Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Инсулиновая гипогликемия и метаболизм мозга

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение гипогликемии и ее последствий для организма занимает важное место среди проблем современной биологии и медицины.

Гипогликемия - широко распространенное состояние, возникающее при инсуломе поджелудочной железы, алкогольной интоксикации, заболеваниях печени и желудочно-кишечного тракта, но чаще всего инсулиновая гипогликемия сопровождает лечение сахарного диабета (Балаболкин, 2000; Cryer, 2004, 2006; Briscoe, Davis, 2006 и др.).

Эпизоды симптоматической гипогликемии наблюдаются у пациентов с инсулинодефицитом при интенсивной терапии около 10 раз в неделю, а тяжелой гипогликемии, сопровождающиеся временной утратой трудоспособности и госпитализацией - по крайней мере, один раз в год (Hepburn et al., 1993; Briscoe, Davis, 2006). По разным оценкам, от 2 до 7% смертей пациентов с сахарным диабетом первого типа связано с гипогликемией (Cryer, 2004; Дедов, 2005).

Предшествующие эпизоды гипогликемии уменьшают нейроэндокринный, симтоматический и когнитивный ответы при последующих гипогликемиях не только при дефиците эффектов инсулина (Segel et al., 2002), но и у недиабетических пациентов (Davis et al., 1997). Компенсаторные реакции при последующих гипогликемиях возникают при меньших концентрациях глюкозы, т.е. при более тяжелой гипогликемии. Это приводит к развитию бессимптомных гипогликемий. Механизмы ослабления симпатоадреналового ответа при последующих гипогликемиях неизвестны (Cryer, 2004, 2005; Briscoe, Davis, 2006). Поскольку мозг исключительно зависим от глюкозы и является первым органом, повреждающимся при гипогликемии (McAuley et al., 2001; Cryer et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005), нарушения в нем обмена могут быть причиной уменьшения симпатоадреналового ответа при последующих гипогликемиях (Cryer, 2005).

Инсулин крови сам по себе не влияет на обмен мозга в целом (Ames, 2000; Brown, 2004). Действие больших доз инсулина, вызывающее определенную неврологическую симптоматику и повреждение нейронов, опосредовано гипогликемией (Siesjo, Agardh, 1983; McAuley et al., 2001; Cryer et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005 и др.). Купирование гипогликемического ступора и комы глюкозой приводит к сравнительно быстрому восстановлению электрофизиологических и метаболических показателей. Исследования нарушений гомеостазиса Са²⁺ при нейрогликопении (Kristian et al., 1993) привели к представлению о эксайтотоксической природе повреждения нейронов при гипогликемии (Wieloch, 1985; Nehlig, 1997).

Несмотря на обилие информации о нарушениях метаболизма в мозге собственно при гипогликемии, изменения, возникающие в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы глюкозой и сроки нормализации связанных с гипогликемией нарушений обмена в головном мозге, до настоящего времени достаточно не исследованы. Повреждение нейронов может возникать не собственно в состоянии гипогликемии, а в восстановительном периоде. Кроме того, купирование гипогликемической комы в реальных условиях часто сопровождается гипергликемией, которая сама по себе может служить причиной нарушений обмена в нервной ткани (Siesjo et al. 1988; Suh et al., 2007). Именно значительные колебания уровня глюкозы в крови приводят к большему развитию окислительного стресса, повреждению эндотелия сосудов и увеличивают риск развития кардиоваскулярных расстройств у пациентов с сахарным диабетом (Ceriello et al., 2008).

Состояния нейрогликопении в ходе лечения больных сахарным диабетом и при других заболеваниях, осложнением которых является гипогликемия, встречаются неоднократно. Поэтому изменения обмена, возникающие в мозге при нейрогликопении, могут создавать метаболический фон, усугубляющий течение последующих эпизодов гипогликемии; возможна «суммация» неблагоприятных изменений.

Гипогликемия увеличивает риск развития последующих гипогликемий. Вопросы о том, как мозг адаптируется к возобновляющимся гипогликемиям и как это может приводить к увеличению повреждаемости нервных клеток, и каким образом возможные индуцированные гипогликемией изменения метаболизма в мозге могут способствовать защите его от повреждения, остаются открытыми (Sherwin, 2008).

Поскольку состояния гипогликемии широко распространены в клинической практике и способны приводить к необратимому повреждению нейронов, исследование патохимии гипогликемии также имеет непосредственное практическое значение в отношении разработки способов защиты нейронов от гипогликемического повреждения.

Систематического изучения изменений метаболизма мозга, которые могут быть следствием неоднократного воздействия на него гипогликемии, не проводилось.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования состояла в определение механизмов инсулиновой гипогликемии в патохимии нервных расстройств, связанных с нейрогликопенией.

Основные задачи исследования:

1. Определение принципиальной возможности и сроков восстановления основных биохимических параметров в мозге после купирования гипогликемической комы глюкозой.

2. Выявление изменений метаболизма в мозге при неоднократной нейрогликопении, способствующих развитию повреждения нейронов и постгипогликемической энцефалопатии.

3. Выяснение взаимосвязи различных изменений обмена в мозге крыс, возникающих в результате неоднократно перенесенной гипогликемии.

Научная новизна

Впервые получены комплексные данные о состоянии энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и процессов перекисного окисления липидов в различных отделах мозга животных при гипогликемии.

Установлено, что в отличие от однократной гипогликемии, неоднократно перенесенная гипогликемия вызывает серьезные нарушения энергетического обмена: снижение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности ферментов энергетического обмена и нарушения распада гликогена в мозге.

Впервые выявлены стойкие нарушения метаболизма аминокислот в мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию: уменьшение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях и уменьшение уровня ГАМК в стволе мозга, увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы и уменьшение количества аспартата в больших полушариях мозга.

Впервые проведено комплексное исследование показателей, характеризующих интенсивность перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты в мозге при гипогликемии. Установлено, что неоднократно перенесенная гипогликемия приводит к снижению мощности антиоксидантных систем в мозге: уменьшению активности супероксиддисмутазы и продуцирующих восстановленную форму НАДФ дегидрогеназ.

Впервые проведена оценка общих показателей энергетического и азотистого обмена в организме экспериментальных животных при гиперинсулинизации. Установлено, что многократное введение высоких доз инсулина вызывает в организме в целом катаболические изменения, связанные с активацией конринсулярного аппарата.

Теоретическое и практическое значение работы. В процессе работы выявлены характерные для гипогликемии изменения метаболизма в головном мозге и в организме в целом. Проведена оценка фактора неоднократно возникающей гипогликемии в развитии нарушений обмена в головном мозге. В процессе исследования выявлены основные закономерности изменений показателей энергетического обмена, метаболизма нейромедиаторных аминокислот и перекисного окисления липидов в головном мозге при гипогликемии и оценено значение различных нарушений метаболизма в патохимии постгипогликемической энцефалопатии. Высказано предположение об увеличении потребления кетоновых тел мозгом крыс, неоднократно перенесших тяжелую гипогликемию. Установлено, что именно неоднократная нейрогликопения вызывает комплекс нарушений метаболизма, включающий в себя уменьшение гликолитической и митохондриальной энергопродукции, нарушения обмена гликогена, снижение активности ферментов синтеза ГАМК и активацию цикла пуриновых нуклеотидов в мозге, инициацию процессов перекисного окисления.

Полученные в работе данные необходимо учитывать при организации исследования нарушений обмена в головном мозге при различных патологических состояниях. Результаты работы могут служить основой для разработки профилактических и реабилитационных мероприятий в ходе лечения пациентов с сахарным диабетом, а также при других заболеваниях, сопровождающихся гипогликемией.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменения метаболизма, возникающие в мозге при однократной инсулиновой гипогликемии, обусловлены нейрогликопенией и имеют, в основном, обратимый характер.

2. Неоднократно перенесенная гипогликемия приводит к нарушению энергетического обмена, метаболизма нейротрансмиттерных аминокислот и активации процессов перекисного окисления липидов в мозге.

3. Большинство выявленных изменений энергетического, аминокислотного обмена и активация перекисного окисления липидов наблюдаются преимущественно в стволе мозга.

4. Общие нарушения метаболизма у животных, неоднократно перенесших инсулиновую гипогликемию, свидетельствуют об активации контринсулярного аппарата, увеличении катаболизма аминокислот и белков и сходны с таковыми при сахарном диабете.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 1995), на Первом Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 1996), на конференции «Состояние и перспективы современного лекарствоведения» (Ярославль, 1997), на конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии», посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1998), на 12-м Международном конгрессе по нейрохимии (Санкт-Петербург, 1998), на конференции «Актуальные вопросы общей и военной патологической анатомии», посвященной 140-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1999), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии» (Москва, 2002), на Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), на 5-й науч.-практ. конф. с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, включая 14 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из общего введения, описания основных методов (Глава 1), трех глав результатов собственных исследований (Главы 2-4), каждая из которых включает литературную справку, описание использованных методических приемов, результаты, обсуждение и краткое резюме. Работа заключается семью общими выводами и списком литературы, состоящим из 664 литературных источника. Работа изложена на 285 страницах, содержит 27 рисунков и 18 таблиц.

Содержание работы

нейрогликопения мозг биохимический

Материалы и методы исследования

Опыты были поставлены на белых беспородных крысах массой 180-250 г. Животные содержались в обычных условиях вивария на стандартном пищевом рационе в условиях свободного доступа к корму и перед забоем были лишены пищи в течении 18-24 часов. Воду получали без ограничения во всех условиях эксперимента. Гипогликемическую кому вызывали внутримышечным введением инсулина (Actrapid MC, Actrapid HM, 40 ЕД/кг массы тела). Купирование гипогликемической комы производили путем внутрижелудочного введения 3.0 мл 40% раствора глюкозы.

При проведении опытов с неоднократной гипогликемией экспериментальные животные были разделены на 5 групп: 1 - интактные (контроль); 2 - крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы; 3 - животные, обследованные через 48 часов после купирования 1-й гипогликемической комы; 4 - крысы, перенесшие 7-9 гипогликемических ком с интервалом в двое суток во время последней из серии ком; 5 - животные, перенесшие 7-9 гипогликемических ком через 48 часов после купирования последней комы.

Крыс забивали декапитацией под легким эфирным наркозом. Материалом для исследования служили большие полушария мозга и ствол мозга, сыворотка крови, печень, скелетная мышца.

Уровень субстратов энергетического и азотистого обмена в сыворотке крови определяли с использованием стандартных диагностических наборов.

Суммарную фракцию митохондрий и фракцию, содержащую растворимую часть цитоплазмы, получали общепринятыми методами дифференциального центрифугирования (Sottocasa, 1979; Прохорова, 1982). Все процедуры по выделению субклеточных фракций проводили при 0 - 4^оС.

Активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41), НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.42), НАДФ-зависимой малат-дегидрогеназы, («малик-энзим», КФ 1.1.1.40), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ. 1.1.1.49), НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37), глутамат-дегидрогеназы (КФ 1.4.1.3), аланинаминотрансферезы (КФ 2.6.1.2), аспартат-аминотрансферазы (КФ 2.6.1.1), количество пирувата, цитрата, -кетоглутарата, лактата, глутамата и гликогена определяли спектрофотометрически (Прохорова, 1982). Активность сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1), б-кетоглутарат-дегидрогеназы (КФ 1.2.4.2), пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.4.1) и НАДН-дегидрогеназы (КФ 1.6.99.3) определяли с использованием 2,6 - дихлорфенолиндофенола в качестве акцептора электронов (Кривченкова, 1977). Интенсивность гликолиза и гликогенолиза оценивали по накоплению лактата в среде инкубации (Панин и соавт. 1982), активность АТФаз исследовали по скорости образования неорганического фосфата (Филиппов, 1991).

Определение количества аминокислот и активности ГАМК - аминотрансферазы (КФ 2. 6. 1. 19) и глутаматдекарбоксилазы (КФ 4.1.1.15) проводили с использованием тонкослойной хроматографии (Розанов, 1980). Активности глутаминазы (КФ 3.5.1.2) и аденозинмонофосфатдезаминазы (КФ 3.5.4.6) оценивали по накоплению аммиака (Лебедева и соавт., 1981). Активность моноаминооксидазы (КФ 1.4.3.4) определяли по накоплению аммиака, используя в качестве субстратов серотонин креатининсульфат, тирамин гидрохлорид, дофамин гидрохлорид и глюкозамин (Горошинская и соавт., 1989).

Скорость накопления малонового диальдегида оценивали по реакции с тиобарбитуровой кислотой, уровень диеновых коньюгатов - спектрофото-метрически (Никушкин и соавт., 1989). Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.11) исследовали по торможению восстановления нитросинего тетразолия (Гуревич и соавт., 1990). Активности нейтральных и кислых протеаз определяли при рН соответственно 7.6 и 3.2 по накоплению тирозина (Мурти и соавт., 1985). Содержание белка определяли методом Lowry.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t - критерия Стъюдента после вычисления средней арифметической ряда (М), среднего квадратичного отклонения () и средней ошибки средней ариф-метической (m). Также использовался непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверными считали те результаты, для которых P<0.05. Исходные числовые данные обработаны в пакете статистических программ «Biotest», «Statistica 5.5».

Результаты исследования и их обсуждение

1. Уровень субстратов и активность ферментов энергетического и азотистого метаболизма в мозге крыс при однократной гипогликемии и в ранние сроки восстановительного периода.

В состоянии гипогликемической комы уровень глюкозы в крови крыс составлял 1.0-1.5 ммоль/л, введение глюкозы коматозным животным приводит к увеличению содержания глюкозы в крови: через 5, 15 и 30 мин величина гликемии составляет соответственно 2.0-3.0 ммоль/л, 6.0-7.0 ммоль/л и 10.0-15.0 ммоль/л.

У животных в состоянии гипогликемической комы уровень исследованных субстратов энергетического обмена в мозге уменьшается. Через 30 мин после купирования комы глюкозой происходит полное восстановление исследованных показателей. Расчет отношения НАД/НАДН в мозге крыс в состоянии гипогликемической комы указывает на резкое уменьшение уровня восстановленности пиридиновых нуклеотидов и свидетельствует о достаточном снабжении кислородом мозга крыс в состоянии гипогликемической комы.

Изменений интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности лактатдегидрогеназы, митохондриальных окислительных ферментов в больших полушариях и в стволе мозга крыс в состоянии гипогликемической комы и через 30 мин после купирования ее глюкозой не выявлено.

В состоянии гипогликемической комы в исследованных отделах мозга животных количество глутамата, ГАМК и аланина уменьшается, наблюдается увеличение уровня аспартата. Через 30 мин после купирования комы глюкозой происходит полное восстановление уровня исследованных аминокислот. Изменений активности глутаматдекарбоксилазы, ГАМК-, аланин- и аспартат-аминотрансфераз в мозге животных в этих экспериментах не выявлено.

Сам факт полного восстановления субстратного обеспечения гликолиза и цикла Кребса, уровня аминокислот, нормализация содержания гликогена в мозге при купировании комы глюкозой свидетельствует о сохранности ферментных систем и их регуляции после перенесенной однократной гипогликемии.

Общий вывод состоит в том, что изменения уровня исследованных субстратов отражают изменения уровня глюкозы в притекающей к мозгу крови и полностью обратимы при купировании комы глюкозой; изменения активности ферментов в состоянии однократной гипогликемической комы и в ранние сроки восстановительного периода практически отсутствуют. Таким образом, однократная гипогликемия в первом приближении представляет собою полностью обратимое в отношении исследованных показателей метаболизма состояние.

2. Общие показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при неоднократной гипогликемии.

Время впадения крыс в первую кому и во все последующие было практически одинаковым, менялось случайным образом для каждого экспериментального животного, не зависело от количества ранее перенесенных коматозных состояний и составляло 2-3 часа. Содержание глюкозы в крови у крыс в состоянии 1-й и 7-й гипогликемических ком было практически одинаковым (Табл.1). У крыс 4-й группы концентрация свободных жирных кислот в сыворотке крови увеличивалась, а уровень кетоновых тел не отличался от нормы. У животных остальных экспериментальных групп оба эти показателя были значительно снижены.

Содержание мочевины в сыворотке крови в состоянии 1-й гипогликемической комы оставалось нормальным, а через 48 часов после купирования уменьшалось. У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, в состоянии последней комы уровень мочевины значительно повышен (на 63%, P<0.001). Концентрация мочевой кислоты в сыворотке уменьшалась у животных в состоянии первой гипогликемической комы и увеличивалась через 48 часов после купирования. У крыс 4-й группы показатель повышен по сравнению с нормой и оставался высоким через 48 часов после купирования последней комы.

Таблица 1. Содержание энергетических субстратов, продуктов азотистого обмена в крови и гликогена в органах крыс при гиперинсулинизации (M ± m)

Таблица 6. Активность ферментов нмоль / (мин · мг белка) в головном мозге крыс при гиперинсулинизации (M ± m)

Наиболее вероятной причиной уменьшения активности -кетоглутарат-дегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы является их повреждение в ходе активации окислительного стресса (Lenaz et al., 1997; Kumar et al., 2003). Кроме того, -кетоглутаратдегидрогеназный комплекс способен генерировать (а при окислительном повреждении особенно) активные формы кислорода (Starkov et al., 2004). Уменьшение активности НАДН-дегидрогеназы и -кетоглутарат-дегидрогеназы в мозге животных, перенесших серию гипогликемических ком может приводить к уменьшению продукции и окисления восстановленной формы НАД и к нарушению продукции АТФ в нервной ткани. Увеличение активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в стволе мозга у крыс 5-ой группы, по-видимому, связано с индукцией синтеза белка-фермента и свидетельствует об увеличении окисления кетоновых тел в мозге (Veech et al., 2001).

В больших полушариях и в стволе мозга активность Na⁺, K⁺-АТФазы была повышена у крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы (2-ая и 4-ая группы) в 1,5 раза (P<0.001) (Рис. 4). У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, увеличение активности фермента наблюдается и через 48 часов после купирования последней комы.

Увеличение активности фермента при гипогликемии было найдено также и другими исследователями (Филиппов, 1991; Kaur, Arora, 1994). Нейрогликопения является фактором, приводящим к активации Na⁺, K⁺-АТФазы в мозге. Повышение активности фермента у животных, неоднократно перенесших гипогликемию, связано с увеличением синтеза белка-фермента. Гипогликемия приводит к увеличению продукции адренокортикотропного гормона и кортикостероидов (Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000), которые стимулируют синтез Na⁺, K⁺-АТФазы в мозге (Grillo et al., 1997). Увеличение активности Na⁺, K⁺-ATФазы также может быть вызвано обеспечением ее работы митохондриальным АТФ в условиях большего окисления кетоновых тел (Gribble et al., 2000; Gajewski et al., 2003).

В состоянии собственно нейрогликопении можно предполагать другие механизмы увеличения активности Na⁺, K⁺-ATФазы в мозге, а именно изменение скорости фосфорилирования-дефосфорилирования б-субъединиц (Therien, Blostein, 2000; Kimura et al., 2007), дополнительную «сборку» молекул фермента из «внутриклеточных запасов» (Clausen, 2003), и / или изменение экспрессии регуляторных субъединиц семейства FXYD (Bйguin et al., 2002; Dubyak, 2004).

5. Изменения уровня аминокислот и ферментов азотистого метаболизма в мозге крыс при неоднократной гипогликемии.

Направленность и выраженность изменений уровня исследованных аминокислот оказались практически одинаковыми у животных, подвергнутых однократной гипогликемии и у крыс, перенесших серию гипогликемических ком в состоянии последней гипогликемической комы (Рис. 5). У животных 5-ой группы наблюдается уменьшение уровня аспартата в больших полушариях мозга (-10%, P<0.05) и ГАМК в стволе мозга (-29%, P<0.05). У крыс, 4-ой и 5-ой групп в больших полушариях мозга обнаружено уменьшение активности глутаматдекарбоксилазы на 11-12% (в обоих случаях P<0.01) (Табл.7).

У крыс, находящихся в состоянии 1-ой гипогликемической комы наблюдается снижение активности глутаминазы в больших полушариях и в стволе мозга (Табл. 7), изменения сохраняются и через 48 часов после купирования комы. Аналогичные изменения обнаружены и в экспериментах с многократной гипогликемической комой. У животных 2-ой, 4-ой и 5-ой групп выявлено увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы в мозге.

Уменьшение количества глутамата, аланина и ГАМК в мозге в состоянии гипогликемической комы является следствием снижения образования их из глюкозы и результатом использования этих аминокислот в качестве эндогенных субстратов окисления. Увеличение содержания аспартата обусловлено уменьшением уровня восстановленности клеточных редокс-систем и снижением гликолитического потока при нейрогликопении (Auer, Siesjo, 1993; Daikhin, Yudkoff, 1998).

Уменьшение количества аспартата в сочетании с увеличением активности аденозинмонофосфатдезаминазы в больших полушариях мозга крыс, перенесших гипогликемию неоднократно свидетельствует об активации непрямого дезаминирования аспартата в реакциях пуринового цикла, что неизбежно приводит к образованию свободного аммиака (Marynissen et al., 1992; Borza et al., 2003). Увеличение уровня аммиака в мозге оказывает разнообразные неблагоприятные воздействия на метаболизм, гемоциркуляцию и синаптическую передачу и способно в конечном итоге приводить к повреждению и гибели клеток (Butterworth, 2002; Rose et al., 2005, 2006). Уменьшение уровня аспартата в нервной ткани также может быть связано с увеличение окисления кетоновых тел мозгом (Yudkoff et al., 2001; Greene et al., 2003).

Таблица 7. Активность ферментов азотистого метаболизма в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию (M ± m)

Увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы может приводить к уменьшению общего пула адениловых нуклеотидов, к снижению энергообеспечения и нарушению межклеточных коммуникаций, обеспечиваемых нуклеотидами (Inoue et al., 2007). Образование и последующее окисление гипоксантина и ксантина в ксантиноксидазной реакции сопровождается продукцией супероксиданионрадикала (Desco et al., 2002) и тем самым способно стимулировать процессы перекисного окисления. Окислительный стресс, в свою очередь, приводит к увеличению активности аденозинмонофосфатдезаминазы путем окисления SH-групп в молекуле фермента (Tavazzi et al., 2001).

Причинами обнаруженного в наших исследованиях уменьшения активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы могут быть значительные колебания уровня субстратов (глутамина, глутамата и аммиака) при гипогликемии и купировании гипогликемической комы (Rao, Murthy, 1993; Butterworth, 1998), а также повреждение ферментов в результате активации окислительного стресса. Указанные изменения могут относиться именно к ГАМК-ергическим нейронам, поскольку эти нейроны обладают высокой фосфатзависимой глутаминазной активностью (Hogstag et al., 1988). Независимо от конкретных механизмов, снижение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы может иметь значение в уменьшении потенциальных возможностей глутамат- и ГАМК-ергической передачи в ЦНС в результате перенесенной гипогликемии, так как основным источником глутамата и ГАМК, освобождаемых нервными окончаниями, является глутамин (Sonnewald et al., 1993; Honegger et al., 2002).

6. Перекисное окисление липидов и связанные с ним реакции в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии.

У крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы изменений в накоплении малонового диальдегида в исследованных отделах мозга не выявлено. Активность супероксиддисмутазы снижалась в стволе мозга на 21% (P<0.001), активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и митохондриальной НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы была снижена в больших полушариях и в стволе мозга (на 9-12%, P<0.05). У крыс 3-ей группы изменений исследованных показателей не выявлено. У животных, перенесших серию гипогликемических ком, через 48 часов после купирования последней комы в стволе мозга обнаружено увеличение образования малонового диальдегида.

У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, наблюдалось уменьшение активности супероксиддисмутазы в больших полушариях мозга и в стволе мозга на 40-50% (P<0.05) (Табл.8). В обоих отделах мозга животных этой группы выявлено уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, являющихся компонентами ферментативной антиоксидантной системы клеток.

В стволе мозга экспериментальных животных, перенесших серию гипогликемических ком, активность нейтральных протеаз увеличивается на 20% (P<0.001), а кислых протеаз на 28% (P<0.01).

Таблица 8. Уровень диеновых коньюгатов (Е_232. 1000) /мг ткани, активность СОД (ЕД / мг белка), НАДФ-зависимых дегидрогеназ нмоль/(мин · мг белка) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком, через 48 часов после купирования последней комы (M  m)

Примечание. ДК - диеновые коньюгаты, СОД - супероксиддисмутаза, Г6Ф-ДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, ГР - глутатионредуктаза, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ - соответственно никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимые изоцитрат- и малат - дегидрогеназы

У крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы, наблюдается уменьшение активности моноаминооксидазы (МАО) в больших полушариях мозга при использовании в качестве субстрата тирамина. Активность фермента в стволе мозга уменьшалась при использовании в качестве субстратов серотонина, тирамина и дофамина, и имела тенденцию к увеличению при инкубации с глюкозамином (Рис. 7). На 2-е сутки после купирования 1-ой комы наблюдается уменьшение интенсивности образования аммиака при использовании в качестве субстратов МАО серотонина и тирамина. В то же время обнаружено увеличение моноаминооксидазной активности при использовании в качестве субстрата глюкозамина, в больших полушариях мозга в 2,2 раза, в стволе мозга в 2,7 раза.

У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, на 2-е сутки после купирования последней комы в больших полушариях мозга уменьшается активность МАО при использовании в качестве субстрата тирамина; в стволе мозга снижается активность фермента при использовании в качестве субстрата серотонина, тирамина и дофамина (Рис.). У животных этой экспериментальной группы наблюдается увеличение образования аммиака при инкубации митохондриальных фракций, полученных из больших полушарий мозга и ствола мозга с глюкозамином соответственно в 2,6 и в 3,5 раза.

Активность МАО при использовании различных субстратов фермента в мозге крыс при гипогликемии. 2 - крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы, 3 - через 12 час после купирования гипогликемической комы глюкозой, 4 - через 48 часов после купирования комы и 5 - животные, перенесшие 7- 9 гипогликемических ком с интервалом 2 дня на 2-е сутки после купирования последней комы

Увеличение скорости накопления малонового диальдегида свидетельствует об активации процессов перекисного окисления липидов в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию. Стимуляция перекисного окисления липидов при гипогликемии связана не только с дефицитом энергии, нарушениями кальциевого гомеостаза и относительной гипероксией, но и с нарушением системы антиоксидантной защиты. Уменьшение активности супероксиддисмутазы в мозге крыс при гипогликемии, следует рассматривать как неблагоприятный фактор, способный в конечном итоге приводить к повреждению клеток мозга, поскольку токсичность кислорода связана, прежде всего, с образованием супероксиданионрадикала (Lebovitz et al., 1996; Hinerfeld et al., 2004).

Выявленное в настоящем исследовании уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ у крыс, подвергнутых гипогликемии, также может быть связано с окислением сульфгидрильных групп белковой части молекул ферментов активными формами кислорода и азота (Halliwel, 1992; Gerlach et al, 1994). Увеличение активности протеаз также является результатом развития окислительного стресса, поскольку действие на геном продуктов перекисного окисления липидов приводит к индукции синтеза протеаз (Halliwel, 1992, 2006). Моноаминооксидаза обнаруживает высокую чувствительность к окислительному стрессу, которая выражается в снижении активности при использовании специфических субстратов и к расширению спектра относительной специфичности фермента (Горошинская и соавт., 1999). Уменьшение активности МАО, продемонстрированное в настоящем исследовании, может быть результатом окислительного стресса и окисления сульфгидрильных групп активного центра фермента (Sablin, Ramsay, 1988; Hubalek et al., 2003).

Заключение

В наших исследованиях не удалось выявить существенных изменений интенсивности гликолиза и активности ферментов цикла Кребса, активности ферментов азотистого метаболизма, показателей перекисного окисления и связанных с ним реакций в мозге крыс в состоянии однократной гипогликемической комы, в ранние сроки после купирования ее глюкозой и через 48 час после перенесенного воздействия. Восстановление субстратного обеспечения гликолиза и цикла Кребса и нормализация уровня аминокислот при купировании комы глюкозой свидетельствует о сохранности ферментных систем и их регуляции после перенесенной однократной гипогликемии.

Изменения большинства исследованных показателей в печени и крови у экспериментальных животных в состоянии 1-ой гипогликемической комы вызваны непосредственным действием инсулина. При многократном воздействии высоких доз инсулина метаболическая реакция на введение гормона обусловлена активацией контринсулярного аппарата в ответ на гипогликемию. Такая реакция проявляется в увеличении уровня свободных жирных кислот и сохранении высокого уровня кетоновых тел в крови, существенном повышении содержания мочевины в крови и активности глутаминазы, глутаматдегидрогеназы, аминотрансфераз в печени, увеличении активности протеаз в печени и скелетной мышце. Таким образом, неоднократно перенесенная гипогликемия представляет собою стрессорное воздействие и вызывает комплекс патохимических изменений, сходный с таковым при сахарном диабете.

У животных, неоднократно перенесших гипогликемию, в мозге выявлена активация процессов перекисного окисления и нарушения системы антиоксидантной защиты: увеличение уровня малонового диальдегида, снижение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, а также ферментов продуцирующих восстановленную фор...