Оценка эффективности клинико-иммунологических и иммуногенетических критериев прогноза клинического полиморфизма и терапии ревматоидного артрита

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Провести анализ клинических особенностей дебюта суставного синдрома с реализацией в ревматоидный артрит или серонегативные артропатии среди европеоидов Сибири с учетом выраженности активности воспалительного процесса, состояния системы иммунитета, гемостаза и нарушений функции суставного аппарата.

2. Оценить характер взаимосвязи воспаления и васкулопатии, влияние активности патологического процесса, баланса про- и противовоспалительных цитокинов, специфичности урогенитальной внутриклеточной и вирусной инфекции, особенностей клинического течения и продолжительности болезни на характер и степень выраженности нарушений в системе гемостаза при ревматоидном артрите. Оценить информативность, специфичность этих признаков, их влияние на характер иммунного ответа и прогноз заболевания.

3. Провести комплексный анализ соотношения циркулирующих про- и противовоспалительных цитокинов, аллельного полиморфизма регуляторных участков генов этих цитокинов у пациентов с ревматоидным артритом с различной активностью воспалительного процесса и состоянием системы гемостаза

4. Изучить характер ассоциированности аллелей и генотипов промоторных участков генов про- и противовоспалительных цитокинов, специфичностей HLA-комплекса с развитием ревматоидного артрита и особенностями его клинического течения.

5. Оценить зависимость эффективности иммуносупрессивной болезньмодифицирующей терапии и применения ингибитора TNF-б от уровня сывороточных цитокинов до начала лечения и динамики их концентраций в процессе терапии.

6. Оценить информативность и провести клиническую апробацию комплексного анализа признаков выявления специфичности иммуногенетических признаков, показателей выраженности васкулопатии и нарушений гемостаза, цитокинового профиля для характеристики вариантов течения РА

Диссертация изложена на 361 странице машинописного текста и иллюстрирована 58 таблицами, 9 рисунками, 1 схемой, содержит приложения. Библиографический указатель включает 486 источников, из них 60 отечественных и 426 зарубежных.

ревматоидный артрит иммуногенетический

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных. В исследование было включено 486 пациентов и в качестве контроля - практически здоровые лица обоего пола европеоидной расы, проживающие в Западной Сибири, которым проведены исследования: иммунного статуса (78 чел.), системы гемостаза (112 чел.), уровня цитокинов (39 чел.), иммуногенетическое типирование (680 чел.). Среди обследованных 392 пациента, страдающих РА. Из них: 291 пациент с продолжительностью анамнеза РА от двух лет и более наблюдались в течение пяти лет; отдельно выделена группа пациентов с ранним РА из 101 пациента, у которых продолжительность суставного синдрома не превышала 18 мес от появления первых клинических признаков суставного синдрома. Средний возраст больных составил 46,19±11,73 лет, средняя продолжительность заболевания в группе больных с ранним РА 7,57±3,9 мес, в группе больных с продолжительным анамнезом 7,33±6,4 лет. Критериями включения в исследование были достоверный диагноз РА, верифицированный в соответствии с критериями ACR [Arnett F.C. et al., 1988], возраст больных от 18 лет и старше. Общая характеристика больных РА представлена в табл. 1.

Таблица 1Общая характеристика больных ревматоидным артритом

Методы лабораторного и инструментального исследования. Исследование системы гемостаза осуществлялось с использованием коагулометра «CL-4» (Behnk Electronik), агрегометра «Биола», тест-систем ООО «Технология-Стандарт» и НИО РЕНАМ (г.Москва). Методология определения состояния системы гемостаза выполнялась в соответствии с рекомендациями Федерального Академического центра по патологии системы гемостаза при ЦНИЛ Алтайского медицинского университета [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001].

Определение HLA-A и -В антигенов МНС I класса проводили с использованием микролимфоцитотоксического теста [Terasaki P.I. et al., 1976]. Генотипирование HLA-DRB1 проводилось методом сиквенс-специфичных праймеров. Генотипирование цитокинов периферической крови осуществлялось при помощи набора реагентов производства ООО «Лаборатория Медиген» (г. Новосибирск). Исследовались шесть полиморфизмов, локализованных в промоторных регионах генов интерлейкинов: TNF-б в позициях С-863А, G-308A, G-238A, IL-4 C-590T, IL-6 G-174C, IL-10 C-592A. Анализ исследуемых полиморфизмов выполнялся с использованием метода рестрикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ). Продукты амплификации подвергались рестрикции соответствующими эндонуклеазами: TNF-б С-863А - Bst BAI, TNF-б G-308A - Bsp19 I , TNF-б G-238A - Msp I, IL-1в T-31C - Alu I, IL-4 C-590T - Bme 18 I, IL-6 G-174C - SfaN I, IL-10 C-592A - RsaI («Сиб Энзим», Новосибирск).

Содержание в сыворотке 9 цитокинов TNF-б, IFN-г, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, GM-CSF оценивали методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-PlexTM 200 System (Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем "Human Cytokine Th1/Th2 Assay". Диапазон измерений составлял 0,2-4000 пкг/мл. Расчеты концентрации 9 исследуемых цитокинов производили на основании калибровочных кривых, построенных для каждого анализа, с помощью программы Bio-Plex Manager 4.1 (Bio-Rad, США). Исследование проводилось до лечения и в динамике терапии в сроках 12 и 24 нед.

Для оценки иммунного статуса исследовали общее количество лимфоцитов; относительное содержание субпопуляций CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток c использованием соответствующих отечественных моноклональных антител производства фирм “Сорбент” и “МедБио Спектр” (г. Москва). Измерения проводили с помощью проточного цитометра FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) и программы CellQuest (Becton Dickinson, USA). Концентрацию сывороточных иммуноглобулинов M,G,A и уровень ЦИК оценивали нефелометрическим методом. Исследование эффекторных функций нейтрофилов и моноцитов проводилось с определением индекса миграции, индекса ингибиции миграции, показателя эффекторных функций [Кожевников В.С., 2001].

Количественное определение растворимой форма молекулы эндотелиально-лейкоцитарной адгезии - Е-селектина (sE-селектин), количества суммарного ревматоидного фактора (РФ) классов IgG, IgA, IgM, С-реактивного протеина (СРП), антител к циклическому цитрулинированному пептиду (аCCP) в сыворотке крови осуществлялось методом твердофазного ИФА - ELISA с использованием наборов производства «Biomerica», «EUROIMMUN».

Верификация УГИ включала ПЦР-диагностику ДНК возбудителей урогенитальных инфекций: Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrea, Trichomonas vaginalis, Herpes simplex viruses type I, type II, Cytomegaloviruses, Epstein-Barr viruses [Wilbrink B. et al. 1998]. Амплификация проводилась с использованием терминального циклера фирмы “ДНК-технология” (Москва, Россия) и диагностических наборов фирмы “Литех” (Москва, Россия).

Для математической обработки полученных данных использовали статистические компъютерные программы Sigmaplot, Statistical Graphic System, INSTAT, STATISTICA (версия 5,0) и SPSS 10,0 for Windous. Оценку результатов проводили параметрическим методом для несвязанных выборок (t - критерий Стьюдента). Для проверки частоты вариант проводили непараметрическое сравнение рядов (Вилкоксона-Манна-Уитни). Для оценки взаимосвязи между параметрами выполнен корреляционный анализ по Спирмену с определением коэффициента ранговой корреляции.

При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели как частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, отношение шансов (OR), доверительный интервал (CI) для OR и диагностический вес признаков (DK).Частоту аллелей генов цитокинов вычисляли методом прямого подсчета по формуле: f=n/2N, где n - количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды), 2N - удвоенная численность обследованных. Распределение HLA-антигенов, генотипов, фенотипов, гаплотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга согласно рекомендациям Вейр Б. Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n - количество раз встречаемости генотипа (комбинации генотипов), N - численность обследованных. Статистическую оценку силы ассоциации генов, генотипов и их комбинаций с клиническими эффектами терапии проводили по показателю OR (odds ratio - отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе) с расчетом 95% доверительного интервала (95% Confidence Interval - 95%CI). Достоверность (P) ассоциаций и различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию ч2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц.

Отбор генетических комплексов, пригодных для индивидуального прогнозирования эффективности терапии, проводился на основе значений трех статистических критериев: двусторонний вариант точного метода Фишера; информационная мера Кульбака (Jku); диагностический (прогностический) коэффициент по формуле: DK=10lg(P1/P2), где P1 и P2 - частота прогностического признака в сравниваемых группах. При достижении прогностического коэффициента величины 12,8 вероятность реализации прогноза составляет 95%. В качестве дополнительных характеристик генетических комплексов, прогностических критериев использовали также показатели чувствительности, специфичности (Sn, Sp).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования клинического полиморфизма суставного синдрома в дебюте ревматоидного артрита и недифференцированных артропатий среди европеоидного населения Сибири

Анализ клинического течения дебюта суставного синдрома показал, что в половине всех случаев верификации диагноза ревматологом диагностирован РА. Острый полиартрит с вовлечением суставов кистей и стоп, продолжительной утренней скованностью, не вызывающий сложностей в диагностике, формировался у трети больных. Суставной синдром у основной части пациентов характеризовался неспецифическими проявлениями, что удлиняло период с отсутствием болезньмодифицирующей терапии и ухудшало прогноз заболевания. Клинические варианты дебюта РА не имели специфических изменений лабораторных параметров воспаления, а их изменения характеризовали остроту патологического процесса. Специфические лабораторные маркеры диагностики РА: а-CCP и РФ определялись на этапе верификации диагноза только у 23,7 и 48,5% пациентов (соответственно) с высокими показателями клинической и лабораторной активности. Выявлен значительный процент больных РА с экстраартикулярными проявлениями болезни (72,3%), которые преимущественно представлены конституциональным синдромом (46,5%) и клиническим выражением вовлечения в патологический процесс сосудов микроциркуляторного русла, что проявляется сетчатым ливедо и сенсорно-моторной полинейропатией.

Дифференцирование РА с серонегативным суставным синдромом показало отсутствие специфичных признаков, способных повысить эффективность диагностики. Проведенный анализ клинического полиморфизма обозначил проблемы и необходимость внедрения маркеров ранней диагностики РА.

Пациенты с дебютом суставного синдрома, верифицированным как РА в первые 18 мес от момента появления клинических симптомов болезни, наблюдались в течение десяти лет. С верификацией диагноза назначалась болезньмодифицирующая иммуносупрессивная терапия, которая существенным образом не изменяла агрессивность течения РА в исследуемой выборке по данным различных систем оценок активности заболевания в процессе пятилетнего наблюдения (табл. 2).

Таблица 2Динамика индексов активности у больных ревматоидным артритом в дебюте и через 5 лет наблюдения, M±у

Полученные результаты могут свидетельствовать о необходимости индивидуализации и прогнозирования эффекта терапии на ранних этапах диагностики заболевания.

Влияние специфичности возбудителей внутриклеточной и вирусной инфекции на формирование клинического полиморфизма суставного синдрома

Общая оценка показателей клеточного и гуморального иммунитета не обнаружила изменений, высокоспецифичных для заболевания и ассоциированных со скоростью деструкции костной ткани по методу A.Larsen в течение пятилетнего наблюдения. В то же время выявлены различия в течении иммунопатологического процесса в группах больных с ранним РА и серонегативной НАП.

Расчет диагностической значимости иммунологических параметров с целью исследования возможности их использования в последовательной диагностической процедуре в качестве признаков дифференцирования суставного синдрома в дебюте показал, что показатели с невысокой информативностью и чувствительностью позволяют принимать диагностическое решение при суммировании коэффициентов до достижения порогового значения на основании метода Вальда (табл. 3).

Таблица 3 Частоты встречаемости и диагностическая значимость иммунологических признаков в дебюте суставного синдрома с верификацией диагноза раннего ревматоидного артрита и недифференцированной артропатии

Наиболее высокой диагностической значимостью при проведении дифференцирования между РА c НАП обладают параметры, фиксирующие нарушения в гуморальном звене иммунного ответа- повышение концентрации IgG в сыворотке крови (DK=9,1), ЦИК (DK=6,7), что отражает основные патогенетические отличия дифференцированных заболеваний.

Таким образом, при проведении сравнительного анализа особенностей иммунного статуса в период верификации суставного синдрома установлены достоверные различия между дебютными формами заболеваний суставов, на основании которых возможно создание дифференциально-диагностического алгоритма прогнозирования РА и недифференцированных серонегативных заболеваний суставов на ранней стадии формирования патологического процесса.

В соответствии с задачами настоящего исследования проведен анализ полиморфизма урогенитальной, вирусной инфекции у пациентов с дебютом суставного синдрома, исходом чего являлись РА и недифференцированные серонегативные состояния. В период дифференцирования суставного синдрома на ранних стадиях его развития урогенитальная внутриклеточная и вирусная инфекции определяются у основной части пациентов. Выявлению УГИ соответствует наличие воспалительных заболеваний органов малого таза чаще в виде стертых или асимптомных форм.

Сравнительный анализ полиморфизма внутриклеточной и вирусной инфекции в группах пациентов с РеА, НАП и рРА продемонстрировал преимущественную встречаемость определенных патогенов при различных нозологиях. Помимо абсолютного преобладания Chlamydia trachomatis при РеА, четких ассоциаций других внутриклеточных инфекций с исследуемыми суставными заболеваниями не выявлено. Риск развития урогенного реактивного артрита при наличии активной инфекции Chlamydia trachomatis достигает 78,75, но при этом диагностическая значимость составляет 7,2, что определяет возможность других исходов УГИ.

Для вирусов семейства Herpes (Herpes 1,2, EpsteinЇBarr) прослеживается четкая связь с формированием РА (ОR=10,67). В группе пациентов с реплицирующими герпес-вирусами определен более короткий период формирования РА, соответствующего критериям ACR (менее 6 мес), с высокими показателями клинической активности и выраженности суставного синдрома (табл. 4).

Таким образом, участие вирусов, внутриклеточной инфекции в инициации и поддержании аутоиммунного воспаления является очевидным и позволяет использовать их ассоциации с различными клиническими и лабораторными параметрами в последовательной процедуре Вальда для верификации диагноза. Мультифакторная теория развития РА позволяет с большей точностью в установлении диагноза опираться на параметры, ассоциированные с различными звеньями патогенеза. Учитывая роль васкулопатии в формировании осложнений воспаления, было исследовано состояние гемостаза на ранних стадиях болезни, связь отдельных видов нарушений с вирусоносительством и внутриклеточной инфекцией, специфичность изменений в связи с развитием отдельных нозологических единиц в дебюте суставного синдрома, особенностей прогноза от характера коагуляционных/тромботических нарушений.

Таблица 4 Диагностическая значимость клинических и лабораторных признаков в дебюте суставного синдрома с верификацией диагноза раннего ревматоидного артрита в зависимости от наличия вирусной инфекции

Результаты исследования системы гемостаза у пациентов с различными вариантами течения ревматоидного артрита и дебютом серонегативных спондилоартропатий

Лица с дебютом РА в отсутствии болезньмодифицирующей терапии имеют лабораторные проявления, соответствующие активации гемокоагуляционного каскада. Воспаление при активном суставном синдроме в дебюте РА характеризуется повышением агрегационной функции тромбоцитов, гиперкоагуляцией, тромбинемией и снижением резервов фибринолитической системы (табл. 5).

Из выявленных нарушений в системе гемостаза можно выделить две группы. Первая-это нарушения, которые наблюдаются независимо от продолжительности РА и степени активности - межклеточная лейкоцитарно-тромбоцитарная гиперагрегация, гиперкоагуляция, ингибиция фибринолиза и тромбинемия.

Таблица 5Состояние основных показателей системы гемостаза в дебюте и в динамике через 5 и 10 лет от начала ревматоидного артрита, M±m

Примечание: * Їдостоверность различия между группами при р<0,05;

**Їдостоверность различия между группами при р<0,01.

Вторая группа нарушений гемостаза динамично изменяется в связи с выраженностью воспаления (табл. 6). Гиперагрегация тромбоцитов достигает значимых значений у пациентов с максимальной активностью РА (р=0,007). Тромбинемия прогрессирует соответственно увеличению показателей СОЭ, СРП, фибриногена и уровня тромбоцитов в периферической крови. Наиболее выраженные изменения тромбоцитарного гемостаза формируются у серопозитивных пациентов (R=0,450*). У больных РА формирование тромбинемии сопровождается и поддерживается дефицитом системы фибринолиза (р=0,0027, R=0,47*).

Таблица 6 Динамика показателей гемостаза в зависимости от степени активности ревматоидного артрита, M±m

Примечание: * - достоверность различия между группами при р<0,05;

**- р<0,01;***- р< 0,001.

Дефицит фибринолиза регистрируется при любой степени активности РА, но максимально выраженная активность способствует пятикратному превышению нормативных показателей. Истощение факторов естественного противодействия коагулянтной активности плазмы: системы растворимых антикоагулянтов и фибринолиза в условиях высокой воспалительной активности- приводит к реализации тромбообразования, о чем свидетельствует прогрессия накопления фибрин-мономеров и олигомеров.

Процесс сопутствующего воспалению микротромбоваскулита при серонегативных состояниях отличает минимальный синтез межклеточных агрегатов (9,42±0,41), нормальное количество сывороточного фибриногена (4,14±0,20) и высокий потенциал ингибирования тромбина (2,74±0,15), в отличие от РА, который характеризуется агрессивным тромбоваскулитом. Снижение активности фибринолиза не позволяет эффективно ингибировать гиперкоагуляцию, отражает злокачественность течения РА и рентгенологического прогрессирования. В противоположность низкий уровень коагуляции может служить протективным признаком медленной рентгенологической прогрессии.

Изменения функций системы гемостаза при РА имеют особенности в связи с выявлением определенных видов внутриклеточной УГИ или вирусной инфекции. Наиболее неблагоприятными факторами в плане формирования микротромбоваскулита и снижения функции естественной антикоагулянтной защиты, фибринолиза определены возбудители семейства Herpes и рода Mycoplasmae.

Уровень сывороточных цитокинов и их участие в различных нарушениях системы гемостаза у больных ревматоидным артритом

В целях уточнения механизмов взаимодействия воспаления и гемокоагуляции при РА было проведено исследование содержания про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных с различными нарушениями в системе гемостаза. В общей группе пациентов с РА выявлено повышенное содержание СРП, Е-селектина, провоспалительных цитокинов TNF-б, IFN-г, IL-2, IL-12(p70), противовоспалительного IL-10 и фактора иммуногемопоэза GM-CSF в сыворотке крови. Средние значения основных параметров приведены в табл. 7. Выявлены различия в распределении некоторых цитокинов в соответствии с нарушениями в системе гемостаза. В настоящем исследовании установлено взаимодействие коагуляционной/фибринолитической и иммунной систем организма в патогенезе воспаления при РА.

Если суммировать эффекты про- и противовоспалительных цитокинов во взаимодействии с системой гемостаза, то участие отдельных цитокинов будет выглядеть следующим образом. Провоспалительные TNF-б (R=0,50*), IFN-г (R=0,49*), IL-2(R=0,43*), IL-12(R=0,47*) и противовоспалительный IL-10(R=0,47*) ассоциируют с гиперкоагуляцией, которая прогрессирует соответственно активности воспаления. Гиперкоагуляция максимально выражена у серопозитивных пациентов. IFN-г способствует гиперкоагуляции только при наличии РФ. Значимым протектором коагуляционных свойств плазмы является тромбоцитоз.

Конечным этапом повышения активности гемостаза является формирование тромбинемии, которая стимулируется высокими концентрациями TNF-б (R=0,68*) в сыворотке крови.

Таблица 7Показатели цитокинового профиля у больных ревматоидным артритом, M±у

Уровень IL-5 в сыворотке крови больных РА с тромбинемией достоверно увеличен (4,72±7,58 в сравнении с группой без тромбинемии 1,96±2,65, р=0,028), что ассоциирует с нормальным содержанием фибрин-мономеров.

Исход тромбообразования во многом зависит от эффективности функционирования систем естественной антикоагулянтной и фибринолитической активности. Снижение активности фибринолиза в условиях тромбинемии ассоциирует с высоким содержанием провоспалительного IFN-г (703,52±1214,01, р=0,040) и противовоспалительного IL-10 (39,80±72,81, р=0,048) в сыворотке крови больных РА. Дефицит фибринолитической системы, связанный с нарушением трансформации плазмина, контролируется провоспалительными TNF-б (R=0,45*), IL-12 (R=0,47*) и противовоспалительными IL-10 (R=0,47*), IL-4 (R=0,48*), IL-10 (R=0,47*). Снижению активности фибринолиза способствуют угнетение активности протеина-С (р=0,046) с прогрессирующей неконтролируемой гиперкоагуляцией , ассоциированное с тромбоцитозом (R=0,71*) и высокой концентрацией Е-селектина (R=0,50*) в сыворотке крови. Вероятно, ингибирование фибринолиза является следствием неконтролируемой активации системы гемостаза. Недостаточность физиологических функций, обеспечивающих антикоагулянтное равновесие, обусловлена повышенным содержанием провоспалительных цитокинов IL-2,IFN-г, IL-12 в сыворотке крови. Среди возможных механизмов истощения системы физиологических антикоагулянтов можно рассматривать стойкое поддержание гиперагрегации, стимулируемой данными цитокинами у серопозитивных пациентов (R=0,72*; 0,67*; 0,91* соответственно).

Пролонгирование воспаления и его хронизация во многом зависят от способности клеток к высокой продукции цитокинов, поддержании состояния гиперкоагуляции и формирования дефицита фибринолиза, что может быть обусловлено наличием определенных генетических профилей. Участие различных цитокинов в механизмах заболевания может различаться в различных популяциях, что зависит от этнических особенностей, различий в экспрессии генов главного комплекса гистосовместимости и специфичностей генетики цитокинов в каждой популяции.

Результаты иммуногенетического обследования пациентов с различными вариантами течения ревматоидного артрита и недифференцированными серонегативными артропатиями

Среди жителей Сибири, больных РА, доминирующим вариантом полиморфного участка промоторного региона гена TNF-б G-308A является GG (72,3%) по сравнению с гетерозиготным AG (27%) и гомозиготным АА (0,7%). Гомозиготный вариант СС (52,2%) и гетерозиготный вариант АС (39,9%) полиморфного участка в позиции 592 гена IL-10 преобладают над гомозиготным АА (7,9%). Среди больных РА установлено повышенное содержание генотипа AG промоторного участка гена TNF-б G-308A (27,0%) в сравнении со здоровыми донорами (17,5%) и генотипа АА (11,0%) промоторного участка гена IL-10 C-592A (7,9%) в сравнении c контролем (2,5%), что свидетельствует об участии этих специфичностей в общем генетическом риске РА.

Для уточнения функциональной роли изучаемого полиморфизма генов TNF-б и IL-10 был исследован уровень провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови среди пациентов, являющихся носителями аллелей TNF-б А (точка 308), связанного с его высокой продукцией и IL-10 С (точка 592), связанного с низкой продукцией указанного цитокина, что теоретически формирует неблагоприятный вариант течения РА (табл. 8).

Таблица 8Концентрации про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных ревматоидным артритом в зависимости от полиморфизма гена TNF-б в точке 308 и гена IL-10 в точке 592

У пациентов с генетической предрасположенностью к высокой продукции TNF-б и низким концентрациям антагонистичного IL-10 отмечено наиболее высокое содержание провоспалительного IL-2, в десятки раз превышающего нормативное распределение. Повышение уровня IL-4, IL-5, IL-13 может иметь компенсаторное значение в связи с недостаточностью противовоспалительного эффекта IL-10.

При анализе клинических особенностей пациентов в зависимости от полиморфизма промоторных участков исследуемых генов выявлены следующие данные. Лица с гетерозиготным фенотипом TNF-б (в точке 308) G/A (р=0,035) как и с аллелью А (р=0,042), ассоциированными с высокой продукцией TNF-б, преимущественно заболевают в возрасте неустойчивого гормонального фона. В группе пациентов с наличием аллели G в генотипе TNF-б G-308A отмечены более низкие показатели активности воспалительного процесса по индексу DAS28 (р=0,0002).

Значительная часть ассоциаций связана с наличием в фенотипе пациента аллелей гена IL-10 C-592A, связанных с продукцией высокого или низкого уровня соответствующего цитокина. Аллель А в генотипе полиморфного участка гена IL-10 C-592A сопряжен с более высокой активностью по уровню СОЭ (р=0,04) и DAS28 (p=0,038), наличию клинических и лабораторных признаков васкулопатии (р=0,036), тромбинемии (р=0,03), дефицитом в системе фибринолиза (р=0,037).

В условиях низкой продукции IL-4 у больных РА не формируется достаточной ингибиции провоспалительных цитокинов, в связи с чем пациенты с наличием IL-4(C-592T) -CC генотипа не формируют ответа на иммуносупрессивную терапию в 68,8% случаев (р=0,004). Напротив, мутантный аллель Т в фенотипе больного РА, способствующий высокой продукции противовоспалительного IL-4, обеспечивает хороший и удовлетворительный эффект у пациентов, принимающих иммуносупрессивную терапию (р=0,022).

В соответствии с литературными данными в исследуемой группе пациентов, страдающих РА, выявлены ассоциации показателей лабораторной активности с IL-6. В группе больных с генотипом GG (-174), ответственным за высокий уровень продукции IL-6, отмечен более высокий уровень СРП, чем у больных с гомозиготным СС-фенотипом (р=0,033), связанным с низкой продукцией IL-6. Присутствие аллеля G у гетерозиготных по IL-6 G-174C пациентов способствует более высокой активности воспаления по уровню СОЭ (р=0,037). Подобная закономерность отмечена и для провоспалительного цитокина IL-1в.

Повышенные концентрации Е-селектина у пациентов с высокой продукцией IL-6, связанной с G аллелем, могут объяснить связь эндотелиальной дисфункции и прогрессии атеросклероза у пациентов с высокой степенью активности ревматоидного воспаления (р=0,018).

Наличие в фенотипе больного РА мутантного аллеля Т IL-4 C-592 обеспечивает высокую продукцию IL-4. До назначения болезньмодифицирующей терапии у этих пациентов активность РА по индексу DAS28 была более высокой (р=0,031). Оценка эффективности иммуносупрессивной терапии через 14 нед показала более значительный ответ по индексам DAS (р=0,039) и ARC70 (р=0,024) в этой группе пациентов.

У пациентов с наличием гомозиготного генотипа GG TNF-б G-308A ответ на лечение иммуносупрессивными препаратами не отличался столь высокой эффективностью, как у больных, генетически обусловленных к высокому синтезу TNF-б (генотип GA) (p=0,015).

Для возможного выявления наиболее благоприятных и неблагоприятных вариантов сочетания аллелей и прогнозирования эффекта проводимой иммуносупрессивной терапии были выделены группы пациентов по сочетанию аллелей высокой и низкой продукции соответствующего цитокина. Как показано на рис. 1, наиболее благоприятный исход лечения иммуносупрессивными средствами показали пациенты, фенотип которых содержал аллель высокой продукции TNF-б и IL-10, что обеспечивало необходимый уровень ингибирования Th1 воспаления (TNF-б308A/IL-10C).

Рис. 1. Оценка эффективности терапии ревматоидного артрита иммуносупрессивными препаратами по индексу DAS в группах пациентов с сочетаниями в фенотипе аллелей с различным уровнем продукции про- и противовоспалительных цитокинов

У больных с низким уровнем продукции противовоспалительных цитокинов IL-4, IL-10 в составе фенотипов IL-10A/IL-4C и TNF-б 308A/IL-10A эффективность терапии была минимальной. Оценена эффективность терапии препаратом инфликсимаб у больных РА через 14 нед от начала лечения. Выявлены различия в распределении генотипа СС IL-10 (C-592A), связанного с высоким уровнем продукции IL-10, и генотипов АС+АА в выделенной группе пациентов. Аллель А указанных генотипов формирует низкий уровень продукции IL-10. Гомозиготное состояние аллели С в фенотипе больного РА, обеспечивая высокий уровень продукции IL-10, способствует хорошей эффективности терапии препаратом инфликсимаб. Напротив, генетически детерминированный низкий синтез IL-10 ассоциирует с низким ответом на проводимую терапию анти-TNF-препаратом, требующим повышения дозы биологического агента или смены терапии.

В целях дальнейшего исследования генетической составляющей в полиморфизме РА в настоящем исследовании изучались закономерности накопления некоторых генов системы HLA среди больных РА. Поскольку популяция кавказоидов Западной Сибири представляет смешанный евроазиатский тип, распределение антигенов HLA имеет свои особенности, что является актуальным для практического использования [Chen K.R. et al., 2002]. Иммуногенетический анализ позволил выделить пациентов с риском развития РА, неблагоприятными вариантами клинического течения заболевания, патогенетическими особенностями, способствующими формированию различного ответа на проводимую терапию.

Специфический генетический маркер развития РА, аллель HLA-DR4, встречался чаще у лиц с наличием вирусной инфекции (OR=3,93, p=0,005), выявленной в дебюте суставного синдрома, и форм...