При инкубации клеток костного мозга in vitro в течение 1 часа с АТФ в концентрации 1 мМ нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза и в состоянии некроза, и, соответственно, уменьшение количества жизнеспособных клеток (Рис.8).

Предварительная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10^-6 М in vitro значительно изменяла чувствительность клеток костного мозга к действию АТФ. Добавление ксенобиотика отменяло апоптоз-индуцирующее действие АТФ и усиливало некрозогенный эффект АТФ (Рис.8).

Однократное и 10-дневное введение доксорубицина in vivo также модулировало процессы апоптоза и некроза под действием АТФ. Воздействие доксорубицина в течение 24 часов уменьшало апоптогенную активность АТФ, а 10-дневный курс введения ксенобиотика тормозил индукцию некроза под действием АТФ. Однако количество клеток с экстернализированным фосфатидилсерином при подострой затравке ксенобиотиком возрастало по сравнению с острой. При этом относительное количество жизнеспособных клеток в популяции в обоих случаях возвращалось к контрольным значениям, что свидетельствует об отсутствии эффекта индукции альтернативного механизма клеточной гибели при невозможности реализовать программу апоптоза (Рис.8).

Рис.8. Влияние доксорубицина (ДОК, инкубация клеток in vitro, острое и подострое введение in vivo) на апоптоз - и некроз-индуцирующее действие АТФ (1 мМ) (А, Б) и НАД⁺ (1 мМ) (В, Г) в клетках костного мозга

Таким образом, отмена апоптоз-индуцирующего действия АТФ под действием однократного введения доксорубицина сопровождалась снижением экспрессии P2X₇ в клетках костного мозга на фоне падения уровня внутриклеточного АТФ, что может служить доказательством снижения чувствительности гемопоэтических клеток к действию АТФ.

Иная ситуация наблюдалась при подостром введении доксорубицина: к 10 дню воздействия ксенобиотика отмечалась экстернализация фосфатадилсерина на фоне повышения уровня внеклеточной АТФ и восстановления экспрессии рецептора P2X₇, что может свидетельствовать о восстановлении чувствительности клеток костного мозга к действию АТФ.

Следовательно, обоснованным представляется предположение о том, что апоптогенная и некрозогенная активность АТФ в костном мозге реализуется через пуринергические рецепторы P2X типа, в частности P2X₇.

Действительно, при использовании нами сурамина (антагонист P2Y рецепторов) не происходило модификации апоптогенной или некрозогенной активности АТФ. Вместе с тем, предварительная инкубация клеток с PPADS (антагонист P2X рецепторов) отменяла апоптогенное действие АТФ, снижая процент клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза и в состоянии вторичного некроза, но в то же время потенцировала некрозогенную активность АТФ.

Таким образом, АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, индуцирует апоптоз в клетках костного мозга, действуя преимущественно через P2X подтип пуринергических рецепторов. Острое и подострое введение доксорубицина in vivo и применение ксенобиотика in vitro снижает чувствительность клеток костного мозга к апоптогенному и некрозогенному действию АТФ. Такой эффект доксорубицина имеет важное патофизиологическое значение, коль скоро может быть компонентом миелотоксического действия ксенобиотика, связанным с нарушением механизмов пуринергической регуляции активности гемопоэтических клеток (Рис.9).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.9. Схема участия различных типов пуринергических рецепторов в индукции клеточной гибели под действием доксорубицина

Следовало ожидать, что экстернализация фосфатидилсерина под действием АТФ может сопровождаться нарушением мембранной асимметрии липидов, изменяющим физико-химические свойства мембраны и проявляющимся образованием на клеточной поверхности пузыреподобных выпячиваний (блеббинг).

Мы обнаружили, что инкубация клеток костного мозга с АТФ в концентрациях 0,1; 1 и 10 мМ приводила к динамическим изменениям плазматической мембраны, проявляющимся образованием мелких пузыреподобных выпячиваний по периметру клетки (начальный блеббинг) и формированием более крупных пузырей (терминальный блеббинг). В физиологической концентрации 0,1 мМ АТФ индуцировала процессы начального блеббинга в первые минуты воздействия, что не сопровождалось значительным увеличением числа клеток с признаками терминального блеббинга, т.е. свидетельствовало об обратимости процесса. При увеличении концентрации до 1 мМ, которая соответствует реально существующей в межклеточном пространстве концентрации АТФ при ряде патологических состояний (цитолиз, воспаление), наибольшей интенсивности блеббинг достигал после 30 минут инкубации и также носил обратимый характер. В максимальной из тестируемых концентраций (10 мМ) АТФ оказывала выраженное цитотоксическое действие, проявляющееся развитием некроза.

Воздействие доксорубицина in vitro характеризовалось дозо-зависимым усилением процессов начального и терминального блеббинга плазматической мембраны клеток костного мозга к 30-45 минуте инкубации, в максимальной из использованных концентраций ксенобиотик индуцировал выраженный некроз клеток. Острое и подострое введение доксорубицина in vivo сопровождалось индукцией блеббинга и некроза с первых минут воздействия.

Совместная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином и АТФ (1 мМ) in vitro либо не влияла на развитие блеббинга плазматической мембраны, индуцированного АТФ (при первоначальном воздействии на клетки ксенобиотика), либо потенцировала как процессы начального, так и терминального блеббинга по сравнению с изолированным действием АТФ (при первоначальном воздействии на клетки эндогенного регулятора). Развитие некроза под действием АТФ в первом случае усиливалось, а во втором - тормозилось (Табл.2).

Введение доксорубицина in vivo в течение 1 и 10 суток значительно модулировало чувствительность клеток к АТФ, что выражалось в изменении динамики блеббинга. Так, индукция начального блеббинга проявлялась при аппликации АТФ на клетки костного мозга, выделенные от животных, подвергнутых действию доксорубицина в течение 1 суток, однако не наблюдалась при 10-дневном курсе введения ксенобиотика (Табл.2). Эти изменения развивалось на фоне изменений продукции МДА и АТФ в клетках, что свидетельствует о нарушении биологических эффектов АТФ при окислительном стрессе и митохондриальной дисфункции.

Таблица 2. Модуляция эффектов АТФ в клетках костного мозга при их инкубации с доксорубицином (ДОК, 10^-6 М) in vitro и при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo (в % от общего количества клеток)

Серия	Показатель	Время инкубации, мин
		5	15	30	45	60
Контроль	Начальный блеббинг	1,50 0,0	1,50 1,06	6,33 0,82	1,88 0,79	1,0 0,47
	Терминальный блеббинг	0,50 0,33	1,25 0,29	2,50 0,35	2,0 0,53	1,58 0,43
	Некроз	7,38 1,57	8,38 0,92	10,17 1,14	10,25 1,46	11,50 1,55
АТФ, 1 мМ	Начальный блеббинг	7,0 0,53****	7,80 1,35**	12,38 1,85*	10,33 1,0****	5,63 0,72***
	Терминальный блеббинг	0,83 0,27	1,08 0,26	1,40 0,27*	1,14 0,10	1,20 0,14
	Некроз	19,17 1,14***	19,17 2,35***	19,83 4,13	21,67 5,94	22,67 5,02
АТФ, 1 мМ + ДОК, 10-6 М	Начальный блеббинг	18,0 2,32***###	19,63 2,43***###	17,38 2,65**	13,25 0,50****#	14,10 1,49****###
	Терминальный блеббинг	0,50 0,24	1,38 0,36	1,63 0,36	1,75 0,37	2,25 0,17###
	Некроз	12,50 1,27##	12,67 2,41	14,83 0,89*	16,67 2,41	16,17 2,68
ДОК, 10-6 М + АТФ, 1 мМ	Начальный блеббинг	10,33 1,34***	9,17 1,95*	9,50 2,45	7,0 1,87	6,25 0,95***
	Терминальный блеббинг	0,83 0, 20	1,17 0, 20	2,0 0,35	1,17 0, 20	0,95 0,18
	Некроз	30,33 1,74****###	28,50 3,37***	32,50 2,67***	32,50 4,34***	33,0 3,85***
ДОК, 24 ч + АТФ	Начальный блеббинг	14,38 0,86****####	12,13 1,09****#	12,88 1,04***	11,38 1,92***	10,88 1,55****#
	Терминальный блеббинг	1,25 0,29	1,75 0,50	2,0 0,47	2,25 0,50	1,50 0,24
	Некроз	17,88 2,06***	19,50 1,25****	21,75 1,09****	22,13 0,83****	23,0 1,58***
ДОК, 10 дней + АТФ	Начальный блеббинг	1,33 1,03	-	-	-	0,33 0,11
	Терминальный блеббинг	0,83 0, 20	-	-	-	2,17 0,54
	Некроз	20,83 3,21**	-	-	-	30,17 3,05***

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с изолированным действием АТФ: ^# Р0,05; ^## Р0,02; ^### Р0,01; ^#### Р0,001.

Следовательно, восстановление чувствительности клеток костного мозга к действию АТФ, выявленное по экстернализации фосфатидилсерина, при подостром введении доксорубицина сопровождалось снижением блеббинг-индуцирующего эффекта АТФ.

Таким образом, весьма логично предположить, что процессы блеббинга и экстернализации фосфатидилсерина опосредуются различными механизмами при действии АТФ (Рис.10).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.10. Предполагаемые механизмы реализации процессов блеббинга и экстернализации фосфатидилсерина под действием АТФ

Обозначения. - указаны места действия ксенобиотика антрациклинового ряда доксорубицина.

Известно, что регуляция чувствительности клеток к действию индукторов апоптоза осуществляется не только уровнем АТФ, но и НАД⁺. В связи с этим мы исследовали развитие запрограммированной клеточной гибели (по экстернализации фофатидилсерина) под влиянием НАД⁺ в клетках костного мозга в состоянии окислительного стресса.

При инкубации костномозговых клеток in vitro в течение 1 часа с НАД⁺ в концентрации 1 мМ нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся в состоянии некроза, и, соответственно, уменьшение числа жизнеспособных клеток, однако процент клеток на ранней стадии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином) соответствовал контрольным значениям (Рис.8).

Предварительная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10^-6 М in vitro модулировала чувствительность гемопоэтических клеток к действию НАД⁺: ксенобиотик значительно снижал апоптоз-индуцирующее действие НАД⁺, однако достоверно усиливал процессы некроза в популяции клеток. При этом количество жизнеспособных клеток достоверно уменьшалось по сравнению с изолированным действием метаболита (Рис.8).

Однократное и 10-дневное введение доксорубицина in vivo также изменяло действие НАД⁺, связанное с преимущественной индукцией некроза. Воздействие доксорубицина в течение 24 часов уменьшало апоптогенную активность НАД⁺, а 10-дневный курс инъекций ксенобиотика отменял индукцию некроза под действием НАД⁺ (Рис.8).

Таким образом, отмена апоптоз - и некроз-индуцирующего действия НАД⁺ при остром и подостром введении доксорубицина сопровождалась снижением экспрессии CD38 в клетках костного мозга на фоне возрастания уровня внутри - и внеклеточного НАД⁺, что подтверждает существующие предположения о необходимости поддержания адекватного уровня НАД⁺ в клетках для реализации программы апоптоза. Полученные экспериментальные данные могут свидетельствовать о снижении чувствительности гемопоэтических клеток к действию НАД⁺.

С учетом выявленного нами индуцирующего влияния НАД⁺ на клеточную гибель, а также того факта, что одним из проявлений апоптоза является блеббинг плазматической мембраны, мы изучили особенности повреждения мембран клеток костного мозга при окислительном стрессе в присутствии НАД⁺ in vitro.

Инкубация клеток костного мозга с НАД⁺ приводила к изменениям плазматической мембраны, сопровождающимся индукцией преимущественно начального блеббинга, который проявлялся с первых минут аппликации метаболита, тогда как клетки с признаками терминального блеббинга регистрировались во второй половине инкубационного периода. На протяжении всей инкубации НАД⁺ оказывал выраженное цитотоксическое действие, проявляющееся развитием некроза (Табл.3).

Таблица 3. Модуляция эффектов НАД⁺ в клетках костного мозга при их инкубации с доксорубицином (ДОК, 10^-6 М) in vitro и при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo (в % от общего количества клеток)

Серия	Показатель	Время инкубации, мин
		5	15	30	45	60
Контроль	Начальный блеббинг	1,50 0,0	1,50 1,06	6,33 0,82	1,88 0,79	1,0 0,47
	Терминальный блеббинг	0,50 0,33	1,25 0,29	2,50 0,35	2,0 0,53	1,58 0,43
	Некроз	7,38 1,57	8,38 0,92	10,17 1,14	10,25 1,46	11,50 1,55
НАД, 1 мМ	Начальный блеббинг	10,67 1,95***	12,0 2,32**	5,50 0,35	5,67 1,24*	4,0 1,22
	Терминальный блеббинг	1,50 0,61	2,0 0,35	2,33 0,89	4,83 1,08	2,50 0,71
	Некроз	19,17 2,01***	21,17 2,01***	24,17 1,67***	26,33 0,89****	29,50 0,35****
НАД, 1 мМ + ДОК, 10-6 М	Начальный блеббинг	10,25 1,50***	11,0 1,87**	13,63 2,60*#	7,13 1,61*	4,33 1,43
	Терминальный блеббинг	0,83 0,34	0,67 0,21#	2,17 0,54	1,83 0,41#	1,25 0,17
	Некроз	19,88 1,92***	20,38 1,92***	20,83 2,41**	21,63 1,82***	23,13 1,21***###
ДОК, 24 ч + НАД	Начальный блеббинг	13,13 0,76****	10,13 0,95***	8,63 0,83##	6,38 0,28***	5,50 0,41****
	Терминальный блеббинг	0,88 0,43	2,13 0,49	2,0 0,24	1,50 0,41#	1,38 0,36
	Некроз	20,25 2,03***	21,0 2,39***	22,88 2,62***	23,38 2,14***	25,38 1,44****#
ДОК, 10 дней + НАД	Начальный блеббинг	1,83 0,54##	-	-	-	1,33 0, 20
	Терминальный блеббинг	1,33 0, 20	-	-	-	1,0 0,35
	Некроз	18,0 2,81*	-	-	-	28,50 2,15***

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с изолированным действием НАД: ^# Р0,05; ^## Р0,02; ^### Р0,01; ^#### Р0,001.

Воздействие доксорубицина in vitro и in vivo изменяло динамику блеббинга по сравнению с изолированным действием НАД⁺. Инкубация клеток с ксенобиотиком in vitro ослабляла НАД⁺-индуцированные процессы терминального блеббинга и некроза. Острое и подострое введение ксенобиотика in vivo также сопровождалось снижением выраженности блеббинга, индуцированного НАД⁺ (Табл.3). Это соответствовало характеру совместного влияния НАД⁺ и ксенобиотика на свободнорадикальное окисление липидов биомембран, проявляющегося подавлением его интенсивности.

Полученные нами экспериментальные данные подтверждают вероятность нарушения процессов блеббинга клеточных мембран в условиях изменения концентрации внутриклеточного НАД⁺ при окислительном стрессе.

Следовательно, эффекты НАД⁺, связанные с нивелированием его апоптоз - и некроз-индуцирующей активности и мембран-цитоскелетных перестроек в состоянии окислительного стресса, имели однотипную направленность, что предполагает опосредованность этих процессов одним механизмом (Рис.11).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.11. Механизмы реализации эффектов НАД⁺ в клетках костного мозга

Обозначения. - указаны места действия ксенобиотика антрациклинового ряда доксорубицина.

Таким образом, НАД⁺, присутствуя во внеклеточной среде в концентрациях, реально достижимых при явлениях интенсивного цитолиза, потенцирует процессы некроза и блеббинга в гемопоэтических клетках in vitro, а также продукцию реактивного кислорода, что может являться одним из механизмов паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге. Применение доксорубицина - индуктора окислительного стресса - модулирует чувствительность гемопоэтических клеток к действию эндогенного регулятора, вероятно, за счет изменения CD38-опосредованных механизмов трансмембранного транспорта НАД⁺.

Принимая во внимание тот факт, что поддержание стабильного уровня НАД⁺ в клетках необходимо для координации клеточного метаболизма, регуляции активности сигнальных каскадных путей, модуляции процессов пролиферации и апоптоза, в то время как применение ксенобиотиков, индуцирующих окислительный стресс, нарушает внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и АТФ вследствие активации полиАДФ-рибозилполимеразы, обоснованным представляется предположение, что поддержание энергетического уровня в поврежденных клетках костного мозга путем подавления активности полиАДФ-рибозилполимеразы может играть решающую роль в восстановлении их функциональной активности, в том числе нормализации процессов пролиферации и запрограммированной клеточной гибели.

Действительно, никотинамид, являющийся субстратным ингибитором НАД-конвертирующих ферментов, в наших экспериментах восстанавливал пролиферативную способность клеток костного мозга, нарушенную доксорубицином. При этом сам никотинамид, будучи примененным изолированно, ингибировал пролиферацию клеток (Табл.4).

Таблица 4. Влияние никотинамида (НИК, 1 мМ) на пролиферацию клеток костного мозга и процессы доксорубицин (ДОК) - индуцируемого апоптоза при культивировании в диффузионных камерах

Серия	КОС	КлОС	Апоптоз, %
Контроль	16,08 2,67	121,38 13,46	2,19 0,33
НИК, 1 мМ	6,14 1,22***	49,17 4,56****	8,42 0,93****
ДОК, 10-6 М	7,44 1,15***	68,69 5,15****	4,14 0,30****
ДОК, 10-6 М + НИК, 1 мМ	22,67 2,91****#	117,33 0,88#	2,17 0,70#

Примечание. ^# достоверное отличие по сравнению с изолированным применением доксорубицина (ДОК) при Р<0,001.

Эффективность никотинамида проявлялась и в плане предотвращения доксорубицин-индуцируемого апоптоза, в то время как сам никотинамид потенцировал развитие запрограммированной клеточной гибели. Причем индукция апоптоза под действием экзогенного корректора коррелировала с подавлением им колоние - и кластерообразующей способности клеток костного мозга (r=0.90 и r=0.95 (P0,01), соответственно). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о прямом участии НАД-зависимых процессов в модуляции ксенобиотиком механизмов клеточной смерти и/или репарации.

В то же время предполагаемая терапевтическая эффективность ингибиторов полиАДФ-рибозилполимеразы может носить относительный характер, проявляющийся в потенцировании летального эффекта при окислительном стрессе.

Известно, что под действием НАД⁺-гликогидролазы/CD38 внеклеточный НАД⁺ быстро деградирует до никотинамида и АДФ-рибозы. Логично предположить, что дополнительное воздействие никотинамида должно сопровождаться повышением уровня НАД⁺ и усилением его эффекта. Действительно, совместная инкубация клеток костного мозга с никотинамидом и НАД⁺ сопровождалась увеличением некроз-индуцирующей активности метаболита. Однако количество клеток в состоянии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином) и вторичного некроза достоверно снижалось по сравнению с эффектом НАД⁺

Таким образом, никотинамид обладает цитопротекторным действием при применении в физиологических концентрациях, однако оказывает цитотоксический эффект при воздействии в высоких дозах. Следовательно, соблюдение баланса реакций, модулятором которых является никотинамид, является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Кроме того, подавление активности полиАДФ-рибозилполимеразы никотинамидом и связанная с этим активация специфических эндонуклеаз, обеспечивающих интернуклеосомную фрагментацию ДНК, обеспечивает раннюю элиминацию клеток, наиболее чувствительных к запрограммированной клеточной гибели, что на уровне популяции выражается в последующем увеличении устойчивости клеток к действию ДНК-повреждающих агентов.

Таким образом, применение никотинамида субстратного ингибитора полиАДФ-рибозилполимеразы позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД⁺ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках in vivo, что может являться новой патогенетически обоснованной терапевтической стратегией в лечении нарушений гемопоэза.

Полученные нами данные дают право сделать вывод о том, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизме межклеточной коммуникации и интеграции. Являясь индуктором митохондриальной дисфункции, доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет нарушения метаболизма НАД⁺ и АТФ, опосредованного изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации, модуляции процессов пролиферации и запрограммированной/патологической клеточной смерти, следствием чего является изменение чувствительности клеток костного мозга к действию эндогенных лигандов.

Постулируемое нами нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, что представляет собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.

В совокупности результаты нашей работы позволяют предложить следующую схему патогенеза нарушения межклеточных взаимодействий при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда (Рис.12).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.12. Схема патогенеза нарушения межклеточных взаимодействий при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда

Выводы

1. Доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет снижения концентрации в клетке НАД (Ф) Н, изменения соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамидных коферментов, и связанным с этим нарушением метаболизма НАД⁺ и АТФ в гемопоэтических клетках. Это проявляется выраженными сдвигами во внутри - и внеклеточном уровнях естественных метаболитов как при остром и подостром введении ксенобиотика in vivo, так и при инкубации с ним клеток костного мозга in vitro.

2. Воздействие доксорубицина на гемопоэтические клетки in vivo нарушает механизмы регуляции функциональной активности клеток костного мозга, ассоциированные с пуринергической сигнализацией, активностью НАД-конвертирующих ферментов и коннексинов: ксенобиотик уменьшает экспрессию P2X₇ в клетках костного мозга через 24 ч и восстанавливает ее к 10 суткам; уменьшает количество CD38⁺ клеток костного мозга при остром и подостром воздействии; увеличивает экспрессию Cx43 в костном мозге при остром введении с последующим ее восстановлением до исходного уровня.

3. Гемопоэзповреждающее действие доксорубицина сопровождается подавлением пролиферативной активности клеток, угнетающим эффектом на эритроидный и миелоидный ростки гемопоэза, потенцированием клеточной гибели по пути апоптоза, динамическими изменениями плазматической мембраны клеток костного мозга (блеббингом), отражающими степень выраженности нарушений мембран-цитоскелетных взаимодействий, и - при увеличении дозы ксенобиотика - разрушением мембраны (некроз), что ассоциировано с нарушением экспрессии молекул межклеточной коммуникации.

4. Метаболиты с регуляторной активностью (АТФ, НАД⁺) регулируют характер мембран-цитоскелетных взаимоотношений, свободнорадикальные процессы и чувствительность клеток костного мозга к действию некрозогенных и апоптогенных стимулов: АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, индуцирует апоптоз и обратимый блеббинг плазматической мембраны клеток костного мозга in vitro, а также оказывает модулирующее влияние на процессы генерации свободных радикалов в клетках в состоянии окислительного стресса. Присутствие НАД⁺ во внеклеточной среде потенцирует некроз и начальный блеббинг плазматической мембраны гемопоэтических клеток in vitro, а также продукцию реактивного кислорода.

5. Реализация активности АТФ в популяции клеток костного мозга осуществляется через P2X₇ подтип пуринергических рецепторов. Острое и подострое воздействие миелотоксического ксенобиотика доксорубицина нарушает уровень внутри - и внеклеточной АТФ, уменьшая концентрацию АТФ внутри клеток через 24 ч и достоверно увеличивая уровень внутриклеточной и внеклеточной АТФ в костном мозге к 10 суткам, модулирует процессы запрограммированной клеточной смерти и перекисного окисления липидов, что сопровождается отменой апоптоз-индуцирующего действия АТФ, свидетельствующей о снижении чувствительности клеток к апоптогенному эффекту метаболита.

6. Важным компонентом регуляции пролиферативной и функциональной активности клеток костного мозга является внутриклеточный гомеостаз НАД⁺, регулируемый НАД-конвертирующими ферментами: снижение экспрессии и активности НАД-гликогидролазы (CD38) в клетках костного мозга при действии доксорубицина сопровождается отменой апоптоз - и некроз-индуцирующего действия НАД⁺ на фоне возрастания уровня внутри - и внеклеточного НАД⁺, что свидетельствует о снижении чувствительности гемопоэтических клеток к регуляторным эффектам эндогенного лиганда НАД⁺.

7. Патогенетически значимым механизмом миелотоксического действия доксорубицина является изменение экспрессии молекул коннексиновых контактов в клетках костного мозга, что сопровождается модуляцией процессов запрограммированной клеточной гибели и альтерацией чувствительности клеток к регуляторному влиянию эндогенных лигандов (АТФ, НАД⁺), транспортируемых коннексинами.

8. Применение никотинамида субстратного ингибитора НАД-конвертирующих ферментов - является патогенетически обоснованным способом коррекции миелотоксического действия доксорубицина: никотинамид эффективно блокирует вызванное ксенобиотиком нарушение пролиферативной активности клеток, способствуя возрастанию количества колоние - и кластерообразующих клеток костного мозга в 3 и 1,7 раза, соответственно, и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках in vivo, снижая уровень доксорубицин-индуцируемого апоптоза в 1,9 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, могут быть положены в основу разработки новой фармакологической стратегии, основанной на направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации (применение антагонистов пуринергических рецепторов, модулирующих апоптогенное действие АТФ в отношении гемопоэтических клеток; подавление активности НАД-конвертирующих ферментов, сопровождающейся нормализацией процессов пролиферации и запрограммированной клеточной гибели), а также использоваться в диагностике и оценке побочных эффектов действия доксорубицина на гемопоэтические клетки.

2. Комплексная оценка мембранной дисфункции в клетках костного мозга может быть использована в качестве маркера нарушения физико-химических свойств мембраны при окислительном стрессе, модулирующего активность мембран-ассоциированных белков и приводящее к снижению чувствительности клеток к действию лигандов рецепторов.

3. Миелотоксическое действие доксорубицина может быть эффективно блокировано применением никотинамида субстратного ингибитора НАД-конвертирующих ферментов, восполняющего клеточный пул НАД⁺ и восстанавливающего, таким образом, пролиферативную активность клеток и программу клеточной смерти в гемопоэтических клетках.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Применение диффузионных камер для изучения гемопоэтических клеток / В.В. Нефедова, Ю.А. Успенская, Т.А. Романова, О.В. Щеглова // Коррекция гомеостаза: Матер. VII Всерос. симпоз. Красноярск, 1996. С.86-87.

2. Нарушение серотонинергических механизмов регуляции гемопоэза in vivo при острой экзогенной интоксикации / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, О.В. Круглик, В.П. Нефедов // Гомеостаз и окружающая среда: Матер. VIII Всерос. симпоз. (с междунар. участием). Красноярск, 1997. С.119-124.

3. Успенская, Ю.А. Нарушение ксенобиотиком индуктором окислительного стресса серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, В.П. Нефедов // Тез. докл.3-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1997. С.239.

4. Успенская, Ю.А. Влияние серотонина и ксенобиотика на пролиферацию костномозговых клеток и процессы запрограммированной клеточной смерти / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, Л.Н. Лапшина // Технологии неистощительного землепользования: Матер. науч. конф. профессорско-преподавательского состава КрасГАУ. Красноярск, 1997. С.55-56.

5. Нарушение серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга при действии ксенобиотика индуктора окислительного стресса / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская, О.В. Круглик и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. 1998. - Т.61. - № 4. - С.34-37.

6. Нарушение клеточных сигнальных систем в патогенезе экзогенных интоксикаций / А.Б. Егорова, С.В. Михуткина, Е.Ю. Ставицкая, Ю.А. Успенская // Вестн. Красноярского регионального отд-ния РАЕН. - Красноярск, 1999. - № 1. - С.99-109.

7. Pathogenesis of plasma membrane blebbing induced by chemical and physical agents / S. V. Mikhutkina, E. Yu. Stavitskaya, Yu. A. Uspenskaya et al. // Proc. IX Intern. Symp. of the Japan-Russia Medical Exchange. - Kanazawa, Japan, 2001. - P.213.

8. Егорова, А.Б. NAD и глутатион модулируют чувствительность клеток костного мозга к окислительному стрессу / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская, В.П. Нефедов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2001. Т.132. - № 7. С.34-37.

9. Повреждение цитоскелета и клеточных мембран при апоптозе / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская, С.В. Михуткина, Е.Ю. Ставицкая // Успехи соврем. биологии. - 2001. - Т.121. - № 5. - С.502-510.

10. Успенская, Ю.А. Модуляция доксорубицином биологических эффектов АТФ в клетках костного мозга in vitro / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, В.П. Нефедов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2002. Т.133. - № 5. С.487-491.

11. Успенская, Ю.А. АТФ, НАД и глутатион модулируют чувствительность клеток костного мозга в условиях окислительного стресса / Ю.А. Успенская // Современные аспекты биологии и медицины: Матер. городской науч. - практ. конф., посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории СГМУ. Томск, 2002. С. 19-21.

12. Успенская, Ю.А. Изменение чувствительности клеток костного мозга при окислительном стрессе связано с модулирующим влиянием НАД / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина // Гомеостаз и экстремальные состояния организма: Тез. докл. XI Междунар. симпоз. Красноярск, 2003. - С.153-154.

13. Модулирующее влияние глутатиона на чувствительность гемопоэтических клеток к воздействию доксорубицина / Ю.А. Успенская, С.В. Михуткина, С.К. Антонова, Л.Л. Петрова // Актуальные проблемы патофизиологии: Матер. межвузовской конф. молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2003. - С.92-94.

14. Механизмы экстернализации фосфатидилсерина и блеббинга при апоптозе, индуцированном действием мембранотоксических ксенобиотоков / А.Б. Салмина, С.В. Михуткина, Ю.А. Успенская и др. // Тез. докл. X Российско-Японского междунар. медицинского симпоз. "Якутия - 2003". - Якутск, 2003. - С.146-147.

15. Блеббинг плазматической мембраны тимоцитов и апоптоз связаны с нарушением емкостного входа Са²⁺ в клетки / С.В. Михуткина, А.Б. Салмина, А.В. Сычев и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2004. Т.137. - № 6. С.628-632.

16. Role of purinergic receptors in realization of ATP effects in bone marrow cells / Ya. A. Uspenskaya, S. V. Mikhutkina, E. A. Pozhilenkova et al. // Proc. XI Intern. Symp. of the Japan-Russia Medical Exchange. - Niigata, Japan, 2004. - P.395.

17. Успенская, Ю.А. Эффекты АТФ в клетках костного мозга реализуются через P2X подтип пуринергических рецепторов / Ю.А. Успенская // Матер. XIX съезда физиологического о-ва им. И.П. Павлова. - Екатеринбург, 2004. - С.220-222.

18. Индукция апоптоза в клетках костного мозга опосредуется активностью пуринергических рецепторов / Ю.А. Успенская, С.В. Михуткина, Е.И. Таксанова и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2004. Т.138. - № 8. С.135-138.

19. Коннексины в коже / В.И. Прохоренков, А.Б. Салмина, Т.Г. Рукша и др. // Клинич. дерматология. - 2004. - № 3. - С.16-20.

20. Кальций-зависимые механизмы апоптоза в патогенезе токсичности ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса / С.В. Михуткина, О.Л. Лопатина, Ю.А. Успенская, Е.А. Пожиленкова // Актуальные проблемы патофизиологии: Матер. X Юбилейной межвузовской конф. молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2004. - С.70-72.

21. Успенская, Ю.А. Роль CD 38 и НАД в регуляции чувствительности клеток костного мозга к миелотоксическому действию доксорубицина / Ю.А. Успенская // Матер. Всерос. конф. молодых ученых. - Красноярск, 2004. - С.183-186.

22. Успенская, Ю.А. Изменение метаболизма НАД⁺ и CD38 в клетках костного мозга в условиях окислительного стресса / Ю.А. Успенская // Актуальные проблемы патофизиологии: Матер. XI межвузовской конф. молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2005. - С.81-83.

23. Успенская, Ю.А. Участие НАД⁺-гликогидролазы в регуляции чувствительности клеток костного мозга к токсическому действию ксенобиотиков / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина / Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда // Бюл. Сибирской медицины. - 2005. - Т.4. - Приложение 1. - С.121.

24. Успенская, Ю.А. Особенности экспрессии CD38 в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина // Тез. докл. XII Симпозиума Российско-Японского медицинского обмена. - Красноярск, 2005. - С.637-639.

25. Нарушение экспрессии CD38 и метаболизма НАД⁺ в клетках костного мозга при действии доксорубицина / А.Б. Салмина, Ю.А. Успенская, С.В. Михуткина и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. 2006. - Т.69. - № 3. - С.50-52.

26. Успенская, Ю.А. Нарушение метаболизма АТФ и НАД⁺ и межклеточной коммуникации в гемопоэтических клетках при окислительном стрессе / Ю.А. Успенская // Вестник КрасГАУ. - 2006. - № 13. - С.235-239.

27. Успенская, Ю.А. Нарушение экспрессии молекул межклеточной коммуникации в клетках костного мозга при действии доксорубицина in vivo / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина, Е.Ф. Вайс // Сибирское медицинское обозрение. - 2007. - № 1. - С.10-13.

28. Особенности экспрессии и функциональной активности P2X₇ рецепторов в клетках костного мозга при действии доксорубицина / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина, Н.А. Малиновская и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. 2007. - Т.70. - № 1. - С.52-56.

29. Успенская, Ю.А. Роль нарушений экспрессии коннексинов в развитии апоптоза клеток костного мозга при действии миелотоксического ксенобиотика / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - № 1. - С.51-54.

30. Успенская, Ю.А. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза в условиях окислительного стресса / Ю.А. Успенская // Матер. XX съезда физиологического о-ва им. И.П. Павлова. - Москва, 2007. - С.455.

Список сокращений

АТФ -	аденозинтрифосфорная кислота
ДНК	дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОК -	доксорубицин
КлОС -	кластерообразующая способность
КОС -	колониеобразующая способность
МДА -	малоновый диальдегид
МПД	максимально переносимая доза
МТТ -	3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) - 2,5-дифенилтетразолия бромид
НАД -	никотинамидадениндинуклеотид
НАДФН	восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НИК -	никотинамид
ПОЛ -	перекисное окисление липидов
ТБК -	тиобарбитуровая кислота
ФИТЦ -	флуоресцеин-изотиоцианат
CD -	кластер дифференцировки (cluster of differentiation)
Cx43 -	коннексин 43
LD50	доза, вызывающая гибель 50% животных
PPADS -	пиридоксальфосфат-6-азофенил-2,4-дисульфоновая кислота

Размещено на Allbest.ru

...