Размещено на http: //www. allbest. ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

- аллергология и иммунология

- гистология, цитология, клеточная биология

Антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции

Николаева Марина Аркадьевна

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Федерального государственного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научный консультант:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Г.Т.Сухих

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.А. Стенина ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА

доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило ГУ «Медико-генетический научный центр РАМН»

доктор биологических наук, профессор Л.А. Захарова Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

Ведущая организация:

Государственный Научный Центр «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится « 24 » октября 2007 г. в 14.00 часов

на заседании диссертационного совета Д 208.072.05

при Российском государственном медицинском университете

по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан « 29 » июля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

1. Актуальность работы

Иммунорегуляция процессов гаметогенеза, оплодотворения и беременности играет важную роль при репродукции человека. Основной функцией иммунной системы является защита организма путем распознавания «своего» и «несвоего» (чужого). Препятствуя развитию инфекций и раковых опухолей и обеспечивая отторжение чужеродных тканей, иммунная система парадоксальным образом «не замечает» уникальных антигенов сперматозоидов, продукция которых начинается в пубертатный период, когда толерантность к «своему» уже давно сформирована, не противодействует проникновению генетически чужеродных сперматозоидов в организм женщины и дальнейшему развитию полуаллогенного плода. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что отсутствие иммунного конфликта при нормальном функционировании репродуктивных органов является результатом сбалансированного динамического взаимодействия иммунной и репродуктивной систем. Однако механизмы, обеспечивающие иммунологическую регуляцию репродуктивной функции человека, до сих пор во многом остаются невыясненными. Очевидно, что изучение взаимодействия иммунной и репродуктивной систем имеет большое теоретическое значение для понимания иммунологических закономерностей, а также несомненное клиническое значение для иммунодиагностики и эффективной коррекции различных нарушений репродукции человека.

До сих пор не существует единого мнения о роли гуморального иммунитета при репродукции. Возможность продукции антител к сперматозоидам - антиспермальных антител (АСАТ) - была показана в конце XIX века в работах К. Ландштайнера (Landsteiner K., 1899) и И.И. Мечникова (Metchnikoff E., 1899). В последующих публикациях, посвященных выявлению АСАТ, было постулировано существование иммунологического бесплодия, обусловленного наличием аутоантител к антигенам сперматозоидов в сыворотке и секретах репродуктивного тракта мужчин (Rumke P. and Hellinger G., 1959) и изоантител у женщин (Franklin R.R. and Dukes C.D. 1964). С тех пор значение АСАТ в генезе бесплодия интенсивно исследуется, но до сих пор остается невыясненным вопрос о том, является ли присутствие АСАТ в сыворотках женщин до наступления беременности, при беременности и после беременности физиологическим или патофизиологическим фактором. Для выявления АСАТ используется широкий спектр методов, приводящих зачастую к противоположным выводам.

С помощью методов спермоагглютинации (Franklin R.R. and Duckes C.D., 1964), спермоиммобилизации (Isojima S. et al., 1968), MAR (mixed agglutination reaction) - теста (Jager S. et al., 1978), иммуноферментного анализа (Zanchetta R. et al., 1982) и IBT (immunobead) - теста (Bronson R.A. et al, 1984) получены данные об отсутствии или низком уровне АСАТ в сыворотке фертильных женщин; в то же время данные иммунофлуоресценции (Tung K.S. et al., 1976) и иммуноблоттинга (Shetty J. et al., 1999, Domagala A. and Kurpisz M., 2004) подтверждают присутствие АСАТ в сыворотках фертильных мужчин и женщин. В обзоре, посвященном проблеме антиспермального иммунитета (Helmerhorst F.M. et al., 1999), авторы делают вывод о методическом кризисе, связанном с выявлением АСАТ. Там же подчеркивается, что «на данный момент отсутствует стандартный единый метод выявления АСАТ, отсутствуют общепринятые представления о клинической значимости АСАТ, отсутствуют доказательства влияния АСАТ на процессы репродукции, невозможно использовать предлагаемые рутинные методы выявления АСАТ в качестве тестов для диагностики иммунного бесплодия»

Очевидно, что в основе противоречивых представлений о значении антиспермального иммунитета лежит проблема адекватности методов, используемых для выявления АСАТ.

Методология изучения влияния антиспермального иммунитета на процессы репродукции включает в себя также сравнение функций АСАТ-негативных и АСАТ-позитивных сперматозоидов.

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида через оболочку яйцеклетки, является акросомная реакция (АР) - рецептор-опосредованная активация и высвобождение протеолитических ферментов (Yanagimachi R., 1988). Данные о влиянии АСАТ на АР противоречивы: в одних исследованиях показано ингибирование АР при наличии АСАТ (Benoff S. et al.,1993), в работах других авторов выявлена стимуляция преждевременной, спонтанной АР (Lansford B. et al., 1990, Harrison S. et al., 1998, Bohring C. et al., 2001).

Противоречивые представления о функциях АСАТ-позитивных сперматозоидов могут быть также обусловлены субъективным характером методов, используемых для оценки этих функций. Так для оценки акросомного статуса используется трудоемкий и субъективный метод флуоресцентной микроскопии.

Очевидно, что для формирования современных представлений о влиянии антиспермального иммунитета на репродуктивную функцию человека необходима разработка новых адекватных методов выявления АСАТ в различных биологических жидкостях бесплодных и фертильных пациентов, а также создание объективных методов оценки влияния АСАТ на оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Цель работы

Характеристика иммунных реакций на антигены сперматозоидов в норме и при нарушениях репродуктивной функции у мужчин и женщин с помощью новых объективных количественных способов выявления антиспермальных антител и оценки функций сперматозоидов.

Задачи исследования

1. Разработка объективного количественного способа выявления антител к антигенам сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии.

2. Количественная оценка уровня антител к антигенам сперматозоидов в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта у фертильных и бесплодных мужчин и женщин.

3. Разработка объективного способа оценки акросомной реакции сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии.

4. Оценка влияния антиспермальных антител на функции сперматозоидов - скорость движения, генерацию активных форм кислорода, акросомную реакцию. антитело сперматозоид репродуктивный иммунитет

5. Выявление зависимости уровня антиспермальных антител от состояния клеточного звена иммунитета у мужчин и женщин.

Научная новизна исследования

Впервые предложен объективный количественный способ выявления антиспермальных антител классов G, A и М на поверхности живых сперматозоидов, присутствующих в эякуляте, а также после инкубации сперматозоидов в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта мужчин и женщин.

Продемонстрировано существование в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта бесплодных мужчин и женщин АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся на поверхности живых сперматозоидов лишь в определенном температурном диапазоне.

Установлено, что количество АСАТ на поверхности клеток зависит от интенсивности клеточных реакций, сопровождающих связывание АСАТ с поверхностными антигенами сперматозоидов, что является причиной низкой чувствительности выявления антител в биологических жидкостях с помощью метода проточной цитофлуорометрии (ПЦМ).

Впервые установлено, что присутствующие в сыворотках крови как фертильных, так и бесплодных мужчин и женщин антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), взаимодействуют с антигенами сперматозоидов.

Впервые в сыворотках крови фертильных мужчин и женщин и в семенной жидкости выявлена высокая активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов. Установлено, что низкая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 в сыворотке крови и семенной жидкости мужчин и в сыворотке крови небеременных женщин является маркером нарушений репродуктивной функции.

Обнаружено, что увеличение антигенсвязывающей активности антител к БТШ90, присутствующих в периферической крови женщин, связано с началом половой жизни.

Впервые выявлена зависимость между активностью связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов и состоянием клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, представленного регуляторными гд Т- лимфоцитами.

Впервые разработан объективный количественный способ оценки акросомного статуса сперматозоидов с помощью окрашивания гамет лектинами Pisum sativum (P.sativum), меченным флуоресцеин- изотиоцианатом, и Аrachis hypogaea (A.hypogaea), меченным тетраметилродамин-изотиоцианатом, и последующего анализа методом ПЦМ.

Впервые показано, что преждевременная активация сперматозоидов, происходящая при связывании АСАТ с поверхностью клеток, является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции.

Практическая значимость работы

Разработаны диагностические критерии для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, основанные на количественном выявлении антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта с помощью ПЦМ.

Установлено, что оценка активности связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов является прогностическим показателем при выявлении иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, а также при диагностике угрозы прерывания беременности.

Разработаны диагностические критерии для выявления бесплодия, обусловленного нарушениями функций сперматозоидов, основанные на количественной оценке спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции с помощью ПЦМ.

Реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в программу лекций кафедры лабораторной диагностики ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 4 Всесоюзном симпозиуме «Иммунология репродукции» (Киев, 1990), VII Всемирном конгрессе по иммунологии репродукции человека (Хельсинки, Финляндия, 1990), 7 Всемирном конгрессе по цервикальной патологии и кольпоскопии (Италия, Рим, 1990), Республиканской научной конференции по иммунологии репродукции (Иваново, 1993), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (1993, Киев), конференции «Иммунологический мониторинг и иммунореабилитация» (Москва, 1995), 11 международном конгрессе по андрологии (Анкара, Турция, 1995), Международном симпозиуме по акросомной реакции сперматозоидов (Коллюр, Франция, 1995), 3 международном форуме по репродуктивной иммунологии (Берлин, Германия, 1996), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1996), Международном симпозиуме по мужскому бесплодию и репродуктивным технологиям (Генк, Бельгия, 1998), 8 Международном симпозиуме по сперматологии (Монреаль, Канада, 1998), европейском симпозиуме по иммунологии репродукции (Рим, Италия, 1999), 1 международной конференции «Хроноструктура и хроноэкология» (Москва, 2000), II Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2000), Второй международной конференции по экспериментальной и клинической репродуктивной иммунобиологии (Амстердам, Нидерланды, 2000), XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (С.-Петербург, 2003), Всероссийской конференции «Мужское здоровье» (Москва, 2003), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2005" (Москва, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2005" (Москва, 2005), IX Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007), 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Сочи, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Присутствие антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта у мужчин и у женщин вне беременности, выявляемых с помощью метода проточной цитофлуорометрии, является маркером нарушения репродуктивной функции. Антиспермальные антитела гетерогенны по изотипу, температурному оптимуму связывания с антигенами и механизмам влияния на функции сперматозоидов.

2. Преждевременная активация сперматозоидов при образовании поверхностных комплексов антиспермальных антител с антигенами является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции. При активации сперматозоидов меняется траектория движения сперматозоидов, усиливается генерация свободных радикалов кислорода, увеличивается вероятность преждевременной акросомной реакции и снижается вероятность оплодотворения.

3. Маркером толерантности иммунной системы фертильных мужчин и женщин к антигенам сперматозоидов является высокая активность связывания антител к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90) с антигенами сперматозоидов, выявляемая в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта. Антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 отражает состояние антиспермального иммунитета и регуляторного клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, являясь прогностическим показателем при выявлении нарушений репродуктивной функции.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 298 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, 4 глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 425 источников. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

2. Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (руководитель лаборатории академик РАМН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т.). Комплексное клинико-лабораторное обследование пациентов, состоящих в бесплодном браке, проводилось совместно с отделением восстановления и сохранения репродуктивной функции НЦ АГиП (рукводитель д.м.н., профессор Назаренко Т.А.).

В группу с иммунным фактором бесплодия включали мужчин (n=395) или женщин (n=182), в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта которых были обнаружены антиспермальные антитела. Выявление антиспермальных антител проводили с помощью MAR-теста (Ferti Pro N.V., Бельгия) стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Позитивными значениями MAR-теста считали значения MAR%?50% (Руководство ВОЗ, 1999).

В группу с бесплодием неясного генеза были включены мужчины (n=123) с нормозооспермией и отсутствием в анамнезе сексуально-передаваемых инфекций, хирургических вмешательств, травм половых органов, орхитов и варикоцеле. Бесплодие неясного генеза у женщин (n=123) было подтверждено с помощью клинико-лабораторного исследования, включавшего тесты функциональной диагностики, проведение лапароскопии, гистероскопии, исследования уровня гормонов, посткоитального теста, ультразвукового исследования.

Контрольную группу составили 30 супружеских пар, имеющих детей, обратившихся для подбора метода контрацепции. Женщины, включенные в контрольную группу, в течение последних 12 месяцев с момента обращения имели беременность. Клинико-лабораторное обследование девушек проводилось совместно с отделением детской гинекологии НЦ АГиП (руководитель профессор, д.м.н. Уварова Е.В.). Клинико-лабораторное обследование пациенток с привычным невынашиванием беременности (n=25) проводилось совместно с лабораторией клинической иммунологии ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (зав. лабораторией - заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю.).

Материалом для непосредственного исследования служили гепаринизированная кровь и сыворотка крови из кубитальной вены, цервикальная слизь, эякулят.

Классификация спермограмм выполнялась согласно стандартному протоколу ВОЗ (Руководство ВОЗ, 1999).

Выявление АСАТ на поверхности сперматозоидов или латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов, проводили на проточных цитофлуориметрах FACScan и FACSCalibur (Becton Dickinson, США), Bryte (Bio-Rad, США), анализируя в каждой пробе по 5000 клеток или латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов.

Для выявления локализации АСАТ на поверхности сперматозоидов. применялся метод флуоресцентной микроскопии. Образцы анализировались с помощью микроскопа фирмы Leitz Laborlux S ( Leica, Germany) при увеличении Ч 400.

Для оценки влияния АСАТ, присутствующих в сыворотке крови, на подвижность сперматозоидов в присутствии комплемента использовали тест спермоиммобилизации (Isojima S. et al., 1968). Индекс спермо-иммобилизации (ИСИ) вычисляли, как отношение процента подвижных сперматозоидов в образце, не содержащем комплемент, к этому показателю в образце с комплементом.

Компьютерный анализ спермы (Computer Assisted Semen Analysis, CASA) проводился совместно с отделением вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Кузьмичев Л.Н.). С помощью анализатора Hamilton Thorn (США) оценивали подвижность сперматозоидов (процент быстро-, средне-, медленно-подвижных и неподвижных сперматозоидов) и скорости движения сперматозоидов по различным траекториям: VCL (curvilinear velocity) - трековая скорость (мкм/сек); VAP (average path velocity) - путевая скорость (мкм/сек); VSL (straight-line velocity) - прямолинейная скорость (мкм/сек).

Измерение уровня генерации свободных радикалов кислорода (СРК) в эякуляте проводили методом хемилюминесценции, используя люминометр LKB-Wallac 1256 (Финляндия). К суспензии клеток добавляли люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион). Оценивали максимальное значение люминисценции, которое наблюдалось через 2-10 минут после добавления люминола. Уровень генерации СРК выражали в мВ/сек.

Лимфоциты периферической крови получали с использованием среды ля выделения лимфоцитов Lymphosep (ICN, USA). Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток определяли с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson, США), меченных флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином. Процедуру окрашивания клеток и последующий анализ методом ПЦМ проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика.

Для получения однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов половых партнеров лимфоциты мужчин предварительно обрабатывали митомицином С (Sigma, США). Клетки культивировали в течение 5 суток и оценивали интенсивность пролиферации колориметрическим методом с использованием бромистого метилтиазолилтетразолия (Кравченко И.Н. с соавт., 1992). Оптическую плотность измеряли при 550 нм на планшетном фотометре (Bio-Rad, США). Пролиферативную реакцию лимфоцитов женщины оценивали как отношение оптической плотности в смешанной культуре к показателям оптической плотности монокультур лимфоцитов половых партнеров.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ «Microsoft» и «MedCalc». Для определения достоверности различий значений в двух группах использовались параметрический парный критерий Стьюдента (при нормальном распределении) и непараметрические критерии - Манна-Уитни или Вилкоксона. При определении зависимостей между показателями был использован коэффициент корреляции Пирсона или Спирмена. В качестве критерия достоверности различий принимали уровень значимости p<0,05. Чувствительность и специфичность методов оценивали с промощью построения характеристической кривой (Receiving Operated Curve) c помощью статистической программы «MedCalc» (Zweig M.H. and Campbell G., 1993).

Результаты работы и их обсуждение

Методом, рекомендованным ВОЗ для выявления антиспермальных антител (АСАТ), является МАR (mixed agglutination reaction) - тест (Руководство ВОЗ, 1999). В основе теста лежит связывание Fc-фрагментов иммуноглобулинов (Ig) класса G (IgG), сорбированных на поверхности латексных частиц, и Fc-фрагментов IgG на мембране сперматозоидов антисывороткой к Fc-фрагменту IgG человека. Мы предположили, что тот же принцип может быть использован для выявления АСАТ методом проточной цитометрии (ПЦМ), который, в отличие от MAR-теста, позволит не только выявлять различные классы иммуноглобулинов, связанные с поверхностными антигенами сперматозоидов, но и оценивать количество антител на поверхности сперматозоидов.

Для выявления АСАТ на поверхности сперматозоидов с помощью ПЦМ клетки инкубировали с мышиными антителами к IgG, IgA и IgM человека (Sigma, США), а затем с ФИТЦ-мечеными антителами к Fc_фрагменту мышиных иммуноглобулинов. С помощью «окна дискриминации» на двухпараметрической цитограмме распределения клеток по прямому и угловому светорассеянию из анализа исключали разрушенные клетки и агглютинаты. Мертвые клетки исключали из анализа, используя окрашивание иодидом пропидия - флуоресцентным красителем, проникающим только в клетки с поврежденной мембраной (Evenson D.P. et al., 1982), и анализировали только живые клетки (рис. 1Б, субпопуляции а,б). Активность связывания АСАТ с поверхностными антигенами характеризовали, оценивая процент живых сперматозоидов, покрытых АСАТ (рис. 1Б, субпопуляция б), и количество АСАТ, связанных с поверхностью сперматозоидов.



Рис. 1 Результаты выявления АСАТ, представленных IgG, на поверхности (А) MAR-негативных (MAR%=0%) и (Б) MAR-позитивных (MAR%=100%) сперматозоидов методом проточной цитофлуорометрии. (а) - субпопуляция живых АСАТ-негативных сперматозоидов; (б) - субпопуляция живых АСАТ-позитивных сперматозоидов; (в) - субпопуляция мертвых сперматозоидов

Для характеристики количества АСАТ использовали среднюю интенсивность зеленой флуоресценции АСАТ-позитивных сперматозоидов, выраженную в условных единицах флуоресценции (УЕФ).

При сравнении результатов выявления АСАТ, представленных IgG (АСАТ IgG), на поверхности живых сперматозоидов бесплодных пациентов с помощью MAR-теста и ПЦМ-теста была выявлена положительная корреляция (рис.2А). Чувствительность и специфичность ПЦМ теста при выявлении MAR-позитивных образцов (MAR% ? 50%) составляла 89% и 86%, соответственно, при очень низком пороговом значении ПЦМ% (>3%).



Рис. 2 Зависимость между результатами выявления АСАТ на поверхности живых сперматозоидов бесплодных пациентов с помощью MAR-теста и ПЦМ-теста. (А) MAR% варьировал от 0% до 100%; (Б) MAR%=100%

При анализе MAR-позитивных образцов спермы, где все сперматозоиды были покрыты АСАТ (MAR%=100%, n=53), с помощью ПЦМ выявлялось лишь 37±28% сперматозоидов, покрытых АСАТ IgG(рис.2Б).

Хотя при выявлении АСАТ IgG в сыворотке крови мужчин (n=20) чувствительность и специфичность ПЦМ-теста по сравнению с МAR-тестом составили 100% при пороговом значении ПЦМ%>15%, процент АСАТ-позитивных сперматозоидов, выявляемых с помощью ПЦМ в образцах, где все сперматозоиды были покрыты АСАТ IgG (MAR%=100%), варьировал от 45% до 93%. При выявлении АСАТ IgG в сыворотке крови женщин (n=24) также была выявлена сниженная чувствительность (64%) и высокая специфичность(100%) ПЦМ-теста при пороговом значении ПЦМ% >49%.

Была проведена оценка диагностической значимости выявления АСАТ, представленных различными классами иммуноглобулинов, в секретах репродуктивного тракта мужчин и женщин.

Для оценки чувствительности и специфичности ПЦМ-теста для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин сравнивали результаты выявления АСАТ в эякуляте пациентов с иммунным фактором бесплодия (MAR%>50%, n =81) и у фертильных пациентов (MAR%?8, n=13) (рис.3).

Рис. 3 Выявление АСАТ IgA, IgG и IgM на поверхности сперматозоидов фертильных мужчин (1) и мужчин с иммунным фактором бесплодия (2)

Чувствительность и специфичность выявления иммунного фактора бесплодия с помощью ПЦМ составила при выявлении АСАТ IgG (ПЦМ%> 13%) 64% и 92%, при выявлении АСАТ IgА (ПЦМ%>3%) 96% и 100%, и при выявлении АСАТ IgM (ПЦМ%>8) 42% и 92%, соответственно. Наблюдалась слабая зависимость между присутствием АСАТ IgG и IgM (r=0,44, р = 0,0001), АСАТ IgА и IgG (r=0,38, р = 0,0001) и АСАТ IgA и IgM (r=0.29, р = 0,007). У пациентов с иммунным фактором бесплодия чаще всего на поверхности сперматозоидов выявлялись АСАТ IgA (96%) , причем в в 33% присутствовали АСАТ IgG, IgA и IgM , в 30% случаев выявлялись АСАТ IgG и IgA, в 7% - АСАТ IgA и IgM, а в 26% образцов выявлялись только АСАТ IgA. Антитела класса G выявлялись лишь у 1% пациентов. Была выявлена положительная корреляция между результатами выявления АСАТ IgG в эякуляте и сыворотке с помощью ПЦМ-теста (r=0,62, р=0,007, n=20) и MAR-теста (r=0,89, р=0,001, n=20).

При использовании полученных критериев был выявлен иммунный фактор бесплодия у 17% (13/76) мужчин с бесплодием неясного генеза, причем в 11 случаях (15%) выявлялись АСАТ IgG и IgA, у 1 пациента (1%) выявлялись только AСАТ IgG, и у одного пациента (1%) были выявлены АСАТ IgM.

Особое диагностическое значение могло иметь использование ПЦМ-теста для выявления АСАТ в цервикальной слизи, так как в этом случае MAR-тест не может быть использован из-за высокой вязкости цервикальной слизи, а с помощью метода спермоиммобилизации не могут быть выявлены АСАТ класса A, так как IgA не фиксируют комплемент.

На рисунке 4 представлены результаты выявления АСАТ в цервикальной слизи пациенток с бесплодием неясного генеза (n=36)и фертильных женщин (n=10). Чувствительность и специфичность выявления иммунного фактора бесплодия у женщин с бесплодием неясного генеза составила при выявлении АСАТ IgG (диагностически значимый уровень ПЦМ%>14%) 22% и 100%, при выявлении АСАТ IgА (ПЦМ%>11%) 33% и 90%, и при выявлении АСАТ IgM (ПЦМ%>3%) 13% и 80%, соответственно. Таким образом, выявление АСАТ в цервикальной слизи обладает большой диагностической значимостью - у 14 из 36 (39%) пациенток с бесплодием неясного генеза уровень хотя бы одного из трех классов АСАТ превышал диагностически значимый и, таким образом, диагностировался иммунный фактор бесплодия.

Чаще всего в цервикальной слизи пациенток с иммунным фактором бесплодия выявлялись АСАТ IgA (86%), причем в 14 % присутствовали IgG, IgA и IgM АСАТ, в 43 % случаев выявлялись IgG и IgA АСАТ, а в 29% образцов выявлялись только IgA АСАТ. Были обнаружены также образцы, в которых выявлялись только АСАТ IgM (14%).

Не было выявлено зависимости между содержанием АСАТ IgG и АСАТ IgA как в цервикальной слизи, так и в сыворотке женщин.

Рис. 4 Выявление АСАТ IgA, IgG и IgM в цервикальной слизи фертильных женщин (n=10, светлые столбики) и женщин с бесплодием неясного генеза (n=37, темные столбики)

Очевидные преимущества ПЦМ-теста по сравнению с MAR-тестом - объективность, возможность анализа большого числа образцов при использовании даже слабо подвижных или неподвижных сперматозоидов, выявление АСАТ классов A, G и M - позволяют использовать предложенный способ для диагностики иммунного фактора бесплодия.

В то же время была обнаружена низкая чувствительность выявления АСАТ IgG с помощью ПЦМ-теста по сравнению с MAR-тестом. Поэтому следующим этапом исследования явился анализ возможных причин получения ложно-негативных результатов ПЦМ-теста.

Было установлено, что в процессе выявления АСАТ при использовании поливалентных антител может происходить агрегация и сбрасывание - шеддинг (англ. shedding- сбрасывание) комплексов антиген-антитело в окружающую среду, и, таким образом, количество связавшихся с поверхностью АСАТ и количество АСАТ, оставшихся на поверхности сперматозоидов, выявляемое методом ПЦМ, могут различаться в десятки раз (Nikolaeva M.A. et al., 2000). Интенсивность шеддинга зависела от множества факторов: особенностей метаболизма сперматозоидов, условий проведения анализа, концентрации АСАТ и вторых антител. При определенных условиях наблюдалось полное удаление комплексов антиген-антитело с поверхности клеток.

Шеддинг иммунных комплексов наблюдался и при использовании моноклональных антител 4Е3 и 1Е10 к поверхностному антигену сперматозоидов - тестикулярной изоформе ангиотензин-превращающего фермента (тАПФ) (Nikolaeva M.A. et al., 2006).

Высокая вероятность агрегации и шеддинга поверхностных комплексов антиген-антитело ограничивает возможность использования ПЦМ для количественного выявления АСАТ. Очевидно, что большое значение приобретает поиск способов ингибирования этих процессов. Стандартные способы блокирования агрегации, обычно применяемые для других типов клеток, такие, как низкая температура, использование азида натрия и цитохалазина В, не приводили к ингибированию агрегации и шеддинга комплексов антиген-антитело с поверхности сперматозоидов в MAR-позитивных образцах. Более того, выявление АСАТ при низкой температуре (4°С) более чем в 5 раз снижало количество АСАТ на поверхности клеток (р<0,0005) по сравнению с количеством АСАТ, выявляемым при 23°С. Однако неожиданно при 4°С были выявлены АСАТ на поверхности живых сперматозоидов в MAR-негативных образцах спермы пациентов c бесплодием неясного генеза (рис.5). Бесплодие, обусловленное присутствием АСАТ, выявляемых при 4°С, диагностировалось среди пациентов с бесплодием неясного генеза с чувствительностью 20% и специфичностью 100% при ПЦМ%>15%. Таким образом, было впервые продемонстрировано существование АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся лишь в определенном температурном диапазоне.

В целом, частота выявления иммунного фактора бесплодия в группе пациентов с бесплодием неясного генеза составила 37% _ у 17% пациентов на поверхности сперматозоидов выявлялись тепловые АСАТ, а в 20% случаев _ холодовые АСАТ.

Рис. 5 Выявление АСАТ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров (n=13), пациентов с иммунным фактором бесплодия (MAR=100%, n=10) и с бесплодием неясного генеза (MAR%=0%, n= 79) c помощью ПЦМ при 4°С

Было установлено, что выявление тепловых АСАТ на поверхности клеток возможно лишь в том случае, если оба Fab_фрагмента IgG связываются с антигенами. Маркером «сшивки» антигенов бивалентными антителами является агрегация поверхностных иммунных комплексов - двухмерный аналог процесса преципитации. Как MAR-тест, так и ПЦМ-тест могут эффективно выявлять тепловые АСАТ лишь при условии эквивалентности концентраций антигенов и антител. Холодовые АСАТ выявлялись при 4°С и проявляли так называемую функциональную моновалентность, когда лишь один Fab_фрагмент был связан с поверхностным антигеном. При этом агрегация поверхностных комплексов отсутствовала - на поверхности головки сперматозоидов MAR-негативных образцов спермы, содержащих холодовые АСАТ, с помощью флуоресцентной микроскопии выявлялось гомогенное распределение флуоресценции.

Следующим этапом исследования явилось выяснение механизмов клеточных реакций на образование поверхностных иммунных комплексов и поиск способов их блокирования. Очевидно, что изучение механизмов влияния АСАТ на функциональную активность сперматозоидов необходимо как для оптимизации выявления АСАТ, так и для понимания патогенетической роли АСАТ при бесплодии и выбора адекватных методов коррекции бесплодия, обусловленного иммунными факторами.

Оценивали влияние АСАТ на функции сперматозоидов - скорость движения, генерацию активных форм кислорода, акросомную реакцию. Не было выявлено зависимости между присутствием тепловых и холодовых АСАТ на поверхности сперматозоидов нативной спермы и процентом активно-подвижных сперматозоидов в эякуляте. Спермоиммобилизирующая активность сывороток крови женщин с бесплодием неясного генеза, содержащих тепловые АСАТ (MAR%=100%, n=9) была существенно ниже, чем активность сывороток, содержащих холодовые АСАТ (MAR%=0%, ПЦМ%>25%, n=6) - индекс спермоиммобилизации (ИСИ) составил 1,4±0,5 и 8,1±6,1, соответственно (р<0,005). Спермоиммобилизирующей активности АСАТ-негативных сывороток пациенток с бесплодием неясного генеза (n=20) и сывороток фертильных женщин (n=10) выявлено не было (ИСИ?1,0).

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида в яйцеклетку, является акросомная реакция (АР) - рецепторно-опосредованный экзоцитоз ферментов, разрушающих прозрачную оболочку яйцеклетки (zona pellucida) (Yanagimachi R., 1988). В норме АР происходит при связывании сперматозоида с оболочкой яйцеклетки. Существуют два основных типа нарушений, препятствующих оплодотворению и приводящих к бесплодию, - спонтанная АР, которая происходит еще до взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки, и отсутствие индукции АР при связывании сперматозоида с zona pellucida. Показана возможность диагностики бесплодия с помощью определения процента сперматозоидов с завершенной АР после индукции АР ионофором А23187 (Tesarik J., 1996). Так как метод флуоресцентной микроскопии, используемый для определения акросомного статуса, трудоемок и субъективен, нами был предложен новый способ оценки АР с помощью ПЦМ.

Для оценки АР сперматозоидов было использовано одновременное окрашивание сперматозоидов двумя лектинами: ФИТЦ-меченым P. Sativum, который связывается с маннозными остатками акрозина, являющегося основным компонентом акросомального матрикса, и ТРИТЦ-меченым A.hypogaea, взаимодействующим с -D-галактозильными остатками, локализованными на наружной акросомальной мембране (Aitken R.J. and Brindle J.P., 1993). Процент спонтанной АР определяли в контрольной пробе, не содержащий ионофор.



Рис. 6 Оценка акросомного статуса сперматозоидов фертильного пациента с помощью ПЦМ. Определение процента (А) спонтанной АР и (Б) АР, индуцированной ионофором А23187, на двухпараметрической цитограмме распределения клеток по интенсивности зеленой и красной флуоресценции

Процент индуцированной АР определяли в пробе, содержащей ионофор А23187. Индуцируемость АР вычисляли как разность между процентом индуцированной и спонтанной АР. Анализируя в каждой пробе по 5000 клеток, определяли процент сперматозоидов с завершенной АР, представленных субпопуляцией клеток со сниженной зеленой и красной флуоресценцией (рис. 6Б).

С помощью предложенного способа было проведено сравнение акросомного статуса активно-подвижных сперматозоидов, полученных из эякулятов бесплодных пациентов, у которых были выявлены тепловые АСАТ (MAR%=100%, n=13) или холодовые АСАТ (ПЦМ%>25%, n=5) на поверхности клеток. В качестве контрольной группы были использованы сперматозоиды фертильных доноров, на поверхности которых ни тепловые, ни холодовые антитела не выявлялись (n=10). Процент спонтанной АР в образцах сперматозоидов, покрытых как тепловыми, так и холодовыми АСАТ, был существенно выше по сравнению с образцами сперматозоидов фертильных доноров (рис.7).

Рис. 7 Уровень спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции и индуцируемости АР в образцах, содержащих (1) АСАТ-негативные сперматозоиды фертильных доноров, (2) сперматозоиды, покрытые холодовыми антителами и (3) сперматозоиды, покрытые тепловыми антителами

Достоверных различий между образцами, содержащими сперматозоиды, покрытые тепловыми и холодовыми АСАТ, выявлено не было. Процент АР, индуцированной ионофором, был значительно ниже в MAR-позитивных образцах (р<0,05) по сравнению с образцами фертильных пациентов. Также выявлено существенное снижение индуцируемости АР в обеих группах бесплодных пациентов по сравнению с фертильными донорами. Был обнаружен парадоксальный ингибирующий эффект ионофора А23187 на спонтанную АР у 54% (7/13) бесплодных пациентов с тепловыми и у 80% (4/5) пациентов с холодовыми антителами.

Проведенное исследование продемонстрировало, что АСАТ к поверхностным антигенам сперматозоидов могут стимулировать АР. Известно, что процессы агрегации поверхностных антигенов сперматозоидов играют ключевую роль в физиологическом протекании АР (Tesarik J. and Mendoza C., 1993; Lassale B. and Testart G., 1996). Возможно, спонтанная АР сперматозоидов, покрытых антителами, также может быть связана с агрегацией иммунных комплексов, происходящей при связывании антител с поверхностными антигенами. Как было показано ранее, агрегация иммунных комплексов является одним из свойств, характерных для MAR-позитивных клеток. Известно, что ионофор А23187 является ингибитором агрегации (Young-Karlan B.R. and Ashman R.F., 1981), и нельзя исключить, что его добавление к сперматозоидам, покрытым антителами, также вызывает ингибирование агрегации иммунных комплексов и блокирует спонтанную АР.

Одним из механизмов индукции АР в присутствии АСАТ может быть усиление продукции свободных радикалов кислорода (СРК). Регулируемый процесс свободнорадикального окисления является важнейшей составляющей метаболизма сперматозоидов, необходимой для капацитации и акросомной реакции, деконденсации хроматина и процессов фертилизации (Aitken R.J. et al., 1998; De Lamirande E. et al., 1998).

С помощью метода хемилюминесценции нами было показано, что максимальный уровень генерации СРК в образцах, содержащих холодовые АСАТ (MAR%=0%, ПЦМ%>25%, n=5), значительно выше, чем в MAR-позитивных образцах (MAR%=100%, n=10) - интенсивность люминесценции составляла 7,6 и 1,2 Мв/106 клеток, соответственно (р<0,03). Генерации СРК в образцах, полученных от фертильных доноров (n=20), не наблюдалось.

Мы предположили, что ингибирование генерации СРК может привести к уменьшению воздействия антител на клеточный метаболизм. В качестве ингибитора перекисного окисления нами был использован N-ацетилцистеин, внутриклеточное деацетилирование которого приводит к образованию тиолового антиоксиданта глутатиона (Mayer M. and Noble M., 1994). Однако ингибирование спонтанной АР в присутствии N-ацетилцистеина наблюдалось лишь в 4 из 10 (40%) МАR-позитивных образцов, содержащих тепловые АСАТ, и в 6 из 12 (50%) MAR-негативных образцов, содержащих холодовые антитела. В остальных случаях присутствие антиоксиданта стимулировало спонтанную АР.

Интенсивность генерации СРК может определять результат воздействия СРК на клетку - приводить либо к активации клетки и АР, либо к повреждению клеточных мембран. Нельзя исключить, что стимуляция АР происходит лишь в узком «коридоре» между активирующим и повреждающим уровнем СРК, так как избыток СРК блокирует индукцию АР (Ichikawa T. et al., 1999). Поэтому снижение генерации СРК может приводить не только к блокированию АР, но и к ее индукции, что согласуется с нашими данными.

Важным фактором, защищающим сперматозоиды от повреждений, является высокая концентрация антиоксидантных ферментов и скэвенджеров СРК в семенной плазме (Lewis S.E., et al., 1997), поэтому нельзя было исключить, что отмывка сперматозоидов от семенной жидкости стимулирует генерацию СРК сперматозоидами, покрытыми антителами, активацию сперматозоидов и акросомную реакцию in vitro.

Были проведены эксперименты, подтвердившие наличие активированных сперматозоидов, покрытых антителами, в нативной сперме, которая не подвергалась экспериментальным манипуляциям. Одним из главных признаков, свидетельствующих об активации клеток, наблюдаемых при физиологической капацитации, является изменение траектории движения клеток. Поэтому были охарактеризованы особенности движения сперматозоидов, покрытых антителами, с помощью компьютерного анализатора спермы. Анализировали фракцию активно-подвижных сперматозоидов, полученных с помощью флотации. В таблице 1 приведены данные о характере движения MAR-негативных сперматозоидов фертильных доноров (MAR%=0%, n=5), а также покрытых тепловыми (MAR%=100%, n=11) и холодовыми (ПЦМ%>25%, n=5) АСАТ сперматозоидов пациентов с иммунным фактором бесплодия и нормальными показателями спермограммыоноров одных пациентов ями спермограммы

Таблица 1 Анализ подвижности сперматозоидов фертильных доноров и покрытых тепловыми или холодовыми АСАТ сперматозоидов бесплодных пациентов (M±SD)

Параметр	Фертильные (MAR%=0%)	Бесплодные (MAR%=100%)	Бесплодные (MAR%=0%, ПЦМ > 25%)	Уровень значимости различий ( Р )
	( n = 5)	( n = 11)	( n = 5)
VSL (мкм/сек)	26,4 ± 6,6a	28,3 ± 8,7	30,2 ± 3,6a	a < 0,04
VCL (мкм/сек)	50,6 ± 11,1 б	61,4 ± 21,1	68,6 ± 11,6 б	б < 0,03
VAP (мкм/сек)	34,0 ± 6,7в	43,0 ± 13,6	42,6 ± 5,4в	в < 0,05
LIN (%)	55,6 ± 6,3 г, д	45,9 ± 8,9 г	42,6 ± 9,3 д	г < 0,05; д < 0,03
STR (%)	78,3 ± 7,1	69,9 ± 12,3	72,7 ± 6,4
ALH (мкм)	3,5 ± 0,7 е, ж	4,7 ± 1,3 е	4,8 ± 0,5 ж	е = 0,07; ж < 0,01

Присутствие АСАТ на поверхности сперматозоидов рассматривается в ряде работ как причина снижения подвижности клеток (Mathur S. et al., 1984), однако различий между группами по содержанию активно-подвижных сперматозоидов нами выявлено не было.

В то же время было продемонстрировано увеличение прогрессивной (VSL), трековой (VCL) и путевой (VAP) скорости сперматозоидов, покрытых холодовыми антителами. При этом наблюдалось снижение линейности движения (LIN) и увеличение амплитуды бокового смещения головки (ALH). Особенностью МAR-позитивных сперматозоидов также являлось снижение линейности движения и тенденция к увеличению амплитуды бокового смещения головки. Изменение этих параметров движения клеток, покрытых антителами, свидетельствуют о гиперактивации сперматозоидов. Движения гиперактивированных сперматозоидов не являются прямолинейными: характерно более глубокое сгибание хвоста, поэтому траектория движения такого сперматозоида напоминает цифру “8” или звездочку. Гиперактивация характеризуется снижением LIN и увеличением ALH (Robertson L. et al., 1988; Mortimer S.T. and Mortimer D., 1990) и рассматривается как одно из проявлений капацитации - серии функциональных, биохимических и биофизических изменений сперматозоида, необходимых для АР и оплодотворения (Yanagimachi R., 1969).

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что одним из механизмов нарушения репродуктивной функции при наличии антиспермальных антител является функциональная и метаболическая активация сперматозоидов, приводящая к стимуляции преждевременной АР и снижению вероятности оплодотворения. Кроме того, активация сперматозоидов может сопровождаться изменениями антигенного состава поверхности сперматозоида - шеддингом одних антигенов и демаскировкой или экспрессией других (Benoff S. et al., 1993), а также разрушением плазматической мембраны в ходе АР, что делает невозможным использование живых сперматозоидов для количественного выявления АСАТ с помощью ПЦМ.

Мы предположили, что наиболее перспективным способом количественной оценки уровня антител, независимым от клеточных реакций, может быть выявление АСАТ с помощью латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов. Метод ПЦМ был адаптирован для выявления АСАТ на поверхности латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов (BioServ Diagnostics, Германия), которые инкубировали c сывороткой крови или семенной жидкостью, а затем с ФИТЦ-мечеными козьими антителами к IgG, IgА или IgМ человека. С помощью предложенного подхода были получены неожиданные результаты: высокая активность связывания антител класса G с латексными частицами наблюдалась в MAR-негативных сыворотках не только бесплодных, но и фертильных мужчин и женщин.

Согласно общепринятой точке зрения, АСАТ, присутствующие в сыворотке и секретах фертильных пациентов, являются низкоаффинными и не оказывают влияния на процессы оплодотворения. Считается, что выработка АСАТ к внутриклеточным антигенам сперматозоидов является физиологическим механизмом, обеспечивающим элиминацию поврежденных или мертвых сперматозоидов. В последнее время большое внимание уделяется также изучению естественных антител - низкоаффинных, полиреактивных антител, распознающих ограниченное количество аутоантигенов и выявляющихся в норме в кровотоке доноров (Bayry J. et al., 2004).

Мы предположили, что выявленные нами антитела могут специфично реагировать с белками теплового шока (БТШ) - консервативными иммунодоминантными антигенами, экспрессируемыми большинством клеток конститутивно или в ответ на различные стрессорные воздействия (Lindquist S. and Craig E.A., 1988). Для выявления специфичности АСАТ, присутствующих в сыворотках фертильных мужчин и женщин, оценивали ингибирование связывания АСАТ с латексными частицами, покрытыми антигенами сперматозоидов, в присутствии мАТ к БТШ с молекулярным весом 25 кДа (БТШ25), 60 кДа (БТШ60), 70 кДа (БТШ70) и 90 кДа (БТШ90) (Sigma, США). Максимальное ингибирование связывания АСАТ (84%) наблюдалось в присутствии МАТ к БТШ90. Таким образом, большая часть антител, выявляемых на поверхности латексных частиц, представлена антителами к БТШ90.

Известно, что БТШ90 является конститутивным белком, выявляемым в большинстве типов клеток (Picard D., 2002) и экспрессируемом сперматозоидами (Neuer A. et al., 2000). Ранее было установлено, что естественные антитела, выявляющиеся в норме в кровотоке доноров, могут взаимодействовать с БТШ90 (Pashov A., et al., 2002). Эти данные, а также выявление антител к БТШ90 у девушек (рис. 10) позволяют предположить, что обнаруженные нами антитела могут являться естественными аутореактивными антителами, и/или продуцироваться при антигенной стимуляции белками теплового шока, экспрессируемыми сперматозоидами и/или аутологичными клетками репродуктивного тракта мужчин и женщин. Было обнаружено, что антитела к БТШ90 являются маркером, отражающим состояние антиспермального иммунитета у мужчин и женщин. Обнаружена негативная корреляция между результатами выявления АСАТ и антител к БТШ90 в сыворотке женщин с бесплодием неясного генеза (рис. 8). Активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов, выявляемая в сыворотке крови женщин с иммунным фактором бесплодия (MAR%>40%), была существенно ниже, чем у фертильных женщин (рис.10).

Рис. 8 Зависимость между результатами выявления АСАТ (MAR%) и антител к БТШ90 (ПЦМ%) в сыворотках женщин с бесплодием неясного генеза (n=12)

При тестировании сывороток мужчин с бесплодием неясного генеза также была выявлена отрицательная зависимость между результатами выявления АСАТ и антител к БТШ90 (r= _ 0,67, р<0,02, n=13). Активность антител к БТШ90 в семенной жидкости MAR-позитивных образцов была также значительно ниже (4,0 УЕФ), чем в MAR- негативных образцах (8,5 УЕФ; р<0,001) и образцах фертильных доноров (17,7 УЕФ; р<0,01).

Оценка антигенсвязывающей активности антител к БТШ90 в сыворотках может быть использована для диагностики иммунного бесплодия у женщин (чувствительность 100%, специфичность - 100% при ПЦМ% < 30,8%). У мужчин иммунный фактор бесплодия может быть диагностирован с чувствительностью 100% и специфичностью 93,3% при активности антител к БТШ90 в семенной жидкости, превышающей 5,8 УЕФ. Предлагаемый способ имеет целый ряд преимуществ: выявление антител к БТШ90, в отличие от MAR-теста, является объективным и не требует трудоемкого микроскопического анализа; при выявлении антител к БТШ90 не требуется наличия активно-подвижных сперматозоидов, а используется стандартный набор реагентов с длительным сроком хранения, что позволяет оптимизировать и стандартизировать тестирование, а также существенно упростить организацию проведения анализа, исключив необходимость процедуры получения спермы у половых партнеров обследуемых женщин в день проведения анализа.

Таким образом, формирование антител к БТШ90 с высокой антигенсвязывающей активностью наблюдается в отсутствии АСАТ, а наличие иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин диагностируется при слабой иммунной реакции на БТШ90. Полученные результаты согласуются с результатами исследования, проведенного Domagala A. and Kurpisz M. (2004), подтвердивших, что частота выявления антител к некоторым антигенам сперматозоидов, лимфоцитов и эритроцитов у здоровых фертильных мужчин была существенно выше по сравнению с бесплодными пациентами с иммунной формой бесплодия.

Было проведено дополнительное исследование, подтвердившее, что высокая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови, является маркером толерантности к аллоантигенам полового партнера у женщин. Анализировали зависимость пролиферативной реакции лимфоцитов женщины (группа небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности) на лимфоциты полового партнера от уровня активности антител к БТШ90.

Рис.9 Зависимость пролиферативной реакции лимфоцитов женщины на лимфоциты мужа в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов от антигенсвязывающей активности антител к БТШ90 (ПЦМ%), выявляемой в сыворотке крови женщины

При использовании однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов было показано, что при высокой активности антител к БТШ90 пролиферативная реакция лимфоцитов жены на лимфоциты мужа отсутствовала (рис.9). При снижении активности антител к БТШ90 наблюдалось увеличение пролиферативной реакции. Уровень активности антител к БТШ90 не влиял на пролиферативную реакцию лимфоцитов женщины на лимфоциты донора.

Таким образом, высокая активность антител к БТШ90 является маркером толерантности иммунной системы женщин к аллоантигенам полового партнера, при которой отсутствуют как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции на аллоантигены.

Была исследована активность антител к БТШ90 в сыворотке крови в процессе изменения репродуктивного статуса здоровых женщин и женщин с нарушениями репродуктивной функции (рис.10). Было выявлено возрастание активности антител к БТШ90, связанное с началом половой жизни - активность антител у женщин, ведущих половую жизнь без контрацепции не менее полугода и не имевших беременности, была выше по сравнению с этим показателем у девушек (рис. 10).

...