Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев

Hong Kong/156/97

H5N1

30

30

40

60

60

Hong Kong/481/97

H5N1

30

30

40

50

60

Hong Kong/485/97 *

H5N1

<5

<5

50

60

70

Вирусы гриппа человека

A/Chr/157/83 M *

H1N1

<2

<2

<5

80

80

A/Singapore/1/57

H2N2

<2

<2

<5

50

80

A/NIB/26/90 M

H3N2

<2

<2

<5

70

70

B/NIB/48/90 M

Type B

<2

<2

<5

80

80

- * Наличие сайта гликозилирования 158 аминокислоты

Относительное сродство - выраженное в процентах отношение сродства данного вируса к субстрату в условиях эксперимента и «сродства» в условиях максимально благоприятствующих связыванию (Отсутсвие всех блокаторов в реакционной смеси). Чем выше цифра в таблице - тем выше сродство вируса к субстрату.

Сравнение состава ганглиозидов в кишечниках курицы и утки

Полученные результаты побудили нас сравнить состав ганглиозидов на эпителиальных клетках кишечников курицы и утки (ЭККК и ЭККУ). На рис. 5 приведена хроматограмма разделения тотальных ганглиозидов из этих двух источников. Для сравнения использованы ГМБ. Видны существенные отличия в составе ганглиозидов ЭККК и ЭККУ. Доминирующий ганглиозид ЭККК совпадает по подвижности с GM1а. В ЭККУ соответствующего ганглиозида нет, а есть другой, с меньшей хроматографической подвижностью, и еще один, близкий по подвижности с GD1a. На дорожке 2 внизу хорошо заметно пятно, соответствующее примерно 10-15-звенному ганглиозиду кишечника курицы, а в кишечнике утки в этой зоне материала так мало, что он не виден на хроматограмме. Для анализа фракций ганглиозиды элюировали с хроматограммы и исследовали их способность связывать разные ВГ.

Результаты связывания ВГ с фракциями ГМБ соответствуют литературным данным. Как было показано Suzuki (1994) вирусы связываются с концевой СК, поэтому GM1а, несущий сиаловую кислоту при третьем от конца звене, не является рецептором ВГ. Хорошими рецепторами для вируса утки являются GD1a и GT1b с концевой структурой Neu5Acб2-3Galв1-3GalNAcв.

Ганглиозид кишечника утки близкий, но не совпадающей по подвижности с GM1а хорошо связывает утиный вирус, следовательно содержат концевую СК. Весьма вероятно, что это GM1b с сиаловой кислотой при концевой галактозе. Следующий ганглиозид ЭККУ совпадает по подвижности и по способности связывать вирусы с GD1a. В кишечнике курицы ганглиозид, совпадающий по подвижности с GM1а не связывает вирусы, что наводит на мысль, что это и есть GM1а. На уровне GD1a и GT1b в кишечнике курицы материала мало, поэтому эти зоны тоже плохо связывают вирусы. Зато зона, соответствующая 10-15-звенным ганглиозидам связывает вирусы утки, курицы и человека.

Как мы показали выше, многие вирусы кур, с сайтом гликозилирования 158 аминокислоты, утратили способность связываться с легкими фракциями ганглиозидов. Отсутствие на клетках мишенях кур малозвенных ганглиозидов, поддерживающих связывание вирусов гриппа, вероятно способствовало эволюции вирусов в сторону распознавания рецепторов с длиной ножкой.



Рис. 5. Тонкослойная хроматография ганглиозидов эпителиальных клеток кишечника утки и курицы. Ганглиозиды: 1 - кишечника утки, 2 - кишечника курицы, 3 - мозга быка (указаны справа). Цифрами вдоль хроматограммы указаны номера фракций, использованных для изучения связывания вирусов.

Связывание вирусов с клеточными мембранами ряда клеток мишеней

Далее, мы исследовали связывание вирусов разных хозяев с мембранами эпителиальных клеток кишечников утки и курицы, трахеи курицы и трахеи мартышки (рис. 6 ). ВГ птиц связываются со всеми четырьмя представленными субстратами, но картина связывания для вирусов разных хозяев различается. Все утиные вирусы связываются с клетками кишечника утки сильнее, чем с остальными субстратами. Для вирусов чаек и кур оптимальным субстратом являются клетки кишечника курицы. Этот же субстрат оптимален для вирусов человека, но, в отличие от птичьих вирусов, вирусы человека практически совсем не связываются с клетками кишечника утки.

Рис. 6. Связывание вирусов гриппа разных хозяев с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки, кишечника курицы, трахеи курицы и трахеи мартышки.

Далее, мы исследовали состав рецепторов для вирусов гриппа на плазматических мембранах вышеупомянутых эпителиальных клеток.

Для этого мы воспользовались четырьмя вирусами с ярко выраженной рецепторной специфичностью: A/Duck/Buryatia/1905/00 (dk/Bur), A/Chicken/Vietnam/NCVD11/2003 (ch/VN), A/Chicken/NJ/12220/97 (ch/NJ ), и вирус человека A/NIB/23/89M (NIB/23M).

В таблице 7 приводятся значения констант диссоциации этих вирусов к полимерам несущим ряд ключевых сиалосахаридных детерминант.

Таблица 7 - Константы диссоциации вирусов к различным рецепторным детерминантам.

Сахаридные Группировки	Вирусы
	dk/Bur	ch/NJ	ch/VN	NIB/23M
	H4N6	H9N2	H5N1	H1N1
Neu5Ac?2-6Gal?1-4GlcNAc? (6`SLN)	>200	>200	>200	5
Neu5Ac?2-3Gal?1-4GlcNAc? (3`SLN)	20	10	5	>200
Neu5Ac2-3Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc (SLex )	200	0.5	50	>200
Neu5Ac?2-3Gal?1-4(6Su)GlcNAc? (Su-3`SLN)	20	10	0.3	>200
Neu5Ac2-3Gal1-3GlcNAc (SLec)	10	10	10	>200

*См подпись под табл. 3.

Из таблицы видно, что только вирус человека связывает 6`SLN; с сиаловой кислотой присоединенной к галактозе 2-3 связью этот вирус не связывается.

Утиный вирус dk/Bur хорошо связывается со SLec - сахаром с 1-3 связью между галактозой и глюкозамином. Добавление сульфогруппы к рецептору безразлично для связывания, а фукозилирование резко снижает сродство к рецептору.

Непатогенный куриный вирус ch/NJ связывается с 3`SLN, SLec и их сульфатированными производными примерно так же как и вирус dk/Bur, но максимальное сродство проявляет к фукозилированым сиалосахарам. Сродство к SLex у ch/NJ в 400 раз выше чем у dk/Bur, что позволяет выявлять наличие фукозилированных рецепторов с помощью этой пары вирусов.

Высоко патогенный H5N1 вирус ch/VN с максимальным сродством связывается с сульфатированным Su-SLN.

Далее мы провели количественный анализ сродства этих вирусов к клеточным мембранам. Для этого данные по связыванию вирусов с субстратами представляли в виде графиков Скетчарда, наклон которых отражает сродство ВГ к субстрату, а точка пересечения графика с осью Х - относительное число рецепторов для исследуемого вируса в данном препарате (Рис. 7). Вирус утки dk/Bur лучше всего связывается с клетками кишечника утки - ход графика Скетчарда указывает на максимальное число рецепторов для вируса и на высокое сродство вируса к этим рецепторам. Вирус утки так же неплохо связывается с клетками куриной трахеи и трахеи зеленой мартышки.

Связывание с клетками кишечника курицы слабое - ход графика указывает на низкое сродство к соответствующим рецепторам.

У вируса курицы ch/NJ соотношение сродства к клеткам кишечника утки и клеткам кишечника курицы противоположное - минимальное сродство к клеткам кишечника утки и максимальное - к клеткам куриного кишечника. С клетками трахеи курицы и мартышки вирус связывается с меньшим сродством, хотя число мест связывания на этих субстратах для вируса достаточно велико.

Другой куриный вирус, ch/VN также лучше связывается с клетками кур, чем с клетками утки, но, в отличие от вируса Ch/NJ, с клетками трахеи связывается с большим сродством, чем с клетками кишечника. Сильнее всего данный вирус связывается с клетками трахеи мартышки.



Рис. 7. Графики Скетчарда связывания вирусов A/Duck/Buryatiya /1905/00 (dk/Bur), A/Chicken/NJ/12220/97 ( ch/NJ), A/Chicken /Vietnam/NCVD-11/2003 (ch/VN) и вируса человека A/NIB/23/89M (NIB/23M) с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки (КУ), кишечника и трахеи курицы (КК и ТК) и трахеи зеленой мартышки (ТМ).

И, наконец, вирус человека A/NIB/23/89M совсем не связывается с клетками кишечника утки, а с клетками кишечника и трахеи курицы связывается очень хорошо. С клетками трахеи мартышки вирус связывается с максимальным сродством, хотя число мест связывания (точка пересечения с осью Х) меньше, чем на куриных клетках.

Исходя из рецепторной специфичности этих вирусов можно трактовать данные по их связыванию с различными клетками.

Способность вируса человека NIB/23M связываться с клетками кишечника курицы и трахеи курицы и мартышки указывает на наличие 6`SLN рецепторов на этих клетках.

Резкие отличия в связывании вирусов dk/Bur и ch/NJ к клеткам кишечников утки и курицы вероятно объясняются доминированием фукозилированных рецепторов в кишечнике курицы.

Высокое сродство вируса ch/VN к клеткам трахеи мартышки и курицы, возможно обусловлено наличием сульфатированных рецепторов.

Выявление сульфатированных рецепторов на клетках мишенях

Выявление сиалосодержащих рецепторов сульфатированных по шестому положению глюкозамина мы проводили с помощью фермента 6-глюкозамин сульфатазы.

Препарат клеточных мембран обрабатывали ферментом до полного удаления всех 6-сульфогрупп с глюкозамина, являющегося третьим звеном сиалосахаридного рецептора. Далее сравнивали сродство вирусов к исходному и обработанному препарату.

Для вирусов Duck /Pensylvania/84 и Duck/Minessota/1525/81 обработка субстратов 6-глюкозамин сульфатазой не влияет на сродство к клеткам. Для вирусов Chicken /HK/786/97 и Equine/Maiamy/1/63, обладающих повышенным сродством к сульфатированным рецепторам, сульфатазная обработка резко понижает сродство к клеткам трахеи мартышки. Такой результат доказывает, что высокое сродство вирусов H5N1 к клеткам трахеи мартышки связано с тем, что на этих клетках присутствуют сульфатированные по глюкозамину сиалосодержащие группировки, скорее всего Su-3`SLN, к которому у данных вирусов особо высокое сродство.

Адаптация вирусов гриппа кур к сульфатированным рецепторам видимо отражает наличие таких рецепторов на клетках мишенях кур. По случайному совпадению, эти же сиалосахаридные группировки, очевидно, присутствуют на клетках дыхательного эпителия зеленой мартышки, и, вполне вероятно, человека. Второй тип рецептора, присутствующий как в клетках дыхательного эпителия человека, так и на клетках эпителия кур это 6`SLN - «человеческий» рецептор. Напомним, что и Su-3`SLN и 6`SLN- это рецепторы на базе одного и того же сахарида второго типа Galв1-4GlcNac.

Наличие рецепторов для человеческих вирусов на эпителиальных клетках кур поставило перед нами задачу провести более широкое исследование птиц из разных систематических групп.

Состав рецепторов для вирусов гриппа на клетках различных птиц.

Изучались птицы, принадлежащие к отрядам:

1) Гусеобразные - Anseriformes:

2) Курообразные - Galliformes:

3) Журавлиные Charadriiformes:

Семейство Бекасовые Scolopacidae:

Семейство Чайковые Laridae

4) Аистообразные Ciconiiformes:

5) Поганкообразные Podicipediformes

6) Журавлеобразные Gruiformes

О составе сиалосодержащих рецепторов на клетках судили по способности этих клеток связывать лектины SNA и MAA, специфически распознающими Neu5Ac?2-6Gal? и Neu5Ac?2-3Gal?1-4GlcNAc группировки, а также вирусы dk/Bur, ch/NJ, ch/VN и NIB/23M с хорошо охарактеризованной рецепторной специфичностью.

На рис. 8 приведены профили связывания вирусов и лектинов с эпителиальными клетками кишечников ряда птиц.



Рис. 8. Связывание Maackia amurensis agglutinin (MAA), Sambucus nigra agglutinin (SNA), а так же вирусов утки dk/Bur, курицы ch/NJ и человека NIB/23/89M c клетками кишечников разных птиц.

Клетки уток плохо связывают ВГ курицы и практически не связывают ВГ человека, но очень хорошо связывают утиный вирус. В полном соответствии с работой Ito et al., (1998) клетки уток практически не связывают лектин SNA. Интересно то, что лектин MAA тоже плохо связываются с этими клетками. Очевидно, на клетках уток преобладают такие сиалил2-3галактозные рецепторы, которые не связывают этот лектин. Это могут быть Siaб2-3Galв1-3Glc/GalNAc - группировки которые хорошо связывают утиные вирусы, но не связывают МАА (Knibbs и др., 1991). Кишечные эпителии куриных птиц хорошо связывают вирус ch/NJ, что указывает на наличие фукозилированных рецепторов. Лектин МАА связывается с клетками куриных птиц существенно лучше, чем с клетками утиных, что указывает на наличие Siaб2-3Galв1-4GlcNAc группировок.

Клетки куриных птиц, а так же куликов и цапли неплохо связывают лектин SNA и человеческий вирус гриппа.

Таким образом, характерные отличия между клетками кишечников утки и курицы, описанные выше, повторяются на изученных нами представителях утиных и куриных птиц.

Клетки кишечника чаек хорошо связывают как утиный вирус так и вирус ch/NJ; очень хорошо связывает лектин MAA и практически не связывают лектин SNA и ВГ человека. Следовательно там обильно представлены 3`SLN и SiaLex группировки, а 6`SLN группировки, по-видимому отсутствуют.

Клетки лысухи, чемги и цапли очень хорошо связывают лектин MAA и очень плохо связывают ВГ. В работе Knibbs (1991) показано, что лектин MAA неплохо связывается с Siaб2-3Galв1-4GlcNAc/Glc - группировками, в которых сиаловая кислота модифицирована в области глицеринового остатка, либо присутствует в гликолильной форме. Нельзя исключить, что на клетках вышеупомянутых птиц присутствуют подобные модифицированные по сиаловой кислоте формы 3`-сиалиллактозы.

Лектины MAA и SNA часто используют как инструмент для исследования наличия рецепторов для вирусов гриппа на различных клетках мишенях (Couceiro и др., 1993; Ito и др., 1998; Feldmann и др., 2000). Наши данные свидетельствуют, что трактовать результаты, полученные с лектинами, надо с осторожностью, так как рецепторные детерминанты для лектина MAA и для птичьих вирусов могут не совпадать, хотя обе включают сиалил 2-3галактозный остаток.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что различной рецепторной специфичностью обладают не только ВГ человека и ВГ птиц, но что вирусы разных птиц также могут иметь различный рецепторный фенотип. Можно описать несколько типов рецепторов вирусов гриппа. Перед терминальной сиаловой кислотой могут находиться либо дисахариды Galв1-3GalNAc, Galв1-3GlсNAc (дисахариды первого типа), либо Galв1-4GlсNAc (дисихарид второго типа). На базе дисахаридов первого типа построены ганглиозиды ганглио-ряда, дисахариды второго типа более характерны для гликопротеинов, хотя встречаются и в ганглиозидах. Терминированные 3`сиаловой кислотой дисахариды первого типа без дополнительных заместителей при третьем от конца звене (как в STF, SLec и ганглиозидах GM1b и GD1a) лучше всего распознаются утиными вирусами гриппа (Рис 9).

Дисахарид второго типа входит в состав рецептора человеческих вирусов 6`SLN и ряда рецепторов птичьих вирусов на базе 3`SLN. Многие птичьи вирусы адаптированы к 3`SLN с заместителями при глюкозаминовом кольце. Все исследованные нами вирусы чаек адаптированы к фукозилированному 3`SLN - SLex . H5N1 вирусы кур обладают максимальным сродством к сульфатированному 3`SLN - Su-3`SLN. H7 вирусы кур, а так же «avian like» свиные вирусы адаптированы к 3`SLN с обоими заместителями - Su-SLex. К этим же рецепторам адаптированы и лошадиные вирусы. Все вышеупомянутые сиалосахаридные остатки широко представлены в живой природе.

Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при переходе от уток к новым хозяевам, очевидно, отражает состав сиалозидов на новых клетках мишенях. По нашим данным клетки кишечников кур обогащены фукозилированными рецепторами, а куриной трахеи сульфатированными сиалосахарами. Возможно не случайно то, что непатогенный куриный вирус ch/NJ адаптирован к фукозилированному SLex, а высокопатогенные H5N1 вирусы кур, которые поражают в первую очередь дыхательные пути птицы, к сульфатированному Su-3`SLN.

Рис. 9. Оптимальные рецепторы для вирусов гриппа разных хозяев - сиалосахара на базе дисахарида первого типа (SLec) и дисахарида второго типа (6`SLN, 3`SLN, SLex , Su-3`SLN).Р21

Побочным следствием адаптации вируса к новому хозяину может быть повышение сродства к рецепторам, присутствующим в дыхательных путях млекопитающих и, в частности, человека. ВГ таких хозяев могут иметь повышенный потенциал перехода к людям и должны быть предметом постоянного наблюдения.

Впервые в мире показано, что рецепторная специфичность вирусов гриппа разных птиц различна.

Впервые в мире показано, что адаптация вирусов гриппа разных эволюционных линий к курам приводит к изменению рецепторной специфичности вируса. У них повышается сродство к сульфатированным и фукозилированным рецепторам, в частности к Su-3`SLN и к Su-SLex. Многие из этих вирусов приобретают также частичное сродство к человеческому рецептору.

Показано, что рецептор Su-3`SLN присутствует в дыхательном эпителии мартышки и, вполне вероятно, в дыхательном эпителии человека. Адаптация к Su-3`SLN возможно способствует заражению человека.

Показано, что человеческие изоляты H5N1 вирусов, несущие мутацию 227 аминокислоты в гемагглютинине, распознает человеческий рецептор. Это лишний раз напоминает о риске возникновения пандемического варианта этих вирусов

Впервые в мире показано, что эволюция рецепторной специфичность вирусов гриппа в людях и в свиньях идет параллельно - поначалу вирусы распознают как Sia?2-3Gal, так и Sia?2-6Gal рецепторы, а затем только 6`SLN.

Впервые в мире показано, что состав сиалосахаридных рецепторов на клетках мишенях разных птиц существенно отличается и вследствие этого рецепторная специфичность вирусов при переходе от первичных хозяев (диких уток) к чайкам и к курам меняется

Впервые в мире показано, что 6`SLN-остатки присутствуют на эпителиальных клетках не только у млекопитающих, но также и многих птиц, в частности куриных.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гамбарян А.С., Ямникова С.С., Львов Д.К., Робертсон Дж., Вебстер Р., Матросович М.Н.. (2002) Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека. Молекулярная Биология, 36, 542-549.

2. Маринина В. П., А. С. Гамбарян, Н. В. Бовин, А. Б.Тузиков, А. А. Шилов, Б. В. Синицын, М. Н. Матросович. (2003), Влияние утраты сайтов гликозилирования, расположенных вблизи рецептор-связывающего участка, на рецепторные характеристики вируса гриппа человека субтипа H1N1. Молекулярнаяя биология, 37, 1-6.

3. Маринина В.П., А.С. Гамбарян, А.Б.Тузиков, Г.В.Позынина, Н.В. Бовин, И.T.Федякина, С.С.Ямникова, Д.К. Львов, М.Н. Матросович. (2004) Эволюция рецепторной специфичности гемагглютинина вирусов гриппа при переходе от уток к свиньям и к людям. Вопросы вирусологии 4, 25-30.

4. Гамбарян А.С, Маринина В. П., Солодарь Т.А., Бовин Н. В., Тузиков А. Б., Ямникова С.С., Львов Д.К., Климов А.И., Матросович М.Н.. (2006) Различная рецепторная специфичность вирусов гриппа уток и кур отражает отличия в составе сиалозидов на хозяйских клетках и муцинах. Вопросы вирусологии 6, 135-143.

5. Gambaryan, A.S. and Matrosovich M.N., 1992. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J. Virology. Methods 39, 111-123.

6. Gambaryan, A.S., Piskarev, V.E., Yamskov, I.A., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Nifant`ev, N.E., and M.N.Matrosovich. (1995). Human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Letters 366, 57_60

7. Gambaryan, A.S., Tuzikov, A. B., Piskarev, V.E., Yamnikova, S.S., Lvov, D.K., Robertson, J.S., Bovin, N.V., Matrosovich, M.N. (1997). Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology 232, 345-350.

8. Gambaryan A.S., M.N.Matrosovich, C.A.Bender, and E.D.Kilbourne. (1998) Differences in the biological phenotype of low-yielding (L) and high-yielding (H) variants of swine influenza virus A/NJ/11/76 are associated with their different receptor-binding activity. Virology 247, 223-231.

9. Gambaryan, A. S., Robertson, J. S., and Matrosovich, M. N. (1999) Effects of egg-adaptation on the receptor-binding properties of human influenza A and B viruses. Virology 258, 232-239.

10. Gambaryan, A., Webster, R., and Matrosovich, M. (2002). Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken. Arch. Virol. 147, 1197-2008.

11. Gambaryan, A.S., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Yamnikova, S.S., Lvov, D.K., Webster, RG and Matrosovich, M.N. (2003). Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken and receptor specificity of the 1997 H5N1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong. Avian Dis. 47 (3 Suppl), 1154-1160.

12. Gambaryan, A.S, Tuzikov, A.B, Pazynina , G.V, Webster, R.G, Matrosovich M.N and Bovin N.V., 2004. H5N1 chicken influenza viruses display a high binding affinity for Neu5Ac2-3Gal1-4(6-HSO3)GlcNAc -containing receptors. Virology 326, 310-316.

13. Gambaryan AS, Karasin AI, Tuzikov AB, Chinarev AA, Pazynina GV, Bovin NV, Matrosovich MN, Olsen CW, Klimov AI. (2005). Receptor-binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells. Virus Res. 114. 15-22.

14. Gambaryan, A., Yamnikova, S., Lvov, D., Tuzikov, A., Chinarev, A., Pazynina, G., Webster, R., Matrosovich, M. and Bovin, N. (2005). Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology 334, 276-283.

15. Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov A. (2006) Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology, 344, 432-448.

16. Yamnikova, S.S., Gambaryan, A.S., Tuzikov, A.B., Bovin, N.V., Matrosovich, M.N., Fedyakina, I.T., Grinev, A.A., Blinov, V.M., Lvov, D.K., Suarez, D.L.and Swayne, D.E. (2003). Differences between HA Receptor-Binding Sites of Avian Influenza Viruses Isolated from Laridae and Anatidae. Avian Diseases 47, (3 suppl.), 1164-116.

Размещено на Allbest.ru

...