Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы.

Нетуберкулезные микобактерии - это микроорганизмы, про которые в начале второй половины ХХ века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию называют микобактериозами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобактериозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Katoch V., 2004; Khatter S., 2008].

В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, и их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2002; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены M. tuberculosis и M. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобактерий входят в так называемый M. tuberculosis complex: M. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель Л.М., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Оттен Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky E., 1979, 1992; Tells C., Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier K., 1998; Dawson D., 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Yong M., 2008].

Не входящие в M. tuberculosis complex микобактерии долгие годы называли микобактериями окружающей среды (enviromental mycobacteria), возбудителями микобактериозов, атипичными микобактериями. Однако, в последние десятилетия большинство микробиологов использует термин «нетуберкулезные микобактерии» (НТМ) [Wallace R. et al., 1990, 1997; Dawson D., 2000; Katoch V., Kumar М., 2001; Heifets L., 2004].

Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 50-70 годы XX века: Л.М. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б.Яблокова, Т.Б. Ильина, Р.О. Драбкина, Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались в небольшом объеме лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005].

За это время ситуация в мире резко изменилась, число больных микобактериозами во многих странах возросло в десятки раз. Это явилось следствием увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras T., Daley C.,2002; Cole T. et al., 2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Shin J. et al., 2009].

Заболевания, вызываемые разными видами НТМ, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Cole T.et al., 2005]. Перед микобактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.

В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению НТМ и микобактериозов прогрессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Katoch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Yong M., 2008].

К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактериоза и назначить своевременное лечение.

Кроме того в России микобактериозы не считаются самостоятельными заболеваниями, несмотря на то, что они включены в Международную классификацию болезней. В связи с такой ситуацией, врачи не знают особенностей течения и лечения этой патологии, нет специальных курсов обучения, не используются современные методы диагностики микобактериозов. Сегодня даже не ясно, в каких учреждениях следует лечить таких больных. Часто пациенты, страдающие микобактериозами, находятся в одних палатах с больными туберкулезом и могут инфицироваться от них, а возможно и заражать их.

Все вышеизложенное определяет актуальность и необходимость разработки комплекса методов выделения и идентификации НТМ с применением всех имеющихся в настоящее время технических возможностей.

Цель исследования.

Создание оптимального комплекса выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий (НТМ) с использованием разработанных и модифицированных методов и на этой основе изучение видового состава выделенных НТМ, включая оценку их чувствительности к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Изучить эффективность наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Йенсена, плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC МGIT 960) для выделения НТМ.

2. Провести сравнительный анализ использования для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.

3. Разработать для видовой идентификации НТМ новый молекулярно-генетический метод - биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с методами ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологическими методами.

4. На основании результатов сравнительных исследований эффективности различных методов выделения и идентификации НТМ разработать оптимальный диагностический комплекс (алгоритм), с его применением охарактеризовать видовой спектр штаммов НТМ, циркулирующих в городе Москве.

5. Проанализировать частоту повторного обнаружения у больных одного и того же вида НТМ, как критерия (при наличии клинико-рентгенологических признаков заболевания) развития микобактериоза.

6. Выявить особенности чувствительности к противотуберкулезным и другим антибактериальным препаратам НТМ, выделенных из диагностического материала, поступившего в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных учреждений города Москвы.

Научная новизна исследования.

В результате сравнительного изучения эффективности выделения НТМ с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960), агаровой Миддлбрука 7Н11 и яичной питательной среды Левенштейна-Йенсена установлено, что наибольшее число микобактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается получить до 10% изолятов, оптимальным для выделения НТМ является комплексное применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.

Выявлено (при субкультивировании на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные на жидкой и плотной яичной питательных средах, могут содержать несколько видов микобактерий.

Впервые для идентификации видов НТМ разработан метод биологических микрочипов: поэтапно испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов. В итоге полученный «БИОЧИП IMS» позволяет идентифицировать 9 видов НТМ: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae и дифференцировать их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).

В результате сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов ПДРФ и ВЭЖХ на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований, не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий, но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.

Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации НТМ, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах - плотной и жидкой и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего - предпочтительнее).

Впервые с помощью разработанного алгоритма охарактеризован видовой состав НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве. С наибольшей частотой среди медленнорастущих НТМ из клинического материала выделяются МАС, M. xenopi и M. kansasii а быстрорастущих - M. fortuitum. Большинство клинических изолятов НТМ отличается высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Впервые создана коллекция клинических изолятов (548 штаммов) нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику.

Предложено для эффективного выделения НТМ из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, выделенных на жидкой и плотной яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных средах культур, позволяет обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культурально-морфологические свойства.

Высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий методом ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.

Результаты видовой идентификации культур нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-генетических методов - ПДРФ и биологических микрочипов аналогичным образом в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований при существенном сокращении времени получения результатов. В связи с этим, указанные методы могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения биочипов является простота метода, возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале и автоматизированный учет результатов.

При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ, при отсутствии M. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.

При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что НТМ в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Создана коллекция из 548 клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ, которая может быть использована в качестве контрольной при разработке или испытании новых диагностических тест-систем.

Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Москвы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиопульмонологии РМАПО.

На основании проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:

· «Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 07.02.2007;

· «Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009;

· «Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для выделения НТМ из клинического материала.

2. Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, иммобилизированных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae) и дифференциации их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).

3. Анализ сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью биочипов, метода ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологических методов, показал, что все эти методы дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические тесты характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения и возможность идентификации непосредственно в клиническом материале.

4. Разработан алгоритм выделения и идентификации НТМ, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобактериозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой средой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.

5. При использовании предложенного алгоритма выделения и идентификации НТМ охарактеризован их видовой состав в городе Москве: с наибольшей частотой из медленнорастущих НТМ в клиническом материале обнаружены МАС, M. kansasii и M. xenopi, а из быстрорастущих - M. fortuitum. Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ (при отсутствии M. tuberculosis) и наличие соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики дает основание для рассмотрения в диагностическом ряду микобактериоза.

6. НТМ, выделенные от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве, отличаются высоким уровнем устойчивости как к основным, так и резервным противотуберкулезным препаратам, и в большинстве случаев чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на научных форумах всероссийского и международного уровней, включая научно-практические конференции и заседания Ученого совета МНПЦБТ, 8-й Российский съезд фтизиатров (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 4-й конгресс Евро-Азиатского респираторного общества и 5-й Международный конгресс пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и 8-ю Московские Ассамблеи «Здоровье Столицы» в 2008 г. и 2009 г., Европейские респираторные конгрессы (Берлин 2008 г., Вена 2009 г.), 5-й конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

1. Материал и методы исследования

нетуберкулезный микобактерия хроматография

1. Клинические и лабораторные штаммы микобактерий.

Исследования проведены в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ и основаны на результатах изучения клинических образцов, поступивших из противотуберкулезных учреждений города Москвы за период с января 2006 г. по ноябрь 2009 г. Всего за этот период исследовано 163766 образцов биологического материала, выделены 13283 культуры микобактерий, из которых к НТМ отнесено 764, что составило 5,8%. Из них 548 клинических изолятов НТМ относящихся к 14 видам, охарактеризованные не только микробиологическими, но и одним или двумя молекулярно-генетическими методами и/или ВЭЖХ, находятся в коллекции МНПЦБТ.

В качестве контролей использовали лабораторные штаммы микобактерий, находящиеся в музее Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis Ravenel, M. bovis BCG, M. avium, M. intracellularae, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae, M. gordonae, M. smegmatis, M.terrae, M. xenopi, M. malmoense, M. gastri, M. simiae, M. phlei, M.vacca, M.flavescense. Штаммы получены из ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва), НИИ фтизиопульмонологии (Санкт-Петербург) от профессора Т.Ф. Оттен и из НИИ лепры (Астрахань). Эталонные штаммы M. avium ATCC 35712, M. intracellularae ATCC 35761, M. kansasii ATCC 25101, M. marinum ATCC 11565, M. fortuitum ATCC 14467, M. gordonae 14470 получены из микобактериологической лаборатории Еврейского медицинского исследовательского центра (Денвер, Колорадо, США) от профессора Л. Хейфеца.

2. Выделение и идентификация НТМ.

Выделение микобактерий проводили микробиологическими методами на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й), на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, разделенных на 2 сектора: с антибиотиками/без антибиотиков (с антибиотиками - 7Н11 селективный агар - для подавления роста посторонней микрофлоры и получения чистой культуры микобактерий, без антибиотиков - для выделения штаммов микобактерий, рост которых могут ингибировать антибиотики), а также в модифицированной жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson).

Биологический материал, полученный от обследуемых лиц: мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, материал биопсии, и т.д., перед посевом на питательные среды для уничтожения неспецифической микрофлоры и разжижения подвергали щадящей обработке с помощью Myco-Prep-реагента (BBL), содержащего N-аcetyl-L-cysteine (NALC) и 3% NaOH. Все образцы микроскопировали на наличие кислотоустойчивых микроорганизмов после окраски флюорохромами.

Идентификацию выделенных культур микробиологическими методами проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Вначале культуры кислотоустойчивых микроорганизмов по морфологии колоний и способности к пигментообразованию на плотных и «косообразованию» (результаты микроскопии) в жидкой питательных средах предварительно делили на две группы: M. tuberculosis complex и НТМ. Затем проводили их дальнейшую идентификацию, основанную на оценке скорости роста, способности роста при различных температурах, в присутствии салицилового натрия, 5% NaCl и изучении их биохимических свойств: способности к восстановлению нитратов, теллурита калия; гидролизу Твина-80; никотинамидазной, арилсульфатазной, каталазной активности и др. С целью сокращения времени получения результатов идентификации биохимическими методами для постановки нитратредуктазного и ниацинового тестов использовали первичные культуры микобактерий, выделенные в жидких питательных средах.

Для хроматографического и молекулярно-генетических анализов использовали культуры микобактерий, выделенные в жидкой и на плотных питательных средах, в которых наличие кислотоустойчивых микроорганизмов и отсутствие контаминации подтверждали микроскопией мазков, окрашенных по Циль-Нильсену. Для подтверждения наличия в культуре одного вида микобактерий и их идентификации микробиологическими методами, проводили субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11.

3. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Идентификацию микобактерий методом ВЭЖХ выполняли по методике, основанной на анализе различий в составе миколовых кислот клеточной стенки, разработанной центром по контролю и предотвращению заболеваний (CDC, USA, 1996) и предложенной для использования, как стандартного метода определения видов, входящих в род Mycobacterium, в микобактериологических референс-лабораториях. Разделение миколовых кислот осуществляли методом обращенно-фазовой хроматографии с помощью хроматографической системы Breeze Waters, состоящей из бинарного градиентного насоса, модуля для автоматического ввода проб, модуля для подогрева колонки, многоволнового флюоресцентного детектора, колонки Symmetry C18 5мМ 3,9Ч50 мм с предколонкой.

4. Идентификация микобактерий молекулярно-генетическими методами.

В сотрудничестве с институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН последовательно разработаны экспериментальные версии биологических микрочипов «IMS», предназначенные для идентификации M. tuberculosis и ряда видов НТМ.

Метод включает в себя двухстадийную ПЦР. На первой стадии проводили амплификацию исследуемых фрагментов gyrB гена. На второй стадии использовали ДНК из амплифицированных образцов и дезоксинуклеотид, меченый флуоресцентной меткой CY-5. Полученные ПЦР продукты гибридизовали на чипе, содержащем набор олигонуклеотидов, специфичных для gyrB регионов разных видов микобактерий. Процедуру гибридизации проводили в камере в течение 16-18 часов при 37С.

Интерпретацию результатов гибридизации осуществляли при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих видоспецифические олигонуклеотиды, с помощью специального программного обеспечения «Imageware» (ИМБ РАН, Россия). Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствовал о наличии совершенного гибридизационного дуплекса.

Идентификация НТМ с помощью ПДРФ также включала два последовательных этапа. На первом этапе проводили ПЦР фрагмента гена hsp65, на втором - осущуствляли рестрикционный анализ ампликонов, полученных после проведения ПЦР. Детекцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов проводили с помощью электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии этидиума бромида при напряжении тока 10B/см в течение 10 минут, в однократном TВE буфере (0,089мМ трис-бората; 0,089М борной кислоты; 2мМ EDTA, рН 8,0). По окончании электрофореза гель просматривали в трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете. После обработки рестриктазой Hin6I на электрофорезе были видны четкие отличия разных видов микобактерий, в зависимости от числа пар нуклеотидов.

5. Определение лекарственной чувствительности культур нетуберкулезных микобактерий.

Лекарственную чувствительность культур, выделенных на плотных и в жидкой питательных средах, из клинических образцов больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез, изучали методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03 г.).

6. Статистическая обработка результатов.

Для обработки информации была сформирована база данных (формат Excel), включавшая паспортную информацию о пациентах, сведения о цели исследования, характере диагностического материала, диагнозе и проведенном лечении, результатах микробиологического и молекулярно-генетических исследований. Оценку достоверности различия качественных признаков и долей в группах проводили с использованием критерия Фишера (для двух параметров) и ч2-критерий (для трех и более параметров). В качестве критического уровня достоверности различий принят р = 0,05.

2. Результаты исследования и их обсуждение

Настоящая работа посвящена проблемам разработки и внедрения оптимального комплекса методов выделения и идентификации НТМ. Следует подчеркнуть, что данные о том, каким должен быть оптимальный комплекс (даже только микробиологических методов), который можно рекомендовать для этих целей, в отечественной литературе отсутствуют, а разные зарубежные авторы имеют неодинаковые мнения по этой проблеме. Что касается ВЭЖХ и молекулярно-генетических методов, то в абсолютном большинстве исследований были охарактеризованы возможности применения только одного из них, без определения его места в системе (алгоритме) выделения и идентификации НТМ.

Настоящее исследование проведено для сравнения эффективности выделения микобактерий на разных питательных средах: плотной яичной - Левенштейна-Йенсена (Л-Й), модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (7Н9) в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 и чашках с плотной агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (7Н11).

Произведено 2029 посевов, выделено 227 культур микобактерий, из них как M. tuberculosis complex идентифицировано 186 культур (81,9%) и 41 (18,1%) - как НТМ (MAC - 17, M. kansasii - 8, M. xenopi - 6, M. fortuitum - 10).

Таблица 1. Эффективность выделения микобактерий на разных питательных средах

Установлено (табл. 1), что жидкая питательная среда (7Н9) более эффективна в выделении микобактерий, чем плотные. Из 227 культур микобактерий, выделенных на трех средах, 204 (89,9%) получены в жидкой питательной среде (как только в ней одной, так и в комбинациях с другими средами). На среде 7Н11 выделены 180 (79,3%), а на Л-Й - 166 (73,1%) культур. Что касается НТМ, то больше всего культур также удалось выделить в жидкой питательной среде 7Н9 - 35 (85,4%), меньше на плотной агаровой 7Н11 - 30 (73,2%), и ещё меньше на среде Л-Й - 27 (65,9%) культур.

Чаще НТМ выделяли на трех средах -18 (43,9%), что достоверно выше, чем при других сочетаниях сред (p < 0,05), и лишь в единичных случаях только на одной среде: Л-Й - 1 (2,4%); 7Н11 - 2 (4,9%) и 7Н9 - 5 (12,2%), соответственно (табл. 2).

Таблица 2. Частота выделения микобактерий на разных питательных средах и их комбинациях (абс., %)

Таблица 3. Эффективность выделения НТМ на средах Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9

Дополнительно на значительно большем количестве материала было проведено сравнение эффективности использования двух сред - Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9, которые постоянно применяют в микробиологической лаборатории МНПЦБТ (табл. 3). Частота выделения всех видов НТМ оказалась также в 1,2 раза выше в жидкой питательной среде, в наибольшей степени это относилось к МАС, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae.

Таблица 4. Сроки выделения культур НТМ на разных питательных средах

Следует отметить, что обнаружение роста микобактерий в системе BACTEC MGIT 960 (в модифицированной жидкой среде Миддлбрука 7Н9) происходило на 10-20 дней раньше (табл. 4), чем на плотных средах. Среднее время детекции роста на этой среде составило 19,8±5,2 дней, по сравнению с 30,5±3,9 днями на среде 7Н11 и 37,2±4,5 днями на среде Левенштейна-Йенсена (т.е. в 1,5 и 1,9 раз быстрее, соответственно).

Эти данные подтверждены и при расширенном исследовании с использованием только сред Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9 (табл. 5).

Таблица 5. Длительность культивирования НТМ на средах Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9

Самый высокий процент контаминации посевов наблюдался на среде Л-Й (11,2%), а самый низкий на среде 7Н11 (5,3%), 7,2% образцов было контаминировано в среде 7Н9.

В ходе проведенных исследований выявлено, что недостатком метода выделения микобактерий в жидких питательных средах является невозможность наблюдения за морфологией и хромогенностью колоний.

Преимуществом яичных сред (в частности, Л-Й), является устойчивость к высыханию, а следовательно пригодность для инкубации в течение длительного периода. Однако при росте контаминатов происходит разжижение среды, что приводит к прерыванию инкубации и потере клинически значимых штаммов микобактерий.

Следует также отметить, что агаровая среда Миддлбрука 7Н11, благодаря простому химическому составу менее подвергалась контаминации, а наличие в ее составе гидролизата казеина способствовало росту штаммов, наиболее требовательных к условиям культивирования.

Дополнительное (к среде 7Н9) культивирование на среде 7Н11 и/или Л-Й обеспечивало более полное выделение микобактерий (по данным L.Heifets,1997 до 10% НТМ вырастает только на плотных средах), а использование чашек с агаровой средой 7Н11 позволяет провести первичную идентификацию вида микобактерий по морфологии колоний и выбрать наиболее информативные биохимические тесты для окончательной идентификации, получить чистую культуру в случаях обильного роста контаминантов и обнаружить смешанные культуры микобактерий.

Вместе с тем, следует иметь в виду, что недостатком применения чашек с агаровой средой 7Н11 в условиях централизованных микробиологических лабораторий с большим потоком исследований являются неудобства, связанные с серьезными трудозатратами по инкубированию и просмотру большого количества чашек, однако в пробирочном варианте эта среда может успешно применяться в комплексе выделения микобактерий. Исходя из вышеизложенного, целесообразнее агаровые чашки использовать для субкультивирования изолятов, полученных на плотной яичной или в жидкой питательных средах.

Необходимо подчеркнуть, что ни на одной из изученных питательных сред не удалось выделить из клинических образцов культуры микобактерий в 100% случаев,что является важным доводом для применения их комбинаций.

В итоге проведенных исследований разработан оптимальный микробиологический комплекс методов выделения НТМ: культивирование диагностического материала на модифицированной жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) в сочетании с одной из плотных сред.

Частота обнаружения и видовой состав НТМ, выделенных в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ

Анализ частоты обнаружения НТМ в клиническом материале свидетельствует о существенном увеличении их количества в последние 2 года. Если в 2006 г. выделено 102 (3,0%), в 2007 г. - 111 (3,4%), то в 2008 г. - 253 (6,9%) и за 10 месяцев 2009 года - 268 (8,7%) изолятов НТМ (от общего числа микобактерий) (рис. 1).

Рис. 1. Частота обнаружения НТМ за период 2006-2009 гг.

Низкий показатель выделения НТМ в 2006-2007 годы связан с отсутствием оптимальных методических возможностей, поскольку организация данного вида исследований только начиналась. В связи с этим, не все выделенные в лаборатории культуры НТМ идентифицировали до вида, часть из них (полученные в жидкой питательной среде) только дифференцировали от микобактерий туберкулезного комплекса, поэтому при подсчете не учитывали. Начиная с 2008 года, выделение и идентификацию НТМ проводили с использованием разработанного алгоритма, с применением вышеописанного набора питательных сред, молекулярно-генетических методов (ПДРФ, биочипы) и ВЭЖХ, что позволило ускорить процесс идентификации микобактерий и повысить его специфичность. Благодаря этому, за последние годы ряду больных был установлен диагноз микобактериоза (некоторым - вместо туберкулеза) и назначена соответствующая терапия; положительная динамика процесса в большинстве случаев подтвердила правильность диагноза.

При изучении видового спектра выделенных в Центре НТМ было установлено (табл. 6), что две трети из них относились к медленнорастущим (по классификации Runyon) и одна треть к быстрорастущим.

Таблица 6. Частота обнаружения микобактерий при использовании микробиологических методов

* В 14 пробах - с MAC и в 6 - с M. Fortuitum.

** В 14 пробах - с M. tuberculosis и в 2 - с M. Fortuitum.

*** В 2 пробах - с MAC и в 6 - с M. Tuberculosis.

**** Прочие (M. gastri, M. simiae - 2, M. szulgai, M. terrae, M. malmoensae, M. smegmatis).

Самым распространенным видом оказались M. avium complex, что согласуется с известным (по данным зарубежных авторов) значением МАС в патологии человека. Вторыми по частоте выделения были M. fortuitum (однако, как одно-, так и неоднократное выделение быстрорастущих микобактерий, требует тщательного изучения наличия и особенностей симптомов заболевания для оценки их этиологической значимости). Затем следовали M. kansasii и M. xenopi. У двоих больных M. xenopi были обнаружены в операционном материале (содержимое туберкулемы, каверны), что даже при однократном обнаружении может служить подтверждением диагноза микобактериоза.

232 культуры микобактерий в результате комплексного микробиологического исследования были отнесены к M. tuberculosis. В данном разделе работы речь идет о тех культурах, которые первоначально вызвали трудности при дифференциации от НТМ. В первую очередь, это культуры, с не типичной для M. tuberculosis морфологией колоний, выделенные на среде Л-Й от больных, длительно получавших противотуберкулезную терапию. В жидкой питательной среде - контаминированые посторонней микрофлорой или смешанные культуры микобактерий (M. tuberculosis + M. fortuitum, M. tuberculosis + МАС). При микроскопии мазков из таких культур не наблюдалось характерного расположения клеток в виде «кос» - проявление корд-фактора при росте на жидких питательных средах и морфология клеток M. tuberculosis была измененной.

При анализе частоты и видового состава НТМ в зависимости от вида исследуемого материала, установлено, что большая часть НТМ была выделена из мокроты (что вполне понятно, поскольку этот источник является наиболее доступным), как «спонтанной» (без каких либо «местных» воздействий), так и после ингаляции. Реже НТМ обнаруживали в материале бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальных смывов, а также в других образцах (плевральный экссудат, материал биопсии и др.). При этом не было существенных (статистически достоверных) различий в соотношении частоты выявления разных видов НТМ в зависимости от источника исследуемого клинического материала.

Проанализирована также частота выделения НТМ в зависимости от диагноза, с которым материал поступил на исследование из противотуберкулезных диспансеров. Выявлены некоторые особенности в распределении видов НТМ по группам с диагнозом: туберкулез, нетуберкулезные заболевания легких, «диагностический поиск». Так, M. kansasii несколько чаще обнаруживали в «диагностическом» материале, чем у больных с диагнозом «туберкулез», а МАС и M. xenopi у больных с клиническим диагнозом «туберкулез».

Изучена частота неоднократного выделения от больных одного и того же вида НТМ (рис. 2). Эти результаты важны, так как неоднократное обнаружение НТМ с большой вероятностью указывает на его этиологическую роль в развитии микобактериоза у данного больного.

Всего НТМ повторно обнаружены у 114 больных; в 47 случаях (41,2%, что достоверно больше, чем другие виды микобактерий, р < 0,05) это были МАС, в 24 (21,1%) - M. kansasii, в 25 (21,9%) - M. fortuitum, в 12 (10,5) - M. xenopi, в 4 (3,5%) - M. flavescens и по 1 случаю (0,9%) - M. gordonae и M. smegmatis.

Двукратно выделяли один и тот же вид НТМ от 73 больных (64,0%), трехкратно - от 29 (25,4%) и более четырех раз - от 12 (10,5%) больных.

Рис. 2. Частота повторного выделения нетуберкулезных микобактерий

Здесь имеет смысл особо обратить внимание на случаи трехкратного и более обнаружения НТМ у одного и того же больного. По критериям Американского торакального общества (Wallace R.et al., 1997) это является (при наличии клинико-рентгенологической симптоматики) важным диагностическим критерием микобактериоза. Всего трехкратно и более НТМ были выделены от 41 больного - 36,0% всех случаев их неоднократного обнаружения (в т.ч. MAC - от 20, M. kansasii - от 8, M. fortuitum - от 8, M. xenopi - от 4, M. flavescens - от одного больного).

В этом разделе работы сопоставлены результаты определения вида микобактерий микробиологическими методами и ВЭЖХ. Содержание миколовых кислот, анализируемых методом ВЭЖХ, и их соотношение в бактериальной клетке является устойчивым фенотипическим признаком, характерным для каждого вида микобактерий, что позволяет получать достоверные, воспроизводимые результаты. Высокая чувствительность метода за счет применения флуоресцентного детектора дает возможность анализировать культуры, выделенные в жидких питательных средах, даже с небольшим содержанием бактериальных клеток, что значительно сокращает сроки идентификации.

На рисунке 3 в качестве примера представлены хроматограммы, полученные при анализе миколовых кислот музейного штамма M. avium ATCC35712 и штамма, выделенного от больного.

Совпадение результатов, полученных с помощью ВЭЖХ и бактериологических методов, имело место в 94,4% случаев; в том числе для медленнорастущих НТМ - в 93,4%, быстрорастущих - в 87,5% (в целом для НТМ - в 92,4%), а M. tuberculosis complex - в 99,0% (табл.8.). При этом следует подчеркнуть, что идентификация вида НТМ культуральными и биохимическими методами занимает до трех недель, тогда как применение ВЭЖХ сокращает это время до 24 часов (статистически достоверные различия результатов идентификации микобактерий микробиологическими методами и ВЭЖХ отсутствуют).

Рис. 3. Анализ миколовых кислот M. avium с помощью метода ВЭЖХ: а - M. avium АТСС 35712 (из музея МНПЦБТ); б - культура № 4-M. avium, выделенная от больного

Таблица 8. Сравнительные данные идентификации микобактерий микробиологическими методами и ВЭЖХ *

* В таблице за 100% взяты результаты микробиологического исследования, с которыми сопоставлены данные ВЭЖХ (в таблице не учитывали, что в ряде случаев окончательная идентификация была основана на результатах использования комплекса методов, включая ВЭЖХ и молекулярно-генетические исследования)

Проведено также сопоставление результатов идентификации методом ВЭЖХ культур микобактерий, выделенных в жидкой и на плотных питательных средах. Всего были проанализированы 243 культуры (сопоставляли данные идентификации только наиболее часто выделяемых культур). Установлено, что в целом совпадение результатов, полученных двумя методами при идентификации культур, выделенных в жидкой питательной среде, имело место в 93,4%, а на плотных - в 93,0% случаев (табл.9), в одном случае M. fortuitum, выделенные на среде Л-Й, методом ВЭЖХ идентифицировать не удалось.

Таблица 9. Результаты идентификации микобактерий, выделенных на плотной (Л-Й) и в жидкой (7Н9) питательных средах, с помощью ВЭЖХ

Таким образом, независимо от того проводили анализ с помощью ВЭЖХ изолятов, выделенных в жидкой или на плотной питательных средах, получены практически идентичные данные, однако, использование культур с жидкой среды предпочтительнее из-за сокращения сроков получения результатов.

Молекулярно-генетические методы в настоящее время широко используются для видовой идентификации микроорганизмов. После того, как был полностью расшифрован геном ряда микобактерий, произошел существенный прогресс в разработке методов их идентификации и соответствующих диагностических тестов. Достаточно сложной задачей является поиск геномной мишени, при молекулярно-генетическом анализе которой будет возможна идентификация вида НТМ (выбор мишени осложняется большим сродством геномов различных представителей рода Mycobacterium). В настоящее время, для этой цели используют инсерционные последовательности (IS900, IS901, IS1245, IS1561, IS2404), структурные гены (rpoB, gyrB, hsp65, secA1, recA, sodA, ген 16S rRNA, область ITS гена 16S rRNA) микобактериальной ДНК.

На основе изучения микобактериального генома и исследований возможных генетических мишеней, приемлемых для видовой идентификации микобактерий, разработаны различные методы молекулярно-генетического определения вида микобактерий: полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в сочетании с гибридизационным анализом, гибридизация in situ, ПЦР в сочетании с рестрикционным анализом (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), секвенирование. Чаще всего с этой целью используют ПЦР в сочетании с гибридизационным или рестрикционным анализом.

В настоящем исследовании для определения вида ...