти дневному сроку. В нейронах области СА4 увеличение числа иммунопозитивных клеток сопровождалось усилением уровня их иммунореактивности (до 325%). В зубчатой извилине количество ГР-иммунопозитивных клеток достоверно не менялось, однако наблюдалось значительное усиление их иммунореактивности - количество интенсивно экспрессирующих ГР клеток в этой области гиппокампа достигало максимума на ранних сроках и затем постепенно снижалось к 11 дню до контрольного уровня. Данные свидетельствуют о том, что ГП вызывает умеренное, но достаточно устойчивое повышение содержания ГР в отделах вентрального гиппокампа - областях, играющих ключевую роль в поддержании механизмов обратной регуляции ГАС. Для того чтобы проанализировать, каким образом изменяется содержание ГР у ГП-животных не в базальных условиях, а в ответ на стресс, была проведена следующая экспериментальная серия, в которой осуществляли сравнительный анализ ГР-иммунореактивности в гиппокампе ГП- и не-ГП животных в различные сроки после психоэмоционального стресса в модели «выученная беспомощность». Как описано выше, у не-ГП животных в этих условиях развивалось депрессивноподобное состояние, а ГП предотвращало этот патогенный эффект стрессорного воздействия и одновременно нормализовывало функционирование глюкокортикоидной обратной связи.

У не-ГП крыс развитие депрессивноподобного состояния сопровождалось резкой и выраженной редукцией ГР-иммунореактивности в вентральном гиппокампе (рис.15). В поле СА4 снижалась интенсивность экспрессии ГР (максимально - на 95% на 5-й день), а в области СА3 и зубчатой извилине существенно понижалась как интенсивность экспрессии, так и общее число иммунореактивных клеток. При этом в СА3 все показатели восстанавливались к 10-му постстрессорному дню, а в зубчатой извилине эффект оказался более устойчивым и сохранялся на всех сроках (рис.15). У ГП-животных обнаружена значительная модификация постстрессорного паттерна экспрессии ГР в вентральном гиппокампе. Во всех исследованных областях наблюдалось резкое увеличение ГР-иммунореактивности, достигающее максимальных значений на 1-й и 5-й день (рис.15).

Рис. 15. Динамика содержания ГР в образованиях вентрального гиппокампа прекондиционированных и непрекондиционированных крыс после стресса в парадигме «выученной беспомощности». N, общее число ГР-иммунопозитивных клеток; Ni, число клеток, интенсивно экспрессирующих ГР. Контроль - 100%. *, изменения достоверны относительно контрольной группы крыс, p0.05; #, изменения достоверны относительно непрекондиционированных крыс, p0.05

Таким образом, ГП не только вызвает умеренное увеличение ГР в вентральном гиппокампе, но и потенциирует их оверэкспрессию в условиях тяжелого патогенного стресса. Эти результаты представляют особый интерес, поскольку глюкокортикоидная рецепция гиппокампа является важной частью стресс-лимитирующей системы, дисбаланс которой способствует повышению уязвимости организма к стрессам и развитию различных постстрессовых патологий (Sapolsky et al., 2000). К мишеням транскрипционных факторов ГР относятся множество генов, в том числе кодирующих HIF-1, нейрогормоны кортиколиберин и вазопрессин, антиоксиданты (тиоредоксин-2) (Kodama et al., 2003). Глюкокортикоиды, связываясь с ГР и действуя на GRE в промоторном регионе гена ВП, подавляют экспрессию гена ВП при стрессе (Kim et al., 2001). ГР также взаимодействует на посттранскрипционном уровне с транскрипционными факторами HIF-1, NF-kB и AP-1, регулируя их активность (Leonard et al., 2005; Derijk RH, de Kloet ER. 2008).

Кортиколиберин. Как уже отмечалось, помимо стимуляции механизмов обратной регуляции ГАС, эффект ГП на эту эндокринную систему заключается в повышении ее реактивности в условиях стресса. Согласно литературным сведениям, в основе повышения стрессореактивности ГАС может лежать гипертонус (hyperdrive) кортиколиберинергической системы мозга, поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали изменения экспрессии нейрогормона кортиколиберина - ведущего активатора ГАС, у прекондиционированных крыс. Исходя из современных представлений о двух контурах кортиколиберинергической системы (гипоталамическом и экстрагипоталамическом) изменения иммунореактивности к кортиколиберину изучались в паравентрикулярном ядре гипоталамуса (мелкоклеточном - мПВЯ, и крупноклеточном - кПВЯ), а также в различных отделах гиппокампа (СА1, СА3/4, зубчатая извилина) и неокортексе (II и V слой).

Содержание иммунореактивного кортиколиберина в гиппокампе и неокортексе контрольных крыс было низким - наблюдались лишь единичные иммунопозитивные клетки. ГП с применением трехкратной умеренной гипобарической гипоксии приводило к незначительному, но устойчивому повышению иммунореактивности к кортиколиберину в областях вентрального гиппокампа (CA3) и достаточно выраженному повышению - в неокортексе. Ко 2-м суткам после последнего сеанса ГП интенсивность иммунореактивности к кортиколиберину в неокортексе увеличивалась до 315% от контрольного уровня, затем количество иммунопозитивных клеток снижалось, но оставалось высоким и через 11 суток. В гипоталамусе ГП крыс, в частности мелкоклеточной и крупноклеточной части ПВЯ, значимых изменений иммунореактивности к кортиколиберину в период 2-11 суток не выявлялось.

Формирование депрессивноподобного состояния у не-ГП крыс сопровождалось изменениями содержания иммунореактивного кортиколиберина, наиболее выраженными в вентральном гиппокампе и гипоталамусе. В СА3 области гиппокампа и зубчатой извилине наблюдалось устойчивое повышение уровня кортиколиберина. В гипоталамусе не-ГП крыс наблюдалось постепенное увеличение экспрессии кортиколиберина в мПВЯ в ходе развития депрессивного состояния. При этом количество иммунопозитивных клеток к 10-му дню повышалось до 200%, а интенсивность экспрессии - до 350%. (рис. 16). У ГП-животных, у которых постстрессовое депрессивноподобное состояние не формировалось, динамика экспрессии кортиколиберина в ответ на стресс значительно модифицировалась. В частности, в СА3 и зубчатой извилине ГП-крыс иммунореактивность к кортиколиберину после стресса не повышалась, либо даже снижалась ниже контрольного уровня. В зоне СА4 у ГП-крыс также предотвращалась волна ранней постстрессовой экспрессии кортиколиберина, и вместе с тем нормализовался уровень кортиколиберина в отдаленный период, сниженный у не-ГП животных. В неокортексе ГП-крыс после стресса обнаруживалось устойчивое и выраженное повышение уровня иммунореактивного кортиколиберина как относительно постстрессового уровня у не-ГП крыс, так и контрольных показателей. В мПВЯ гипоталамуса ГП-крыс происходило отчетливое повышение интенсивности экспрессии нейрогормона на раннем сроке (1-е сутки после стресса), однако в отдаленный период показатели иммунореактивности к кортиколиберину у этих крыс были значительно снижены по сравнению с не-ГП особями (рис.16).

Рис. 16. Количественная оценка иммунореактивности к кортиколиберину в зубчатой извилине гиппокампе и мПВЯ гипоталамуса непрекондиционированных (черные столбики) и прекондиционированных (белые столбики) крыс в ответ на тяжелый психоэмоциональный стресс. N, общее число иммунопозитивных клеток; Ni, число клеток, интенсивно экспрессирующих кортиколиберин. Контроль - 100%. *, изменения достоверны относительно контрольной группы крыс, p0.05; #, изменения достоверны относительно непрекондиционированных крыс, p0.05

Вазопрессин. Поскольку наряду с кортиколиберином важнейшим нейроэндокринным регулятором ГАС является нейрогормон вазопрессин, нами были исследованы изменения его содержания в гиппокампе, неокортексе и гипоталамусе после ГП. В контроле был отмечен низкий уровень иммунореактивного вазопрессина в большинстве исследуемых образований мозга. Наличие вазопрессин-иммунопозитивных клеток исходно регистрировалось лишь в V слое неокортекса и ПВЯ гипоталамуса, однако в последнем случае уровень вазопрессин-иммунореактивности был достаточно высок.

После ГП наблюдалось резкое повышение экспрессии вазопрессина на раннем сроке (2 суток) в экстрагипоталамических отделах мозга (гиппокамп, неокортекс), которое затем нивелировалось к 11-му дню. В ПВЯ гипоталамуса после ГП значимых изменений не обнаруживалось. Вызываемые тяжелым стрессом изменения содержания иммунореактивного вазопрессина в исследуемых образованиях мозга имели транзиторный характер - они регистрировались лишь в ранний постстрессовый период и практически нивелировались к 10-му постстрессорному дню, когда формировалось устойчивое депрессивноподобное состояние. При этом психоэмоциональный стресс в парадигме «выученной беспомощности» оказывал неодинаковый эффект на экспрессию вазопрессина в гипоталамусе и экстрагипоталамических областях мозга. В частности, стрессорное воздействие резко редуцировало содержание вазопрессина в ПВЯ гипоталамуса, но повышало его уровень в вентральном гиппокампе и неокортексе через сутки после психоэмоционального стресса. К 10-ти суточному сроку эти стресс-индуцированные изменения нивелировались. У ГП-крыс паттерн стресс-индуцированной экспрессии вазопрессина оказался иным. Так, у них не наблюдалось постстрессового снижения содержания этого нейрогормона в гипоталамическом ПВЯ. Вместе с тем после ГП в значительной мере предотвращалась ап-регуляция уровней вазопрессина в вентральном гиппокампе (СА4 и зубчатой извилине) и, напротив, усиливалась его экспрессия в неокортексе (слои II-III, V).

Таким образом, ГП модифицирует центральные уровни нейрогормонов-регуляторов ГАС - кортиколиберина и вазопрессина как в базальных условиях, так и в ответ на стресс. При этом модификации активности кортиколиберинергической системы носили более устойчивый характер, в то время как изменения в системе вазопрессина были транзиторными и регистрировались лишь в ранние сроки после воздействий. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что реализация про-адаптивных эффектов ГП происходит с вовлечением как молекулярно-клеточных протективных механизмов мозга, так и механизмов эндокринной регуляции адаптивных функций организма. Очевидно, индуцируемые ГП устойчивые модификации активности ГАС и механизмов ее нейроэндокринной регуляции (экспрессия нейрогормонов, уровни кортикостероидных рецепторов) обеспечивают переход этой основной эндокринной системы адаптации в новый режим, определяющий большую устойчивость организма к повреждающим факторам.

В заключении следует отметить, что проведенные нами многосторонние исследования феномена ГП вносят вклад в разработку проблемы повышения адаптивных возможностей мозга и организма в целом. Разработан оригинальный способ ГП умеренной гипобарической гипоксией, который оказывает выраженные нейропротективные и адаптогенные эффекты при действии повреждающих факторов различной природы (тяжелых форм гипоксии, стрессов). Согласно полученным экспериментальным результатам, в основе формирования ГП-индуцируемой долговременной (фаза экспрессии) толерантности мозга к повреждающим воздействиям лежит активация эволюционно-приобретенных, генетически детерминированных защитных механизмов, связанных с репрограммированием генетического аппарата нейронов мозга и выраженным устойчивым увеличением синтеза про-адаптивных белков. Этот эффект осуществляется посредством влияния ГП на процессы внутриклеточной сигнальной трансдукции, приводящие к кооперативной активации транскрипционных факторов, мишенями которых являются про-адаптивные нейропротективные гены.

Установлено, что используемый способ ГП индуцирует повышение резистентности мозга не только к факторам гипоксической природы, но и к другим повреждающим воздействиям, т.е. обладает свойством «кросс-толерантности». Существенная роль в проявлении этого свойства ГП принадлежит, очевидно, запуску механизмов «перекрестной адаптации или неспецифической резистентности» по Ф.З.Меерсону (Меерсон, 1994), обусловленных модификациями гормональной регуляции адаптивных процессов, направленных на эффективную мобилизацию гормон-зависимых защитных механизмов.

Полученные в работе данные могут быть полезны при разработке нейропротекторов и адаптогенов нового поколения, оказывающих направленное действие на активацию внутриклеточных компонентов защитных механизмов мозга. Наряду с этим, проведенные нами исследования должны способствовать внедрению ГП в качестве одного из эффективных немедикаментозных способов нейропротекции в клиническую неврологическую и нейрохирургическую практику для предупреждения и лечения гипоксических, постстрессовых и нейродегенеративных повреждений нервной системы.

Заключение

1. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией оказывает выраженные нейропротективные эффекты, предотвращая структурно-функциональные повреждения мозга крыс в условиях тяжелой гипобарической гипоксии. Это проявляется существенным повышением структурной резистентности нейронов наиболее чувствительных к гипоксии образований мозга (гиппокампа, неокортекса) и нивелированием нарушения воспроизведения приобретенного навыка, вызываемого тяжелой гипобарической гипоксией.

2. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией предотвращает развитие постстрессовых тревожно-депрессивных патологий, индуцируемых тяжелыми формами психоэмоционального и травматического стресса. Гипоксическое прекондиционирование обладает антидепрессивным действием, предотвращая формирование депрессивноподобного состояния у крыс в модели «выученная беспомощность», и оказывает анксиолитический эффект при развитии тревожного состояния у крыс в модели посттравматического стрессового расстройства.

3. У прекондиционированных животных подавляется развитие апоптоза в нейронах гиппокампа и неокортекса мозга крыс вслед за тяжелой гипобарической гипоксией путем активации экспрессии внутриклеточных антиапоптотических факторов (белков Bcl-2, Bcl-xL, митоген-активируемой киназы ERK) и редукции экспрессии проапоптотических факторов (белков Bax, pc-Jun, митогенактивируемых киназ JNK и р38).

4. У непрекондиционированных и прекондиционированных умеренной гипобарической гипоксией крыс проявляются существенные различия паттерна активации ранних генов ngfi-a, junB, c-jun, hif-1б в уязвимых образованиях мозга (гиппокампе, неокортексе, стриатуме) в ранние (3 ч.) и поздние (24-72 ч.) сроки после тяжелой гипобарической гипоксии.

5. У прекондиционированных особей, в отличие от непрекондиционированных, при предъявлении тяжелой гипобарической гипоксии обнаружена кооперативная активация экспрессии как активационных (CREB, NF-kB), так и индуцибельных (NGFI-A, c-Fos, HIF-1б) транскрипционных факторов, вовлекаемых в механизмы индукции процессов адаптации и выживания клеток мозга при повреждающих воздействиях.

6. Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией в ответ на тяжелую гипобарическую гипоксию повышает экспрессию ряда генов позднего действия и их продуктов, участвующих в механизмах нейропротекции и нейропластичности, в частности, генов антиоксидантов mn-sod, trx2, белков цитозольных и митохондриальных супероксиддисмутаз и тиоредоксинов, а также белка амилоидного метаболизма - б-секретазы ADAM17, стимулирующей образование неамилоидогенной формы белка-предшественника в-амилоидного пептида sAPP.

7. В реализацию протективных, антидепрессивных и анксиолитических эффектов прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией вовлекаются гормон-зависимые механизмы регуляции адаптивных функций организма, что проявляется в:

а) повышении стрессореактивности гипофизарно-адренокортикальной системы и оптимизации механизмов ее регуляции по принципу отрицательной обратной связи;

б) предотвращении нарушения функции гипофизарно-адренокортикальной системы в условиях тяжелых повреждающих воздействий (тяжелой гипобарической гипоксии, психоэмоциональных и травматических стрессов);