Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии

14.00.36 - Аллергология и иммунология

03.00.06 - Вирусология

доктора медицинских наук

Миронов Александр Николаевич

Москва, 2009

Работа выполнена на ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ и

в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные консультанты:

академик РАМН, профессор В.В. Зверев

доктор медицинских наук, профессор Н.А. Михайлова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Ковальчук

доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин

доктор медицинских наук С.Г. Маркушин

Ведущая организация: НИИ гриппа СЗО РАМН

Защита состоится «25» марта 2010 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «25» декабря 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.В. Яковлева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Грипп - острая вирусная инфекция с воздушно-капельным путем передачи, характеризующаяся острым началом, лихорадкой, общей интоксикацией и поражением респираторного тракта. Эпидемии гриппа происходят ежегодно, поражая до 15 % населения Земного шара, значимо увеличивая смертность в группах повышенного риска, увеличивая затраты на медицинскую помощь и нанося серьезный экономический ущерб. По частоте и количеству случаев грипп и ОРВИ занимают первое место, составляя 95 % всех инфекционных заболеваний. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. заболевших гриппом и другими ОРВИ [Литвинова О.М, 2001; Couch R.B., 1999; Palach A.M., 1991; Palache A.M., 1997].

Кроме ежегодных эпидемий вирус гриппа А может вызывать и пандемии. Пандемии всегда являлись событиями мирового значения. Они возникали в результате появления высококонтагиозного вируса гриппа, к которому большая часть населения не имела иммунитета, и, как следствие, практически глобальной восприимчивости людей к инфекции. Характерными особенностями пандемий являлись быстрота распространения гриппа по всем частям света, как правило, менее чем за год, и подверженность заболеванию более четверти всего населения. Помимо высокой смертности пандемии всегда отличались внезапностью возникновения вспышки заболевания, не позволяющей адекватно подготовиться к борьбе с инфекцией. В прошлом столетии отмечено три пандемии гриппа: «испанский грипп» в 1918 г., «азиатский грипп» в 1957 г. и «гонконгский грипп» в 1968 г. «Испанка» унесла от 40 до 50 миллионов человек во всем мире [Mills C.E, 2004; White L.F, 2008]. Ни сроки, ни последствия следующей пандемии невозможно предсказать определенно.

Из известных 15 подтипов вируса гриппа А подтип H5N1 обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом: он быстро мутирует и вступает в рекомбинацию с вирусами, инфицирующими различные виды животных, в том числе млекопитающих [Cleaveland S, 2006; Vahlenkamp T.W, 2008; Chang S, 2007]. Первый подтвержденный случай заражения людей гриппом птиц произошел в Гонконге в 1997 г., когда H5N1 вызвал тяжелое респираторное заболевание у 18 человек, из которых 6 умерло, причем заболевание было вызвано вирусом, циркулирующим в тот момент в популяции местной домашней птицы [Wong S.S, 2006; Lewis D.B, 2006].

В настоящее время активно дискутируется вопрос о возможности распространения новой пандемии гриппа [Garcнa-Garcнa J, 2006; Thomas J.K, 2007; Kleinman A.M, 2008javascript:PopUpMenu2_Set(Menu18269321);]. Опасность представляет не только широкое распространение подтипа H5N1 в популяции птиц, но также высокая летальность данного вируса для человека: из 433 случаев заболевания людей гриппом H5N1 262 закончились летальным исходом [WHO, 2009]. В случае с гриппом птиц Н5N1 была определена 3 фаза предупреждения пандемии гриппа.

13 апреля 2009 г. в Мексике был подтвержден первый случай заражения новым видом вируса, который получил название «свиной грипп». Позже, когда был идентифицирован штамм возбудителя (California/07/2009), болезнь получила название грипп H1N1. Появление и циркуляция данного вируса гриппа Н1N1 в популяции людей привела к объявлению 27.04.09 г. 6 фазы предупреждения о пандемии. Объявление этой фазы указывает на то, что началась глобальная пандемия. По данным ВОЗ на 15.06.2009 в мире случаи заражения вирусом гриппа H1N1 зафиксированы в 76 странах. Общее число заболевших составляет 35928 человек, из них смертью закончились 163 [Li G.-X, 2009; Bolotin S, 2009; et al].

Можно предполагать, что причина столь быстрого распространения вируса H1N1 в человеческой популяции является отсутствие иммунитета у человека и наличие в геноме данного вируса генов от вируса гриппа птиц и вируса гриппа человека [WER, 2009; Hurt A.C, 2009; MMWR, 2009].

В плане предупреждения возникшей угрозы здоровью людей вакцинация будет основным инструментом в борьбе с инфекцией. Следовательно, разработка эффективных вакцин против пандемического гриппа - вопрос первостепенной важности. Лабораторно-экспериментальные исследования, проведенные с субтипом Н5N1 показали, что существует реальная проблема разработки пандемических вакцин, связанная с тем, что отработанные и принятые повсеместно схемы применения (способ введения, кратность, интервал, доза) сезонных гриппозных вакцин не эффективны в случае «птичьего» или «свиного» гриппа [Desheva J.A, 2006; Howard M.K, 2008; MMWR, 2009; WHO, 2009].

Еще одной проблемой, связанной с появлением пандемического вируса гриппа, является недостаток производственных мощностей для обеспечения населения вакциной.

Новые технологии должны сыграть важную роль в разработке наилучшей вакцины против пандемического гриппа. Идеальная вакцина должна быть безопасной и высокоэффективной с точки зрения защиты во всех целевых группах, включая грудных детей и престарелых. Препарат должен содержать небольшое количество антигена вируса и храниться без охлаждения. И наконец, такая вакцина должна производиться в больших масштабах и недорого стоить [ВОЗ, 2005].

Стратегии производства эффективных вакцин, использующих меньшее содержание антигена, за счет включения в состав препарата адъюванта, могут привести к значительному увеличению производственного потенциала, но для этого необходимо проведение полномасштабных доклинических и клинических исследований, доказывающих безопасность и иммуногенность сконструированных препаратов.

Имея в виду изложенные аргументы, проведение целенаправленных фундаментальных и прикладных исследований по разработке и изучению свойств «макетных» пандемических вакцин против гриппа является актуальной проблемой.

Целью настоящей работы являлось экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии.

Задачи исследования:

1. Сконструировать живую и инактивированные потенциальные («макетные») препандемические гриппозные вакцины.

2. Изучить физико-химические и молекулярно-биологические свойства отечественных потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин.

3. Провести доклинические и клинические исследования живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» и оценить их результаты.

4. Провести сравнительные доклинические и клинические исследования гриппозных инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» и выбрать наиболее оптимальный вариант;

5. Провести доклинические и клинические исследования гриппозной инактивированной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцины «АвиФлю» и оценить их результаты.

6. Разработать оптимальную стратегию вакцинации населения в период подготовки к пандемии.

Научная новизна. Впервые изучены свойства живой «Ультрагривак» и инактивированных субъединичной сорбированной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной сорбированной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа.

В ходе проведенных исследований впервые:

- выбраны наиболее перспективные варианты потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа - живая «Ультрагривак», инактивированные адсорбированные - субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;

- экспериментально обоснована необходимость применения двукратной схемы вакцинации с целью профилактики пандемического гриппа;

- в рамках доклинических исследований экспериментально доказана безопасность и иммунологическая эффективность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин на лабораторных животных;

- в рамках клинических исследований экспериментально доказана низкая реактогенность, безопасность и иммуногенность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин на добровольцах;

- разработаны и утверждены критерии реактогенности и иммуногенности живой «Ультрагривак» и инактивированной субъединичной адсорбированной «ОрниФлю» препандемических гриппозных вакцин.

- обоснованы схемы вакцинации населения РФ с целью специфической профилактики гриппа в случае возникновения пандемии: для живой вакцины «Ультрагривак» - интраназально двукратно с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 lg ЭИД₅₀; для инактивированной субъединичной адсорбированной вакцины «ОрниФлю» - внутримышечно двукратно с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА.

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народно-хозяйственное значение. В результате проведенной работы:

- доказана эффективность технологических подходов при конструировании безопасных и эффективных живой и инактивированных вакцин против пандемического гриппа;

- выбраны наиболее оптимальные конструкции вакцин для защиты населения РФ от пандемии гриппа - живая вакцина «Ультрагривак»; инактивированные адсорбированные субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;

- по результатам исследований оформлены НТД, зарегистрированы и разрешены к применению в РФ живая интраназальная вакцина «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) и инактивированная субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);

Результаты и выводы диссертации могут быть использованы при разработке средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний, имеющих пандемический потенциал.

Внедрение результатов работы. По теме работы разработана НТД (ФСП, инструкция по применению, регламент производства) на живую гриппозную вакцину «Ультрагривак», гриппозные инактивированные адсорбированные субъединичную «ОрниФлю» и расщепленную виросомальную «АвиФлю».

В марте 2009 г. в РФ зарегистрированы и разрешены к применению две «макетные» пандемические гриппозные вакцины:

- инактивированная субъединичная адсорбированная «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);

- живая «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября 2006 г.), Международном семинаре-тренинге «Актуальные вопросы защиты населения от биологических угроз» (Москва, 17-19 октября 2007 г.), Шестой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 12 октября 2007 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля 2008 г.), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская обл., Кольцово, 9-10 октября 2008 г.), IV научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Краснодарский край (пос. Джемете), 9-12 сентября 2008 г.), Проблемной комиссии РАМН «Грипп и гриппоподобные инфекции, включая особо опасные. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения. (Санкт-Петербург, 19 февраля 2009 г.), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ. II Всемирный форум по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 26-28 апреля 2009 г.), Международной конференции «Актуальные проблемы в области развития и внедрения противогриппозных вакцин и вакцин против гриппа птиц» (г. Иркутск, 14-15 мая 2009 г.), Х международном конгрессе, посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», г. Казань, 20-23 мая 2009 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе в 15 журналах, рекомендованных ВАК и в 41 тезисе докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 482 страницах текста, включая 129 таблиц и 34 рисунка; состоит из введения, трех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 317 источников, из них 24 отечественных и 293 - иностранных.

Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны автором на основании проведенных исследований. Проекты конструирования, планирование и проведение доклинических и клинических исследований препандемических гриппозных вакцин проведены при непосредственном участии автора. Автор принимал личное участие в заседаниях ВОЗ, Проблемной Комиссии и Комиссии по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам по вопросам, связанным к подготовке к пандемии гриппа. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в анализе полученных данных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

Содержание работы

Материалы и методы:

Вакцинные штаммы

При конструировании «макетных» пандемических вакцин использованы два вакцинных штамма, рекомендованных ВОЗ, полученные методом обратной генетики и один штамм, разработанный в РФ, на основе апатогенного утиного штамма Н5, полученный методом классической рекомбинации (реассортации).

Штамм NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), клайд 1, предоставлен Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBSC), Великобритания. Штамм А/Indonesia/5/2005, клайд 2.1., получен из Института по контролю за заболеваниями (CDC), США.

Реассортанты NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1) и А/Indonesia/5/2005 (H5N1) разработаны на основе штамма А/PR/8/34(Н1N1) и содержали модифицированные методами обратной генетики HA и NA. Соотношение генов в штаммах 6:2, история пассирования - клеточная культура VERO - 1 пассаж, РКЭ - 2 пассажа.

Методом классической рекомбинации, в ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, подготовлен вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5], на основе апатогенного утиного штамма вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5N2) и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2). Соотношение генов в вакцинном штамме А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] - 7:1, с историей пассирования - 7 пассажей в РКЭ в процессе реассортации.

Субстрат накопления

В качестве субстрата накопления вакцинных штаммов использованы 10 - суточные РКЭ.

Культуры клеток

Для определения биологической активности штаммов вирусов гриппа птиц в исследованиях использованы перевиваемые культуры клеток почек зеленых мартышек - Vero B, почек собаки - МDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на базе раствора Хенкса (раствор Эрла для культуры клеток Vero B), содержащую 7,5 и 2 % сыворотки крупного рогатого скота соответственно.

Адъюванты

В качестве адъювантов использованы: алюминия гидроксид («Brenntag Biosector», Дания), Полиоксидоний® - сополимер N-окиси 1,4 этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида («Группа Компаний Петровакс», г. Москва), Глутоксим® - Бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль (ЗАО «ФАРМА ВАМ», г. Москва).

Исследуемые вакцины против гриппа птиц

На основе вакцинных штаммов приготовлены три типа инактивированных (цельновирионная, сплит (расщепленная) и субъединичная) и живая аттенуированная вакцины против гриппа птиц.

Инактивированная цельновирионная вакцина против гриппа птиц, на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), приготовлена по технологии получения Вакцины гриппозной инактивированной элюатно-центрифужной жидкой, зарегистрированной и разрешенной к применению в РФ.

Инактивированная субъединичная вакцина против гриппа птиц, на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), получена по технологии производства сезонной вакцины «Гриппол» (Вакцина гриппозная тривалентная полимер-субъединичная жидкая), зарегистрированной и используемой в РФ в рамках календаря профилактических прививок. В зависимости от входящих в состав препарата адъювантов сконструированы 2 вида субъединичных вакцин - «ОрниФлю» - вакцина сорбированная на алюминии гидроксиде и «ВГИПС» - вакцина в смеси с Полиоксидонием.

В основе технологии приготовления инактивированной сплит (расщепленной) вакцины против гриппа птиц «АвиФлю» использованы подходы, отработанные на новой сезонной инактивированной расщепленной вакцине «Грифор», зарегистрированной в 2008 г. в РФ. Инактивированная расщепленная вакцина против гриппа птиц, поэтапно, произведена на основе штаммов NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), А/Indonesia/5/2005(H5N1), А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5]. Принципиальное отличие конструкции данной вакцины заключалось в использовании адъюванта алюминия гидроксида и в пространственной структуре препарата в форме виросом. препандемический гриппозный вакцина инактивированный

«Ультрагривак» - живая аттенуированная вакцина против гриппа птиц, произведена по технологии сезонной гриппозной вакцины «Ультравак», успешно применяемой в РФ для предотвращения и снижения заболеваемости гриппом различных возрастных групп на протяжении более 30 лет. Вакцина приготовлена на основе вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5]. Для получения вакцинного штамма в процессе реассортации использованы два апатогенных штамма: А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5N2), не вызывающий заболевания и гибели уток и А/Ленинград/134/17/57(H2N2), универсальный холодоадаптированный донор аттенуации, используемый в приготовлении сезонной гриппозной вакцины.

Экспериментально-производственные серии живой и инактивированных вакцин против гриппа птиц произведены на филиалах ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Иркутске «Иркутское предприятие по производству бактерийных препаратов» и г. Уфе «Иммунопрепарат».

Вирулентный штамм вируса гриппа птиц А/ H5N1

Для оценки протективных свойств полученных вакцин против гриппа птиц использован дикий вирулентный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/05 (H5N1).

Штаммы вируса гриппа птиц, используемые при оценке кросс-реактивности вакцин против гриппа птиц

При изучении кросс-реактивности «Ультрагривак» - вакцины живой аттенуированной использован штамм вируса гриппа птиц А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 (H5N1), выделенный в Новосибирской области в 2005 г. Кроме того, при исследовании сывороток крови привитых вакциной «Ультрагривак» использованы гетерологичные вакцинные штаммы NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), А/Indonesia/5/2005 (H5N1).

При оценке кросс-реактивности «АвиФлю» - вакцины инактивированной расщепленной применены гетерологичные вакцинные штаммы NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), А/Indonesia/5/2005 (H5N1) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5].

Лабораторные животные

Лабораторно-экспериментальные (доклинические) исследования проведены на белых беспородных половозрелых мышах обоего пола, массой 18-20 г, морских свинках обоего пола, массой 200-250 г, кроликах породы «Шиншилла» обоего пола, массой 2,5- 3 кг, курах породы белый Леггорн в возрасте 4-х недель, хорьках обоего пола в возрасте 4-х месяцев, обезьянах: яванских макаках, массой от 2,5 до 3,0 кг, павианах гамадрилах, массой от 2,3 до 2,7 кг, зеленых мартышках, массой 2,0 кг, макаках резусах, массой 2,4 кг.

Биоматериалы

Кровь и сыворотки крови, полученные от иммунизированных животных, изучали в рамках доклинических исследований.

Кровь и сыворотки крови, мочу и носоглоточные смывы привитых добровольцев изучаны в рамках клинических исследований. Получение и обработку клинических материалов производили согласно «Методическим указаниям по проведению контроля противогриппозных препаратов» от 16.11.84 или МУК 4.2.2136-06.

Методы:

Электронная микроскопия

Вакцины против гриппа птиц на различных технологических стадиях приготовления исследовали в электронном микроскопе JEM 100-CX (JEOL, Япония) при инструментальном увеличении 58000х, напряжении 80 кВольт и апертурной диафрагме 50 мкм. Фотографирование производили на фотопленку (Agfa Alliance Camera CE, Германия). Морфологический анализ изучаемых образцов проводили методом негативного контрастирования.

Метод электрофореза

Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы антигенов инактивированных вакцин против гриппа птиц применяли метод электрофореза в 12 % полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в нередуцирующих условиях с последующей окраской геля Кумасси ярко-голубым R-250. Испытание проводили на полуфабрикатах вакцин перед добавлением каких либо стабилизаторов, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы.

Доклинические исследования

Доклинические исследования проводили в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22 июня 1998 г. № 86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 267 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и рекомендаций руководств.

На лабораторных животных проводили оценку безопасности вакцин против гриппа птиц по следующим критериям: острая токсичность, хроническая токсичность, влияние на гематологические показатели, местное и местно-раздражающие действие, гиперчувствительность немедленного типа, гиперчувствительность замедленного типа, генетическая стабильность.

Эффективность вакцин против гриппа птиц на лабораторных животных включала оценку иммуногенных свойств в ИФА, РТГА, РН и протективных свойств, после инфицирования вирулентным штаммом вируса гриппа птиц.

Клинические исследования

Клинические исследования проводили в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22 июня 1998 г. № 86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 266 «Правила клинической практики в Российской Федерации», национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р52379-2005 «Надлежащая клиническая практика» и утвержденными протоколами, на основании решений Федерального комитета по этике и разрешений Росздравнадзора, согласно Европейскими Предписаниями по GCP и Хельсинской Декларацией.

Критерии переносимости, реактогенности и безопасности включали оценку витальных симптомов (АД, ЧСС, tє тела), нежелательных явлений (местные и системные реакции), согласно МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» и лабораторных показателей (IgA, IgM, IgG, IgE, ОАК, ОАМ, б/х крови).

Иммуногенные свойства вакцин против гриппа птиц изучали в РТГА, РМН, ИФА, определяя уровень сероконверсии, уровень серопротекции, фактор сероконверсии, величину среднегеометрического титра антител. После вакцинации живой аттенуированной вакциной против гриппа птиц также проводили оценку секреторного IgA и специфического IgG.

Анализ гена гемагглютинина Н5 вируса гриппа методом ПЦР

Анализ гена гемагглютинина серотипа H5 в вируссодержащем материале проводили с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс Influenza virus H5» - для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа Н5N1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией по «конечной точке».

Анализ нуклеотидных последовательностей генов PB1, PB2, PA, M, и NS

Вирусную РНК выделяли из вируссодержащей культуральной жидкости набором RNeasy Mini kit «Qiagen» (Valencia, CA). Реакцию обратной транскрипции проводили с праймером Uni-12, комплементарным 3`-концевой последовательности всех сегментов генома вируса гриппа с помощью ревертазы M-MulV «СибЭнзим» (Россия). Методом ПЦР с использованием специфичных праймеров на гены PB1, PB2, PA, NР, M, и NS вируса гриппа получены фрагменты ДНК генов. Постановку полимеразной реакции осуществляли на амплификаторе Dyad «BioRad».

Определение концентрации секреторного IgA в назальных смывах методом ИФА

Для исследования использовали набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации секреторного иммуноглобулина класса А в биологических жидкостях («Вектор-Бест», Россия). Концентрацию sIgA в образцах определяли по калибровочному графику. Чувствительность анализа составляла 0,35 мг/л.

Определение активности цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), сенсибилизированных к вирусу гриппа

Идентификацию (предсказание) ЦТЛ-эпитопов в последовательностях белков вируса гриппа А (ВГА) для оценки ВГА-специфического ответа CD8+ T-лимфоцитов (TCD8+) в реакции ELISPOT ИФН-гамма проводили с помощью программы ProPred1 и оригинального программного обеспечения QMpredict. Шесть пептидов для ELISPOT ИФН-гамма анализа: GILGFVFTLTV, RMVLASTTAK, ELRSRYWAI, SRYWAIRTR, CTELKLSDY, KMNTQFEAV, были синтезированы стандартным твердофазным методом на тритильном полимере с использованием Nsc-аминокислот. Очистку пептидов обращено-фазовой ВЭЖХ проводили на колонке 15х250 мм с полимером PLRP (Polymer Laboratories Reverse Phase) 300A 15-20 мкм в градиенте ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФУ). Для постановки ELISPOT ИФН-гамма использовали наборы Human IFN-gamma ELISPOT Set, Pierce Product # ELS002 и 96-луночные планшеты Millipore MultiScreenHTS-IP Filter Plates for ELISPOT, Millipore Product # MSIPS4W10.

Статистическая обработка данных

При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (M±у). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы Statistica (версия 6,0) с использованием теста t-распределения Стьюдента для выборок с нормальным распределением, или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни.

Конструирование и изучение физико-химических и молекулярно-биологических свойств «макетных» пандемических вакцин против гриппа

Позиция ВОЗ по вопросу использования вакцин с целью профилактики гриппозной инфекции сводится к тому, что наиболее надежными средствами защиты от вирусных инфекций являются вакцинные препараты, формирующие при иммунизации напряженный и длительный иммунитет.

Необходимость разработки новых подходов в конструировании и изучение свойств препандемических гриппозных вакцин связана с невозможностью применения классических подходов получения вакцинных штаммов, неэффективностью использования схем (кратность, интервал введения, дозы), используемых в настоящее время для специфической профилактики сезонного гриппа, а также необходимостью включения в состав инактивированных препаратов адъювантов, с целью повышения иммуногенных свойств вакцин и уменьшения дозы антигена, без потери эффективности.

Использование в технологии приготовления вакцин концентрирования и очистки вируса методами высокоскоростного центрифугирования, а также добавление детергента тетрадецилтри-метиламмония бромида (ТДТАБ) позволило получить высокоочищенные субъединичные препараты, с низкой реактогенностью и достаточной иммуногенностью. Используя отработанные технологические подходы на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004), были сконструированы прототипы пандемической инактивированной субъединичной вакцины против гриппа птиц Н5N1 («ОрниФлю», «ВГИПС»). Методом электронной микроскопии выявлено, что основными морфологическими структурами полуфабриката вакцин были специфические объединения гемагглютининов (розетки), а также минивиросомы с размером от 22 до 50 нм (рис. 1). При проведении электрофореза в ПААГ показано, что очищенные вирионы вируса гриппа птиц Н5N1 содержали в составе как внутренние, так и наружные антигены. Проведение технологических операций приготовления субъединичной вакцины позволило получить высокоочищенный препарат, состоящий из поверхностного белка НАо и следовых количества NP (рис. 2).

Рисунок 1. Полуфабрикат вакцины «ОрниФлю», субтип H5N1, штамм NIBRG -14(A/Vietnam/1194/2004)



Рисунок 2. Анализ полипептидного состава вакцины «ОрниФлю»: 1. Препарат очищенных вирионов вируса гриппа птиц, штамм NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004); 2. Полуфабрикат вакцины «ОрниФлю», штамм NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004).

В отличие от технологии приготовления инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» при конструировании расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю» использовали более щадящий метод инактивации вирусов гриппа - ультрафиолетовое облучение, позволяющее сохранять в нативном состоянии структуру вирионов, новый детергент - бета октилгликозид, обеспечивающий возможность самосборки структур в форме виросом, моделирующих пространственную структуру вирионов вируса гриппа, а также современные методы концентрирования и очистки с использованием хромотографических установок.

При морфологическом исследовании полуфабриката расщепленной виросомальной вакцины выявлено наличие в материале большого количества виросом диаметром 100-180 нм, на поверхности которых неравномерно располагались гемагглютинины. В отличие от вирионов виросомы представляли собой слабо структурированные «пустые» частицы, состоявшие из оболочки и упомянутых выше гемагглютининов (рис. 3, 4). При изучении полипептидного состава инактивированной расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю», приготовленной на основе штаммов А/Indonesia/5/2005 (H5N1) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] установлено, что препараты содержали поверхностный антиген вируса НАо и внутренние белки М1 и NP. Молекулярная масса полипептидов НАо отличалась в зависимости от штаммов, так для штамма А/Indonesia/5/2005 (H5N1) она составляла 75 кДА, а для штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] - 72 кДа (рис. 5).

Рисунок 3. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», субтип H5N1, штамм А/Indonesia/5/2005 (H5N1)

Рисунок 4. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», субтип H5N2, штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5]



Рис. 5. Анализ полипептидного состава вакцины «АвиФлю»: 1. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», штамм А/Indonesia/5/2005 (H5N1). 2. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2)[17/Н5].

Для усиления иммуногенных свойств в конструкции «макетных» инактивированных субъединичной и расщепленной виросомальной вакцин использованы адъюванты - алюминия гидроксид (вакцины «ОрниФлю», «АвиФлю») и Полиоксидоний (вакцина «ВГИПС»).

На первом этапе исследований согласно регулирующим стандартам по проведению доклинических испытаний новых МИБП и в соответствии с согласованным с ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Протоколом исследования) оценена переносимость и безопасность сконструированных препаратов на двух видах лабораторных животных (белые беспородные мыши и морские свинки).

В результате проведенных исследований показано, что инактивированные цельновирионная несорбированная и сорбированная на алюминии гидроксиде препандемические вакцины, полученные на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), обладали токсическими свойствами, плохо переносились и вызывали у лабораторных животных изменения в поведении, снижение двигательной активности и аппетита, изменение шерстяного покрова. Кроме того, у животных, иммунизированных этими препаратами, при патоморфологическом и гистологическом изучении отмечали образования лимфогистиоцитарных инфильтратов в печени, и незначительную гиперплазию единичных лимфоидных фолликулов в ткани селезенки, что могло быть одним из проявлений реакции на вводимые препараты. При изучении местного действия инактивированной цельновирионной вакцины сорбированной на алюминии гидроксиде отмечали выраженную местную воспалительную реакцию в виде покраснения и отека. Менее выраженные местные реакции отмечались у лабораторных животных после введения инактивированной субъединичной вакцины в смеси с Полиоксидонием.

Применение сконструированных инактивированных субъединичных и расщепленной экспериментальных образцов препандемических вакцин против гриппа птиц в остром опыте при однократном внутрибрюшинном введение в дозах 0,65 мкг/кг и 2250 мкг/кг - для белых мышей и 0,65 мкг/кг и 181,7 мкг/кг - для морских свинок, не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела, образованию воспалительных экссудатов, выпотов, некробиотических изменений, что свидетельствовало об отсутствии клинических симптомов интоксикации. Ежедневное в течение 14 сут подкожное введение вакцин в суммарной дозе 181,7 мкг/кг - для морских свинок и 2250 мкг/кг - для белых мышей не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела, изменению поведения и самочувствия иммунизированных лабораторных животных, что явилось доказательством хорошей переносимости и безопасности разработанных вариантов вакцин.

После отработки ряда технологических деталей и результатов, полученных в рамках предварительных доклинических исследований, нами были сконструированы и изучены четыре прототипа вакцин против гриппа птиц Н5: «ОрниФлю» - инактивированная субъединичная сорбированная на алюминии гидроксиде; «ВГИПС» - инактивированная субъединичная в смеси с Полиоксидонием; «АвиФлю» - инактивированная расщепленная виросомальная сорбированная на алюминии гидроксиде; «Ультрагривак» - живая интраназальная.

Целью дальнейших исследований явилось: выбор оптимальной схемы иммунизации (кратности введения препарата) на белых мышах; выбор инфицирующей дозы вируса гриппа птиц (штамм А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5N1)) для оценки протективных свойств; оценка иммуногенных (РТГА, РН, ИФА) и протективных свойств экспериментальных образцов живой и инактивированных вакцины против гриппа птиц на белых мышах.

В результате предварительных доклинических исследований «макетных» вакцин против гриппа птиц было показано, что для формирования иммунного ответа у лабораторных животных необходимо проводить не менее двух иммунизаций с интервалом 21-28 сут (для инактивированных) и 10 сут (для живой). Обязательным условием повышения иммуногенности сконструированных инактивированных вакцин явилось включение в состав адъювантов, наиболее перспективными, из которых, явились алюминия гидроксид и Полиоксидоний.

При сравнительной оценке иммуногенных и протективных свойств разработанных экспериментальных образцов инактивированных вакцин показано, что эффективность вакцин зависит от схемы иммунизации животных. Увеличение иммунизирующей дозы и кратности введения, как для живой, так и для инактивированных вакцин существенно повышала их иммуногенные и защитные свойства. Для инактивированных вакцин («ОрниФлю», «ВГИПС», «АвиФлю») наиболее оптимальной схемой иммунизации является двукратное (с интервалом 21-28 суток) введение вакцин в дозе 15 мкг НА. Такая тактика вакцинации приводит к индукции ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА - от 1:10 до 1:40 и ВНА - 1:20 и защищает от заражения вирулентным штаммом (27 ЛД₅₀) от 50 до 80 % белых мышей. Наиболее эффективными являлись инактивированные субъединичная и расщепленная виросомальная вакцины, сорбированные на гидроокиси алюминия (71 и 80 %). Субъединичная вакцина в смеси с Полиоксидонием оказывал менее выраженный защитный эффект (50 %).

При двукратном интраназальном введении живой вакцины «Ультрагривак» с интервалом в 10 суток в дозе 10^6,4 ЭИД₅₀ вакцина вызывала индукцию ИФ-АТ в титре 1:1280, АГА - 1:180, ВНА - 1:40, и обеспечивала защиту белых мышей от интраназального заражения вирулентным вирусом гриппа птиц в дозе 27 ЛД₅₀ в 87 %, что соответствует требованиям к медицинским средствам защиты (ОТТ 8.1.112-98). Однократная иммунизация в аналогичных условиях обеспечивала защиту только 57 % животных. В контрольных группах, зараженных той же дозой вирулентного возбудителя, погибло 100 % особей, что подтверждает правильность обоснованной ранее инфицирующей дозы вирулентного штамма (табл. 1)

Таблица 1. Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцин против гриппа птиц на белых мышах

№	Вакцина	Иммунизация	Средняя величина титров антител после иммунизации в серологических реакциях	Доля выживших животных после инфицирования, %
			ИФА	РН	РТГА
1.	«АвиФлю»	1	1:40	<1:10	<1:10	33
		2	1:160	1:33	1:40	71
2.	«ОрниФлю»	1	1:80	1:10	<1:10	40
		2	1:320	1:20	1:10	80
3.	«ВГИПС»	1	<1:40	<1:10	<1:10	20
		2	1:80	1:20	1:20	50
4.	«Ультрагривак»	1	1:320	1:14	1:40	57
		2	1:1280	1:40	1:180	87
5.	Контроль	1,2	<1:10	<1:10	<1:10	0

В рамках лабораторно-экспериментальных исследований изучены физико-химические и иммунобиологические свойства и выбраны наиболее перспективные вакцинные кандидаты: живая интраназальная («Ультрагривак») и инактивированные субъединичные («ОрниФлю», «ВГИПС»), расщепленная виросомальная («АвиФлю»).

Доклиническое и клиническое изучение живой гриппозной вакцины «Ультрагривак»

В Российской Федерации в отделе вирусологии ГУ НИИЭМ РАМН был получен штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2)[17/Н5] для живой вакцины путем реассортации донора аттенуации А/Ленинград/17/57(H2N2) и штамма А/утка/Потсдам/86, а затем наработаны экспериментальные серии «макетной» вакцины на Иркутском предприятии ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ.

В рамках доклинических исследований показано, что реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2) сохраняет молекулярную структуру НА и является антигенно-идентичным родительскому птичьему вирусу; он не патогенен для кур; проявляет аттенуирующий фенотип при интраназальном введении мышам, активно репродуцируясь в ВДП при сниженной репродукции вируса в легких; вызывает образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вирусам подтипа H5N1; при однократном введении создает высокий уровень резистентности к инфекции высокопатогенным вирусом подтипа A(H5N1). «Ультрагривак» - вакцина гриппозная живая, лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения, является иммунологически эффективным препаратом, вызывая выработку ИФ-АТ в титре 1:320 при однократном и 1:1280 при двукратном (с интервалом 10 сут) введении в дозе 10 ^6,4 ЭИД₅₀ белым мышам массой 14-16 г, вируснейтрализующих антител в титре 1:40 при двукратном введении и гемагглютинирующих антител при однократном введении в титре 1:40, при двукратном - 1:80 и обеспечивает 100 % защиту от заражения 8 ЛД₅₀ и 87 % защиту от 27 ЛД₅₀ вирулентного штамма вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5N1) (табл. 2).

Оценивая влияние иммунизации живой вакциной против гриппа птиц на иммунный статус обезьян, необходимо отметить, что вакцинация обеспечивает появление специфических титров АТ, определяемых в реакциях ИФА, РН и РТГА. Однократная вакцинация не обеспечивала формирование напряженного иммунитета у животных. Вторая иммунизация приводила к приросту титров антител, что указывает на обоснованность использования двукратной схемы иммунизации. Результаты клинического обследования добровольцев и проведенные лабораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии отклонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации добровольцев вакциной «Ультрагривак» в сравнении с фоновыми значениями.

Таблица 2 - Результаты оценки антигенных и протективных свойств вакцины «Ультрагривак» на белых мышах

Схема введения вакцины	Титр в ИФА	Титр в РН	Титр в РТГА	Заражающая доза, ЛД50	Количество погибших животных на …сутки после заражения	Продолжительность жизни животных (х±д), сут.	Доля выживших, процент
	до инфицирования	после инфицирования	кратность превышения, раз	до инфицирования	после инфицирования	до инфицирования	после инфицирования	кратность превышения, раз
										5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
Однократное	1: 320	1:2560	8	<1:10	1:160	1:40	1:320	8	8	0	0	1	3	2	0	0	0	0	0	8,2±0,8	60 (9/15)
		1:2560	8		1:160		1:160	4	27	1	1*	2	3	0	0	0	0	0	0	7,2±1,2	57 (8/14)
Двукратное	1:1280	1:1280	1	1:40	1:80	1:80	1:160	2	8	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	-	100 (15/15)
		1:1280	1		1:80		1:160	2	27	0	0	1	1	0	0	0	0	0	0	7,5±0,7	87 (13/15)
Контроль (неиммунизированные)	8	0	0	1	1	8	-	-	-	-	-	8,7±0,7	0
	27	0	0	1	6	3	-	-	-	-	-	8,2±0,6	0

Примечание:

1. - 1*- у погибшего животного вирус гриппа H5N1 из легких не выделили, при вскрытии отсутствовал характерный признак поражения легких - «красное опеченение».

2. 4-кратное и более превышение титра в ИФА после заражения свидетельствует о перенесенной инфекции животных.

Рисунок 6. Местные реакции на введение вакцины «Ультрагривак»

Местные реакции после первой вакцинации на 4, 5 дни были представлены катаральными явлениями в носоглотке, имели слабовыраженный транзиторный характер и исчезали на 6 день (рис.6). Местные реакции средней и сильной степени выраженности, а также системные реакции у привитых добровольцев отсутствовали. Результаты клинического и биохимического анализа крови и общего анализа мочи в процессе вакцинации не претерпели существенных изменений относительно нормальных значений. Реизоляты проявляли ts и ca фенотип, сохраняли изменения в генах внутренних и неструктурных белков, а также характерные для донора аттенуации биологические свойства, что свидетельствует о генетической стабильности вакцины «Ультрагривак» (табл. 3).

Таблица 3. Оценка генетической стабильности вакцины «Ультрагривак»

Интервал между введением	Вакцинация	Основные мутации в генах внутренних и неструктурных белков реизолятов, характерные для [17/H5]
		РВ2-1459	PB1-819	PA-107	PA-1045	М-969	NS-798
10 сут	V1	T	T	C	T	A	A
	V2	T	T	C	T	A	A
21 сут	V1	T	T	C	T	A	A
	V2	T	T	C	T	A	A

Изучение локального иммунного ответа в носовых секретах волонтеров, привитых вакциной «Ультрагривак» показало, что достоверные приросты концентрации sIgA-антител в ИФА отмечены более чем в 2 раза, по сравнению с исходными значениями, после двукратного введения препарата, независимо от интервала введения 10 или 21 сут (рис. 7).

Рисунок 7. Оценка местного иммунитета на введение вакцины «Ультрагривак»

При оценке в РМН сывороток крови привитых добровольцев после двукратной вакцинации процент лиц с титром антител ?1:20 составил более 70 %, с титром антител ?1:40 - более 50 %, при этом кратность прироста СГТ антител - 5 (рис. 8).



Рисунок 8. Оценка иммуногенных свойств вакцины «Ультрагривак»

С целью оценки реактогенности, безопасности, местного, клеточного и гуморального иммунного ответа, выбора оптимальной схемы (интраназальная двукратная с интервалами 10 и 21 сут) вакцинации, а также возможности усиления иммуногенности препарата за счет увеличения дозы с 6,9 lg ЭИД₅₀/0,5 мл до не менее 7,5 lg ЭИД₅₀/0,5 мл на двух клинических базах с участием 200 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет была проведена II фаза клинических исследований вакцины «Ультрагривак».

Показано, что препарат вне зависимости от интервала введения 10 или 21 сут обладает хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Местные реакции были представлены катаральными явлениями в носоглотке, носили слабовыраженный транзиторный характер и исчезали через 1-2 суток (рис. 6). Уровни сывороточных иммуноглобулинов классов A, М, G и. Е, у всех добровольцев в течение периода исследования сохранялись в пределах нормальных значений. Получены положительные данные о выделяемости вируса из носовых ходов привитых, что свидетельствует о хорошей приживаемости вакцины. Для выделения вакцинного вируса потребовалось 2-3 пассажа на чувствительных культурах клеток, что говорит о крайне незначительном содержании вируса в мазках из полости носа привитых и может свидетельствовать о безопасности вакцины для окружающих (рис. 9).

Рисунок 9. Оценка безопасности вакцины «Ультрагривак» для окружающих

Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса продемонстрирована молекулярно-биологическими методами, что является существенной гарантией безопасности применения применяемого вакцинного штамма на людях. Полученные данные показывают, что вакцина «Ультрагривак» способна обеспечить иммунный ответ не только в отношении гомологичного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 Н5N2 [17/Н5], и в отношении других штаммов вируса гриппа птиц А (H5N1): А/Vietnam/1194/2004 и A/Indonesia/5/2005, т.е. обладает высокой кросс-реактивностью (рис. 10). В результате проведенных клинических исследований установлено, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак ареактогенна, безвредна для вакцинируемых, безопасна для окружающих, индуцирует развитие местного, клеточного и гуморального иммунитета, что позволило зарегистрировать препарат в Российской Федерации с целью защиты населения в случае возникновения пандемии гриппа. Учитывая назначение вакцины «Ультрагривак» для специфической профилактики пандемического гриппа преимущество имеет схема введения препарата с интервалом 10 сут, что позволит сократить время для обеспечения полноценной защиты людей от инфекции.

Рисунок 10. Оценка кросс-реактивности вакцины «Ультрагривак»

Доклиническое и клиническое изучение инактивированных гриппозных вакцин «ОрниФлю», «ВГИПС» и «АвиФлю»

С целью оценки безопасности и эффективности полученных вакцинных кандидатов были проведены доклинические исследования на лабораторных животных. В результате проведенных исследований показано, что вакцины «ОрниФлю» и «ВГИПС» нетоксичны в остром и хроническом эксперименте, хорошо переносились животными, не обладали выраженными местными и местно-раздражающими действиями, не вызывали негативного влияния на патоморфологические, гистологические и гематологические показатели. Незначительные изменения изучаемых показателей более выражены были при использовании вакцины «ВГИПС». При изучении антигенных и протективных свойств показано, что для индукции иммунитета и получения эффективной защиты животных от патогенного вируса гриппа птиц необходимо проводить не менее двух иммунизаций. Наиболее оптимальной схемой иммунизации животных является внутримышечная двукратная с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА, позволяющая инициировать выработку ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА - от 1:10 до 1:40 и ВНА - 1:20 и защищать от гибели от 50 до 80 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса птичьего гриппа А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5N1) (табл. 4).

В рамках I фазы сравнительных клинических исследований на ограниченном контингенте добровольцев (241 доброволец в возрасте от 18 до 50 лет) с целью оценки реактогенности, безопасности и иммуногенности при использовании трех дозировок препаратов (15, 30 и 45 мкг НА) после одно- и двукратного введения были изучены инактивированные субъединичные сорбированная на алюминии гидроксиде «ОрниФлю» и в смеси с Полиоксидонием «ВГИПС» вакцины против гриппа птиц.

Оба типа вакцин отличались хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Серьезных побочных реакций на введение вакцинных препаратов отмечено не было ни в одном случае. В большинстве случаев местные реакции слабой и средней степени выраженности наблюдались как у привитых вакциной «ОрниФлю», так и вакциной «ВГИПС» и были представлены болью в месте введения вакцин (рис. 11, 12).

Уровень иммуногенности, индуцированный вакциной «ОрниФлю», содержащей 15 мкг НА соответствовал уровню иммуногенности индуцированному вакциной «ВГИПС», содержащей 45 мкг НА (рис. 13), а также по данным литературы показателям иммуногенности индуцированных препаратом субъединичной вакцины без адъюванта, содержащей 90 мкг НА и препаратом адсорбированной субъединичной вакцины, содержащей 30 мкг НА.

Исходя из концепции создания вакцинных препаратов, предпочтение отдается вакцине, которая при минимальном количестве антигена индуцирует достаточный уровень специфического иммунного ответа у привитых добровольцев и не оказывает неблагоприятного влияния на здоровье вакцинируемых.

Таблица 4. Антигенные и протективные свойства инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»

Кратность введения вакцины	Препарат	Иммунизирующая доза, мкг НА	Величина титра антител в	Количество погибших животных на …сутки после заражения	Продолжительность жизни животных (х±д), сут.	Доля выживших, процент
			ИФА	РН	РТГА	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
Однократное	«ВГИПС»	1,0	<1:40	<1:10	<1:10	0	0	4	4	1	2	0	0	0	0	8,1±1,1	15,4 (2/13)
		15,0	<1:40	<1:10	<1:10	0	0	6	5	0	1	0	0	0	0	7,7±0,9	20,0 (3/15)
	«ОрниФлю»	1,0	<1:40	<1:10	<1:10	0	0	9	5	0	0	0	0	0	0	7,4±0,5	6,7 (1/15)
		15,0	<1:80	<1:10	<1:10	0	0	7	2	0	0	0	0	0	0	7,2±0,4	40,0 (6/15)
Двукратное	«ВГИПС»	1,0	1:40	1:10	1:10	0	0	3	7	0	0	0	0	0	0	7,7±0,5	28,6 (4/14)
		15,0	1:80	1:20	1:20	0	0	4	2	1	0	0	0	0	0	7,6±0,8	50,0 (7/14)
	«ОрниФлю»	1,0	1:40	<1:10	<1:10	0	0	6	7	1	0	0	0	0	0	7,6±0,6	6,7 (1/15)
		15,0	1:320	1:20	1:10	0	0	3	0	0	0	0	0	0	0	7,0±0,0	80,0 (12/15)
Контроль (неиммунизированные)	0	0	1	6	3	0	0	0	0	0	8,2±0,6	0

Примечание - заражающая доза 25 ЛД₅₀

Рисунок 11. Оценка местных реакций на введение вакцин «ОрниФлю» и...