Размещено на http://www.allbest.ru/

Научно-исследовательский институт нефрологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» ФАЗСР

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кинетический физико-химический подход к оценке качества клеточных мембран у больных хронической почечной недостаточностью, получающих лечение гемодиализом

Суглобова Елена Дмитриевна

Санкт-Петербург 2007

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нефрологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» ФАЗСР.

Научный консультант: доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова» ФАЗСР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Зыбина Наталья Николаевна ФГУЗ «ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова» МЧС России

доктор биологических наук профессор Арутюнян Александр Вартанович ГУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» РАМН

доктор медицинских наук профессор Арьев Александр Леонидович ГУ ДПО «СПбМАПО» ФАЗСР

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Защита состоится «11» октября 2007 г. в «…..» часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2.

Автореферат разослан 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета С.С. Алексанин.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Гемодиализ как способ сохранения и, следовательно, организации жизни стал объективной реальностью для многих тысяч больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ХПН). Современный комплекс детоксикационной заместительной почечной терапии дает возможность продолжительной (в среднем до 10 - 12 лет) жизни пациентов даже без проведения трансплантации [Спиридонов В.Н. и др., 2005]. Известно, что экскреторная функция почек моделируется гемодиализом достаточно качественно, но имитировать инкреторный путь в полной мере не удается, что приводит к дальнейшему прогрессированию осложнений ХПН [Руководство по диализу, 2003]. Кроме того, и сам гемодиализ становится причиной целого перечня плохо корригируемых состояний [Vanholder R.C. et al., 2003]. Так, например, нарушения гемодинамики и электролитного баланса приводят к прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний [Descamps-Latscha B. et al., 2000; London G.M. et al., 2003; Marco M.P. et al., 2003; Zoccali C. et al., 2003]; кровопотери в ходе самой процедуры гемодиализа и при отключении аппарата «искусственная почка» усугубляют эритропоэтин-дефицитную анемию [Besarab A. et al., 2000; Locatelli F. et al., 2003; Добронравов В.А., Смирнов А.В., 2005]; постоянный контакт элементов крови с чужеродной поверхностью усиливает микровоспаление [Fernandez-Reyes M.J. et al., 2002; Bellomo G. et al., 2003; Liu Y. et al., 2004]; недостаточное выведение фосфатов провоцирует нарушения минерального обмена [Block G.A. et al., 1998; Lindsay R.M. et al., 2003] и т.д.

В такой ситуации для оценки качества медицинской помощи и адекватного ведения больных весьма актуальным является мониторинг, с одной стороны, всех технических систем диализа, а с другой стороны - клинических и клинико-лабораторных показателей пациентов. Среди последних широко представлены концентрационные величины, являющиеся маркерами эндогенной интоксикации, электролитной дисфункции, патологий белкового и липидного обменов; есть также расчетные величины, в основном описывающие очистку в ходе диализной сессии. При этом показатели, характеризующие качество клеточных мембран пациентов, получающих лечение хроническим гемодиализом, в данном перечне фактически отсутствуют. В то же время в работах, связанных с изучением ренальной патологии, все большее внимание уделяется проблемам эндотелиальной дисфункции как одной из основных причин возникновения и прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) вплоть до терминальной стадии [Paisley K.E. et al., 2003; Annuk M. et al., 2003; Панина И.Ю., 2006]. Эндотелиальная дисфункция - это вариант «мембранной болезни», и именно поэтому мониторинг состояния мембранных систем из разряда желаемых перешел в ранг необходимых.

Как любой диагностический метод, оценка качества плазматической мембраны должна быть не слишком сложна при выполнении. Очевидной обязательной моделью исследования оказываются эритроциты как наиболее доступные клеточные объекты у здоровых лиц и у больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию хроническим гемодиализом.

Для оценки общей резистентности мембран эритроцитов, как правило, используются кислотный гемолиз эритроцитов по И.А.Терскову - И.И.Гительзону [1957] и осмотический гемолиз по Л.И.Идельсону [Медицинские и лабораторные технологии, 1998].

Однако по своему механизму методы определения общей резистентности не вполне отвечают требованиям биофизического теста качества клеточных мембран больных, получающих регулярный гемодиализ, поскольку время кислотного гемолиза скорее говорит о способности поверхностных мембранных сайтов к протонированию с дальнейшей денатурацией [Трикуленко А.В., Пинишко У.В., 1999], чем о состоянии билипидного слоя, а осмотическая резистентность прежде всего зависит от условий ультрафильтрации, т.е. от количества и скорости переноса воды через мембрану [Candan F. et al., 2002; Kovacic V. et al., 2003]. Эти методы не отражают изменения разграничительной и транспортной функций мембран, происходящие при персистировании перекисного окисления липидов (ПОЛ), выделяемого в качестве одной из основных причин прогрессирования ХБП [Dasgupta A. et al., 1992; Canestrari F. et al., 1995; Bayes B. et al., 2003; de Gomez Dumm N.T. et al., 2003]. Не вполне пригодны для использования в целях характеристики функционирования мембран и чисто аналитический подход с выделением отдельных компонентов - продуктов деградации фосфолипидов, например, малонового диальдегида эритроцитов, или изолированное определение активности отдельных ферментативных систем [Mimic-Oka J. et al., 1995; Zima T. et al., 1996; Miyata T. et al., 2000; Ozden M. et al., 2002; Soejima A. et al., 2002; Vaziri N.D. et al., 2003]: в процессе адаптации к хроническому гемодиализу изменения, которым подвержены белковые или липидные соединения, могут привести к значимым отличиям свойств последних по сравнению со свойствами здоровых лиц, однако при этом при рассмотрении мембраны как целого ее компартментализующие качества будут лучше отвечать новому состоянию организма пациента.

Таким образом, описание свойств мембран в исключительно непопуляционной ситуации, в условиях необычной «искусственной» жизни, каковой и является хронический гемодиализ, требует использования нестандартных параметров оценки.

По теории А.А.Болдырева [1992], основой существования клеточных структур в смысле маркерной характеристики их целостности является градиент макронеорганических катионов в различных компартментах. Именно неправильное, патологическое распределение макронеорганических ионов в значительной мере определяет состояние организма пациента гемодиализа как макроструктуры [Flanigan M.J., 2000]. Поскольку компартментализация - фундаментальный процесс, протекающий в соответствии с законами неравновесной термодинамики, можно утверждать, что метаболизм мембранных систем полностью определяет гомеостаз организма [Структура и функции биологических мембран, 1975; Геннис Р., 1997]. В рамках представления о функционировании мембраны как единого целого тема настоящего исследования актуальна.

Цель исследования. На основе разработанного кинетического физико-химического (ионометрического) подхода выявить наиболее значимые клинико-лабораторные электролитные характеристики состояния клеточных мембран для создания системы оценки их состояния у больных хронической почечной недостаточностью, получающих лечение регулярным гемодиализом.

Задачи исследования:

1. Адаптировать ионометрические методики к измерению концентрации электролитов в динамике в модельных и нативных биологических жидкостях.

2. Обосновать физико-химический подход к оценке резистентности эритроцитарной мембраны человека к внешнему действию каналоформера.

3. Выявить информативные биофизические показатели резистентности, характеризующие состояние функционирующей плазматической мембраны эритроцита.

4. Сравнить резистентность эритроцитарных мембран к внешнему действию каналоформера полиенового антибиотика нистатина у здоровых лиц и у больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию регулярным гемодиализом.

5. Изучить влияние эффекторов (специфического ингибитора Na,K-АТФ-азы уабаина, стимулятора эритропоэза пептидного гормона эритропоэтина, компонентов аутологичной плазмы крови) на показатели резистентности эритроцитов пациентов гемодиализа к внешнему действию нистатина.

6. Проанализировать корреляционные взаимосвязи между резистентностью к действию каналоформера, кислотной и осмотической резистентностью эритроцитов и клинико-лабораторными показателями у больных, получающих лечение регулярным гемодиализом.

7. Изучить состояние мембран эритроцитов больных ХПН на разных стадиях терапии хроническим гемодиализом.

8. Построить модели состояния больных «до диализа - после диализа», применяя метод статусметрии.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Обоснован новый физико-химический подход к оценке качества плазматической мембраны эритроцитов человека. Разработан оригинальный биофизический эксперимент, позволяющий по изменению внеклеточной электролитной концентрации охарактеризовать суммарный процесс, протекающий при образовании в эритроцитарных мембранах неселективных гидрофильных нистатиновых каналов. Предложены пути разделения указанного интегрального процесса на отдельные составляющие, отвечающие различным стадиям резистентного ответа клеточной мембраны на внешнее воздействие каналоформера.

Предложен способ определения вклада инактивации нистатиновых каналов (self-treatment) в суммарный ответ мембраны эритроцита на внешнюю агрессию каналоформера.

Для динамического контроля внеклеточных ионных концентраций в минимизированных пробах биологических жидкостей наряду с миниионселективными электродами, снабженными мембранами специально подобранного состава, применены ионселективные полевые транзисторы (ИСПТ) с фотополимеризуемыми полиуретановыми валиномицинсодержащими мембранами.

Разработан новый способ оценки состояния билипидного слоя мембраны эритроцита - обобщенный показатель «интегральный нормированный выход калия» при использовании нистатина в качестве мембраноактивного агента. Выявлены достоверные различия данного параметра у пациентов хронического гемодиализа по сравнению с группой лиц без ренальной патологии.

Созданы модели классификаций состояний межгрупповых сравнений пациентов «до диализа - после диализа». Установлено, что показатели очистки наиболее информативны в начальный период лечения регулярным гемодиализом; в дальнейшем большее значение приобретают характеристики резистентности клеточных мембран.

Практическая значимость работы. Разработан новый лабораторный метод исследования клеточных эритроцитарных мембран, позволяющий не только определить их качество, но и оценить влияние различных эффекторов. Обосновано применение различных методов определения резистентности мембран (кислотной, осмотической, ультразвуковой и резистентности к внешнему действию каналоформера) для их характеристики.

Показана целесообразность мониторинга состояния клеточных мембран пациентов гемодиализа, а также необходимость мембранной протекции в начале лечения регулярным гемодиализом. Продемонстрирована принципиальная возможность построения моделей состояния пациентов «до диализа - после диализа» методом статусметрии, выявивших наиболее важную роль характеристик качества мембран в третий-четвертый год гемодиализной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ионометрия является доступным и адекватным методом определения интегральных изменений содержания ионов (K⁺ и Na⁺) во внеклеточной среде суспензии эритроцитов человека при действии на них каналоформера - полиенового антибиотика нистатина. При этом для проб минимизированного объема наиболее удобным и предпочтительным является применение датчиков, выполненных на основе ионселективных полевых транзисторов.

2. При взаимодействии неселективного каналоформера с плазматической мембраной эритроцита человека реализуется совокупность быстрых и медленных процессов, включающая функционирование активного транспорта и инактивацию ионных каналов (self-treatment), суммарный эффект которых может быть охарактеризован как резистентность по отношению к внешней агрессии нистатина.

3. Оптимальной характеристикой ответа на воздействие каналоформера нистатина на эритроцитарную мембрану является «интегральный нормированный выход калия». Данная величина представляет собой суммарное изменение внеклеточной ионной нормированной концентрации за определенный отрезок времени: в первые минуты после начала каналообразования для оценки быстрых процессов и в более отдаленные временные интервалы для описания области стабилизации кинетических зависимостей.

4. Интегральный нормированный выход калия из эритроцитов у больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию хроническим гемодиализом, достоверно выше, чем у здоровых лиц. При этом у пациентов гемодиализа, как и у людей без ренальной патологии, аутологичная плазма оказывает стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану. В то же время для эритроцитов больных, получающих лечение гемодиализом, результаты применения других эффекторов - уабаина и эритропоэтина - необычны. Уабаин, являясь специфическим ингибитором Na⁺,K⁺-АТФазы, оказывает парадоксальное мембранопротекторное действие, уменьшая интегральный нормированный выход калия, а эриропоэтин - традиционный стимулятор эритропоэза - в больших концентрациях значительно повышает данный показатель.

5. Показатели резистентности к внешнему действию каналоформера не коррелируют с показателями кислотной, осмотической и ультразвуковой устойчивости эритроцитов, а при факторном анализе они входят в состав разных главных компонент, что позволяет говорить о принципиальном различии указанных параметров. Правомерность данного положения подтверждается неизменностью интегрального нормированного выхода калия и изменением осмотической резистентности эритроцитов при ведении больных на низкокальциевом гемодиализе.

6. Величины различных типов резистентности эритроцитарных мембран не меняются в начальный период лечения больных ХПН регулярным гемодиализом. В дальнейшем, по прошествии 6-7 лет адекватной заместительной почечной терапии хроническим диализом, наблюдается положительная динамика устойчивости плазматических мембран клеток к внешним воздействиям.

7. Статусметрический анализ комплекса клинических, клинико-лабораторных и биофизических данных пациентов гемодиализа позволяет выделить наиболее информативные показатели при построении моделей состояния больных «до диализа - после диализа». Наряду с характеристиками очистки к ним относятся величины резистентности клеточных мембран. Наибольшие различия в состоянии пациентов до и после сессии фиксируются в третий-четвертый год лечения регулярным гемодиализом.

Апробация. По материалам диссертации опубликовано 37 работ, в том числе 15 - в центральных журналах, рекомендованных ВАК.

Результаты исследования доложены на Рабочем совещании главных нефрологов и заведующих отделениями хронического гемодиализа «Диализное лечение больных с ХПН» (Санкт-Петербург, 1995), 4-ой Конференции нефрологов Северо-запада России «Проблемы ХПН» (Иматра, 1995), Рабочем совещании нефрологов Северо-запада России «Нефрология» (Санкт-Петербург, 1996), Научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии» (Санкт-Петербург, 1998), 9-ой Всероссийской конференции по физиологии и патологии почек и водно-солевого обмена (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции «Нефрология и диализ» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Болезни почек: эпидемиология, диагностика, лечение» (Кызыл, 2004), Научно-практической конференции, посвященной 10-летию медицинского факультета «Нефрология в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2005), IV Конференции РДО (Санкт-Петербург, 2005).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 312 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 133 отечественных и 362 иностранных источника, и приложения. Работа иллюстрирована 50 таблицами и 36 рисунками.

Содержание исследования

Разработка экспериментального подхода к мониторингу проницаемости мембран эритроцитов человека

В кинетических экспериментах с эритроцитами здоровых лиц рабочая проба представляла собой суспензию отмытых от плазмы крови солевым раствором эритроцитов в солевых же растворах Тироде или Моргана [Cumberbatch M. et al., 1981], состав которых был несколько модифицирован (табл. 1). В некоторых экспериментах клетки были ресуспендированы с добавлением аутологичной плазмы крови.

Таблица 1 Составы растворов Тироде и Моргана

Эритроциты от плазмы отделяли однократным центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин, 4°С), затем отмывали подряд три раза солевым раствором Моргана либо Тироде. Отмытые эритроциты вносили в ячейку, туда же добавляли солевые растворы Моргана или Тироде, а в части опытов - плазму крови. Объемы вносимых в ячейку эритроцитарной массы и соответствующего типу эксперимента солевого раствора либо плазмы в большинстве опытов составляли 4,5 и 0,9 мл, а иногда - 2,25 и 3,15 мл соответственно.

Общая схема экспериментальной установки представлена на рис. 1.

Рис. 1. Установка для регистрации внеклеточных концентраций Na⁺ и К⁺. 1 - фторопластовые ячейки; 2 - Na⁺ электрод; 3 - К⁺ сенсор; 4 - электролитические мостики, заполненные 1 М NН₄NО_З; 5 - насыщенный раствор КС1; 6 - электрод сравнения; 7 - 1 М NH₄NО_З; 8 - термостат с шейкером; 9 - электролитический мостик, заполненный насыщенным раствором КСl; 10 - суспензия эритроцитов (рабочая проба); 11 - коммутатор; 12 - иономер; 13 - самопишущий потенциометр.

При работе с эритроцитами пациентов гемодиализа пробы были минимизированы, при этом в качестве датчиков использовали ионселективные полевые транзисторы.

Реагенты уабаин (Fluka) и эритропоэтин (Boeringer Manheim) в виде водных растворов вносили в пробы через отверстия в крышках ячеек.

Каналообразующим агентом служил нистатин. Его натриевую соль производства ВНИИ антибиотиков и ферментов медицинского назначения растворяли в ДМФА и 0,1 мл полученного раствора добавляли в пробу.

Для создания "равновесных" концентраций Na⁺ и К⁺ вне и внутри клеток в конце опыта использовали сапонин (Merck), 0,1 мл водного раствора которого в концентрации 40 мг сухого вещества на 1 мл дистиллированной воды вызывал лизис эритроцитов в пробе.

Динамика внеклеточных концентраций Na⁺ и K⁺ при модификации мембран эритроцитов нистатином. В предварительных экспериментах было показано, что утечка ионов Na⁺ и K⁺ в направлении градиентов их концентраций через эритроцитарную мембрану в отсутствие ее модификаций незначительна и активность противоградиентного переноса ионов также чрезвычайно низка. При применении нистатина для провокации мембранных ионтранспортирующих систем было необходимо определить его оптимальную концентрацию в пробах, при которой изменения трансмембранного градиента содержания ионов были бы заметны, но при этом не происходила бы тотальная перфорация мембраны с нарушением билипидного слоя и последующим быстрым лизисом.

Результаты экспериментов при воздействии нистатина в различных его концентрациях на плазматические мембраны эритроцитов представлены на рис. 2 и 3. Как следует из приведенных данных, оптимальные для определения характеристик резистентности эритроцитарных мембран к внешнему воздействию антибиотика концентрации нистатина находятся в интервале 0,105 - 0,526 мг/мл внеклеточной жидкости (1,11·10^-4 М - 5,56·10^-4 М).

Рис. 2. Влияние концентрации нистатина на внеклеточную концентрацию K⁺ в суспензии эритроцитов человека в растворе Тироде. По оси ординат: (Ct_K⁺- ДCt_K+), где Ct_K⁺ - внеклеточная концентрация иона в пробе в момент времени t; ДCt_K+ - разница между внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в момент времени t и внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в начальный момент времени.

По оси абсцисс: время (мин) с момента добавления нистатина в пробу.

Стрелкой указан момент внесения сапонина в пробу.

Концентрация нистатина в пробе:

1 - 0,026 мг/мл (2,78·10^-5 М); 4 - 0,263 мг/мл (2,78·10^-4 М);

2 - 0,053 мг/мл (5,56·10^-5 М); 5 - 0,526 мг/мл (5,56·10^-4 М);

3 - 0,105 мг/мл (1,11·10^-4 М); 6 - 0,789 мг/мл (8,34·10^-4 М).

Следует особо обратить внимание на форму полученных кинетических кривых. При средних и высоких концентрациях нистатина во внеклеточной жидкости первоначально наблюдалось достаточно быстрое увеличение внеклеточной концентрации K⁺ и уменьшение концентрации Na⁺. Однако через 30-40 минут после внесения каналоформера в пробу кинетические зависимости ионных концентраций достигали некоторого стационарного уровня. Этот уровень был тем выше для (Ct_K+ - ДCt_K+) и, соответственно, тем ниже для (Ct_Na+ + ДCt_Na+), чем выше было содержание каналоформера в пробе. При последующем тотальном лизисе под действием сапонина скачок ионной концентрации до «равновесного» значения был тем меньше, чем больше нистатина взаимодействовало с эритроцитами.

Причиной возникновения протяженного стационарного участка кинетической кривой могло быть компенсаторное действие трансмембранного ионного переноса, осуществляемого Na⁺,К⁺-АТФазой. Для проверки этого предположения была произведена предварительная инкубация эритроцитов со специфическим ингибитором фермента уабаином. Однако, как это показано на рис. 4, при ресуспендировании отмытых клеток и в растворе Тироде, и в растворе Моргана при предварительном воздействии уабаина стационарный участок на кинетических зависимостях сохранялся. При условии, что нистатин быстро взаимодействует с клеточными мембранами (табл. 2) возникновение стационарного состояния при движении ионов в соответствии с градиентами их концентраций возможно только при инактивации сформированных гидрофильных каналов. Подобный репаративный процесс (self-treatment) был предсказан D.C. Tosteson et al. [1985] для бислойных фосфолипидных мембран, а затем был продемонстрирован А.А. Львом и Л.В. Щагиной [1989] на примере холестерин-содержащих мембран эритроцитов. Процесс «self-treatment» происходит в основном за счет латеральной диффузии и возможен, если нарушения целостности мембраны эритроцита не превышают одной ячейки спектрин-актиновой сети.

Рис. 3. Влияние различных концентраций нистатина на внеклеточную концентрацию Na⁺ в суспензии эритроцитов человека в растворе Тироде. По оси ординат: (Ct_Na+ + ДCt_Na+), где Ct_Na+ - внеклеточная концентрация иона в пробе в момент времени t; ДCt_Na+ - разница между внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в момент времени t и внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в начальный момент времени.

По оси абсцисс: время (мин.) с момента добавления нистатина в пробу.

Стрелкой указан момент внесения сапонина в пробу.

Концентрации нистатина в пробе: те же, что и на рис. 2.

Рис. 4. Динамика внеклеточной концентрации K⁺ при действии нистатина в концентрации 2,78·10^-4M (0,263 мг/мл) на ресуспендированные в растворах Тироде (кривые 1 и 2) и Моргана (кривые 3 и 4) эритроциты человека, предварительно инкубированные с 5,62·10^-4M (0,41 мг/мл) уабаином (кривые 2 и 4) и без уабаина (кривые 1 и 3).

Обозначения по осям абсцисс и ординат те же, что и на рис. 2.

Нистатин внесен в пробу в момент времени t=0. Доверительные 95%-ые интервалы не превышают 4% от средних значений.

Таблица 2 Связывание нистатина с мембранами эритроцитов человека

Примечание: Начальная концентрация нистатина во внеклеточной среде - 2,78·10^-4M (0,263 мг/мл). Отсчет времени - от момента внесения нистатина в суспензию эритроцитов.

Оценить интенсивность резистентного ответа фосфолипидного двойного слоя по отношению к внешнему действию каналоформера позволяет применение модели одномерной диффузии. По скорости изменения внеклеточной ионной концентрации можно рассчитать коэффициент диффузии K⁺ (или Na⁺) через мембрану эритроцита по нистатиновым каналам (рис. 5). Наибольшая его величина соответствует состоянию, когда облегченному направленному трансмембранному переносу ионов ничто не препятствует. При решении обратной задачи, считая указанную наибольшую величину коэффициента диффузии постоянной, можно получить теоретическую кинетическую зависимость концентрации K⁺, характеризующую процесс в отсутствие резистентного ответа мембраны. Отношение расчетной ионной концентрации к экспериментальной в какой-либо момент времени t определяет интенсивность противодействия внешней агрессии антибиотика. Следует отметить, что резистентность мембран тем выше, чем более физиологичной оказывается среда ресуспендирования.

Рис. 5. Теоретические (1 и 3) и экспериментальные (2 и 4) кривые зависимости внеклеточной концентрации К⁺ в присутствии 2,78·10^-4 M (0,263 мг/мл) нистатина при инкубации суспензии эритроцитов в растворах Тироде (кривые 1 и 2) и Моргана (кривые 3 и 4). По оси абсцисс: время (мин.). По оси ординат: Ct_K⁺ - внеклеточная концентрация K⁺. Доверительные 95%-интервалы не превышают 4% от средних значений.

При изучении действия каналоформера на эритроциты, отмытые раствором Моргана и ресуспендированные в аутологичной плазме, были получены кинетические кривые, оказавшиеся весьма индивидуальными для каждого образца донорской крови. Однако в целом можно выделить два основных типа зависимостей, которые условно были обозначены как «инверсионный» и «неинверсионный» (рис. 6). «Неинверсионный» ответ на действие каналоформера, как в случае предварительной инкубации с уабаином, так и без нее характеризовался сглаженными кинетическими кривыми, демонстрирующими монотонное возрастание концентрации K⁺ во внеклеточной среде. Хотя при сравнении результатов измерений для разных доноров различия между «уабаиновыми» и «безуабаиновыми» ячейками значительно варьировали в диапазоне от нескольких десятых до 25-30 ммоль/л, все же, как правило, при использовании уабаина значения Сt_К+ были выше. Ответ «инверсионного» типа встречался достоверно реже: из 39 доноров - лишь у 9-ти человек (ч² =17,52; p = 0,0001).

Рис. 6. Динамика внеклеточных концентраций K-⁺ при действии уабаина и нистатина на эритроциты человека, ресуспендированные в аутологичной плазме: а - зависимость «неинверсионного» типа; б - зависимость «инверсионного» типа. По оси абсцисс - время, мин. По оси ординат - Сt_К+ - внеклеточная концентрация K⁺ в суспензии в момент времени t. Отсчет времени - от момента внесения нистатина в суспензию. Начальные концентрации нистатина и уабаина в суспензии 5,56·10^-4 M (0,526 мг/мл) и 7,12·10^-3 М (5,20 мг/мл) соответственно. Доверительные 95%-ные интервалы не превышают 4% от средних значений. 1 - без уабаина; 2 - с уабаином.

Следует отметить, что при всем разнообразии полученных кинетических кривых в «инверсионном» варианте для «безуабаиновых ячеек» в координатах «концентрация K⁺ - время» четко наблюдался максимум концентрации K⁺, а при наличии в пробе ингибитора Na⁺, K⁺-АТФазы он отсутствовал. И высота пика концентрационной кинетической кривой, и скорость уменьшения внеклеточной ионной концентрации, наблюдающиеся после достижения максимума, индивидуальны для разных доноров; наибольшая внеклеточная концентрация K⁺, зафиксированная при концентрации нистатина во внеклеточной среде 0,526 мг/мл, составила 60 ммоль/л.

При сравнительном изучении резистентности эритроцитов, ресуспендированных в солевом растворе и в аутологичной плазме, к внешнему воздействию каналоформера было обнаружено, что концентрация K⁺, соответствующая положению квазистационарного состояния в ячейках с солевым раствором, примерно в 2-2,5 раза превышала аналогичный концентрационный уровень в ячейках с нативной средой. При этом взаимное расположение квазистационарных концентрационных уровней не зависело от типа ответа на действие антибиотика. Вероятно, различные типы отклика на внешнее воздействие каналоформера на эритроцитарную мембрану при ресуспендировании отмытых клеток в нативной среде обитания - аутологичной плазме - демонстрируют различную степень активации Na⁺, K⁺-АТФазы. Если процессу выхода K⁺ из эритроцитов ничего не препятствует, концентрация этого иона во внеклеточной среде должна непрерывно возрастать. Поэтому при ингибировании транспортного фермента Na⁺, K⁺-АТФазы уабаином, когда главные барьеры для выхода калия из эритроцита сняты, концентрация K⁺ монотонно увеличивается. В ячейке без ингибитора противоградиентное перемещение ионов приводит к двукратному уменьшению внеклеточной концентрации K⁺. При «неинверсионном» типе кинетической кривой подобное противодействие утечке ионов по сформированным нистатиновым каналам, по всей видимости, выражено значительно слабее. В целом же стабилизирующая роль нативной среды в отношении плазматической мембраны эритроцитов доноров весьма значительна.

Таким образом, разработанный эксперимент с использованием в качестве датчиков ионселективных электродов и ИСПТ позволяет оценить резистентность эритроцитарной мембраны по отношению к внешнему воздействию каналоформера.

Резистентность к внешнему действию нистатина как характеристика мембран эритроцитов больных ХПН, получающих лечение регулярным гемодиализом

Группы пациентов

При изучении резистентности эритроцитов по отношению к внешнему воздействию каналоформера обследовали группу из 147 человек, получавших заместительную терапию регулярным гемодиализом. Контрольной группой служили 24 здоровых добровольца. По возрастному и половому составу исследуемая и контрольная группы достоверно не отличались друг от друга.

В исследуемой группе у 121 человека в качестве основной патологии был диагностирован хронический гломерулонефрит, у 3 человек - первичный хронический пиелонефрит, у 12 человек - диабетический нефросклероз, у 5 человек - поликистоз почек и вторичный пиелонефрит, и еще у 4 человек - прочие заболевания почек.

Сеансы стандартного бикарбонатного гемодиализа выполнялись на аппаратах «искусственная почка» Fresenius 4008B и 4008H, Braun HD-Secura A, Hospal Integra и Bellco Formula 2000 с применением полисульфоновых полиметилметакрилатных диализаторов и диализаторов с мембраной из модифицированной целлюлозы площадью 1,3-1,8 м². Скорость потока крови составляла в среднем 300 мл/мин, диализирующего раствора - 500 мл/мин. Сеансы проводились 3 раза в неделю по 4-4,5 часа. Количество полученных сеансов колебалось от 3 до 2580 и составляло в среднем 560,5±49,4.

При изучении влияния аутологичной плазмы на резистентность мембран эритроцитов при действии на них нистатина из указанного контингента больных выделили группу из 114 человек. У 40 больных из общей группы пациентов исследовали влияние эритропоэтина на выход калия из эритроцитов при внешнем действии каналоформера. В данной группе количество полученных сеансов гемодиализа составило в среднем 323,5±59,0.

При длительном наблюдении первую группу составили 20 человек. Первое исследование скорости выхода калия из эритроцитов было выполнено через 3,2 0,8 лет после начала заместительной терапии гемодиализом. Повторное исследование этой группы больных было проведено после 5,1 0,8 лет пребывания в отделении гемодиализа. Таким образом, интервал между исследованиями не превышал 2 лет.

Вторая группа состояла из 30 больных. Первое исследование было выполнено у них при среднем сроке пребывания в отделении гемодиализа 3.70,8 лет, второе измерение было произведено при среднем сроке лечения гемодиализом 7,8 1,1 лет, то есть интервал между исследованиями составил 4 года.

При изучении различных типов общей резистентности эритроцитов в течение 201 сеанса регулярного гемодиализа обследовали 108 больных с ХПН. Обследованная группа состояла из 66 мужчин и 42 женщин в возрасте от 17 до 69 лет. У 94 больных был диагностирован хронический гломерулонефрит, у двух больных - хронический пиелонефрит, у пяти - поликистоз почек и вторичный пиелонефрит, у трех больных - сахарный диабет, диабетическая нефропатия, у двух больных - мочекаменная болезнь и вторичный пиелонефрит, и еще двое страдали «прочими» заболеваниями почек.

Все больные получали сеансы стандартного гемодиализа. Количество сеансов колебалось в пределах от 3 до 2580 и составило в среднем 589±42. Резистентность эритроцитов определяли до и после сеанса.

У 36 больных измерения проводили повторно после первичного определения резистентности взятых у них эритроцитов. В начале наблюдения средний срок лечения регулярным гемодиализом составлял 2,6±0,5 лет. К этому времени количество сеансов, полученных больными, варьировало от 4 до 1313, составляя в среднем 400±73, а при повторном измерении - уже от 28 до 1938 (в среднем 623±82 сеанса), поскольку продолжительность лечения регулярным гемодиализом к моменту повторного обследования возросла до 4,0±0,5 лет.

Из 36-ти наблюдаемых больных у 22-х измерения показателей были проведены еще раз через 5-6 лет лечения. На момент начала наблюдения количество полученных сеансов варьировало от 7 до 1178 (в среднем 423±83), что соответствовало 2,7±0,5 года лечения регулярным гемодиализом. Через 5-6 лет наблюдения число сеансов, полученных больными, составило уже от 668 до 2048 (в среднем 1275±86) при продолжительности лечения 8,2±0,5 лет.

Группу сравнения образовали добровольцы без ренальной патологии в количестве 25 человек.

Для изучения состояния мембран при ведении больных на низкокальциевом гемодиализе (НКГД) (концентрация Ca²⁺ в диализирующем растворе составляла 1,25 ммоль/л против 1,75 ммоль/л при стандартном сеансе) из всего контингента пациентов отделения хронического гемодиализа отобрали 43 человека с наиболее выраженными клинико-лабораторными и, в большинстве случаев, рентгенологическими признаками нарушений фосфорно-кальциевого обмена. Отобранную группу больных разделили на две подгруппы: основную (21 пациент; 8 мужчин и 13 женщин; средний возраст 43,7±3,0 года) и контрольную (22 пациента; 7мужчин и 15 женщин; средний возраст 45,9±2,5 лет). Длительность лечения гемодиализом в обеих подгруппах достоверно не различалась и составляла 86,6±7,84 и 91,9±12,7 сеансов для основной и контрольной подгрупп соответственно. Основная подгруппа была переведена на низкокальциевый диализ (в комплексе с терапией б-D₃ и карбонатом кальция в качестве фосфат-баиндера). Продолжительность наблюдения в этой части исследования составила 18 месяцев.

Методика работы с эритроцитами пациентов гемодиализа при минимизации исследуемых проб

При работе с эритроцитами пациентов гемодиализа и здоровых лиц клетки отмывали солевым раствором Моргана и по 1 мл полученной эритроцитарной массы переносили в ячейки и добавляли либо 0,5 мл раствора Моргана, либо 0,5 мл аутологичной плазмы, в зависимости от условий эксперимента.

В качестве провокатора трансмембранных потоков Na⁺ и K⁺ использовали нистатин: 0,04 мл его раствора в перегнанном ДМФА с концентрацией 5 мг/мл (3,0·10^-4М) вносили в ячейку для индуцирования интенсивного выхода внутриклеточного K⁺ во внешнюю среду по сформированным каналам. Концентрация нистатина в пробе, таким образом, составляла 0,222 мг/мл внеклеточной жидкости (2,34·10^-4 М).

Эффекторами эритроцитарной мембраны в экспериментах служили следующие вещества:

1. Уабаин - специфический ингибитор Na⁺,K⁺-АТФазы. 0,04 мл его раствора в деионизированной воде (14,6 мг/мл деионизированной воды) добавляли в ячейку за 10 мин до внесения в нее раствора нистатина. В «безуабаиновые» ячейки при этом вносили 0,04 мл деионизированной воды.

2. Рекормон - рекомбинантный человеческий эритропоэтин, пептид с молекулярной массой 34 кДа (Boeringer Manheim). В экспериментах в ячейку вносили 0,04 мл его готового раствора, что соответствовало 160 IU. Таким образом, конечная концентрация препарата в ячейке в 24 раза превышала достигаемую в плазме крови при его однократном внутривенном введении. Содержание эритропоэтина в рабочей пробе выбирали с тем расчетом, чтобы оно имело тот же порядок, что и содержание остальных эффекторов, т.е. чтобы количество его молекул и молекул других агентов, взаимодействующих с одной клеткой, было примерно одинаковым.

3. Мембраноактивные компоненты, входящие в состав аутологичной плазмы крови.

В качестве ячеек применялись фторопластовые бюксы с внутренним диаметром 12 мм, в пластиковых крышках которых закреплялись либо ионоселективные электроды (диаметр корпусов 4 мм), либо ИСПТ (пластина толщиной 0,8 мм).

Определение э.д.с. выстраиваемых рабочих гальванических элементов производили на иономере И-130 (в случае использования в качестве датчиков ионоселективных электродов) и на специальном устройстве, разработанном в Барселонском институте микроэлектроники (в случае применения ИСПТ).

Квалификация всех использованных реактивов была не ниже «ХЧ».

Определение величины интегрального нормированного выхода калия

При анализе кинетических зависимостей внеклеточной концентрации K⁺ при действии нистатина на эритроциты больных с ХПН, получающих терапию регулярным гемодиализом, выяснилось, что взаимное расположение концентрационных кривых весьма разнообразно и зависит от индивидуальных особенностей эритроцитов и плазмы крови конкретного пациента гемодиализа. Однако к числу общих признаков таких кривых можно отнести немонотонность, практически исключающую возможность их динамического сглаживания как функций времени. Такая особенность оказалась характерной именно для крови больных, получающих заместительную почечную терапию гемодиализом. Поэтому расчет положения теоретических точек концентрации K⁺, соответствующих отсутствию резистентного ответа плазматических мембран на внешнее действие каналоформера, сложен.

Для оценки указанной резистентности эритроцитов по отношению к нистатину мы предложили использовать другой показатель, получивший описательное название «интегральный нормированный выход K⁺» (ИНВК) (рис. 7), который рассчитывался следующим образом:

1. Нормировка внеклеточной концентрации K⁺. Несмотря на то, что рабочие ячейки готовили стандартно и количество эритроцитов в пробах одной серии было примерно одинаковым (в каждой ячейке определяли значение гематокрита), для нивелирования возникающих различий фиксируемую в каждый следующий момент величину концентрации K⁺ относили к конечному (лизисному) значению.

2. При определении «интегрального выхода» K⁺ вычисляли площадь области диаграммы, расположенную под кривой зависимости «нормированной концентрации K⁺» от времени.

Рис. 7. Способ определения интегрального нормированного выхода калия. По оси абсцисс: время (мин.), прошедшее с момента внесения нистатина в рабочую пробу.

Для характеристики быстрых процессов рассчитывали «интегральный нормированный выход K⁺» за 3 и 10 минут, прошедших с момента внесения в пробу нистатина. Для описания эффекта резистентности в целом наиболее адекватными оказались временные интервалы от 25-ой до 35-ой минуты и от 40-ой до 45-ой минуты от начала воздействия каналоформера.

Некоторая часть экспериментальных кривых носила инверсионный характер. Для оценки глубины инверсии, т.е. непосредственного проявления функционирования активного противоградиентного транспорта, была разработана специальная компьютерная программа, позволяющая построить участок кривой между точками A и B (см. рис. 7), соответствующими моментам изменения знака производной C_норм.K+=f(t). Положение точек A и B определяли для каждой экспериментальной кривой визуально. Разность между площадями участка области диаграммы, расположенного под зависимостью, полученной расчетным путем, и участка под реальной опытной кривой C_норм.K+=f(t) и была определена как «площадь инверсии» (SI).

Таким образом, перечень характеристик резистентности мембран к внешнему действию каналоформера включает:

Ny (0-3), Ny (0-10), Ny (25-35), Ny (40-45) - ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии только нистатина на эритроциты, ресуспендированные в солевом растворе;

Ou+Ny (0-3), Ou+Ny (0-10), Ou+Ny (25-35), Ou+Ny (40-45) - ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии нистатина на эритроциты, предварительно инкубированные с уабаином;

Pl+Ny (0-3), Pl+Ny (0-10), Pl+Ny (25-35), Pl+Ny (40-45) - ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии нистатина на эритроциты, ресуспендированные в аутологичной плазме;

Epo+Ny (0-3), Epo+Ny (0-10), Epo+Ny (25-35), Epo+Ny (40-45) - ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии нистатина на эритроциты, предварительно инкубированные с эритропоэтином;

Ny (SI), Ou+Ny (SI), Pl+Ny (SI) - площадь инверсии при действии только нистатина на эритроциты, ресуспендированные в солевом растворе, при действии нистатина на эритроциты, предварительно инкубированные с уабаином, и при действии нистатина на эритроциты, ресуспендированные в аутологичной плазме, соответственно.

Определение показателей общей резистентности эритроцитов

В работе применяли три типа гемолиза: кислотный, осмотический и ультразвуковой.

Кислотный гемолиз проводили по Терскову и Гительзону [1957] 0,1N раствором соляной кислоты; временной интервал между измерениями составлял 10 секунд. Регистрацию гемолиза продолжали до момента прекращения процесса, то есть до получения постоянного значения светопоглощения. каналоформер статусметрия эритроцитарный диализ

Ультразвуковой гемолиз проводили с использованием аппарата для ультразвуковой терапии УЗТ-1.03У в условиях, оптимальных для регистрации динамики светопоглощения: интенсивность излучения - 1,0 Вт/см, режим работы - импульсный 2 мс. Регистрировали время 50%-ного ультразвукового гемолиза таким же образом, как и кислотного.

Осмотический гемолиз проводили по Идельсону [Медицинские и лабораторные технологии, 1998], используя в качестве гипотонического раствора 0,45% раствор хлористого натрия, приготовленный из стандартного физиологического раствора.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием параметрических и непараметрических методов при применении стандартных пакетов программ (Statistica for Windows v. 6.0, SPSS v. 12.0). Критический уровень достоверной нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Оценку эффективности процедуры диализа у больных с ХПН, получающих заместительную почечную терапию, по комплексу лабораторных и клинических показателей состояния пациентов проводили с использованием математических моделей статусметрии [Андерсон Т., 1963; Разоренов Г.И., Поддубский Г.А., 1985, 1986; Разоренова Т.С., 1998]. Все обследованные были разделены на 7 групп по общему количеству пройденных процедур диализа (примерно 150 в год). Для каждой из них строили математические модели, по которым оценивали «весомость» информативных показателей и выбирали критерий различий. Модели представляли в виде дискриминантных функций Z:

Z = b₀ + b₁X₁ + b₂X₂ + b₃X₃ + … + b_kX_k ,

преобразующих комплекс показателей (Х₁,, Х₂, Х₃, …, Х_k) в критерий классификации. Знак при коэффициенте (b₁, b₂, b₃, …, b_k) указывает, в каком из классов имеют место более высокие значения средних.