Видеоцифровая регистрация для иммунологических и биохимических исследований в практике клинической лабораторной диагностики

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

14.03.10 - КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Видеоцифровая регистрация для иммунологических и биохимических исследований в практике клинической лабораторной диагностики

Старовойтова Татьяна Авенировна

Москва 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении «Российский Государственный Медицинский Университет» Росздрава

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Тогузов Руслан Тимофеевич.

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Панченко Леонид Федорович

Доктор медицинских наук, профессор Сапрыгин Дмитрий Борисович

Доктор медицинских наук, профессор Титов Владимир Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова» Росздрава

Защита состоится « 21» апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.071.04. при ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава по адресу:123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «РМАПО» Росздрава по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д.19

Автореферат разослан «___» ______________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор В.Т.Морозова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Важнейшая роль лабораторной диагностики в медицине является общепризнанным фактом, в связи, с чем усовершенствование имеющихся и разработка новых вариантов аналитических лабораторных методов на основе использования современных и постоянно развивающихся компьютерных технологий представляется весьма актуальным. Очевидна направленность этих усовершенствований, призванных обеспечить повышение достоверности, точности, снижение времени выполнения и трудоемкости проведения анализов. («Концепция развития службы клинической лабораторной диагностики Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2004-2010 годы»).

Одной из важных зон внедрения новых лабораторных методик, основанных на использовании современных информационных технологий регистрации и обработки результатов, являются малые и средние лаборатории, где и в настоящее время большое количество лабораторных исследований проводится на основе визуальной интерпретации. К таким исследованиям относятся иммунологические агглютинационные и преципитационные анализы, тесты «сухой химии», иммунохроматографические тесты, иммунодот- и иммуноблот-анализы.

Важным технологическим направлением развития этих и других лабораторных методов является видеоцифровой компьютерный анализ. Применение видеоцифрового анализа к традиционным тестам с визуальной регистрацией решает задачу документирования и объективизации результатов анализа, что поднимает эти тесты на принципиально более высокий уровень достоверности и аналитической ценности. Видеоцифровой анализ открывает новые возможности и для усовершенствования методов, где применяются обычные варианты фотометрии и рефлектометрии, таких как иммуноферментный анализ, турбидиметрические исследования, тесты «сухой химии».

Другим перспективным направлением усовершенствования лабораторных методик является внедрение микрометодов, обеспечивающих проведение исследований c использованием минимальных количеств реагентов и образцов. Существенные преимущества дает сочетание подходов видеоцифровой регистрации и проведение аналитических процедур в микроматричном формате. Многими научными группами разрабатываются аналитические системы, включающие приспособления для проведения реакций в минимальных объемах и видеоцифровые системы регистрации. Такие системы позволяют создать принципиально новые варианты высокопроизводительных и экономичных методик.

В связи с этим исследования, направленные на разработку и внедрение высокотехнологичных аналитических систем на основе видеоцифрового анализа, обеспечивающих эффективное проведение распространенных клинико-диагностических определений на высоком уровне достоверности, можно считать весьма актуальными.

Цель исследования

Создать новые и усовершенствовать имеющиеся методы проведения распространенных клинико-диагностических исследований с применением видеоцифровой регистрации и оценить на клиническом материале аналитические характеристики созданных лабораторных комплексов и методов.

Задачи исследования:

1. Разработать лабораторные видеоцифровые системы для регистрации результатов латексной агглютинации, пассивной гемагглютинации, изосерологических исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа и биохимических тестов «сухой химии».

2. Сформулировать медико-технические требования к программному обеспечению видеоанализаторов и обосновать алгоритмы оценки результатов специфических аналитических реакций с учетом особенностей их прохождения.

3. Создать стандартизованные методики проведения агглютинационных тестов с документированием, автоматической оценкой результатов, обеспечивающие возможность внутрилабораторного контроля качества исследований.

4. Разработать систему регистрации результатов и планшеты для проведения латексных агглютинационных и изосерологических исследований со сниженным расходом реагентов.

5. Сконструировать приспособления формирования матриц микрокапель на планарных носителях и создать полные аналитические системы, включающие эти приспособления и программно-аппаратные комплексы для регистрации и интерпретации результатов иммунологических и биохимических исследований в микроматричном формате.

6. Провести расширенную апробацию разработанных методов и аппаратуры на клиническом материале в сопоставлении с референсными лабораторными системами и подготовить научно обоснованную методическую базу для внедрения этих методов в практику клинической лабораторной диагностики.

Научная новизна работы

Разработана не имеющая аналогов многофункциональная система регистрации результатов иммунологических исследований на основе сканера. видеоцифровой агглютинация иммунохроматографический

Впервые разработано программное обеспечение для регистрации результатов латекс - агглютинационных исследований на планарных носителях с количественной оценкой реакций для любых латекс -агглютинационных тестов.

С применением разработанных подходов видеоцифровой регистрации и микрометодов предложены новые, эффективные варианты проведения серийных исследований латексной агглютинации, изосерологических тестов в различных форматах, позволяющие снизить необходимые для анализов объемы реагентов и проб в 10-30 раз.

Разработана, защищенная патентом РФ, полная аналитическая система для проведения матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микро - формате, включающая приспособления нанесения микрокапель образцов и реагентов на планарные носители, видеоанализатор и специализированное программное обеспечение.

Практическая ценность работы

Разработана лабораторная многофункциональная регистрирующая система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа. Эта универсальная видеоцифровая система с пакетом программ «Эксперт-Лаб» (Свидетельство о регистрации № 2007613095 в Реестре программ для ЭВМ от 20.07.2007) может рассматриваться как основной лабораторный комплекс, обеспечивающий регистрацию результатов практически всего спектра иммунологических исследований.

За разработку и внедрение системы комплекса «Эксперт-Лаб» присужден Диплом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007). Разработка видеоцифровых систем для лабораторной диагностики отмечена золотой медалью «Международного салона инноваций и инвестиций» (Москва, 2009).

На основе разработанного аналитического комплекса для матричных дот - иммунологических и биохимических анализов в микроформате с видеоцифровой регистрацией предложены методы серийного дот - анализа альбумина в моче, глюкозы крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, АСЛО) и изосерологических исследований, позволяющие в десятки раз снизить объемы реагентов и проб и повысить производительность.

Внедрение результатов работы

Разработанная лабораторная система «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов латекс - и гемагглютинационных исследований, иммунохроматографических тестов, иммуноферментного анализа внедрена в серийное производство на предприятии ОАО «ЛОМО» (Санкт-Петербург) (Регистрационное удостоверение № ФС 02012006/3617-06 от 10.08.2006). Системы «Эксперт-Лаб» используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в практике работы КДЛ ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова», НУЗ «ЦКБ №1 ОАО «РЖД», ГУЗ «Московский областной перинатальный центр», ГУЗ ДЦ №1 УЗ ЮЗАО.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные и научно обоснованные подходы усовершенствования лабораторных методов с видеоцифровой регистрацией реализованы и внедрены в практику в виде многофункциональных программно-аппаратных комплексов, обеспечивающих получение объективных и достоверных результатов широкого спектра биохимических и иммунологических лабораторных исследований.

2. На основе сочетания подходов видеоцифровой регистрации и применения микрометодов создана и реализована в виде полного аналитического комплекса технология проведения биохимических и иммунохимических исследований в матричных форматах в микрообъемах реагентов и образцов.

3. Использование разработанных видеоцифровых систем регистрации результатов иммунологических и биохимических исследований повышает качество и достоверность лабораторных данных за счет объективизации их оценки, сохранения первичного документа теста для ретроспективного контроля.

Личный вклад автора

Автор лично принимала участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: разрабатывала медицинские требования к приборным и аппаратным компонентам программно-аппаратных комплексов и приспособлений для проведения исследований в микроформатах, критерии для алгоритмов регистрации и дискриминации результатов иммунологических исследований, осуществляла оценку разработанных лабораторных методов в сопоставлении с референсными вариантами, сформулировала рекомендации для использования результатов исследований в клинико-диагностических лабораториях.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на совместной научно-практической конференции кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ и проблемной научно-исследовательской лаборатории нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 06 октября 2009года.

Печатные работы

По теме диссертации опубликовано 19 публикаций в отечественной и зарубежной печати, из них в изданиях, рекомендуемых ВАК- 9 работ. Получены патент на изобретение №2325644 от 27.05.2008 и свидетельство №2007613095 «Пакет программ для лаборатории «Эксперт-Лаб» от 20.07.2007.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 163 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, практических рекомендаций, списка литературы, списка сокращений. Список литературы содержит 149 работ, из которых 44 отечественные источники. В диссертационную работу включены 11 таблиц и 48 рисунков.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Контрольные материалы, образцы мочи, крови и сывороток были предоставлены ООО «КДЛ - тест» г. Москвы (всего более 12 000 образцов от 8860 пациентов, проходивших плановое или динамическое обследование).

Изображения аналитических объектов (96-луночных плоскодонных и круглодонных микропланшетов, разработанных микропланшетов формата 3х4, матричных объектов формата 5х6) в режиме светопропускания получали с помощью сканера «Epson Perfection-4990 Photo» («Epson», Япония), а изображения матричных дот-объектов и иммунохроматографических тест-полосок в режиме отражения получали как с помощью сканера, так и с использованием рефлектометра «Рефлеком» (ООО «Синтэко-Комплекс», Россия.)

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с видеоцифровой регистрацией на наличие антител к Treponema pallidum было исследовано 9964 образца сыворотки. 96 проб параллельно тестировались в реакции Treponema pallidum particle agglutination (TPPA).

Аналитические характеристики программно-аппаратного комплекса при регистрации результатов иммуноферментного анализа (ИФА) исследованы на 1317 образцах сывороток (определение антител к ТПО и ТГ, ТТГ, общего ПСА, свободного тироксина, трийодтиронина, ДЕА-S, антител к Chlamidia trachomatis класса G, HBsAg). При постановке иммунологических реакций применяли коммерческие тест-системы.

Для разработки технологии проведения реакции латекс -агглютинации (ЛА) и изосерологических исследований в формате 8х12 с видеоцифровой регистрацией результатов было отобрано 460 сывороток пациентов с известным содержанием СРБ, РФ, АСЛО и 201 образец цельной крови с установленной группой крови соответственно.

Для формирования матриц микрокапель исследуемых образцов или реагентов на планарных носителях использовали разработанные нами аппликаторы со стальными пинами различной толщины.

Серийный анализ глюкозы методом «сухой химии» проводили, нанося на мембрану «Меридиан» (фирма «NDP», Австралия), помещенную на специальный носитель, образцы сыворотки крови с помощью разработанного 30-пинового аппликатора.

Серийное определение альбумина в моче проводили, нанося 30-пиновым аппликатором образцы мочи пациентов на нитроцеллюлозную мембрану «Schleicher & Schull» (Германия). После блокировки мембраны в растворе сухого молока проводили реакцию с генноинженерным рецептором или моноклональными антителами к альбумину, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем мембраны промывали буфером и помещали в субстратную смесь, содержащую диаминобензидин. Для калибровки применяли мочу с добавлением известных количеств сухого альбумина человека.

Серийные исследования факторов ревматоидной тройки (СРБ, РФ, АСЛО) проводили, используя латексные реагенты «BioScience» (Франция), «BioSystems» (Испания). 30-пиновым аппликатором забирали микрокапли (0,3-0,5 мкл) латексной суспензии и образцов двукратных разведений тестируемой сыворотки и контролей из соответствующих микропланшетов. С помощью системы позиционирования-смешивания помещали их последовательно на носитель в виде упорядоченной матрицы точек и перемешивали. Контроль воспроизводимости и чувствительности разработанных методов осуществляли с помощью контрольных сывороточных аттестованных образцов фирмы «Randox» и «DiaSis».

Оценку аналитических характеристик матричных микрометодов определения: - аналитов ревматоидной тройки в тестах ЛА производили в ходе исследований 119 образцов сыворотки крови, - концентрации глюкозы в сыворотке и цельной крови при исследованиях 340 образцов и 37 образцов соответственно, - серийного определения содержания альбумина в моче в ходе исследований 67 образцов.

Серийные и мультиплексные исследования групп крови проводились с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-D-супер фирмы «Медиклон» (Россия). Суспензию эритроцитов (или образцы крови) и цоликлоны (исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты - для перекрестного метода) аппликаторами наносили на стекло и перемешивали.

Иммунохроматографические тесты для определения простатического специфического антигена (ПСА) различных фирм («Alfa Scientific Design» США, Medical» ЮАР и др.) использовали в сочетании с разработанной системой видеорегистрации. В качестве образцов для иммунохроматографического определения ПСА использовали 207 сывороток крови пациентов с заболеваниями предстательной железы, проходивших обследование по городской программе скрининга мужчин старше 40 лет, а также 169 сывороток здоровых мужчин.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы«STATISTICA-6 for WINDOWS» и MS Exell с учетом характера распределения и применением параметрических и непараметрических критериев.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Системы получения изображений аналитических объектов и принципы построения программного обеспечения для регистрации результатов клинических лабораторных исследований

Сфера применений видеоцифровых устройств для лабораторных исследований постоянно расширяется благодаря улучшению характеристик серийно выпускаемых сканеров и видеоцифровых камер, разработкам новых технологических решений. Методы видеоцифровой регистрации (ВЦР) могут быть использованы в качестве альтернативы методам обычной и отражательной фотометрии в приложении к традиционным объектам фотометрических исследований лабораторной диагностики, а в применении к методикам с визуальной регистрацией предоставляют такие преимущества как документирование и объективизация результатов исследований.

А. Использованные системы получения изображений аналитических объектов.

На рис.1 показаны варианты адаптированных к различным аналитическим объектам видеоцифровых систем получения изображения, использованных в данной работе, к которым разрабатывалось специализированное программное обеспечение.

Рис. 1 Модификации регистрирующих видеоцифровых устройств на основе видеоцифровой камеры: (а) - «Рефлеком-Мини»; (б) - анализатор «Рефлеком»; (в) - «Рефлеком-компакт» и на основе сканера: (г) - разработанная нами система «Эксперт-Лаб»

На рис. 1(а-в) представлены несколько вариантов систем на основе видеоцифровых камер. Обычная система «Рефлеком» (б) позволяет регистрировать результаты иммунохроматографических тестов, матричных дот - тестов в формате 5х6 в режиме отражения и тестов в формате 3х4 в режиме пропускания. Разработанные нами системы «Рефлеком-Компакт» (в) и вариант «Рефлеком-Мини» (а) (решенная в виде моноблока с мини-компьютером), предназначены для работы с иммунохроматографическими тестами в полевых условиях и являются модификацией исходной системы, работающей с тем же программным обеспечением. Все системы «Рефлеком» в автономном режиме могут питаться от батареи компьютера. На рис. 2 (г) показана разработанная нами система «Эксперт - Лаб» на основе сканера.

Системы получения изображения на основе видеокамер и сканеров имеют свои достоинства и недостатки. Видеоцифровые ПЗС - камеры компактны, позволяют получать качественные изображения, обеспечивают высокую скорость съемки, дают возможность конструировать малогабаритные мобильные и универсальные, чем сканеры, приборы. К недостаткам систем с видеокамерами относятся: небольшое поле зрения и сложность создания равномерного освещения исследуемого объекта.

Сканеры доступны по ценам, дают изображения высокого разрешения, обладают хорошей цветопередачей. Из-за больших размеров и требований к электропитанию они используются в основном только как стационарное оборудование.

Существенным достоинством системы «Эксперт - Лаб» является возможность работы с широко распространенными лабораторными тестами, проводимыми в 96-луночных планшетах, изображения которых можно получать в режиме пропускания, а затем вычислять аналитические параметры, относящиеся к каждой из 96 лунок планшета.

Разработка систем ВЦР велась на основе универсального построения интерфейсов, вне зависимости от типа устройства получения изображения. Алгоритмы обработки информации создавались в соответствии с характеристиками конечных результатов для конкретных типов реакций. Благодаря этому подходу удалось создать многофункциональные устройства, способные обеспечивать достоверную и объективную регистрацию результатов широкого спектра клинических лабораторных исследований.

Б. Построение программного обеспечения (ПО) для иммунохроматографических полосок и полосок «сухой химии» c регистрацией в режиме отражения.

В настоящее время одним из важных направлений развития лабораторных иммунологических и биохимических экспресс исследований стали иммунохроматографические тесты и тесты «сухой химии».

На иммунохроматографических (ИХ) тест - полосках в результате исследования предусмотрено появление нескольких линий ? контрольной, обозначающей пригодность теста, и тестовых, обозначающих наличие или отсутствие определяемого аналита. Номенклатура доступных ИХ тестов постоянно расширяется, и почти полностью совпадает со спектром распространенных иммуноферментных определений. Однако в лабораторной диагностике ИХ тесты имеют ограниченное применение из-за проблем, связанных с отсутствием документирования и субъективностью оценки результатов.

Нами разработано программное обеспечение «Видеотест», позволяющее документировать и проводить количественную оценку результатов ИХ тестов. На рис. 2 (а) показано выделение аналитически значимой ИХ полоски и представление в рабочем окне этой программы гистограмм интенсивности линий на полоске после проведения теста.



Рис. 2 Фрагменты окон настройки разработанных нами программ обработки результатов ИХ - тестов и тестов «сухой химии». (а) - выделение рамкой аналитического поля ИХ - тест - полоски в окне настройки программы и его изображение в окне программы с гистограммой интенсивностей; (б) - расположение аналитических зон на тест - полоске сухой химии; (в) - рабочее окно представления информации об изменении цвета тест - полоски в ходе реакции с сывороткой крови в кинетическом режиме

Разработанное ПО дает возможность не только выделить аналитически значимые части изображения («зоны интереса»), которыми являются линии, появляющиеся в результате реакции, но рассчитывать и регистрировать в цифровом виде интегральную интенсивность линий в контрольной и тестовой зонах. Интегральная интенсивность линий, как цифровая характеристика, затем используется во всех дальнейших вычислениях, в частности для оценки результатов. Можно также установить пороговые значения для автоматического определения положительных или отрицательных результатов теста, или наличия контрольной полосы для подтверждения пригодности теста.

Программа «Видеотест» для ИХ полосок предусматривает сохранение всей аналитической информации в цифровом виде в памяти компьютера, включая исходное изображение аналитической зоны тест - полосок, которое в данном случае является «первичным документом теста» (ПДТ).

Программное обеспечение «Видеотест» является универсальным и может быть адаптировано к любым иммунохроматографическим полоскам. Результаты, полученные при применении программы «Видеотест» для полуколичественных определений на примере простатического специфического антигена (ПСА) приведены далее.

Тест - полоски «сухой химии» для биохимического анализа крови и мочи широко используются в клинической лабораторной диагностике и являются традиционным объектом регистрирующих приборов на основе обычной рефлектометрии. Однако и для этих объектов видеоцифровая регистрация обладает рядом преимуществ. На рис. 2(б) и 2 (в) показаны расположение аналитической зоны («зона интереса») и компенсации на изображении тест - полоски и окно представления информации об изменении цвета тест - полоски в кинетическом режиме, соответственно.

Каждая «зона интереса» и изображение каждой полоски может обрабатываться одновременно. Это дает системам ВЦР многие преимущества перед традиционными рефлектометрическими методами, такие как: (1) сохранение первичного изображения тест - полоски (ПДТ); (2) возможность работать с произвольным количеством независимых каналов регистрации, то есть анализировать несколько полосок одновременно; (3) применимость этого подхода к различным типам тест - полосок в режиме конечной точки и в кинетическом режиме. Таким образом, с использованием разработанного гибкого ПО для полосок «сухой химии» возможна объективная интерпретация результатов и получение информации в виде концентраций соответствующих аналитов.

Для иммунохроматографических полосок и полосок «сухой химии» предусмотрено сохранение всей первичной информации о прохождении исследований с возможностью ретроспективного контроля и коррекции ошибочных результатов.

В. Принципы построения ПО для регистрации исследований в 96-луночных планшетах и на основе матричных объектов.

Как было отмечено выше, существенным достоинством систем ВЦР является возможность выделения и независимой обработки информации любого количества зон интереса. То есть, системы ВЦР при соответствующем построении ПО являются многоканальными с произвольным количеством каналов. Особенно эффективным такой многоканальный режим является при работе с объектами, представляющими собой совокупность многих аналитических зон. К самым распространенным в клинических лабораториях объектам такого типа относятся 96-луночные плоскодонные или круглодонные микропланшеты для иммунологических исследований. Широко используются и другие аналитические объекты, представляющие собой упорядоченные матрицы точек, микроматричные («microarray») объекты или микрочипы.

С позиции построения интерфейсов ПО такие объекты принципиально не отличаются друг от друга. Получение изображений 96-луночных планшетов из-за их значительных размеров и трехмерной (не плоскостной) геометрии возможно только с помощью сканерной системы «Эксперт-Лаб», в то время как с матричными объектами в микроформате можно применять и анализатор «Рефлеком».

Зонами интереса для 96-луночного планшета и для мембраны с матрицей окрашенных точек являются индивидуальные лунки планшета и точки матрицы, соответственно. После получения изображения в каждой из лунок микропланшета и в каждой из точек матрицы с помощью разработанных алгоритмов можно в численной форме определить или оптическую плотность содержимого лунки, или интенсивность окрашивания индивидуального пятна. По этим численным значениям можно определить концентрации соответствующих аналитов.

Более сложные математические процедуры необходимы в тех случаях, когда в результате иммунологических реакций возникают неоднородные объекты. Такие реакции, как реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция латекс - агглютинации, реакции агглютинации эритроцитов приводят к формированию в лунках осадков, характерных для каждого типа исследования, по наличию или отсутствию которых и определяется положительный или отрицательный результат реакции. Для каждого варианта таких исследований разрабатывался свой алгоритм обработки изображения.

Единый принцип построения интерфейсов всех программ, относящихся к матричным объектам, проиллюстрирован на рис. 3 на примере программы для регистрации результатов реакции латексной агглютинации, проводимой на крышке стандартного 96-луночного микропланшета (программа «Эксперт-Лаб Агглютинация»).

Рис. 3 Схема организации основных рабочих окон разработанного нами ПО сканерной системы для регистрации результатов исследований в формате 96-луночного планшета на примере окна программы «Эксперт-Лаб Агглютинация»

В нижнем левом углу компьютерного окна представлено сохраняемое первичное изображение результатов реакции, зафиксированное в строго заданный методикой момент времени. Сохранение исходного изображения в цифровом формате обеспечивает ретроспективный контроль результатов, возможность консультаций, выявление ошибок, связанных с «человеческим фактором», что особенно важно для тестов с визуальной оценкой результатов. В левой верхней части экрана отображены данные автоматической интерпретации результатов с возможным обозначением цветом.

Помимо этих возможностей, существенное значение имеет применение компьютерного редактирования цифровых изображений. Любая часть изображения может быть контрастирована, помещена в отдельное окно, увеличена. Все это позволяет оператору быть более объективным при визуальной оценке результатов, так как изображение фиксируется в строго определенный момент времени. Этот последний факт особенно важен для таких быстро протекающих реакций как латексная агглютинация. При необходимости, можно одновременно вывести на экран увеличенное изображение

нескольких проб (положительный и отрицательный контроль). Численная характеристика агглютинации также выводится на экран (рис.3, справа вверху), обеспечивая дополнительной информацией для принятия верного решения.

Результаты агглютинационных иммунологических реакций традиционно учитываются визуально, и применение систем ВЦР с сохранением и компьютерной обработкой информации существенно повышает достоверность таких исследований.

Подробное описание специализированных пакетов программ для регистрации результатов клинических лабораторных исследований на основе матричных объектов и результаты оценки характеристик применения ПО в сочетании с видеоцифровыми системами получения изображений приведены далее.

2. Оценка характеристик видеоцифрового аппаратно-программного комплекса «рефлеком» для регистрации результатов иммунохроматографических тестов и тестов «сухой химии»

А. Определение общего простатического специфического антигена на основе ИХ-тестов с регистрацией аппаратно-программным комплексом «Рефлеком».

Простатический специфический антиген (ПСА) считается эффективным маркером для дифференциальной диагностики рака предстательной железы (РПЖ) и доброкачественной гиперплазии простаты (ДГПЖ), а также для контроля эффективности лечения РПЖ. ПСА в незначительных концентрациях присутствует в крови здоровых людей. Уровень ПСА в крови ниже 4 нг/мл считается нормальным, концентрация от 4 до 10 нг/мл - зона риска. В настоящее время определение общего ПСА с успехом используется для скрининговых обследований. Одним из наиболее доступных вариантов порогового определения общего ПСА являются ИХ - тесты.

Традиционные лабораторные иммунологические методы определения ПСА требуют дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала. Система на основе ИХ тест - полосок и видеоцифрового анализа позволяет проводить с достаточной достоверностью скрининговые обследования на ПСА и может существенно повысить доступность и широту внедрения скринингового обследования.

На рис. 4 (а) показаны типичные регистрируемые картины аналитических полей ИХ - тестов фирм «Alfa Scientific Design» для сывороток с различным содержанием ПСА.



Рис. 4 (а) Изображения аналитических полей и гистограмм ИХ-полосок фирмы «Alfa Scientific Design» для сывороток с содержанием ПСА 10 нг/мл (вверху) и менее 3 нг/мл (внизу); (б) Сопоставление данных интенсивности окрашивания тестовой полосы (интегральной величины левого пика гистограмм на рис 4 (а) в условных единицах и концентрации ПСА образцов сывороток крови

При концентрациях ПСА около 10 нг/мл все тесты обычно показывают две хорошо различимых линии. В этих случаях визуальная интерпретация не вызывает проблем, и это характерно для большей части сывороток при концентрациях ПСА выше 6-7 нг/мл. Однако при значениях концентрации ПСА около порогового значения (3-4 нг/мл), где трудно определить наличие или отсутствие тестовой полосы, интерпретация теста затруднена. В ситуациях с неоднозначным результатом, безусловно, необходимо сохранение первичного документа о проведенном исследовании. Применение видеоцифровой регистрации приближает ИХ-метод по диагностической ценности к более сложным лабораторным методикам.

На рис. 4 (б) приведены результаты измерений концентрации ПСА в исследуемой панели сывороток на анализаторе «VICTOR 1420» с наборами «Дельфия» в сопоставлении с данными интегральной интенсивности полос ИХ -тестов фирмы «Alfa Scientific Design». Показаны результаты для сывороток, уровень ПСА, в которых по данным референсного метода, был выше 4 нг/мл. Данные для сывороток пациентов с концентрациями ПСА в сыворотке менее 1 нг/мл не приводятся.

Результаты показывают высокую степень взаимосвязи между методами (r =0,92, при p<0,05). Приведенные данные позволяют сделать вывод, что иммунохроматографический анализ с видеоцифровой регистрацией является адекватным и достоверным методом. Такой метод может быть вариантом выбора для скрининга, так как не требует условий оснащенной лаборатории, обученного персонала и легко реализуется при выездных обследованиях.

Б. Биохимические исследования крови на основе тестов «сухой химии» с применением аппаратно-программного комплекса «Рефлеком-БХК».

Программно-аппаратный комплекс «Рефлеком-БХК» на основе ВЦР был разработан для измерения ряда биохимических параметров с использованием тест - полосок «сухой химии» производства фирмы «Аркрей» (Япония) для применения в условиях орбитальной станции.

В разработанном комплексе использовалась регистрация изменений цвета и/или интенсивности окрашивания аналитических зон тест - полосок при нанесении на них образцов сыворотки крови или плазмы. Из-за необходимости регистрации результатов в широком спектральном диапазоне, изображение аналитических зон тест - полосок осуществлялось с помощью освещения в различных длинах волн видимой части спектра. Невозможность применения автоматизированных систем в условиях невесомости обусловила необходимость нанесения образцов сыворотки на тест - полоски с помощью обычных микродозаторов. Для сокращения времени проведения анализа по многим параметрам использовался многоканальный вариант регистрации, обеспечивающий одновременное проведение реакции на 8-ми тест -полосках.

Применена модифицированная конструктивная схема прибора «Рефлеком», адаптированная по размерам поля зрения видеокамеры и спектральным характеристикам освещения. Система позиционирования тест-полосок обеспечивает размещение 8 тест-полосок и поддержание постоянной температуры 37°С в аналитической зоне. ПО «Рефлеком-БХК» позволяет автоматически получать изображения аналитических зон тест-полосок той или иной видеокамерой, в зависимости от типа определяемого параметра и обрабатывать изображения с получением соответствующих значений концентраций аналитов. Данные по сходимости при измерении контрольной сыворотки фирмы «Аркрей» с регистрацией результатов на анализаторе «Рефлеком-БХК» суммированы в таблице 1. Обращает на себя внимание, что практически по всем аналитам CV не превышает ПДЗ CV10 согласно приказу МЗ РФ № 45 от 07.02.2000 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

Таблица 1 Данные измерений контрольной сыворотки (диапазон паспортных значений приведен в таблице) на ВЦР анализаторе «Рефлеком-БХК»

Название теста	Паспорт-ные значения	Единицы измерения	Среднее значение (Хср)	Коэффициент вариации (CV, %)	ПДЗ коэффициент вариации (CV10, %) (приказ 220)
АЛТ	210-314	МЕ/л	260,4	4,3	16,0
АСТ	201-301	МЕ/л	275,8	13,5	11,0
Амилаза	285-427	МЕ/л	351,3	10,9	11,0
ГГТ	222-332	МЕ/л	289,8	9,1	11,0
КФК	367-551	МЕ/л	437,4	9,9	22,0
ЛДГ	965-1447	МЕ/л	1193,2	9,2	11,0
Общий холестерин	3,04-4,56	ммоль/л	3,8	0,7	8,0
Три-глицериды	1,45-2,17	ммоль/л	1,4	3,2	16,0
ЛПВП	0,29-0,69	ммоль/л	0,5	3,8	8,7
Глюкоза	173-211	ммоль/л	10,5	1,6	5,0
Фруктоз-амин	455-637	мкмоль/л	553,4	3,2	4,2
Альбумин	22-34	г/л	28,3	3,3	4,0
Общий билирубин	60-90	мкмоль/л	75,9	2,5	16,0
Мочевина	13,1-19,7	ммол/л	16,8	1,2	11,0
Мочевая к-та	352-528	мкмоль/л	445,9	1,9	8,0
Ca	2,99-4,49	ммоль/л	3,7	1,6	3,3
Mg	0,82-1,23	ммоль/л	1,1	1,8	7,0
Неорганический фосфор	1,27-1,9	ммоль/л	1,5	1,6	8,0

3. Оценка характеристик аппаратно-программного комплекса «эксперт-лаб» для регистрации иммунологических исследований в формате стандартного 96-луночного и разработанного 12-луночного планшета

В этом разделе приводятся данные исследований применения разработанной нами системы «Эксперт-Лаб» на основе сканера с различными типами специализированного ПО для регистрации результатов иммуноферментного анализа (ИФА), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и латексной агглютинации (ЛА) в формате стандартного 96-луночного планшета и латексной агглютинации (ЛА) в формате 12-луночного планшета.

А. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для регистрации результатов твердофазного иммуноферментного анализа в 96-луночных микропланшетах.

Разработанный нами аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с ПО «Эксперт-Лаб ИФА» может быть с использован в качестве вертикального фотометра для микропланшетов при проведении ИФА. Он не уступает по характеристикам высококлассным фотометрам с расширенными опционными возможностями. Оценка характеристик регистрации результатов ИФА с применением комплекса «Эксперт Лаб» была проведена в сопоставлении с данными анализатора «VICTOR 1420» («Wallac», Финляндия) при длине волны 450 нм. Воспроизводимость двух систем сопоставлялась при многократных измерениях набора фильтров КПА-01 для метрологической поверки вертикальных фотометров. Полученные коэффициенты вариации во всем диапазоне оптических плотностей для обоих приборов не превышали 1%.

Следующим этапом работы являлась апробация аппаратно-программного комплекса для обычных задач ИФА в КДЛ. На рис. 5. представлены данные измерений значений ОП модельного планшета, полученные с помощью аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и на анализаторе «VICTOR 1420». Очевидно полное совпадение результатов в диапазоне оптических плотностей от 0 до 3 оптических единиц (коэффициент корреляции по Спирмену - 0,999). При значениях оптических плотностей выше 3,0 прибор «VICTOR» выходит за паспортный предел измерений, который для него составляет 3,0, а сканер позволяет измерять и такие значения оптической плотности.

Количественные методы лабораторных измерений подразумевают построение калибровочной кривой и определение по ней концентрации аналитов. Программа «Эксперт-Лаб ИФА» позволяет вводить значения калибраторов, строить калибровочную кривую и определять значения концентраций исследуемых веществ. Для применяемых в лабораторной практике вариантов количественных определений ИФА были проведены сопоставления значений концентраций для различных схем постановки реакций.



Рис. 5 Сравнение значений ОП, полученных с помощью разработанного нами аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и на анализаторе «VICTOR 1420»

Данные сопоставительных исследований приведены в таблице 2. Уравнения регрессии и коэффициенты корреляции для различных типов иммуноферментных реакций: количественный конкурентный (свободный тироксин, трийодтиронин, ДЕА-S), количественный «сэндвич» (антитела к ТПО и ТГ, ТТГ), качественный с определением «cut off» (антитела к Chlamidia trachomatis класса G, HBsAg) демонстрируют статистическую неразличимость данных, полученных с помощью двух систем регистрации.

Предлагаемое для сканерной системы ПО дает возможность разных вариантов обсчета и представления получаемой информации во всех режимах измерения (оптические плотности, вариант «cut off», измерение концентраций). Программа обеспечивает удобную предварительную разметку планшета, гибкие варианты распечаток.

Таблица 2 Статистическая проверка сопоставимости концентраций аналитов, измеренных на фотометре и сканере

Аналит	Уравнение Регрессии	Коэффициент Корреляции
Антитела к ТПО	y = 1,0274x -2,6629	0,968
Антитела к ТГ	y = 0,9994x -0,7105	0,843
ТТГ	y =1,0016x +0,0521	0,999
Свободный тироксин	y = 1,0047x -0,3034	0,995
Трийодтиронин	y = 0,9917x-0,4691	0,942
ДЕА-S	y = 1,1354x -0,1163	0,998
Антитела к Chlamidia trachomatis класса G	y = 0,9117x+0,1691	0,999
HbsAg	y = 0,8919x+0,171	0,999

На основе анализа изображения лунок для ПО «Эксперт-Лаб ИФА» разработана опция автоматического выявления лунок, имеющих неоднородную окраску, которые отмечаются в итоговом протоколе анализа. Эта уникальная функция, принципиально недоступная для обычных фотометров, дает возможность выявить неправильные измерения, часто имеющие место, например, для гиперактивных образцов, измерение которых приводит к выпадению субстрата в осадок из-за повреждений поверхности лунок и других ошибок проведения ИФА определений. Применение функции выявления лунок с негомогенной окраской показано на рис. 6.

Рис. 6 Пример выявления лунок с негомогенной окраской с помощью ПО «Эксперт-Лаб ИФА» (увеличенное изображение и выделение лунки А12 с неоднородной структурой)

Кроме того, сканерная система позволяет сохранять первичное изображение планшета, что обеспечивает ретроспективный контроль для любых спорных, требующих повторного анализа, ситуаций.

Таким образом, полученные результаты показывают, что аппаратно-программный комплекс «Эксперт-Лаб» с соответствующим ПО может использоваться в качестве вертикального фотометра, причем предоставляет пользователю ряд преимуществ, принципиально недоступных для обычных фотометров.

Б. Применение комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакции агглютинации желатиновых частиц.

Для регистрация результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) разработка алгоритмов ПО («Эксперт-Лаб РПГА») проводилась по экспериментальным данным, полученным при применении трепонемных эритроцитарных диагностикумов для скрининга наличия антител к Treponema pallidum.

Основное окно программы построено по описанному выше принципу с представлением сохраняемого первичного изображения, расчетных оценок интенсивности реакции в каждой лунке, данных автоматической интерпретации результата реакции для каждого образца. Предусмотрена опция вывода на экран увеличенных изображений любых лунок, обеспечивающая возможность более объективного заключения о прохождении реакции.

Для изучения характеристик разработанной системы регистрации результатов РПГА было исследовано 9964 сыворотки, из них 381 образец (3,8%) имел положительный результат РПГА, 75 образцов (0,75%) были сомнительными.

Наличие численной оценки интенсивности реакции на основании рассчитанных целевых значений позволяет вести контроль качества. Для этого использовали лиофилизированную сыворотку (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), выпускаемую для внутрилабораторного контроля качества. На рис. 7 приведен пример контрольной карты. Для расчета CV и построения контрольной карты вычисляли коэффициент позитивности (КП ? интенсивность агглютинации пробы/интенсивность агглютинации отрицательного контроля). Целевые значения составили: Хср = 3.1, SD = 0.57, CV20 = 18%.

Рис. 7 Контрольная карта для определения антител к Tr.pallidum методом РПГА с ВЦР, построенная на основе числовой оценки интенсивности реакции

Сравнение визуального и инструментального учета результатов РПГА разработанной системой показало высокий уровень корреляции получаемых результатов (R Cпирмена 0,999, р =0,00005).

Были проведены эксперименты по сопоставлению автоматического учета и оценки результатов четырьмя опытными операторами, которые продемонстрировали субъективность при визуальном учете результатов РПГА. Процент расхождений оценок операторов при визуальной оценке РПГА составил от 2% (отрицательные результаты) до 47% (результаты +/?). В отличие от визуальной оценки, программа «Эксперт-Лаб РПГА» полностью формализует представление результатов степени выраженности агглютинации, не меняющихся при повторных оценках планшетов, то есть позволяет объективизировать учет результатов.

Для регистрации результатов реакции агглютинации желатиновых частиц был разработан вариант программного обеспечения «Эксперт-Лаб Serodia» и продемонстрирована возможность использования этой модификации программы для тест-систем на основе сенсибилизированных желатиновых частиц фирмы «Serodia» для определения антител к вирусу гепатита С, ВИЧ 1 и 2, антител к Tr.pallidum (ТРРА), РФ, АСЛО, антистрептокиназы. Для таких и аналогичных тест-систем также важна объективизация результатов анализа.

На рис. 8 в качестве примера показаны лунки с положительными, сомнительными и отрицательными результатами реакции агглютинации при исследовании на антитела к Tr.pallidum, к HCV.

Рис. 8 Изображения положительных (+), сомнительных (+/?) и отрицательных (?)результатов определения антител к Tr.Pallidum, HCV в тестах агглютинации желатиновых частиц фирмы «Serodia»

Для проверки совпадения результатов РПГА и ТРРА с применением ВЦР было параллельно исследовано 46 положительных и 46 отрицательных проб. Обработка результатов привела к регрессионной кривой: RPGA = 1,3381 + 0,94618 * Serodia, R Спирмена 0,93, что подтверждает соответствие результатов двух этих методов.

В. Применение и характеристики комплекса «Эксперт-Лаб» для оценки результатов реакции латексной агглютинации.

Исследования латексной агглютинации в формате 96-луночного планшета проводили на прозрачных крышках 96-луночного планшета, где лунки отделены друг от друга бортиками (фирмы “Costar”, США). Стандартный способ проведения реакции латексной агглютинации (ЛА) подразумевает использование непрозрачных карточек со специальными реакционными полями, на которых смешивается по 50 мкл латексного реагента и исследуемого образца, результат оценивается визуально через 2-3 минуты. Для ВЦР с комплексом «Эксперт-Лаб» использовалось измерение в режиме пропускания с проведением реакции в крышках планшетов. Расход реагентов и сывороток при этом составлял не более 10 мкл, то есть снизился в 4-5 раз по сравнению со стандартной методикой. Полученное первичное изображение всей крышки сохраняется в памяти компьютера и служит основой для последующих цифровых операций с конкретными «зонами интереса» (контрастирование, увеличение, математическая обработка). Основное рабочее окно программы «Эксперт-Лаб Агглютинация» показано ранее на рис.3.

В качестве модели для оценки характеристик реакции ЛА с видеоцифровой регистрацией было выбрано определение СРБ, РФ и АСЛО. На рис. 9 показаны увеличенные изображения лунок с наличием агглютинации при определении СРБ, РФ, АСЛО, причем видно, что морфология конгломератов различается для разных латексов.



Рис. 9 Изображения лунок с положительными образцами (наличием агглютинации) при определении СРБ, РФ, АСЛО соответственно

Разработанное ПО предоставляет возможности программной обработки полученного изображения для облегчения визуальной оценки степени выраженности ЛА, такие как контрастирование, одновременный анализ на экране увеличенных изображений отдельных лунок для тестируемой сыворотки и контролей, показ аналогового представления количества образовавшихся комплексов. На рис. 10 проиллюстрировано применение этих опций на примере определения СРБ.

Рис.10 Изображения лунок с тестируемыми положительной (А8) и отрицательной (А9) сыворотками: (а) исходное, (б) после контрастирования, (в) результаты математической обработки, отражающие количество конгломератов

Результаты расчета количества конгломератов в образцах выражаются числом, отражающим интенсивность реакции и, таким образом, дают возможность количественной оценки результата реакции агглютинации и определения порогового значения для автоматической дискриминации положительных и отрицательных образцов, что снижает влияние случайных и системных ошибок на результат лабораторного исследования.

Аналитические характеристики разработанного метода ЛА с видеоцифровой регистрацией исследовали с использованием контрольных сывороток фирмы «Randox» трех уровней концентраций и латексов фирмы «BioSystems». Для расчета сходимости и воспроизводимости использовали численные значения интенсивности агглютинации, полученные в ходе программной обработки. Полученные данные представлены в табл. 3.

Таблица 3 Данные по сходимости и расчетные значения целевых значений интенсивности агглютинации в контрольных сыворотках «Randox»

	Концентрация по паспорту контролей	CV20, %	СVBC,%	CV по данным производителя,%	Средние значения интенсивности по 20 определениям (Хcp±m)
СРБ	(мг/л)			25
Level 1	21,8 - 29,6	12,2	16,9		18257686
Level 2	44,7 - 60,5	11,8	13,7		29242892
Level 3	66,6 - 90,0	9,2	12,0		390601046
РФ	МЕ/мл			25
Level 2	32,2 - 48,4	7,3	7,6		27996476
Level 3	45,0 - 67,6	9,3	11,3		418021053
АСЛО	МЕ/мл			20
Level 3	309 - 399	10,2	15,1		12451416

Обращает на себя внимание, что для всех аналитов CV20 меньше заявленного для полуколичественных латексных тест-систем. Наличие расчетных цифровых результатов агглютинационных тестов при видеоцифровой регистрации позволяет также проводить внутренний и внешний контроль качества при выполнении исследований методом латексной агглютинации, что, в принципе, невозможно при визуальном учете.

Расчет минимальной концентрации исследуемых веществ (аналитическая чувствительность) метода ЛА с ВЦР, проводился методом двукратных разведений контрольных сывороток и составил для СРБ-6,72,3 мг/л, РФ-10,43,4МЕ/мл, АСЛО-26879МЕ/мл. Оценку правильности исследуемого метода проводили на положительных образцах сывороток методом двукратных разведений для получения значения концентрации

исследуемых аналитов. Параллельно они исследовались на анализаторе AU 640, фирмы «Olimpus Corporation». При сравнении полученных данных для СРБ (n=28) и РФ (n=38) коэффициенты корреляции (R) Спирмена составили 0,90 и 0,95 соответственно.

Результаты определения СРБ, РФ и АСЛО с помощью системы «Эксперт-Лаб-агглютинация и визуальной оценкой приведены в таб.4.

Таблица 4 Результаты определения СРБ, РФ и АСЛО с помощью системы «Эксперт-Лаб» в сопоставлении с данными визуальной регистрации.

Исследуемый аналит	Регистрация результата	Кол-во образцов	% несовпадений
		всего	отрицат.	положит.
СРБ	визуально	237	174	63	9,7
	ВЦР	237	193	44
РФ	визуально	174	94	52	1,1
	ВЦР	174	95	51
АСЛО	визуально	77	60	17	6,5
	ВЦР	77	61	16

Сопоставление визуальной и инструментальной оценки протекания реакции ЛА для 488 исследуемых образцов ЛА выявило 34 случая несовпадения полученных результатов из-за ошибок оператора.

Доступность объективного метода контроля качества лабораторных исследований при применении такого широко распространенного метода, как латексная агглютинация, имеет важное практическое значение.

Разработанная методика проведения реакции латексной агглютинации в формате 12-луночных микропланшетов позволяет еще более снизить количество реагентов и образцов, необходимое для проведения исследований этим методом. Для реализации этой задачи был разработан специальный планарный носитель - 12-луночный микропланшет для применения с системой ВЦР. Изображение такого микропланшета в исходном состоянии (а) и с нанесенными смесями латексного реагента и проб сыворотки (б) представлено на рис. 11.

Рис.11 Микропланшет формата 3х4 в исходном состоянии (а) и заполненного пробами и реагентами при проведении реакции латексной агглютинации (б)

Рабочее окно программы для исследований в 12-луночном микропланшете при проведении реакции латексной агглютинации показано на рис.12.

...