Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Роль нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда

14.00.16 патологическая физиология

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Успенская Юлия Александровна

Иркутск 2007

Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО "Красноярский государственный аграрный университет", в Межкафедральной научно-исследовательской биохимической лаборатории при кафедре биохимии с курсом медицинской химии ГОУ ВПО "Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" и Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Салмина Алла Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Константинов Юрий Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Хышиктуев Баир Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Явербаум Павел Моисеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО "Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", г. Томск

Защита состоится "____" ______________ 2007 года в "____" часов на заседании диссертационного совета Д 001.054.01 при ГУ "Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения Российской академии медицинских наук" по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ "Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН".

Автореферат разослан "____" _______________ 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Шолохов Л.Ф.

Общая характеристика работы

1. Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и метаболизм НАД⁺ в клетках костного мозга.

2. Исследовать влияние ксенобиотика на уровень АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве. Оценить роль различных подтипов пуринергических рецепторов в реализации апоптогенной активности АТФ и модуляции этих процессов доксорубицином в клетках костного мозга мышей in vitro и in vivo.

3. Исследовать развитие запрограммированной и патологической клеточной гибели в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина in vivo и in vitro. Изучить вклад повреждения мембран клеток костного мозга при действии АТФ и НАД⁺ на фоне применения миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vitro и in vivo в реализацию механизмов запрограммированной клеточной смерти.

4. Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на АТФ - и НАД-зависимые процессы регуляции пролиферации и апоптоза клеток костного мозга. Оценить угнетающий эффект доксорубицина на различные ростки кроветворения.

5. Оценить уровень экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергического рецептора P2X₇, CD38/НАД⁺-гликогидролазы, коннексина 43) в клетках костного мозга мышей в физиологических условиях, а также при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

6. Изучить особенности регуляции функциональной активности клеток костного мозга эндогенными регуляторами гемопоэза АТФ и НАД⁺ в норме и в условиях окислительного стресса.

7. Установить вклад НАД-зависимых механизмов в миелотоксический эффект ксенобиотика и возможность его патогенетической коррекции субстратными ингибиторами ферментов трансформации никотинамидадениндинуклеотида.

Научная новизна. Установлено, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизмах межклеточной коммуникации и интеграции.

Впервые установлена роль нарушения P2X₇-ассоциированных сигнальных механизмов в реализации действия миелотоксических ксенобиотиков и изучены некоторые механизмы пуринергической дизрегуляции.

Доказано, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД⁺-гликогидролазы/CD38. Изучена роль НАД⁺-гликогидролазы/CD38 в регуляции метаболизма НАД⁺ в гемопоэтических клетках в условиях окислительного стресса.

Впервые обнаружено, что нарушение экспрессии и функциональной активности коннексина 43 является одним из механизмов цитотоксического эффекта доксорубицина.

Исследованы механизмы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге аденозинтрифосфатом и никотинамидадениндинуклеотидом. Изучены закономерности изменения степени чувствительности клеток костного мозга к присутствующим во внеклеточном пространстве естественным метаболитам при действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

Приоритетное значение имеют данные о том, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД⁺ при действии ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина) модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул.

Выявлено, что поддержание гомеостаза НАД⁺ в клетках костного мозга является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Экспериментально доказано, что применение субстратных ингибиторов НАД-конвертирующих ферментов позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД⁺ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках.

Теоретическая и практическая значимость работы

1. Одним из значимых механизмов миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда является индукция дизрегуляторных процессов в системе межклеточной коммуникации и интеграции, проявляющаяся изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергических рецепторов P2X₇, НАД⁺-гликогидролазы/CD38 и коннексина 43) и сопровождающаяся нарушением мембран-цитоскелетных взаимодействий, пролиферативного и дифференцировочного статуса клеток костного мозга и их чувствительности к действию апоптогенных стимулов и эндогенных регуляторов гемопоэза.

2. Ксенобиотики антрациклинового ряда регулируют механизмы пролиферации и запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения за счет нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД⁺ и пуринергической регуляции гемопоэза.

3. АТФ и НАД⁺, присутствуя во внеклеточном пространстве при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина, модулируют процессы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток костного мозга.

4. Патогенетическая коррекция миелотоксического эффекта ксенобиотиков антрациклинового ряда эффективно достигается применением субстратных ингибиторов ферментов каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 12 - в центральной печати (в реферируемых ВАК журналах), 2 - в международной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, иллюстрирована 13 таблицами и 39 рисунками. Библиографический указатель включает 462 литературных источника, в том числе 86 отечественных и 376 иностранных авторов.

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 510 белых беспородных мышах-самцах (Рис.1). Культивирование клеток костного мозга in vitro в концентрации 110⁶ клеток в 1 мл проводилось в термостате при +37С в питательной среде (-МЕМ ("Gibco", Великобритания), среде 199 с L-глутамином ("Вектор", Россия), растворе Хенкса ("Вектор", Россия), сбалансированном фосфатном буфере (Sigma, США) в течение 1 ч с последующей регистрацией эффектов ксенобиотика, а также модуляторов острой и подострой экзогенной интоксикации in vitro и in vivo методами диффузионных камер, спектрофотометрическими, биолюминесцентными, микроскопическими и иммуноцитохимическими методами.

внутриклеточный гомеостаз ксенобиотик антрациклиновый доксорубицин

Изучение токсического влияния доксорубицина гидрохлорида (далее по тексту - доксорубицин, ДОК) ("Ферейн", Россия) на клетки костного мозга in vitro производилось при совместной инкубации суспензии клеток костного мозга с ксенобиотиком (510^-7 - 10^-6 - 510^-6 М) в течение 60 минут при +37С, а также в условиях его предварительной инкубации (15 минут) в присутствии экзогенного корректора никотинамида в концентрации 1 мМ и последующем культивировании (5 суток) в диффузионных камерах в перитонеальной полости животных-реципиентов и эндогенных регуляторов АТФ и НАД.

Исследование влияния доксорубицина на клетки костного мозга in vivo проводилось при остром однократном введении мышам в максимально переносимой дозе (МПД - 6 мг/кг) внутрибрюшинно в физиологическом растворе, а также подостром внутрибрюшинном введении в дозе 1/10 LD₅₀ (0,95 мг/кг) в течение 10 дней с интервалом 24 ч.

Исследование влияния АТФ и НАД на костномозговые клетки in vitro проводилось при совместной инкубации суспензии клеток с АТФ (Reanal, Венгрия) и НАД (Reanal, Венгрия) в концентрациях 0,1, 1, 10 мМ и 1 мМ, соответственно, в течение 1 ч при +37С, а также на фоне применения доксорубицина in vitro в дозе 10^-6 М, который добавляли в среду культивирования костномозговых клеток на 15 минуте инкубации, или in vivo при остром однократном введении мышам в МПД (6 мг/кг) внутрибрюшинно в физиологическом растворе, а также подостром введении в дозе 1/10 LD₅₀ (0,95 мг/кг) в течение 10 дней с интервалом 24 ч.

Прединкубация клеток с никотинамидом (Мосхимфармпрепараты, Россия) в концентрации 1 мМ проводилась в течение 15 минут с последующим добавлением в среду НАД и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.

Прединкубация клеток с блокаторами пуринергических рецепторов PPADS (пиридоксальфосфат-6-азофенил-2,4-дисульфоновая кислота) (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ и сурамином (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ проводилась в течение 15 минут с последующим добавлением в среду АТФ или доксорубицина и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.

Для исследования пролиферативного статуса клеток костного мозга методом диффузионных камер in vivo клетки получали путем вымывания питательной средой (80% среды -МЕМ ("Gibco", Великобритания), 20% лошадиной сыворотки, 100 мг/л ампициллина) из 2 бедренных костей мыши-донора. Клетки в концентрации 110⁶/мл добавляли в питательную среду и заполняли ею диффузионные камеры (по 0,1 мл на камеру). Диаметр пор фильтра камер 0,22 мкм. Камеры имплантировали в перитонеальную полость мышей-реципиентов (по 2 камеры на животное) хирургическим путем под гексеналовым наркозом. Через 5 дней культивирования мышей выводили из эксперимента методом дислокации спинного мозга в шейном отделе, камеры извлекали, фильтры окрашивали гематоксилин-эозином. Методом световой микроскопии подсчитывали число образовавшихся колоний (скопления из 50 и более клеток) и кластеров (скопления менее 50 клеток) ( 400).

Определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в суспензии клеток костного мозга проводили путем измерения содержания малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по стандартной методике, включающей в себя инкубацию с ТБК исследуемой пробы, экстракцию продуктов реакции бутанолом и спектрофотометрическое измерение их содержания.

Определение концентрации АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве проводили с помощью биолюминометра 8802 (СКТБ "Наука", Россия) по методу Угаровой Н.Н. (1981).

Определение концентрации НАД⁺ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве проводили спектрофотометрически с использованием алкогольдегидрогеназы по методу Асатиани В.С. (1969).

Оценка цитотоксичности доксорубицина в МТТ-тесте проводилась с использованием тетразольной соли МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) - 2,5-дифенилтетразолия бромид) (Sigma, США) в дозе 5 мг/мл, которую добавляли по 50 мкл в каждую пробу. Клетки костного мозга инкубировали с МТТ в течение 1,5 ч при +37С. В конце инкубационного периода кристаллы формазана растворяли путем добавления 500 мкл 0,1 н НСl-изопропанола. Оптическую плотность исследуемых проб определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 570 нм, фоновую плотность - при длине волны 640 нм, и по разности двух измерений находили искомую величину.

Изучение процессов апоптоза клеток, культивируемых в диффузионных камерах, проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией ( 900) анализировалось по 200 клеток на каждом фильтре, окрашенном гематоксилин-эозином. При этом морфологическими признаками апоптоза считали наличие "карликовых" клеток, кариопикноз, кариорексис, наличие апоптотических телец.

Исследование миелограммы по мазкам костного мозга проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией ( 900) анализировалось по 500 клеток на каждом препарате, окрашенном по Папенгейму. При выведении миелограммы выделяли следующие клеточные формы: недифференцированные бласты, промиелоциты, миелоциты, юные нейтрофилы, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, плазматические клетки, эритробласты, пронормобласты, нормобласты базофильные, нормобласты полихроматофильные, нормобласты оксифильные, мегалобласты, мегакариоциты. По полученным данным рассчитывали лейкоэритробластическое соотношение и индекс созревания эритробластов.

Детекция апоптоза и некроза в препаратах клеток костного мозга проводилась по оценке экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны путем регистрации связывания ФИТЦ-меченого аннексина V и проницаемости мембран для пропидия йодида (Annexin V Apoptosis Detection Kit, Caltag Laboratories, США), соответственно, согласно протоколу фирмы-производителя и последующей флуоресцентной микроскопии. Под иммерсией ( 900) анализировали по 200 клеток на каждом стекле. Определяли относительное количество клеток 4 популяций: жизнеспособные (неокрашенные ни аннексином V, ни пропидия йодидом), находящиеся на ранней стадии апоптоза (положительные по аннексину V при отсутствии окрашивания ядра пропидия йодидом и дающие зеленое свечение), находящиеся в состоянии вторичного некроза (положительные и по аннексину V и по пропидия йодиду и дающие зелено-красное свечение) и собственно некротические клетки (положительные только по пропидия йодиду и дающие красное свечение).

Регистрация блеббинга плазматической мембраны клеток костного мозга осуществлялась методом фазово-контрастной микроскопии при инкубации клеток в течение 60 мин при +37С. Под иммерсией ( 900) анализировалось по 200 клеток в каждом препарате, приготовленном через 5, 15, 30, 45 и 60 минут инкубации клеток костного мозга (1х10⁶/мл) в среде 199. По морфологии цитоплазматической мембраны дифференцировали следующие виды клеток костного мозга: интактные клетки (морфологически неизмененные клетки, имеющие четкую, контрастирующуюся светло-желтым ободком плазматическую мембрану); клетки в состоянии начального блеббинга (образование небольших пузырей на поверхности мембраны); клетки в состоянии терминального блеббинга (образование крупных, ? и более от диаметра клетки пузырей); некротические клетки (в 1,5-2 раза крупнее интактных клеток, отсутствует свечение в виде светло-желтого ободка по периметру клетки, имеют неровную мембрану).

Оценка экспрессии CD38 на клетках костного мозга проводилась с помощью прямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием Р-фикоэритрин-меченых моноклональных антител к CD38 (Caltag Laboratories, США) по стандартной методике. Под иммерсией ( 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. CD38⁺ клетки костного мозга, дающие желто-оранжевое свечение по периметру клетки, определяли по наличию иммунопозитивного материала.

Оценка экспрессии P2X₇ на клетках костного мозга проводилась с помощью двойного непрямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к рецептору P2X₇ (Sigma, США) по стандартной методике. Под иммерсией ( 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. P2X₇⁺ клетки костного мозга, дающие зеленое свечение по периметру клетки, определяли по наличию участков связывания антител с P2X₇, экспрессируемым на плазматической мембране клеток.

Оценка экспрессии коннексина 43 (Cx43) на клетках костного мозга проводилась с помощью двойного непрямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к Cx43 (Chemicon International, США). Под иммерсией ( 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. Cx43⁺ клетки костного мозга, дающие зеленое свечение по периметру клетки, определяли по наличию участков связывания антител с Cx43, экспрессируемым на плазматической мембране клеток.

Статистическую обработку результатов проводили методами математической статистики с применением пакетов прикладных программ "Биостатистика для Windows, версия 4.03" и "Microsoft Excel 2002". Для каждого исследуемого признака определяли показатели среднего арифметического (М) и стандартной ошибки среднего арифметического (m). Нормальность распределения проверяли с использованием теста Колмогорова-Смирнова. При условии соответствия нормальности распределения достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Сопряженность между признаками устанавливали путем проведения корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции (r) Пирсона. Различия считались достоверными при уровне значимости, равном либо менее 5% (Р0,05).

Результаты исследований

Ксенобиотики антрациклинового ряда занимают одно из ведущих мест в арсенале современных лекарственных средств, используемых при лечении злокачественных новообразований различных локализаций и прежде всего при химиотерапии опухолей кроветворного аппарата. Одним из типичных представителей группы антрациклиновых антибиотиков, относящимся к числу наиболее эффективных и перспективных цитостатических средств, является доксорубицин (адриамицин). Накопленные к настоящему времени сведения о клеточных "мишенях" действия доксорубицина позволяют предположить высокую значимость механизмов окислительного стресса в повреждении клеток этим ксенобиотиком, а моделирование окислительного стресса представляет собой экспериментальный подход к изучению клеточных механизмов его токсического действия.

В экспериментах in vitro нами установлено, что при внесении доксорубицина в концентрациях 510^-7 М, 10^-6 М, 510^-6 М в костномозговую суспензию in vitro происходило дозо-зависимое увеличение продукции МДА, свидетельствующее об интенсификации процессов ПОЛ мембран клеток костного мозга, что позволяет отнести данный ксенобиотик к группе индукторов окислительного стресса. Введение ксенобиотика in vivo также приводило к нарастанию концентрации МДА в клетках костного мозга к 24 часу до 12,92 0,56 мкмоль/л (Р<0,001), с последующим снижением до 8,24 1,11 мкмоль/л после 2 суток введения и 4,97 0,94 мкмоль/л (Р<0,02) после 10 суток введения доксорубицина.

Одним из обязательных компонентов патогенеза окислительного стресса является изменение количественных и качественных параметров пула внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов в результате их окисления и гидролиза и нарушение АТФ-синтетических процессов в клетке. Действительно, в экспериментах, выполненных нами с использованием биолюминесцентного и спектрофотометрического методов определения внутри - и внеклеточного содержания АТФ и НАД⁺, установлено, что острое и подострое введение доксорубицина мышам in vivo и инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10^-6 М in vitro приводили к изменению внутри - и внеклеточного содержания АТФ и НАД⁺ в клетках костного мозга.

Так, через 24 ч и 48 ч после острого введения ксенобиотика концентрация АТФ внутри клеток достоверно уменьшилась. Однако к 10 суткам подострого воздействия доксорубицина уровень внутриклеточной и внеклеточной АТФ в костном мозге достоверно увеличился (Рис.2).

а

б

Рис.2. Концентрация АТФ (А) и НАД⁺ (Б) в клетках костного мозга и во внеклеточном пространстве при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo и инкубации клеток с доксорубицином (10^-6 М) in vitro

Примечание. Здесь и далее: Р уровень значимости; достоверность отличий по сравнению с контролем: ^* Р0,05; ^** Р0,02; ^*** Р0,01; ^**** Р0,001.

Воздействие ксенобиотика на клетки костного мозга in vitro и in vivo сопровождалось также нарушением количественных параметров пула НАД⁺: через 24 ч и 48 ч после острого введения доксорубицина уровень НАД⁺ внутри клеток достоверно не изменился, тогда как во внеклеточной жидкости его концентрация повысилась по сравнению с исходным значением. Аналогичная ситуация наблюдалась при предварительной инкубации клеток костного мозга с доксорубицином в дозе 10^-6 М in vitro. К 10 суткам подострого воздействия доксорубицина in vivo уровень внутриклеточного и внеклеточного НАД⁺ в костном мозге достоверно увеличился (Рис.2).

Мы считаем, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД⁺ при действии ксенобиотика антрациклинового ряда значимо модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул за счет изменения их экспрессии, что вызывает нарушение процессов передачи информации в клетке или запрограммированной клеточной гибели.

Нами впервые обнаружено, что доксорубицин изменяет экспрессию P2X₇ в клетках костного мозга. Воздействие ксенобиотика in vivo в течение 1 суток значительно снижало количество P2X₇⁺ клеток костного мозга. Однако к 10 суткам введения их количество практически вернулось к контрольным значениям (Рис.3). Это соответствовало уменьшению уровня внутриклеточной АТФ при остром курсе введения доксорубицина и его увеличению при подостром курсе введения ксенобиотика, соответственно.

Рис.3. Особенности экспрессии P2X₇, CD38 и Cx43 в клетках костного мозга в норме и при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo

Выявленная нами альтерация уровня пиридиновых нуклеотидов (НАД⁺), вызванная действием индуктора окислительного стресса, может быть связана с активацией НАД⁺-гликогидролаз, принимающих участие в передаче сигналов и некоторых метаболических проводящих путях. В связи с этим интересным представлялось изучение особенностей экспрессии CD38 (как одного из типичных представителей класса НАД⁺-гликогидролаз, использующих НАД⁺) в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

Нами впервые установлено, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД⁺-гликогидролазы/CD38. Продемонстрировано, что острое и подострое воздействие ксенобиотика приводило к снижению экспрессии CD38 в клетках костного мозга мышей, сопровождающемуся уменьшением его суммарной ферментативной активности (Рис.3). Понижение количества CD38⁺ клеток соответствовало увеличению уровня внутри - и внеклеточного НАД⁺. Кроме того, вероятна и обратная связь: избыток субстрата (НАД) приводил к уменьшению экспрессии CD38. Следовательно, нарушение экспрессии CD38 характеризуется значимыми изменениями метаболизма НАД⁺ в гемопоэтических клетках (Рис.4).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.4. Схема нарушения метаболизма НАД⁺ в гемопоэтических клетках под действием доксорубицина

Обозначения. Здесь и далее: серым цветом указаны собственные оригинальные результаты.

Коль скоро доказано, что АТФ и НАД⁺, действуя через пуринергические рецепторы, локализованные на плазматической мембране и обладающие функциональной активностью для обоих эндогенных регуляторов, и НАД⁺-гликогидролазу/CD38, высвобождаются во внеклеточную среду посредством щелевых контактов, сформированных коннексинами и выполняющих аутокринную и паракринную регуляцию клеточной активности, следующим этапом наших исследований явилась оценка степени экспрессии коннексина 43 (Cx43), как основного коннексина кроветворной ткани, в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

Нами установлено, что острое введение ксенобиотика in vivo увеличивало экспрессию Cx43 в костном мозге. К 10 дню подострого введения доксорубицина in vivo степень экспрессии возвращалась к контрольным значениям (Рис.3).

Таким образом, доксорубицин нарушает лиганд-рецепторные взаимодействия, призванные осуществлять сигнально-временную координацию важнейших тканевых процессов, что, в свою очередь, является причиной формирования внутрипопуляционных изменений количественного или качественного плана. Последствия изменения лиганд-рецепторных взаимодействий подразумевают как краткосрочные, так и долговременные перестройки клеточного метаболизма и нарушения регуляции пролиферативного или дифференцировочного статуса клетки, как, впрочем, и клеточной смерти.

Известно, что основными механизмами поражения костного мозга, возникающего при действии цитостатиков, являются миелосупрессия в результате глубокого подавления пролиферативной деятельности костного мозга, связанного, в свою очередь, с гибелью значительной части пролиферирующих клеток и блокированием митотического цикла гемопоэтических элементов, а также свободнорадикальные механизмы, приводящие к индукции окислительного стресса, повреждению липидов и белков мембран и цитоскелета.

Действительно, нами установлено, что угнетающему эффекту доксорубицина подверглись как эритроидный (индукция пролиферации мегалобластов), так и миелоидный (увеличение количества миелоцитов) ростки гемопоэза при отсутствии изменений со стороны тромбоцитарного ростка. Выявленное нами отчетливое повышение числа мегалобластов как при остром, так и подостром введении ксенобиотика отражает развитие анемии, о чем свидетельствует также уменьшение индекса созревания эритробластов, являющегося критерием нарушения созревания нормобластов. Причем процент мегалобластов при однократном воздействии доксорубицина в МПД был выше, чем после 10-ти дневного курса введения ксенобиотика, что соответствует литературным данным о том, что ингибирующий эффект антибиотиков-антрациклинов на кроветворение более отчетливо проявляется при их однократном введении в массивных (LD₅₀, МПД) дозах, чем при курсовом введении в терапевтических дозах.

Миелоингибирующий эффект доксорубицина проявлялся в виде повышенной гибели костномозговых элементов. В экспериментах, выполненных нами с использованием техники культивирования клеток костного мозга мышей в диффузионных камерах в перитонеальной полости мышей-реципиентов, установлено, что доксорубицин в концентрациях 510^-7, 10^-6, 510^-6 М в дозо-зависимой манере эффективно подавлял колоние - и кластерообразующую способность клеток костного мозга при совместной инкубации с ним в предимплантационный период (Табл.1). При этом ксенобиотик в равной степени ингибировал образование как колоний, так и кластеров, что подтверждает неспецифический характер цитотоксичности последнего в отношении клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

Таблица 1. Влияние прединкубации клеток костного мозга с доксорубицином (ДОК) на колоние - (КОС) и кластерообразующую (КлОС) способность и процессы запрограммированной клеточной смерти при культивировании в диффузионных камерах

Обозначения. Здесь и далее КОС и КлОС представлены как абсолютное количество колоний и кластеров, соответственно, на 10⁵ имплантированных клеток.

Примечание. n (объем выборки) в разных сериях от 5 до 16.

Таким образом, обнаруженное нами гемопоэзповреждающее действие доксорубицина, сопровождающееся внутрипопуляционными изменениями в костном мозге, происходит на фоне нарушения экспрессии молекул межклеточной коммуникации, что, в конечном итоге, отражается на развитии неэффективного гемопоэза как болезни дизрегуляции в механизме регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки (Рис.5).

Механизмы поражения клеток костного мозга в условиях применения цитостатиков связаны, помимо нарушения пролиферативного статуса, с индукцией окислительного стресса. Признавая ключевую роль нарушения работы дыхательной цепи митохондрий в цитотоксическом действии доксорубицина, мы оценили выраженность окислительного стресса в клетках костного мозга при внесении в среду инкубации АТФ или НАД⁺ на фоне введения доксорубицина in vitro и in vivo.

АТФ при внесении в инкубационную среду не влияла на продукцию МДА интактными клетками, проявляя при этом дозо-зависивый эффект. Однако она тормозила этот процесс в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина в течение 24 часов in vivo, и потенцировала его в клетках, выделенных от животных после 10-дневного введения ксенобиотика (Рис.6). Выраженность окислительного стресса в клетках костного мозга соответствовала направленности изменений концентрации внутриклеточной АТФ: снижение концентрации АТФ после острого введения доксорубицина и ее повышение в результате подострого введения ксенобиотика согласуется со способностью АТФ подавлять и стимулировать продукцию реактивного кислорода, соответственно, при действии на гемопоэтические клетки.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.5. Схема нарушения экспрессии молекул межклеточной коммуникации в развитии неэффективного гемопоэза

Совместная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином и АТФ in vitro либо не оказывала влияния на индукцию процессов ПОЛ (при первоначальном воздействии на клетки ксенобиотика), либо снижала продукцию МДА в среде инкубации по сравнению с изолированным действием АТФ или цитостатика (при первоначальном воздействии на клетки эндогенного регулятора) (Рис.6).

Таким образом, АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, оказывает модулирующее влияние на процессы ПОЛ в гемопоэтических клетках в состоянии окислительного стресса.

При оценке выраженности окислительного стресса в клетках костного мозга при воздействии НАД⁺ нами обнаружено, что он вызывал значительное усиление продукции свободных радикалов. Внесение в среду инкубации НАД⁺ на фоне острого введения доксорубицина in vivo и инкубации клеток с ксенобиотиком in vitro приводило к подавлению процессов перекисного окисления липидов мембран клеток костного мозга, что может быть связано с нарушением окислительно-восстановительного потенциала пула НАД⁺ в условиях окислительного стресса. Однако подострое применение доксорубицина в течение 10 дней не влияло на степень выраженности ПОЛ, вызванного НАД⁺ (Рис.6).

Рис.6. Влияние АТФ (А, Б) и НАД⁺ (В, Г) на доксорубицин-индуцируемое перекисное окисление липидов в клетках костного мозга при его остром и подостром введении in vivo и инкубации клеток с доксорубицином (ДОК, 10^-6 М) in vitro

Примечание. Здесь и на рис.8: достоверность отличий по сравнению с изолированным действием АТФ/НАД: ^# Р0,05; ^## Р0,02; ^### Р0,01; ^#### Р0,001.

Модулирующее влияние НАД⁺ на продукцию свободных радикалов при действии ксенобиотика - индуктора окислительного стресса может быть связано с активностью НАД⁺-утилизирующих ферментов, в том числе НАД⁺-гликогидролазы/CD38.

На рис.7 представлена патогенетическая схема развития неэффективного гемопоэза при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда.

Хорошо известно, что состояние окислительного стресса сопровождается снижением концентрации в клетке НАД (Ф) Н и изменением соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамидных коферментов.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.7. Патогенетическая схема развития неэффективного гемопоэза при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда

Инкубация клеток костного мозга с доксорубицином вызывала снижение параметров МТТ-теста, являющегося индикатором уровня НАД (Ф) Н в клетке и сохранности функции митохондрий. Инкубация с НАД⁺ приводила к достоверному увеличению показателей МТТ-теста по сравнению с контролем, и снижала токсичность доксорубицина. Протективное действие внеклеточного НАД⁺ в отношении нуклеотид-деплетирующей активности доксорубицина подтверждает возможность транспорта НАД⁺ в клетки, опосредованное активностью мембранных моно-АДФР-трансфераз или НАД⁺-гликогидролаз, а также свидетельствует о нормализации процессов генерации восстановленных коферментов и/или митохондриальной функции в клетках.

Принимая во внимание данные о тесной взаимосвязи патогенеза окислительного стресса с феноменом запрограммированной клеточной смерти (апоптоза), представлялось интересным изучение роли нарушения межклеточных взаимодействий в условиях окислительного стресса и связанного с этим изменения чувствительности гемопоэтических клеток к действию эндогенных регуляторов в необратимом повреждении клеток и их гибели.

При подсчете относительного количества гемопоэтических клеток с морфологическими признаками апоптоза (при культивировании их в диффузионных камерах) было выявлено, что апоптогенный эффект доксорубицина зависит от используемой дозы ксенобиотика: чем меньшая концентрация препарата применялась в экспериментах, тем вероятнее была гибель клеток по механизму апоптоза (Табл.1). При этом степень подавления пролиферации клеток также зависела от дозы доксорубицина. Следовательно, нами установлен факт наличия дозовой зависимости в характере цитоповреждающего действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костного мозга.

Одним из современных методов оценки ранних стадий апоптоза и некроза является обнаружение экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны и проницаемости мембран для пропидия йодида, соответственно.

Инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10^-6 М in vitro приводила к возрастанию числа клеток в состоянии апоптоза, а также индукции некроза с одновременным сокращением популяции жизнеспособных клеток. Острое введение доксорубицина мышам in vivo не оказывало апоптоз-индуцирующего эффекта, однако в клетках, подвергнутых 10-дневому воздействию ксенобиотика, нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином), и, соответственно, уменьшение количества жизнеспособных клеток. При этом доксорубицин в обоих случаях не проявлял некрозогенную активность.

Предполагается, что уровень АТФ является важным фактором внутриклеточной регуляции процессов апоптоза и некроза, а также определяет чувствительность клеток к действию индукторов апоптоза. В связи с этим мы исследовали экстернализацию фофатидилсерина под влиянием АТФ в клетках костного мозга, подвергнутых острому и подострому действию доксорубицина.