Размещено на http://www.allbest.ru/

АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДНЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ

14.00.53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

КОЗИНА Людмила Семеновна

Санкт-Петербург - 2008

Работа выполнена в лаборатории биохимии

Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии

Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор

Хавинсон Владимир Хацкелевич

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор Ноздрачев Александр Данилович

доктор медицинских наук, профессор

Малинин Владимир Викторович

доктор биологических наук, профессор

Розенгарт Евгений Викторович

Ведущая организация:

ГУ «Российский научно-исследовательский институт геронтологии»

Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «____»__________________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д .3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан _________________________________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Рыжак Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Свободнорадикальная теория старения, предложенная в 50-е г.г. прошлого столетия

Д. Харманом и получившая дальнейшее развитие в многочисленных работах зарубежных и отечественных исследователей, к которым относятся в первую очередь Н.М. Эммануэль и его школа, до настоящего времени считается одной из самых перспективных теорий, объясняющих механизмы старения и связанных с ним патологических процессов.

Известно, что процессы старения организма и формирования возрастной патологии обусловлены ростом молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, а также нарушением функции системы антиоксидантной защиты организма. При этом наблюдается дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, определяющий интенсивность патологических процессов. Оксидативные реакции приводят к нарушению регуляции клеточного гомеостаза, что способствует развитию заболеваний или индуцирует процесс преждевременного старения [Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Зенков Н.К. и соавт.,2001; Дубинина Е.Е., 2006]. В основе этих нарушений лежат процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые носят каскадный характер, окислительной модификации белков и ДНК.

Наряду с этим, установлено, что одной из наиболее важных регуляторных функций эндогенных пептидов (глутатион, карнозин и его производные, некоторые нейропептиды) является ограничение чрезмерной активации свободнорадикальных процессов, прежде всего ПОЛ, и поддержание способности системы антиоксидантной защиты противодействовать окислительному стрессу, развивающемуся в организме при патологических процессах, действии неблагоприятных факторов внешней среды и старении [Болдырев А.А., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Лысенко и соавт., 2005]. Принимая во внимание разнообразие физиологических эффектов регуляторных пептидов, легко представить, что уменьшение их продукции может привести к нарушению механизмов пептидной регуляции и постепенному угасанию функций в стареющем организме.

В Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН выделено из тканей животных большое количество геропротекторных полипептидных препаратов, представляющих собой низкомолекулярные соединения пара- и аутокринной природы, выполняющие функции внутри- и межклеточных мессенджеров. Они, как и многие синтезированные на основе изучения их аминокислотного состава короткие пептиды, принимают участие в переносе информации между группами клеток, регулируют их активность и обладают полифункциональным действием в организме. Широкий спектр фармакологической активности этих соединений связан с их влиянием на ряд наиболее общих механизмов, лежащих в основе разнообразных патологических процессов. Установлено, что они способствуют увеличению продолжительности жизни, тормозят развитие опухолей, обладают иммуномодулирующим действием и т.д. [Анисимов В.Н., 2003]. Существует представление о том, что соединения пептидной природы могут осуществлять свои функции на уровне межклеточного взаимодействия между геномом и структурно-функциональными элементами нейро-иммунно-эндокринной регуляции [Хавинсон В.Х., Кветной И.М. и соавт., 2003, Пальцев М.М., Кветной И.М., 2008]. По-видимому, пептиды, обладающие антиоксидантной активностью, способны корректировать нарушения подобного взаимодействия в условиях окислительного стресса, возникающего при старении вследствие развития различных патологических процессов (сердечно-сосудистые заболевания, нарушение мозгового кровообращения, злокачественный рост, нейродегенеративные болезни и т.д.).

Механизмы действия регуляторных пептидов до настоящего времени объясняют с позиций существования пептидного каскада, сформулированных в гипотезе о функциональном континууме пептидов [Ашмарин И.П., Каменская М.А., 1988; Ашмарин И.П., 1996; Ашмарин И.П., Королева С.В, 2003]. Каждый пептид имеет спектр биологической активности, определяемый, во-первых, его непосредственным действием и, во-вторых, его способностью индуцировать выход эндогенных регуляторов, в том числе и других регуляторных пептидов. В свою очередь, каждые из них также могут служить индукторами выхода следующей группы пептидов и т.д., благодаря чему формируется сложный каскадный процесс. Гипотеза о существовании такой системы регуляции позволяет преодолеть серьезные противоречия, возникающие при попытках объяснения относительно длительных физиологических эффектов короткоживущих пептидов. Другим механизмом действия регуляторных пептидов считается их процессинг, в результате которого становится возможным в короткие сроки путем активации определенных протеолитических ферментов образовывать в нужном месте необходимое количество требуемых пептидов [Яковлев и соавт., 1992; Гомазков О.А., 1995]. Образующиеся короткие фрагменты из 3-4 аминокислотных остатков, полностью лишенные гормональной активности, могут оказаться значительно более эффективными, чем исходные соединения.

Известно, что любая клетка наделена системой защиты от АФК и продуктов перекисного окисления, которые способны нанести ей непоправимый вред. Значительная часть этой защитной системы локализована в митохондриях и микросомах и представлена такими ферментами, как супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Ингибирование избыточного свободнорадикального окисления (СРО) играет особо важную роль в функционировании митохондрий, мембрана которых несет на своей поверхности комплексы ферментов, осуществляющих транспорт электронов, цикл трикарбоновых кислот и процессы фосфорилирования.

Нормальная деятельность ферментных систем митохондрий выполняет важную роль в осуществлении физиологических функций клетки, работа которой во многом определяется состоянием проницаемости, пассивного и активного транспорта, а также стабильностью митохондриальных мембран [Скулачев В.П., 1997; Skulachev V.P., 2002]. Отсюда правомочно заключить, что даже незначительные структурные и функциональные сдвиги в митохондриальных мембранах, возникшие вследствие усиления процессов перекисного окисления, могут существенно нарушать функции клетки. Вместе с тем регуляторные пептиды, ингибируя кислородозависимые процессы в мембране, способствуют сохранению ее целостности и обеспечивают нормальное функционирование клетки. В этой связи перспективной представляется гипотеза о вызываемой пептидными регуляторами длительной модификации характера экспрессии генов, кодирующих белки митохондриальных мембран [Khavinson V. et al., 2002, 2007].

Пептидный компонент регуляции проявляется на всех уровнях функционирования организма [Гомазков О.А., 1995; Шерстнев В.В. и соавт, 1999]. Одним из наиболее важных механизмов реализации разнообразных эффектов биологически активных пептидов является их нормализующее влияние на интенсивность свободнорадикального окисления в органах и тканях, что, как правило, сопровождается усилением клеточного и гуморального иммунитета, улучшением коагулогических показателей, повышением нейрональной активности, оптимизацией когнитивных функций и т.д. [Лысенко А.В. и соавт., 2005]. Особое значение приобретает пептидная регуляция при коррекции нарушений, вызванных воздействием на организм стрессорных факторов, способствующих ускоренному старению. В связи с этим можно рассматривать пептидные биорегуляторы как перспективные фармакологические средства, способствующие замедлению возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме.

Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным представляется проведение экспериментального изучения влияния коротких пептидов как антиоксидантов на интенсивность свободнорадикальных процессов на клеточном уровне, а также в различных органах при воздействии стресса и при старении. Это позволит выявить и оценить антиоксидантные эффекты коротких пептидов и возможные механизмы их реализации, что представляет значительный научно-практический интерес.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение влияния на свободнорадикальные процессы ряда геропротекторных пептидных препаратов, разработанных в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (эпиталон, вилон, пинеалон и др.) и возможных механизмов их антиоксидантного действия.

В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возрастную динамику основных показателей СРО и системы антиоксидантной защиты в крови, мозгу и печени крыс;

2. Исследовать влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в сыворотке крови и тканях крыс.

3. Изучить влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в условиях действия экстремальных факторов (гипоксия, гипокинезия);

4. Оценить антиоксидантную активность и мембранопротекторные свойства коротких пептидов в модельных экспериментах:

· Исследовать прямую антиоксидантную активность коротких пептидов

· Исследовать влияние коротких пептидов на Fe2+-индуцированное окисление липопротеинов крови и скорость осмотического гемолиза эритроцитов

· Изучить действие коротких пептидов на нейрональные клетки мозжечка

5. Изучить механизмы защитного действия пептидных биорегуляторов при гипоксии:

· Исследовать влияние коротких пептидов на устойчивость крыс к воздействию гипобарической гипоксии

· Исследовать влияние коротких пептидов (пинеалон) на состояние потомства крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии

· Исследовать влияние пинеалона на поведенческие реакции крысят, перенесших пренатальную гипоксию

· Исследовать влияние пинеалона на нейрональные клетки мозжечка потомства крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии

· Исследовать влияние коротких пептидов на клетки нейробластомы человека при гипоксическом воздействии

Научная новизна работы

Установлено, что в печени и сыворотке крови крыс при старении снижается уровень генерации активных форм кислорода (АФК), что сопровождается значительным подавлением активности системы антиоксидантной защиты. При этом выявлено заметное повышение уровня содержания в белках карбонилпроизодных аминокислот, что свидетельствует об использовании АФК в реакциях окислительной модификации белков. Возрастная динамика СРО в гомогенатах мозга аналогичных изменений не претерпевает, однако впервые выявлена интенсификация свободнорадикальных процессов в митохондриях, выделенных из ткани коры больших полушарий и гипоталамуса старых крыс (24 мес.) по сравнению с молодыми животными (3 мес.). Обобщены данные, полученные в отношении действия коротких пептидов (эпиталон и его структурные аналоги, вилон и кортаген) на свободнорадикальные процессы и основные системы антиоксидантной защиты в крови, печени и мозге лабораторных животных (белые крысы линий ЛИО и Wistar, мыши линии CBA). Впервые показано, что исследуемые пептидные препараты особенно эффективны как антиоксиданты при старении животных. Наиболее выраженные антиоксидантные свойства были выявлены у эпиталона. На примере эпиталона показано, что эффективность антиоксидантного действия пептидных биорегуляторов еще более возрастает при воздействии на организм экстремальных факторов (гипоксия, гипокинезия).

Впервые проведено изучение антиоксидантной активности и мембранопротекторных свойств эпиталона, вилона и других коротких пептидов (везуген, пинеалон) в модельных экспериментах in vitro. Установлено, что исследуемые пептиды не обладают прямой антиоксидантной активностью, но способны защищать липопротеиновые комплексы плазмы крови от Fe2+--индуцированного окисления и подавлять осмотический гидролиз эритроцитов.

Приоритетными являются исследования, проведенные в области изучения антигипоксических свойств коротких пептидов. Выявлена способность пинеалона и других вышеперечисленных пептидных препаратов защищать нейроны мозжечка потомства крыс, подвергнутых гипоксическому воздействию, от окислительного стресса, индуцируемого перекисью водорода или лигандом NMDA-рецепторов глутамата N-метил-D-аспартатом. Нейропротекторное действие коротких пептидов показано также

в экспериментах с использованием клеток нейробластомы человека, культивируемых в условиях гипоксии. Установлено, что эпиталон и, отчасти, вилон проявляют антигипоксический эффект, препятствуя подавлению экспрессии металлопептидаз (неприлизина и инсулин-деградирущего фермента), участвующих в катаболизме в-амилоидного пептида, играющего исключительно важную роль в патогенезе весьма распространенной в пожилом и старческом возрасте болезни Альцгеймера.

Практическая ценность работы

Выявление антиоксидантной активности ряда коротких пептидов (эпиталон, вилон, кортаген, пинеалон и везуген) дает основание полагать, что она играет важную роль в механизмах геропротекторного действия этих биорегуляторов, поскольку ослабление мощности антиоксидантных систем организма является одной из ведущих причин развития возрастной патологии и преждевременного старения.

Показана возможность использования эпиталона и вилона в качестве стресспротекторных соединений при воздействии на организм таких сопутствующих старению неблагоприятных экологических факторов как гипоксия и гипокинезия.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ряд исследуемых коротких пептидов (пинеалон, везуген, эпиталон и вилон) обладают выраженными нейропротекторными свойствами, что проявляется в защите нервных клеток от окислительного стресса, развивающегося в результате гипоксического воздействия. Детальное изучение нейропротекторной роли указанных соединений создает предпосылки их применения для профилактики и терапии различных нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с возрастом. Особенно перспективны в этом отношении трипептиды пинеалон и везуген, которые могут быть использованы как биологические добавки к пище, способствующие улучшению качества жизни и активного долголетия человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Короткие пептиды (эпиталон, кортаген, вилон, пинеалон и везуген) обладают антиоксидантными свойствами в экспериментах in vivo и in vitro.

2. Антиоксидантные эффекты коротких пептидов (эпиталон, вилон) особенно наглядно проявляются при старении и в условиях действия на животных экстремальных факторов (гипокинезия, гипоксия).

3. Короткие пептиды (эпиталон, вилон, везуген и, особенно, пинеалон) обладают антигипоксическим действием, что выражается в повышении устойчивости животных к гипобарической гипоксии.

4. Пинеалон повышает активность антиоксидантных ферментов в мозгу и печени беременных самок крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии, и обеспечивает защиту потомства от ее последствий.

5. Короткие пептиды (пинеалон, эпиталон и вилон) при гипоксическом воздействии оказывают протекторное влияние на нейроны мозжечка крыс и клетки нейробластомы человека.

Апробация работы

Материалы исследования доложены и обсуждены на международной конференции “Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging» (Saint-Petersburg, 2001), международной научно-практической конференции «Медико-психологическая реабилитация: современное состояние и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2004), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2005, 2006), IV национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Киев, 2005), 4-й, 5-й и 6-й национальных научно-практические конференциях с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота» (Смоленск, 2005, 2006, 2007), II и III Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005, 2006), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), 4-й Российской конференции с международным участием «Гипоксия, механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), научной конференции с международным участием «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), региональных научных конференциях «Геронтология: от кардиологии к социально-экономическим аспектам» (Сыктывкар, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи-Адлер, 2006), международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), VII Всероссийской конференции с международным участием «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), VII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина. 2006, 2007), научно-практической конференции, посвященной 20-летию первой в России кафедры гериатрии («Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии», Санкт-Петербург, 2006), III и IV Всероссийских научно-практических конференциях "Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов" (Москва, 2006, 2007), Научно-практической конференции «Пожилой больной» (Москва, 2006), международной конференции 4th Bologna International Meeting “Affective, behavioral and cognitive disorders in the elderly-ABCDE”(Bologna, Italy, 2006), международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2007), II Международном конгрессе "Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном мире" (Санкт-Петербург, 2007), XIV Российском национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), III, IV научно-практических[ геронтологических конференциях с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой, "Пушковские чтения" (Санкт-Петербург, 2007, 2008), XII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), II Международном конгрессе "Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном мире" (Санкт-Петербург, 2007), II-м Санкт-Петербургском международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши,2008), Конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), а также международных форумах: International conference “Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging» (Saint-Petersburg, 2001), 18th World Congress of Gerontology (Rio de Janeiro, Brazil, 2005), International Symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease» (Saint-Petersburg, 2007), 21st Biennial Meeting of International Society for Neurochemistry and the 38th Annual Meeting of the American Society for Neurochemistry (Cancun, Mexico, 2007), 4th International Peptide Symposium, 7th Australian Peptide Symposium, 2nd Asia-Pacific International Peptide Symposium “Discovery to Drugs: The Peptide Pipeline” (Cairns, Queensland, Australia), VI European Congress International association of gerontology and geriatrics (Saint-Petersburg, 2007).

Реализация результатов исследования

Результаты исследований используются в научной и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Научного центра неврологии РАМН (Москва), ГУН «НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова» ФАЗСР РФ, ГУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» РАМН, Южно-Федерального Университета, (Ростов-на Дону), Института молекулярной и клеточной биологии Университета (Лидс, Великобритания).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 72 работы, 19 статей в журналах и в сборниках научных трудов (из них 9 в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ), 1 монография, 52 тезиса докладов.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 252 страницах, содержит 21 таблицу и иллюстрирован 36 рисунками. Указатель литературы содержит 360 источника, из которых отечественных - 113, зарубежных -247.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

препарат пептидный геропротекторный

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные и исследуемые препараты

Исследование процессов СРО и антиоксидантной активности пептидных биорегуляторов проводилось в экспериментах in vivo и in vitro. Эксперименты были поставлены на молодых (3мес) и старых (24 мес) крысах линии ЛИО, а также половозрелых крысах линий Wistar (6 мес) и мышах линии CBA (18 мес). Животных содержали в пластмассовых клетках, они получали стандартный в условиях вивария корм и воду без ограничений.

В качестве пептидных препаратов были использованы синтетические короткие пептиды эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), кортаген (Ala-Glu-Asp-Pro), вилон (Lys-Glu), везуген (Lys-Glu-Asp) и пинеалон (Glu-Asp-Arg). В экспериментах in vivo пептидные препараты вводили в течение 5 дней внутрибрюшинно в дозе 2,5 - 10 мкг/кг массы (эпиталон, вилон, кортаген, везуген и пинеалон). Дозы и интервалы времени применения препаратов соответствовали тем, что были отработаны ранее [Малинин В.В., 2001].

Экспериментальные модели стрессовых воздействий

В качестве экспериментальных моделей стресса были выбраны гипокинезия и гипобарическая гипоксия:

1. Гипокинезию у крыс модулировали путем помещения их в тесные пластиковые пеналы из оргстекла, добиваясь резкого ограничения движения животных [Федоров И.В., 1987; Лысенко А.В. и соавт., 2001].

2. Модель острой гипобарической гипоксии вызывали, помещая крыс в барокамеру проточно-вытяжного типа при атмосферном давлении 0,029 МПа, что соответствует подъему на высоту 9000 м над уровнем моря [Вальдман А.В. и соавт., 1989]. В барокамеру были вмонтированы поглотители углекислоты и влаги. Животные находились в ней в условиях свободного наблюдения в течение 3 ч. под постоянным наблюдением. Затем крыс декапитировали, брали кровь, извлекали мозг и выделяли на льду кору головного мозга.

В отдельных сериях экспериментов использовали модель острой сублетальной гипобарической гипоксии, модулируя ее в барокамере с регулируемым протоком воздуха для предотвращения развития гиперкапнии [Boldyrev A.A. et al., 1997]. С помощью вакуумного насоса давление в барокамере снижали за 1 мин. до конечного значения 0,125 атм.; в таких условиях животных выдерживали до остановки дыхания, после чего возвращали в условия нормального давления, постепенно подавая в камеру атмосферный воздух. Эта же модель использовалась нами для исследования потомства беременных самок крыс, подвергнутых гипоксическому воздействию пренатальной гипоксии (пренатальная гипоксия). В этих опытах крысы были подвергнуты гипобарической гипоксии на 10- й день беременности - в срок, при котором у потомства происходит закладка нервной системы [Федорова Т.Н. и др., 2006].

Физиологические методы исследования.

Разделение экспериментальных животных на группы устойчивых и чувствительных к гипоксии проводили в условиях стандартной методики открытого поля [Буреш Л. и соавт., 1991; Вербицкий Е.В., 2003]. Регистрировали частоту вертикальных и горизонтальных локомоций, груминга, болюсов, выходов в центр открытого поля, что отражало физиологическую активность подопытных животных.

При оценке гипоксического воздействия регистрировали следующие параметры:

1- время потери дыхания "на высоте" (сек);

2- время восстановления позы (сек), то есть период времени от остановки дыхания до момента, когда животное после "спуска с высоты" и восстановления дыхания в условиях нормобарии принимало нормальную позу;

3- время реституции (сек), которое составляло общую продолжительность периода восстановления физиологической активности после гипоксического воздействия.

Для определения эффективности защитного действия исследуемых пептидов использовали такие параметры, как смертность, необходимость применения процедуры искусственного дыхания, «коэффициент реституции», выражающий отношение продолжительности времени реституции к времени до остановки дыхания в барокамере.

Биофизические и биохимические методы исследования.

Интенсивность ПОЛ оценивали по количеству малонового диацетальдегида - МДА (ТБК-активных продуктов), диеновых конъюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО), а также показателям Н2О2-индуцируемой люминолзависимой или Fe2+- индуцируемой хемилюминесценции (ХЛ), которую измеряли на хемилюминометрах Emilitte -1105 (Россия) и LKB-1251 (Швеция). В хемилюминометрических исследованиях регистрировали светосумму и высоту вспышки ХЛ, величина которых определяет интенсивность свободнорадикальных реакций и расходования свободных радикалов вследствие их взаимодействия с природными антиоксидантами, содержащимися в биосубстрате [Арутюнян А.В и соавт., 2000]. МДА определяли спектрофотометрически по интенсивности окраски образующегося в реакции с тиобарбитуровой кислотой триметинового комплекса с максимумом поглощения при 535 нм [Гаврилов В.Б. и соавт., 1987]. Для экстракции ДК из сыворотки крови использовали смесь изопропилового спирта и гептана (1:1), содержащую бутилированный гидрокситолуол (0,5 г в 100 мл смеси), концентрацию ДК определяли спектрофотометрически при 232 нм в гептановой фазе [Dillard C.J., Tappel A.L., 1989]. ШО определяли по флюоресценции с максимумом возбуждения при 370 нм и максимумом излучения при 450 нм [Арутюнян А.В и соавт., 2000].

Уровень окислительной модификации белков оценивали по содержанию карбонильных производных аминокислот в белках. В основе метода лежит взаимодействие белков, полученных после осаждения трихлоруксусной кислотой и обработки осадка смесью этилового спирта и этилацетата (1:1) с 2,4 - дифенилгидразином. Карбонильные производные после растворения белкового осадка в 8 М мочевине при 37о С.определяли при 363 нм, используя коэффициент молярной экстинкции 22х103 М-1см [Levine R.L. at al., 1981; Арутюнян А.В. и др., 2000].

Активность системы антиоксидантной защиты оценивали, определяя уровень общей антиокислительной активности (ОАА) и активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП). Для определения ОАА использовали хемилюминесцентную реакцию рибофлавина с перекисью водорода в присутствии двухвалентного железа, измеряя светосумму в течение 2 мин. при 37о С. [Арутюнян А.В. и др., 2000]. ОАА выражали в условных единицах на мг белка, рассчитывая ее по формуле:

ОАА= (1-ССоп./ССк.) /А, где ССоп. - величина светосуммы опытного образца; ССк - величина светосуммы конторольной пробы; А - содержание белка в реакционной смеси, который определяли методом [Lowry O.H. et al., 1951]. Активность Cu,Zn - супероксиддисмутазы определяли с использованием системы, обеспечивающей восстановление нитросинего тетразолия, а активность глутатионпероксидазы с использованием гидроперекиси третичного бутила и восстановленного глутатиона [Арутюнян А.В. и др., 2000]. Определение содержания церулоплазмина основано на его оксидазной активности в реакции окисления пара-фенилендиамина [Камышников В.С., 2000].

О состоянии эритроцитарных и лейкоцитарных мембран судили по количеству внеэритроцитарного гемоглобина [Меньшиков В.В. и соавт., 1987], который определяли с помощью тест-набора производства «Olvex Diagnosticum» (Санкт-Петербург) и суммарной пероксидазной активности [Внуков В.В., 1979]. Мембрано-стабилизирующее действие пептидных соединений в опытах in vitro исследовали на модели осмотического гемолиза эритроцитов крови крыс или здоровых доноров [Pribush A. еt al., 2002].

В отдельной серии экспериментов оценивали прямую антиоксидантную активность исследуемых пептидных биорегуляторов по их способности восстанавливать стабильный радикал 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ), измеряя скорость убыли ДФПГ - радикалов спектрофотометрически при 519 нм [Brasnod-Williams W. еt al., 1995; Schlesier K. еt al., 2002].

Выделение субклеточных фракций проводили методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [de Robertis E., 1971] на рефрижераторной центрифуге К-24.

Молекулярно-биологические методы исследования.

1. Культура клеток мозжечка крыс.

Действие пептидных препаратов на образование активных форм кислорода (АФК) гранулярными клетками мозжечка крыс исследовали методом проточной цитометрии [Boldyrev A.A. et al., 1997; Болдырев А.А., 2000]. Использовали первичную культуру нейронов, выделенную из мозжечка 9-дневных крыс линии Wistar. Клетки получали путем обработки измельченного мозжечка в растворе Тироде с 0,2% диспазой -коллагеназой для разрушения межклеточных контактов (30 мин при 33С) с последующим отмыванием кусочков ткани, их взмучиванием и фильтрованием полученной суспензии через тефлоновый фильтр с размером пор 50 мкм. Полученная суспензия содержала около 2 млн клеток в 1 мл. Цитометрический анализ проводили на приборе FacStar (“Becton Dickinson”, США), исследуя популяцию NMDA-чувствительных клеток, которую выделяли гейтом, соответствующим размеру гранулярных клеток (около 10 мк). Полученные результаты анализировали с помощью компьютерной программы WinMDI 2.7.

Исходные вещества (эпиталон, вилон, везуген и пинеалон) в концентрации 10 мМ были растворены в буфере HEPES (10 мМ, рН 7,4), карнозин и N-ацетилцистеин (NАС) растворяли в воде и доводили рН до 7,4. Все вещества использовали в конечной концентрации 1 мM, добавляя их к клеткам непосредственно после выделения. После 120 мин. преинкубации клетки нагружали в течение 40 мин при 37С флуоресцентным красителем DCFH2DA в конечной концентрации 0,1 мМ для определения АФК. Затем клетки стимулировали H2O2 (10 мМ) в течение 30 мин. при 37С. За 1 мин до измерения флуоресценции к суспензии клеток добавляли пропидий иодид в конечной концентрации 10 мкг/мл для оценки доли нежизнеспособных

2. Клетки нейробластомы человека.

Клетки нейробластомы NB7 культивировали в стандартной среде RPMI-1640 (Sigma, Англия), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки телят, 5% пенициллина/стрептомицина и 5% L-глутамина. Клетки выращивали в 30 мл среды во флаконах с площадью 175 см2 при 370C в 5% (по объему) СО2 до достижения ими 70% конфлюэнтности, после чего культуральную среду заменяли на среду, не содержащую сыворотку, в которую добавляли тестируемые компоненты (вилон и эпиталон добавляли до конечной концентрации 50 нМ, или антиоксидант экстракта зеленого чая эпигаллокатехин-3-галлат - до концентрации 50 мкг/мл). К контрольным образцам добавляли такое же количество фосфатного буфера (20 мМ, рН 7.4). После добавления среды клетки содержали или в стандартных условиях, как описано выше, или при пониженном содержании кислорода. Для создания гипоксии использовали О2/СО2 инкубатор (MC0-175M, Sanyo, Япония), в котором содержание кислорода поддерживалось на уровне 1% при помощи замещения его азотом. Содержание СО2, влажность и температура в инкубаторе, поддерживались на стандартном уровне - 370C, 5% (по объему) СО2.

Выделение РНК из культивируемых клеток с использованием набора реагентов (Mini-prep RNeasy purification kit, Qiagen Sussex, Англия) и полимеразную цепную реакцию полученных препаратов РНК с применением набора TITANIUM (One-Step RT-PCR Kit, BD Biosciences, Англия) проводили согласно протоколу производителя

Все эксперименты с клетками повторялись 3 раза, а анализ мРНК осуществлялся

3-5 раз в зависимости от воспроизводимости результатов. Все количественные параметры стандартизировали по мРНК актина.

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке с помощью компьютерной программы STATISTICA 5.0 (Statsoft). Использовали методы параметрической и непараметрической статистики: t- критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни, корреляционный тест Спирмена и регрессионный анализ. Статистическую обработку проводили, используя пакет программ ”BIOSTAT” (Гланц С., 1999).

Лабораторная база для проведения исследований была предоставлена кафедрой биохимии МГУ им. М. В. Ломоносова, Научным центром неврологии РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН и лабораторией протеолиза Института молекулярной и клеточной биологии Университета г. Лидс, Великобритания.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастная динамика ряда показателей свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы

Литературные данные о динамике процесса генерации АФК при старении носят противоречивый характер. Многие авторы считают твердо установленным фактом, что продукция АФК при старении возрастает, и связывают это с окислительным повреждением митохондриальных мембран и нарушением функционирования электрон-транспортной цепи митохондрий [Скулачев В.П., 1997; Ozawa T.,1997; Allen R.G., Nresini M., 2000]. При старении усиливается образование промежуточного продукта восстановления коэнзима Q (убихинона), способного неферментативным путем передавать (сбрасывать) электроны на молекулярный кислород с образованием супероксидного радикала. По мнению других авторов, при старении образование АФК уменьшается вследствие общего снижения интенсивности окислительно-восстановительных процессов (окислительного метаболизма). Одновременно наблюдается снижение активности СОД и других компонентов антиоксидантной защиты, по крайней мере при отсутствии выраженной возрастной патологии [Кольтовер В.К., 1998; 2000, 2005, 2007].

В ряде работ описано снижение общей антиокислительной активности у мышей при старении, причем оно происходит с неодинаковой интенсивностью у животных разных линий [Эммануэль Н..М, 1982]. Показано также, что старые крысы и черви нематоды утрачивают способность к индукции СОД и других антиоксидантных ферментов при гипероксии и становятся более чувствительными к токсическому действию кислорода [Darr D., Fridovich I., 1995; Гусев В.А., Панченко Л.Ф.,1997].

Представление о снижении уровня генерации АФК и активности антиоксидантой системы в процессе старения нашло подтверждение в наших исследованиях. Согласно полученным нами данным, уровень АФК снижается в сыворотке старых крыс по сравнению с молодыми почти на 50%, а в печени более чем в 5 раз. При этом не наблюдается заметных изменений в уровне содержания продуктов ПОЛ, однако достоверно (р<0,05) возрастает уровень содержания белковых карбонилов (1, 86 мкмоль и 5 мкмоль/мг белка в сыворотке крови и 1,53 и 2,39 мкмоль/мг белка в сыворотке крови и печени молодых и старых крыс соответственно). Полученные нами результаты полностью соответствуют литературным данным о большей чувствительности белковых молекул к окислительному повреждению, по сравнению с липидами при старении [Pacifici R.E., Davies K.J,A., 1991; Хавинсон и соавт., 2003; Дубинина Е.Е., 2006]. В наших экспериментах было установлено, что снижение уровня генерации АФК у старых крыс сопровождается подавлением активности СОД, что наиболее наглядно проявляется в печени, отличающейся наиболее высоким содержанием этого фермента [Tian L. et al.,1998]. Активность СОД в печени молодых крыс составляла 116,0 ±8,5отн.ед., тогда как у старых 48,3 ±6,4 отн. ед.(р<0,001). В мозгу исследуемые показатели не претерпевают заметных возрастных изменений, за исключением СОД, активность которой у старых животных несколько понижается. Эти данные также согласуются с литературными сведениями о сопряженном и однонаправленном характере изменений уровня генерации АФК и показателей системы антиоксидантной защиты при старении [Кольтовер В.К., 1998; 2000, 2005, 2007].

Влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы.

Многочисленные исследования, проведенные в 70-е - 90-е годы прошлого столетия, показали, что комплексный препарат эпифиза эпиталамин обладает выраженным геропротекторным действием и стимулирует функциональную активность репродуктивной, иммунной и эндокринной систем организма [Анисимов В.Н., 1973; Anisimov V. et al., 1982, 1994; Лабунец И.Ф., Бутенко Г.М.,1992; Кузник Б.И. и др..,1998; Хавинсон В.Х. и др., 1998]. Вместе с этим было установлено, что эпиталамин проявляет антиоксидантные свойства в экспериментах in vivo и in vitro [Анисимов В.Н и др. 1995, 1996, 1997; Дятлов Р.В. и др., 1997; Мыльников С.В. и др., 2000].

Выполненные нами эксперименты посвящены изучению антиоксидантного действия тетрапептида эпиталона, сконструированного на основе исследования аминокислотного состава эпиталамина, а также некоторых других коротких пептидов, оказывающих сходные с эпиталоном биологические эффекты (кортаген, вилон) и играющих важную роль в пептидергической регуляции гомеостаза.

Было проведено сравнительное изучение влияния эпиталона и кортагена на процессы свободнорадикального окисления (СРО) в сыворотке крови и мозге половозрелых крыс (Wistar). Характерно, что в мозге эпиталон оказывал более выраженное по сравнению с кортагеном ингибирующее действие на процесс ПОЛ, вызывая достоверные изменения в содержании как начальных (ДК) и так и конечных (ШО) продуктов ПОЛ. Под влиянием кортагена статистически достоверно снижалось содержание ДК, тогда как в отношении ШО наблюдалась лишь тенденция к их снижению. В сыворотке крови отмечается избирательное влияние обоих пептидов на начальные этапы ПОЛ, что выражалось в статистически достоверном снижении уровня ДК и некоторой тенденцией к уменьшению содержания ШО. Полученные данные свидетельствуют также о том, что исследуемые пептиды ингибируют наряду с ПОЛ также и процесс окислительной модификации белков (ОМБ), причем наиболее наглядно это проявляется в ткани мозга. В сыворотке крови некоторое снижение интенсивности ОМБ (около 15%) наблюдалось только под влиянием кортагена. Можно полагать, что в этих условиях ШО образуются не только путем последующего превращения ДК, но и при взаимодействии бифункциональных продуктов ПОЛ типа малонового диацетальдегида с различными соединениями, содержащими свободные аминогруппы, прежде всего аминокислотными остатками белков, что приводит к их окислительной модификации с образованием карбонильных групп [Дубинина Е.Е., 2006].

При изучении влияния исследуемых пептидов на антиоксидантную активность было установлено, что кортаген вызывал подавление ОАА в сыворотке крови, а эпиталон как в сыворотке крови, так и в головном мозге. Снижение ОАА сопровождалось ингибированием активности антиоксидантных ферментов: под влиянием эпиталона и кортагена подавлялась активность глутатионпероксидазы мозга, а введение животным кортагена вызывало статистически достоверное понижение активности СОД в сыворотке крови; активность фермента в мозгу, так же как и под влиянием эпиталона при этом не изменялась. Структурное сходство эпиталона и кортагена обуславливает их аналогичные эффекты в отношении большинства изученных нами показателей свободнорадикального окисления.

Полученные данные позволяют полагать, что действие эпиталона и кортагена может быть связано с подавлением образования продуктов ПОЛ и ОМБ и компенсаторным снижением антиокислительной активности. Ранее было установлено, что антиоксидантное действие полипептидного препарата эпифиза эпиталамина проявляется в повышении активности антиоксидантных ферментов [Arutjunyan A.V. et al., 2001; Козина Л.С., Арутюнян А.В., 2007]. Приведенные выше результаты об отсутствии изменений в активности ферментативного звена антиоксидантной защиты под влиянием исследуемых пептидов свидетельствуют об отличии механизмов антиоксидантного действия эпиталона и кортагена от эпиталамина.

Антиоксидантное действие эпиталона особенно наглядно проявлялось в экспериментах на старых животных (крысы, мыши). Эпиталон в сыворотке крови старых крыс оказывал выраженное ингибирующее влияние на ПОЛ, заметно снижая уровень ДК, и вызывал при этом некоторое подавление процесса ОМБ. При этом у них отсутствовали сдвиги в активности антиоксидантных ферментов и антиокислительной активности в целом.

В головном мозгу старых крыс под влиянием эпиталона также наблюдалось подавление образования продуктов ПОЛ и уровня ОМБ. Вместе с тем, при отсутствии изменений в активности ГП при введении эпиталона отмечалось отчетливое повышение активности СОД (43,5±7,6 по сравнению с 24,8±2,8 отн.ед./мг белка в контроле).

В экспериментах, поставленных на. мышах линии СВА, проведено сравнительное изучение влияния эпиталона и вилона на свободнорадикальные процессы. Наиболее отчетливое антиоксидантное действие было выявлено у эпиталона; на фоне повышенного уровня образования АФК в сыворотке крови оно было сопоставимо по величине с ингибирующим действием мелатонина, являющимся эффективным природным антиоксидантом, вырабатываемым эпифизом. Наряду с этим, под влиянием эпиталона и мелатонина наблюдалось заметное повышение ОАА. Эпиталон, также как и мелатонин, проявлял тенденцию к уменьшению образования АФК в головном мозгу и при этом значительно повышал ОАА. Вилон не действовал на уровень образования АФК в сыворотке крови, печени и ткани головного мозга. Эпиталон не оказывал заметного влияния на образование АФК и уровень ОАА в печени, не влиял на интенсивность ПОЛ в сыворотке крови, но был эффективен качестве ингибитора ПОЛ в головном мозгу и печени мышей. Применение вилона ни в одном случаев не вызывало статистически достоверных изменений в уровне содержания продуктов ПОЛ и показателей антиоксидантной системы. Мелатонин же всегда вызывал ингибирование процесса ПОЛ. Под влиянием исследуемых пептидов, а также мелатонина не было выявлено каких-либо изменений в активности СОД, хотя при определении ОАА наблюдалось ее повышение в сыворотке крови и головном мозгу при хроническом воздействии на мышей эпиталона и мелатонина.

Таким образом, введение эпиталона, в отличие от вилона, приводит к заметному снижению интенсивности свободнорадикальных процессов в крови и тканях мышей CBA. Преимущественное влияние эпиталона на начальные этапы ПОЛ (уровень ДК) в печени и сыворотке крови и, напротив, его терминальную стадию (уровень ШО) в головном мозгу может быть обусловлено влиянием тетрапептида на процесс взаимодействия образующихся из ДК бифункциональных продуктов ПОЛ типа малонового диацетальдегида с низко- или высокомолекулярными соединениями, содержащими свободные аминогруппы (фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин, нуклеотиды и прежде всего аминокислоты, пептиды и белки).

Влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в условиях действия экстремальных факторов (гипокинезия, гипоксия).

Гипокинезия вследствие ограничения общей двигательной активности является фактором, способствующим преждевременному старению и одним из основных симптомов ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний, в частности паркинсонизма [Charlton C., Crowell B., 1995].

Результаты проведенных нами исследований показали, что 24-часовая гипокинезия вызывала у крыс прирост светосуммы ХЛ плазмы крови с одновременным достоверным увеличением суммарной пероксидазной активности крови, что указывает на начальные стадии активации ПОЛ. В коре головного мозга при этом показатели ХЛ снижались, что, вероятно, свидетельствует о достаточной мощности антиоксидантных систем мозга на данном этапе этого довольно сильного стрессорного воздействия. Вместе с тем, гипокинезия приводила к интенсификации ПОЛ мозгу, о чем можно судить по увеличению содержания малонового диацетальдегида (МДА).

Предварительное введение крысам перед началом сеанса гипокинезии эпиталона, приводило к достоверному снижению показателей ХЛ и суммарной пероксидазной активности (СПА) в плазме крови. При этом наблюдалось некоторое снижение уровня внеэритроцитарного гемоглобина и заметное повышение содержания церулоплазмина, а также активности СОД в гемолизате эритроцитов. Наряду с этим, при введении эпиталона наблюдалось снижение СПА, уровня содержания МДА, показателей ХЛ и повышение активности СОД в растворимой фракции коры головного мозга, по сравнению с показателями при стрессе.

Церулоплазмин является одним из важнейших компонентов антиоксидантной системы крови, который, помимо окисления Fe2+,обладает супероксиддисмутазной активностью и способностью нейтрализовать наиболее реакционноспособные гидроксильные радикалы [Погосян Г.Г., Налбандян Р.М., 1983; Бобырев В.Н. и соавт., 1994; Atanasiu et al., 1998].

Предварительное введение крысам вилона приводило к сходным по направленности действия, но гораздо менее выраженным по сравнению с эпиталоном, изменениям в регуляции свободнорадикальных процессов при гипокинезии. Он был менее эффективен в отношении показателей ХЛ в плазме крови и коре мозга, несколько повышал уровень внеэритроцитарного гемоглобина, почти не влиял на активность СОД в гемолизате эритроцитов и коре головного мозга. При этом он также как эпиталон снижал уровень СПА и МДА в коре головного мозга и повышал активность церулоплазмина в плазме крови.

В следующей серии экспериментов нами было исследовано влияние гипоксии на интенсивность свободнорадикальных процессов крови и коре мозга половозрелых крыс. Гипоксия включает в себя весь комплекс процессов в организме, обусловленных кислородной недостаточностью. Она является неотъемлемым элементом стрессорного действия гипокинезии, физического перенапряжения и служит одной из важных причин развития возрастной патологии (атеросклероз, ишемические поражения сердца и мозга, болезнь Альцгеймера и т.д.) [Лысенко А.В. и соавт., 2005].

Проведенными нами исследованиями установлено, что в условиях гипоксии в плазме крови и коре головного мозга показатели ХЛ, за исключением величины светосуммы ХЛ в мозгу, заметно возрастали, при этом уровень содержания МДА в мозгу почти не изменялся. Не претерпевал также достоверных изменений уровень СПА в плазме крови и мозгу при гипоксии. Введение эпиталона перед сеансом гипоксии способствовало нормализации показателей ХЛ в плазме крови и коре мозга и несколько снижало уровень содержания МДА в мозгу, что было статистически достоверно по отношению к интактным животным. Под влиянием эпиталона происходило также снижение уровня СПА как в плазме крови, так и коре мозга крыс, подвергнутых воздействию гипоксии.

Предварительное введение вилона подопытным животным вызывало аналогичные, но менее наглядные, по сравнению с эпиталоном, изменения исследуемых показателей свободнорадикального окисления.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства вилона при воздействии гипокинезии и гипоксии проявлялись гораздо слабее, чем у эпиталона. Известно, что при воздействии стрессорных факторов на организм происходит активация функции эпифиза, что можно отнести к защитным антистрессовым механизмам, поскольку вырабатываемый им мелатонин, будучи мощным эндогенным антиоксидантом, обладает разнообразными нейропротекторными свойствами [Хавинсон В.Х. и соавт., 2003]. В связи с этим полученные нами данные об антиоксидантных эффектах эпиталона представляют значительный интерес, поскольку предполагают, что при острой гипоксии в антистрессовой защите нервной системы и всего организма участвуют также пептиды эпифиза [Заморский Н.И., Пишак В.П., 2000].

Оценка антиоксидантной активности и мембранопротекторных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах in vitro.

Исследование прямой антиоксидантной активности коротких пептидов

Результаты анализа антирадикальной активности исследуемых коротких пептидов (эпиталон, вилон, везуген и пинеалон) показали, что ни одно из исследуемых, соединений в диапазоне концентраций 0,5 - 1 мМ, за исключением эпиталона, не обладает способностью взаимодействовать с ДФПГ-радикалом. Между тем N - ацетилцистеин (NАС) уменьшает оптическую плотность проб, содержащих ДФПГ, проявляя сильное антиоксидантное действие уже в концентрации 0,25 мМ. Карнозин в этой системе выступает как слабый антиоксидант. Действие эпиталона проявляется еще слабее, по сравнению с карнозином. Везуген и пинеалон даже несколько увеличивают оптическую плотность проб, что может служить косвенным указанием на возможность их взаимодействия с ДФПГ с образованием промежуточных продуктов. Условно эта способность, наиболее заметная в случае везугена, может быть названа «прооксидантной», природа которой остается неизвестной.

Действие коротких пептидов на Fe2+-индуцированное окисление липопротеинов крови и скорость осмотического гемолиза эритроцитов

Внесение FeSO4 в кювету, содержащую фракцию липопротеинов, инициирует быструю вспышку хемилюминесценции (ХЛ), пропорциональную количеству предобразованных гидроперекисей липидов (h), ее величина уменьшается в присутствии антиоксидантов, способных взаимодействовать с гидроперекисями (Рис. 1). Последующая лаг-фаза () характеризует собственный антиоксидантный потенциал системы (АОП), который исчерпывается по мере превращения двухвалентного железа в трехвалентное. После истощения собственного АОП вспыхивает волна хемилюминесценции, и скорость этого процесса отражает скорость окисления липидного материала [Vladimirov Yu., 1991]. Величина латентного периода тем больше, чем выше АОП системы. При этом, как правило, более высокий АОП коррелирует с более низкой скоростью окисления [Федорова Т.Н. и др., 1996].

...