Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность исследования.

Бронхиальная астма (БА) является глобальной медико-социальной проблемой [GINA, 2009]. Сегодня в мире насчитывается около 300 миллионов больных БА. Согласно прогнозам к 2025 г. этот показатель может составить 400 миллионов. В России ежегодно регистрируется около 115 тысяч впервые выявленных больных. В 2007 г. на учете состояло более 1,2 миллионов больных астмой. Эта болезнь является причиной более 2 миллионов дней временной нетрудоспособности работающего населения и 4 миллионов дней госпитализации ежегодно на территории России (по данным Федерального государственного статистического наблюдения). В структуре инвалидности удельный вес БА среди болезней органов дыхания составляет 64,9%, а в трудоспособном возрасте 80,9% [Чучалин А.Г., 2009].

Проблемы диагностики и лечения БА связаны с выраженным клиническим полиморфизмом болезни [Anderson G.P., 2008; Holgate S.T., 2008; Buc M. et al., 2009]. Выделяют аллергический и неаллергический фенотип БА, с быстрым и медленным прогрессированием снижения функции легких, с эозинофильной и нейтрофильной инфильтрацией, терапевтически чувствительную и терапевтически резистентную. Неблагоприятным прогнозом отличается тяжелая терапевтически резистентная БА, что связано с неконтролируемым воспалением. В последние годы предметом пристального внимания пульмонологов всего мира является проблема тяжелого, неконтролируемого, резистентного к лечению течения БА, сопровождающегося высокой частотой инвалидизации и смертности больных [Чучалин А.Г., 2007; Огородова Л.М. и соавт., 2008; Цой А.Н., Архипов В.В., 2008, Bousguet J. et al., 2007; Bateman E.D. et al., 2008]. Недостаточная эффективность базисной терапии в условиях регулярного лечения может быть ассоциирована как с генетически детерминированной кортикостероидной резистентностью, так и снижением ответа на кортикостероиды, связанным с прогрессированием воспаления и ремоделирования дыхательных путей (ДП), в значительной мере обусловливающих сохранение у пациентов симптомов бронхиальной гиперреактивности и обструкции бронхов [Черняк Б.А., Воржева И.И., 2008].

Сегодня сформулированы клинические критерии фенотипов БА, но патофизиологические аспекты их развития остаются не до конца ясными [Фассахов Р.С., 2005]. В связи с этим выяснение фундаментальных аспектов клинического полиморфизма БА является актуальным, поскольку невозможно с позиции современных знаний предложить персонифицированные подходы к терапии этой болезни. Результаты последних исследований привели к пониманию важной роли оксида азота в развитии БА [Гельцер Б.И. и соавт., 2003; Brune B., 2003; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Li C.Q., Wogan G.N. 2005; Gaston B. et al., 2008; Ichikawa T. et al., 2008]. Известно, что молекула оксида азота (NO*), будучи реакционно-способным соединением, участвует в развитии БА путем прямого и непрямого вклада в аллергическое воспаление [Осипов А.Н., 2007; Giustarini D. et al., 2003]. Прямой заключается в том, что оксид азота, как сигнальная молекула, регулирует функции бронхиального дерева и является одним из релаксирующих факторов эпителиального происхождения, регулирует функцию реснитчатого эпителия, бронхиальную и легочную гемодинамику. Непрямой путь участия оксида азота в механизмах БА реализуется при помощи биохимических превращений метаболитов NO* в реакциях воспаления [Bove P.F., Vliet A., 2006]. Около 85% от общего уровня NO-содержащих веществ в организме здорового человека составляют нитраты и нитриты и примерно 10% - S-нитрозосоединения, которые рассматриваются как депо NO* [Hess D.T., 2005; Kutzia A. et al., 2006; Gaston B., 2007].

Нитриты, будучи стабильными метаболитами аэробного окисления NO*, отражают как продукцию NO* (ферментативную и неферментативную), так и активность воспаления в ДП [Невзорова В.А. и соавт., 2001; Гельцер Б.И. и соавт., 2003; Филиппова Н.А. и соавт., 2006; Козырицкая Д.В. и соавт., 2007; Gookin J.L. et al., 2002; Kharitonov S.A. et al., 2004; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Paredi P., 2005; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2006; Barnes P.J. et al., 2009; Brindicci C. et al., 2009]. В отношении других метаболитов NO* исследования находятся в стадии накопления данных и носят в основном экспериментальный характер [Saleh D. et al., 1998; Dweik R. et al., 2001; Ischiropoulos Н., 2003; Celio S. et al., 2006; Ichikawa Т. et al., 2008; Maarsingh H. et al., 2009].

Для обозначения механизмов развития воспаления, включающих повышенную генерацию активных форм азота (АФА) и повреждение высокоактивными соединениями азота молекулярных компонентов клетки, в работах J.S. Stamler et al. (1998), по аналогии c оксидативным стрессом (oxidative stress), предложен термин «нитрозилирующий стресс (nitrosative stress)». Изучение закономерностей нитрозилирующего стресса является сегодня одним из развивающихся научных направлений [Klatt P., 2000; Dalle­Donne I. et al., 2005; Chiappetta G., 2009]. В частности, регуляция образования метаболитов NO* и причины нарушения депонирования NO* S­нитрозотиолами при аллергическом воспалении ДП, с точки зрения формирования нитрозилирующего стресса, до сих пор остаются малопонятными.

В развитии мультифакториальной болезни, к которой относится БА, участвуют несколько факторов (механизмов). Конечный фенотип формируется в результате взаимодействия генетических особенностей индивида и внешнесредовых факторов [Пузырев В.П., 2003]. Морфологические и молекулярные особенности, лежащие в основе этой гетерогенности, не известны. На сегодняшний день показано сцепление БА и ее клинических проявлений со многими хромосомными регионами [Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., 2007; Schwartz D.A., 2004; Gao L., Barnes K.C., 2009]. Однако вследствие сложного клинического фенотипа БА, полигенной модели наследования и значительной роли воздействий внешней среды в развитии и прогрессировании этого заболевания, большее число генов подверженности к астме до сих пор остается до конца не идентифицированным и требует дальнейшего исследования.

Несомненно, не только выраженность воспаления, но и генотип больного БА влияет на процессы превращения метаболитов NO* и их накопление в ДП. Однако данных об участии генов, контролирующих образование и метаболизм NO*, в настоящее время недостаточно. Несмотря на значительные достижения и большое число публикаций в области респираторной медицины [Nevin B.J., Broadley K.J., 2002; Bove P.F., Vliet A., 2006; Valko M. et al., 2006; Fitzpatrick A.M., 2009; Lewis S.J., Gaston B., 2009], некоторые пути превращений NO* при БА с этих позиций не изучены вообще.

Предположительно уровень экспрессии и полиморфизм генов NO-синтаз (NOS) ассоциированы с нарушением метаболизма NO* и персистенцией аллергического воспаления в ДП, а снижение активности глутатион­S­трансферазы (GST), участвующей в реакции редокс-циклирования глутатиона, может быть причиной нарушения депонирования NO* S­нитрозотиолами. В этой связи получение новых научных знаний о закономерностях регуляции нитрозилирующего стресса при воспалении ДП создаст теоретические предпосылки для разработки новых диагностических и лечебных технологий. Определение патогенетического значения полиморфных вариантов генов NOS и GST, закономерностей экспрессии NOS при БА позволит сформулировать принципиально иные вмешательства в патологический процесс, основанные на разработке новых фармакологических мишеней персонифицированной терапии БА.

Цель исследования:

Установить общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновать его значение в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы.

Задачи исследования:

1. Определить содержание метаболитов нитрозилирующего (нитриты, нитрозоглутатион, 3-нитротирозин) и оксидативного (малоновый диальдегид) стрессов, а также активность (супероксиддисмутаза, каталаза) и содержание (глутатион) компонентов антиоксидантной системы в дыхательных путях у больных бронхиальной астмой с разной тяжестью и в разные периоды болезни. Установить их роль в механизмах нарушения функции легких при бронхиальной астме.

2. Установить специфические тканевые и клеточные маркеры структурно-функциональных нарушений слизистой оболочки бронхов больных бронхиальной астмой в зависимости от тяжести, периода болезни и содержания метаболитов оксида азота в дыхательных путях.

3. Изучить содержание цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-б, ИНФ-г) в бронхиальном смыве у больных бронхиальной астмой и проанализировать ассоциацию количества этих цитокинов с уровнем метаболитов нитрозилирующего стресса.

4. Обосновать участие генов NOS в регуляции продукции метаболитов оксида азота и формировании аллергического воспаления дыхательных путей путем оценки уровня мРНК NOS1, NOS2, NOS3 в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой. Выявить взаимосвязь экспрессии генов NOS1, NOS2 и NOS3 с тяжестью бронхиальной астмы, нарушениями функции легких и содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.

5. Установить взаимосвязь полиморфизма 276С/Т и 186А/С гена NOS1, -954G/C и 343C/- гена NOS2, 894G/T и 260GCCC/- гена NOS3 c содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.

6. Выявить взаимосвязь полиморфизма GSTT1*1/0 и GSTM1*1/0 генов GST с уровнем метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве, клинико-функциональными и морфологическими характеристиками бронхиальной астмы. Оценить вклад полиморфизма этих генов в контроль образования нитрозоглутатиона в дыхательных путях.

7. Разработать концепцию, раскрывающую общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновывающую выбор молекулярных мишеней терапии клинических фенотипов бронхиальной астмы.

Научная новизна.

В результате выполнения настоящей диссертационной работы получены новые теоретические знания и сформулирована концепция клинического полиморфизма бронхиальной астмы с позиции нитрозилирующего стресса. Впервые проведен системный анализ инициации, формирования и регуляции нитрозилирующего стресса и полученные результаты сопоставлены с клинико-функциональными, морфологическими и фармакологическими характеристиками болезни.

Впервые обоснована фундаментальная концепция нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, заключающаяся в том, что нарушение образования S­нитрозотиолов сопровождается избыточным накоплением 3-нитротирозина и нитритов в дыхательных путях и приводит к персистенции воспаления и повреждению слизистой бронхов.

Приоритетными являются данные о том, что нитрозилирующий стресс может проявляться накоплением в бронхиальном смыве преимущественно нитритов, что ассоциировано с легкими и обратимыми симптомами болезни и обратимыми нарушениями функции легких. В случае реализации нитрозилирующего стресса преимущественно за счет повышения уровня 3­нитротирозина в бронхиальном смыве регистрируются необратимые тяжелые, резистентные к терапии симптомы и функциональные проявления болезни.

Новыми являются результаты, полученные методом дискриминантного анализа, показавшие, что среди изученных метаболитов нитрозилирующего стресса наибольший вклад в формирование клинического полиморфизма бронхиальной астмы вносят показатели уровня нитрозоглутатиона. Прогрессирование тяжести заболевания происходит при усугублении дефицита нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве.

Впервые показано, что интенсивность нитрозилирующего стресса при воспалении на фоне бронхиальной астмы ассоциирована с развитием оксидативного стресса и с существующим дисбалансом в сторону интенсификации нитрозилирующего стресса (кратное увеличение 3­нитротирозина в сравнении с малоновым диальдегидом в бронхиальном смыве).

Абсолютно приоритетными являются данные о молекулярно-генетических механизмах нитрозилирующего стресса. Так, установлено, что аллель -954С гена индуцибельной NOS ассоциирован с формированием нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме. Патогенетический вклад данного полиморфизма подтвержден высоким уровнем мРНК индуцибельной NOS в бронхобиоптатах больных и высоким уровнем нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве.

В результате обобщения клинических, функциональных, генетических характеристик пациентов с привлечением многофакторного дискриминантного анализа получены приоритетные данные об ассоциации экспрессии конститутивных изоформ (нейрональной NOS, эндотелиальной NOS) в бронхиальных биоптатах с улучшением паттерна воспаления и показателей функции легких при бронхиальной астме, а в случае повышенной экспрессии гена индуцибельной NOS в ткани бронхов - с ухудшением состояния слизистой оболочки бронхов и низкими значениями показателей функции внешнего дыхания при бронхиальной астме.

Впервые установлено участие генов GST в регуляции нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме. Показано, что функционально неактивная комбинация GSTT1*0/GSTM1*0 характеризуется нарушениями метаболизма оксида азота, а именно, преимущественным образованием 3-нитротирозина и дефицитом нитрозоглутатиона в связи с ферментативным дефицитом GST. У пациентов с данной комбинацией аллелей зарегистрирован экстремально высокий уровень 3-нитротирозина и низкий уровень нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве. Данный молекулярный механизм является фактором риска тяжелой бронхиальной астмы в связи с необратимым характером накопления 3­нитротирозина, низким бронходилатационным потенциалом на фоне дефицита нитрозоглутатиона и плохим ответом на терапию.

Новыми являются результаты о роли нитрозилирующего стресса в ремоделировании дыхательных путей при бронхиальной астме. Так, установлено, что повышенное содержание 3-нитротирозина ассоциировано с текущим воспалением, уменьшением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитов, снижением относительного объема желез, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани. Увеличение уровня 3-нитротирозина в дыхательных путях ассоциировано с более высокой плотностью провоспалительных клеточных элементов и провоспалительных цитокинов (гистиомакрофагальные элементы, нейтрофилы, лимфоциты, ИЛ-8, ФНО-б). Таким образом, метаболит нитрозилирующего стресса 3-нитротирозин является маркером необратимого повреждения дыхательных путей.

Теоретическая и практическая значимость.

Работа выполнена в области клинической патофизиологии бронхиальной астмы. В результате выполнения работы предложена концепция, раскрывающая значение нитрозилирующего стресса как базисного механизма аллергического воспаления дыхательных путей. Концепция описывает закономерности участия метаболитов оксида азота в поддержании аллергического воспаления с учетом активности воспаления (тяжесть, период болезни), тканевых и клеточных маркеров ремоделирования бронхов, цитокинопосредованной коммуникации (Th1/Th2-цитокины) и генотипа больного (NOS, GST).

Установленные в исследовании новые патогенетически важные молекулярные маркеры клинического полиморфизма бронхиальной астмы (генотип GSTT1*0/GSTM1*0 генов GST, генотипы СС и GC полиморфизма ­954G/C гена NOS2) с позиции функциональности NOS и GST могут стать молекулярными мишенями для разработки новых терапевтических подходов персонифицированной патогенетической терапии и новых клеточных технологий в лечении бронхиальной астмы.

Важное практическое значение имеют результаты исследования, раскрывающие взаимосвязь закономерностей развития нитрозилирующего стресса с формированием клеточных и тканевых паттернов воспаления, в том числе ассоциированных с феноменом «терапевтическая резистентность».

Результаты исследований могут быть использованы при подготовке врачей-терапевтов, клинических фармакологов, пульмонологов, иммунологов-аллергологов, педиатров.

Апробация и реализация работы.

Основные результаты работы обсуждены на XVI Европейском респираторном конгрессе (Мюнхен, 2006), представлены на конгрессе терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2009), 18 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), 19 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), 4 национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на конгрессе педиатров России (Томск, 2009), на проблемной комиссии по патофизиологии, на теоретических семинарах кафедр патофизиологии, педиатрии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Диссертация апробирована на заседании апробационного совета НИИ фармакологии СО РАМН (Томск, 2010). Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биохимии и молекулярной биологии, госпитальной терапии, терапии ФУВ, педиатрии ФУВ, факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре биологии и химии Камчатского государственного университета имени Витуса Беринга, на кафедре иммунологии и аллергологии Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета.

1. Характеристика клинического материала и методы исследования

оксидативный стресс бронхиальный астма

В результате скрининга 282 взрослых, находящихся на амбулаторном учете в поликлиниках г. П-Камчатского, и отвечающих критериям включения, в исследование включены 142 человека: 77 здоровых и 65 больных БА. Основную часть работы составили результаты комплексного обследования 65 пациентов (13 мужчин и 52 женщины, в возрасте от 19 до 60 лет, средний возраст - 46,48±1,79 лет), из которых у 8 диагностирована легкая, 27 - среднетяжелая, 30 - тяжелая БА. На базе Камчатского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (главный врач - Э.А. Ломан) проведены сбор конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ); забор периферической крови для иммунологических, биохимических, молекулярно-биологических исследований; иммунологическое обследование. На базе первой городской больницы г. П­Камчатского (главный врач - С.В. Мачидловский) проведены клиническое обследование больных, верификация диагноза, лечение. В Камчатском краевом онкологическом диспансере (главный врач - А.М. Щанкин) проведены бронхоскопия с получением бронхоальвеолярного смыва (БС) и бронхобиоптата. Исследование биохимических маркеров предпринято на базе кафедры биохимии и молекулярной биологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (зав. кафедрой - профессор, д.м.н. В.Ю. Серебров). Химический синтез и определение нитрозоглутатиона осуществлены на кафедре общей химии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (зав. кафедрой - профессор д.х.н. М.С. Юсубов). Молекулярно-генетические исследования проведены на базе ЦНИЛ ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Байков). Морфологические исследования проведены на базе кафедры морфологии и общей патологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. кафедрой - профессор, д.м.н. И.В. Суходоло). Исследование выполнено на базе протокола, одобренного локальным комитетом по этике ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (заключение №383 от 31.01.2006).

Критерии включения пациентов с бронхиальной астмой:

· Амбулаторные и стационарные пациенты.

· Возраст пациентов от 19 до 60 лет.

· Положительные результаты кожных аллергопроб.

· Пациенты, имеющие ранее подтверждённый диагноз БА.

· Тест на обратимость положительный (ОФВ1 с сальбутамолом >12%, >200мл).

· Отсутствие соответствующей тяжести БА терапии в течение последнего месяца до включения в исследование.

· Пациенты, не имевшие острых респираторных заболеваний, а также обострений астмы в течение предшествующих 4 недель.

· Пациенты, умеющие правильно пользоваться ингалятором, пикфлоуметром, способные адекватно оценивать своё состояние, а также своевременно и правильно заполнять дневники самоконтроля.

Диагноз и тяжесть заболевания определяли в соответствии с рекомендациями международного согласительного документа GINA 2006 и национальной программы лечения и профилактики БА.

Критерии включения в контрольную группу.

Контрольную группу составили 77 волонтеров, 27 из них включены для проведения биохимических и иммунологических исследований (4 мужчин и 23 женщины в возрасте от 19 до 60 лет, средний возраст 45,32±7,3 лет). Все они являются жителями г. П­Камчатского. Это - добровольцы без аллергических заболеваний на момент включения и в анамнезе, без гельминтозов, острых и хронических заболеваний в стадии обострения в течение трех месяцев до включения, не получавших в течение последнего месяца определенных препаратов (системные ингаляционные глюкокортикостероиды, антилейкотриеновые препараты, пролонгированные теофиллины, пролонгированные 2 - агонисты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб), с отрицательными аллергопробами и IgE<100 МЕ/мл. У всех обследованных показатели функциональных тестов подтверждали отсутствие патологии органов дыхания. Для выполнения молекулярно-генетических исследований включена вся группа, из них 9 (11,7%) мужчин, 68 (88,3%) женщин, соответствующих указанным выше критериям включения.

Больные посетили клинику четыре раза (Визиты 0 ? 3), волонтеры - два раза (Визиты 0 и 1). Продолжительность исследования составила 26 недель: 2 недели - наблюдение и обследование, 24 недели - лечебный период. После назначения терапии, адекватной степени тяжести, и стабилизации клинико-функциональных показателей пациенты дважды госпитализировались для проведения фибробронхоскопии и биопсии (табл. 1).

Таблица 1. Схема обследования волонтеров и больных бронхиальной астмой

В настоящем исследовании лечение больных БА, вне зависимости от степени тяжести заболевания, осуществляли комбинированным препаратом Серетид - комбинация флутиказона пропионата (ФП) и сальметерола. Использовали двукратный режим дозирования. Пациенты с легкой БА получали препарат Серетид в дозе 250 мкг/сут по ФП, со среднетяжелой БА в дозе 500 мкг/сут по ФП, в случае тяжелой БА доза Серетида увеличивалась до 1000 мкг/сут по ФП. Бронхолитическую терапию короткодействующими в2­адреномиметиками использовали для купирования симптомов БА. В течение всего лечебного периода больные заполняли дневник самоконтроля и посещали клинику через 12 (Визит 2) и 24 (Визит 3) недели.

Исследование вентиляционной функции легких. Оценка функциональных тестов проведена у всех включённых в исследование. Для оценки характера нарушений функции внешнего дыхания (ФВД) и доказательства обратимости были определены: форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ1) на оборудовании MasterScope (Erich Jaeger GMBH, Германия), ПСВ - пикфлоуметрами Mini-Wright, в утренние и вечерние часы до приёма лекарственных препаратов.

Получение бронхиальных смывов (БС) и биоптатов осуществляли по стандартной методике (Robinson D.S., 1998) гибким фиброскопом BF1T20 (Olympus, Япония) в условиях эндоскопического кабинета. Процедура БС осуществлялась через тубус бронхоскопа путем введения 50 мл стерильного изотонического раствора NaCl, подогретого до 37°С, с немедленной аспирацией в специальный силиконизированный контейнер (Полосухин В.В., 1995). Полученные БС были разделены на аликвоты и помещены на хранение в сосуд Дюара (жидкий азот) для последующего единовременного определения метаболитов. Измерение изучаемых показателей проводили в супернатанте БС.

Биоптаты получали со слизистой оболочки среднедолевого бронха методом щипковой биопсии, в количестве двух фрагментов: для молекулярно-биологических исследований помещали на хранение в сосуд Дюара (жидкий азот), а для патоморфологической оценки - в 10% нейтральный забуференный формалин.

Цитоморфологические методы. Из зафиксированного в 10% нейтральном забуференном формалине материала после стандартной проводки и заливки готовили срезы толщиной 5-7 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином (Лили Р., 1969). Качественную и количественную оценку слизистой оболочки бронхов проводили на световом микроскопе при увеличении 200, 400, 900. При морфометрическом исследовании методом точечного счета сеткой Автандилова оценивали объемную плотность покровного эпителия и отдельных клеток (мм3/мм3), относительный объем соединительной ткани и желез (%). С помощью окуляр-микрометра измеряли высоту покровного эпителия, толщину базальной мембраны (мкм). Подсчет плотности различных клеточных популяций в 1 мм2 собственной пластинки слизистой оболочки проводили в графическом редакторе Adobe PhotoShop 7.0.

Получение конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) осуществляли, используя метод, при котором пациент последовательно выдыхал через рот, в отсутствие носового дыхания (назальные клипсы), в -образную полипропиленовую трубку с внутренним диаметром 5 мм, помещенную в полиэтиленовую пробирку, опущенную в стакан со льдом. Для предотвращения контаминации экспирата слюной (слюна содержит большие количества нитритов) полипропиленовую трубку изгибали в -образную петлю.

Определение цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-б, ИНФ-г) в сыворотке крови и БС проводили твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем «ИЛ-4-ИФА-Бест», «ИЛ-8-ИФА-Бест», «ФНО­б­ИФА-Бест», «гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ» ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск.

Определение Ig E в сыворотке периферической крови и БС проводили одностадийным (сэндвич) твердофазным иммуноферментным анализом тест­системами «Диаплюс» фирмы «Roche», Швейцария.

Содержание нитритов в КВВ и БС устанавливали по цветной реакции с реактивом Грисса. К 200 мкл исследуемого образца добавляли 50 мкл реактива Грисса, розовая окраска развивалась в течение 10 мин. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Калибровочную кривую строили по известным концентрациям нитрита натрия.

Содержание малонового диальдегида (МДА) в БС определяли спектрофотометрически по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, оценивая количество образовавшегося триметинового комплекса по оптической плотности при длине волны 535 нм [Матвеев С.Б., 1999].

Содержание 3-нитротирозина (3-НТ) в БС определяли спектрофотометрически по реакции с соляной кислотой, оценивая максимум светопоглощения при длине волны 370 нм [Каминская Л.Ю., 2005 г].

Активность каталазы в БС определяли спектрофотометрически при 410 нм по реакции пероксида водорода с солями молибдата [Королюк М.А., 1988].

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в БС определяли спектрофотометрически по реакции торможения аутоокисления адреналина в адренохром при длине волны 485 нм [Брусов О.С., 1978].

Содержание мочевины в сыворотке периферической крови и БС оценивали спектрофотометрически с помощью набора реагентов «Мочевина-Ново» (Вектор Бест, Новосибирск) согласно приложенной инструкции.

Содержание нитрозоглутатиона (GSNO) в БС определяли в два этапа. Первоначально провели химический синтез GSNO [Hart T.W., 1985]: навеску GSH (153,5 мг) растворяли в 1 мл воды и охлаждали до 5°C. Для подкисления среды использовали 0,25 мл 2N соляной кислоты, тщательно перемешивали. Затем порциями добавляли нитрит натрия (34,5 мг), инкубировали 40 мин при температуре 5°C. Раствор приобретал ярко-красный цвет. Полученный раствор обрабатывали охлажденным ацетоном (12 мл), перемешивали 10 мин. Образовавшиеся хлопья розового цвета выпадали в осадок. Суспензию центрифугировали 7 мин при 6000 об/мин. Надосадок выливали, к осадку добавляли последовательно холодный эфир, ацетон, эфир по 6 мл и каждый раз центрифугировали 4 мин при 6000 об/мин. Осадок розового цвета сушили под тягой. Сухой порошок в плотно закрытом флаконе, экранированный от действия солнечных лучей, хранили при температуре -3°С. На втором этапе работы строили калибровочную прямую и определяли концентрацию GSNO в БС больных БА. GSNO растворяли в физиологическом растворе по 9 контрольным точкам и измеряли светопоглощение растворов GSNO при длине волны 335 нм с помощью спектрофотометра UNICO - 2800.

Содержание глутатиона (GSH) в БС определяли спектрофотометрически по реакции с 5,5`-дитиобис-2-нитробензойной кислотой при длине волны 412 нм [Anderson M.E., 1985].

Периферическую (венозную) кровь для молекулярно-биологических исследований забирали из локтевой вены, утром натощак в стерильную пробирку, содержащую 2,5 мл 3% ЭДТА, в объеме 10 мл.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили стандартным методом с использованием фенол-хлороформной экстракции [Lahiri D.K. et al., 1992].

Определение полиморфизма генов NO-синтаз осуществляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Амплификацию проводили на автоматическом амплификаторе ДТ96 (ДНК­технология, Москва), используя праймеры, специфичные к участку гена («Биосет», Новосибирск) и ферменты рестрикции («Сибэнзим», Новосибирск).

Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой при оптимальной для фермента температуре в течение 12-24 ч. Продукты рестрикции фракционировали в 6% полиакриламидном геле в течение 120 мин при 160 В. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете.

Определение полиморфизма генов глутатион­S­трансфераз для генов GSTT1 и GSTM1 проводили с помощью мультиплексной ПЦР [Spurdle A.B., 2001]. Амплификацию проводили на автоматическом амплификаторе ДТ96 (ДНК-технология, Москва), используя структуру праймеров («Биосет», Новосибирск), специфичных к участку гена.

Гомозиготность по «нулевым» аллелям генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию соответствующих фрагментов размером 131 и 114 п.н. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о гомо- либо гетерозиготности по одной нормальной копии гена. Для внутреннего контроля амплификации определяли фрагмент гена ER размером 181 п.н.

Выделение тотальной РНК из биоптатов. Образцы ткани слизистой бронхов, полученные в ходе БФС сразу после забора помещались в эппендорфы и замораживались в жидком азоте при температуре -196оС, где они и хранились вплоть до момента выделения РНК. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения ДНК и РНК на колонках «QIAGEN RNA/DNA» (QIAGEN, Германия).

Определение уровня экспрессии генов NO-синтаз в бронхобиоптатах проводили в режиме реального времени (РТ-ПЦР), используя коммерческие наборы, разработанные и произведенные в ООО «Биосан» (г. Новосибирск) на амплификаторе с детекцией флуоресценции «Биомс1» (г. Томск, Россия). РТ­ПЦР выполняли с использованием следующих праймеров и зондов.

Определение уровня экспрессии проводили путем сравнения пороговых уровней флюоресценции маркерного гена и гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ), уровень экспрессии которого принимался за 100%.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 5.5а (StatSoft, USA). Для нормально распределенных выборок данных вычисляли среднее арифметическое (M), ошибку среднего арифметического значения (m); оценку статистической значимости различий средних проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Me) и интерквартильный размах. Для оценки статистической значимости различий показателей выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали непараметрические критерии: Манна-Уитни (U­тест) (сопоставление двух независимых групп) и критерий Вилкоксона для парных сравнений (сопоставление двух зависимых групп). С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Для выявления наиболее значимых показателей, по которым наблюдались межгрупповые различия, был проведен кластерный и пошаговый дискриминантный анализ. Различия между показателями считали статистически значимыми при значении р<0,05 [Реброва О.Ю., 2002]. Сравнение распределения частот аллелей и генотипов в группах обследованных проводили с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с БА сравнивали частоты генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий ч2 с поправкой Йетса на непрерывность, а также с применением двустороннего точного критерия Фишера. О величине ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (OR) [Pearce N., 1993], величины, показывающей, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов). Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%.

2. Результаты исследования и их обсуждение

1. Клинико-функциональная характеристика больных бронхиальной астмой при включении в исследование

Клинические и параклинические исследования, выполнены во всех группах пациентов. Установлены значения IgE, превышающие контроль у всех больных БА, что отражает патогенетическую структуру заболевания в представленной выборке пациентов (легкая форма - 192,0 МЕ/мл (95% CI: 56,1­796,9), среднетяжелая - 184,2 МЕ/мл (95% CI: 95,0-390,0), тяжелая - 115,7 МЕ/мл (95% CI: 48,8-276,0), группа контроля - 67,21 МЕ/мл (95% CI: 41,3-81,0). Не выявлено зависимости данного показателя от тяжести болезни.

У всех обследованных больных выявлены сниженные показатели ОФВ1, ПСВ и ФЖЕЛ, которые статистически значимо отличались в группах больных, выявлена бронхиальная обструкция на уровне мелких (МОС25) и средних (МОС50) бронхов (табл. 2). Наиболее выраженное нарушение вентиляции легких по обструктивному типу выявлено в группе больных тяжелой астмой. Полученные результаты объяснимы, поскольку эти показатели являются критериями диагностики тяжести БА, GINA 2006.

При включении в исследование все больные имели симптомы астмы, у всех контроль БА по АСТ­тесту был ниже 19 баллов (неконтролируемая БА). Никто из пациентов в период включения в исследование не получал ИКС на регулярной основе и в объеме, соответствующем тяжести БА. Результаты мониторирования пациентов в лечебной фазе исследования показали в целом положительную клинико-функциональную динамику. Так, при легкой и среднетяжелой БА установлено уменьшение тяжести дневных, ночных симптомов (исчезновение при легкой), частоты применения скоропомощной терапии, восстановление до референтных значений показателей функции легких, значительное сокращение (до 0 при легкой) обострений, госпитализаций. У всех больных с легкой БА уровень АСТ поднялся до 25 баллов, что свидетельствует о контролируемом течении болезни, при Таблица 2. Показатели функции внешнего дыхания и АСТ- теста в изучаемых группах больных бронхиальной астмой на фоне лечения, (M±m)

Примечание:

* - оценка по шкале симптомов

- p<0,05, - p<0,001 - уровень значимости различий по сравнению с пациентами с легкой астмой

- p<0,05, - p<0,001 - уровень значимости различий по сравнению с пациентами со среднетяжелой астмой

# - p<0,05, ## - p<0,001 - значимость различий при сравнении показателей до и после лечения среднетяжелой БА у 75% больных достигнут контроль над астмой. Можно предположить, что применение стандартной противовоспалительной терапии в объемах, соответствующих тяжести БА, позволило снизить активность воспаления в ДП в связи с чем болезнь приняла бессимптомное течение.

При тяжелой БА, несмотря на в целом положительную динамику клинико-функциональных параметров на фоне стандартного лечения, ни у одного больного не достигнут контроль над болезнью (АСТ менее 19), ниже референтных остались показатели функции легких, число госпитализаций и обострений не претерпело достоверно значимой динамики. С позиции клинической патофизиологии это можно объяснить или необратимым компонентом ремоделирования бронхиальной стенки или персистирующим воспалением, несмотря на высокие дозы глюкокортикостероидов, включая ИКС. По данным P.J. Barnes (1998) распространенность терапевтически резистентной БА (по определению European espiratory society (1999), при которой не удается достичь контроля над симптомами болезни, несмотря на применение адекватных доз ингаляционных кортикостероидов (ИКС) в течение не менее 6 месяцев) составляет 5­10% общей популяции больных данным заболеванием. Проблема неконтролируемого течения БА гораздо более масштабна и число таких больных достигает 60% в Европейских странах [AIRCEE, AIRE, 2004; Огородова Л.М. и соавт., 2009]. Среди причин неконтролируемого течения активно обсуждается персистенция воспаления [Bousquet J., 2000; Vignola A.M., 2000; Goleva E., 2006; Barnes P.J., 2009] с развитием нитрозилирующего стресса в ДП, закономерности формирования и влияние которого на патофизиологические проявления астмы не ясны.

2. Закономерности развития нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме.

Опираясь на ранее проведенные исследования [Nevin B.J., 2002; F.L.M. Ricciardolo et al., 2004; Paredi P., 2005; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2006; Bove P., 2006], нами разработана модель реакций NO*, описывающая ключевые пути формирования метаболитов NO* при воспалении (рис. 1). Для подтверждения научной гипотезы участия метаболитов NO* в формировании нитрозилирующего стресса изучено содержание 3-НТ, нитритов и GSNO.

Установлено высокое содержание нитритов в КВВ и БС при БА, отражающее тяжесть и период болезни (активность воспаления). После лечения достоверное снижение уровня нитритов в КВВ и БС зарегистрировано при всех тяжестях БА, но только при легкой астме исследуемый показатель достиг контроля (рис. 2). Учитывая, что бронходилатационный эффект связан с участием NO* через рГЦ/цГМФ - зависимые механизмы [Ballou D.P. 2002, Friebe А., Koesling D., 2003], интенсивное образование нитритов можно рассматривать и как факт, отражающий снижение доли NO*, участвующего в модуляции тонуса ДП. Установленные нами взаимосвязи подтвердили возможное участие нитритов в механизмах, связанных с ограничением воздушного потока в бронхах больных БА (ОФВ1 (R=-0,53; р=0,00750), ПСВ (R=-0,54; р=0,03700)), обосновывая существенный вклад токсичных метаболитов в развитие БА.

Рис. 1. Модель реакций оксида азота при воспалении

Установлены высокий уровень 3-НТ и низкий - GSNO в БС, ассоциированные с тяжестью болезни. Содержание данных метаболитов претерпело положительную динамику на фоне лечения у всех больных, за исключением пациентов с тяжелой БА. Дефицит GSNO в данном случае может быть обусловлен рядом причин, которые сегодня обсуждаются в научной литературе. Роль S-нитрозотиолов - донировать NO*, обеспечивая эффекты оксида азота на некотором расстоянии от места его синтеза. В последние годы активно обсуждается гипотеза о дефиците S-нитрозотиолов в бронхиальном секрете при БА, несмотря на высокий уровень NO* в выдыхаемом воздухе [Vliet A., 2006; Gaston B. et al., 2009; Fitzpatrick A.M., 2009; Lewis S.J., Gaston B., 2009]. Возможно, это связано с активным метаболизмом S-нитрозотиолов (с высвобождением NO*) и тиолов (вследствие окислительного стресса), либо имеет место нарушение их образования с участием GSH и NO*. В рамках данного иcследования обнаружено, что нарушение депонирования NO* у больных БА ассоциировано с ухудшением параметров ФВД (ОФВ1 (R=0,50; р=0,00009), ПСВ (R=0,51; р=0,00002)), что подтверждает участие GSNO в механизмах бронхообструкции. Что касается значительного повышения 3-НТ в БС больных БА, выявленное в работе, следует указать, что его повышение было ассоциировано с основными показателями обструкции легких ОФВ1,% (R=-0,64; р=0,00008), ПСВ,% (R=­0,56; р=0,00088), ФЖЕЛ,% (R=­0,58; р=0,00047), подтверждая вклад данного метаболита в патофизиологические механизмы тяжелой БА. Предположительно повышение концентраций 3-НТ, во-первых, связано с нарастанием вентиляционной недостаточности по обструктивному типу по мере нарастания тяжести БА [Гельцер Б.И. и соавт, 2003], что приводит компенсаторному увеличению продукции NO*. Во-вторых, при более тяжелом течении заболевания в респираторном тракте регистрируется накопление АФК [Викторов И.В., 2000], реагирующих с NO* с образованием ONOOя-, который, кроме того, что является сильным окислителем (образование гидроксильного радикала, активация ПОЛ, повреждение митохондрий и ДНК, ингибирование каталитической, функциональной активности белков и продукции сурфактанта), способен связываться с белковыми молекулами по остаткам тирозина с образованием 3­НТ [Matata B.M., Galinanes М., 2002; Ischiropoulos H., 2003; Radi R., 2004; Dalle-Donne I. et al., 2005]. Так, группой японских исследователей представлена патофизиологическая роль ONOO- в процессах ремоделирования ткани бронхов. Ими продемонстрировано влияние пероксинитрита на продукцию фибронектина, коллагена, десмина (маркера миофибробластов) и увеличение синтеза трансформирующего фактора роста в за счет активации NF-кB [Ichikawa T. et al., 2008].

Таким образом, у больных БА нарушено образование GSNO, сопровождающееся избыточным накоплением 3­НТ и нитритов, с формированием нитрозилирующего стресса.

В настоящее время обсуждаются различные механизмы нарушения метаболизма NO* при воспалении. Согласно данным литературы, источником нитритов является NO*, образующийся как с участием ферментов NOS, так и посредством химического превращения - неферментативным путем [Осипов А.Н. и соавт, 2007; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Hess D.T., 2005; Bove P.F., Vliet A., 2006; Kutzia A. et al., 2006]. Поэтому способность NO* к быстрым окислительно-восстановительным реакциям можно рассматривать как один из путей нарушения физиологической роли NO* в респираторном тракте.

Принимая во внимание «пересечение метаболических путей» NO* и O2, являющихся первичными природными радикалами и имеющих сопоставимые сигнальные свойства и эффекторные молекулы [Valko M. et al., 2007], в работе проведена оценка интенсивности оксидативного стресса (МДА, СОД, каталаза, GSH) в ДП (рис. 3*). До лечебного периода у всех больных зарегистрировано высокое содержание МДА в БС, что отражает тяжесть заболевания. После лечения уровень данного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) достоверно снизился при легкой и среднетяжелой, достигнув значений контроля только в группе легкой БА. Установлена прямая корреляция между уровнем МДА и содержанием 3-НТ и нитритов в БС (R=0,62; p=0,00023 и R=0,67; p<0,01600, соответственно) и обратная - с уровнем GSNO (R=­0,60; p=0,00023), что указывает на взаимосвязь изучаемых явлений и патогенетические механизмы дисрегуляции, а также подтверждает что повышение образования нитритов свидетельствует об интенсивности аллергического воспаления в ДП [Dweik R.A. et al., 2001].

Усиленную внутриклеточную продукцию АФК и АФА, интенсификацию свободнорадикального окисления (СРО) в органах дыхания больных БА связывают с повреждением, последующей десквамацией эпителия ДП и развитием бронхиальной гиперреактивности [Ercan Н. et al., 2006]. Известно, что несоответствие между скоростью СРО и возможностями АОЗ приводит к их ингибированию, тем более выраженному, чем тяжелее БА [Таганович А.Д. и соавт., 2002; Болевич С.Б. и соавт., 2006]. В нашем исследовании этот процесс отражался в снижении активности каталазы по мере прогрессирования тяжести БА и в полном дефиците активности СОД (возможно, это связано с ингибирующим влиянием продуктов СРО) в группе больных тяжелой БА. Аналогичные данные получены и другими исследователями [Андрушкевич В.В. и соавт., 2000; Юлдашева И.А. и соавт., 2003; Варшавский Б.Я. и соавт., 2003]. Снижение активности каталазы определяет накопление в клетке перекиси водорода, изменение структуры различных биомакромолекул, повреждение мембраны клеток. Учитывая, что в присутствии Fe2+ из перекиси водорода образуется гидроксил-радикал, запускающий ПОЛ [Меньщикова Е.Б., 2006], можно ожидать его участие и в свободнорадикальных реакциях с NO*.

Что касается СОД - фермента, участвующего в реакции дисмутации супероксид аниона, необходимо отметить компенсаторное повышение его активности при среднетяжелой, и отсутствие компенсаторного повышения при тяжелой БА. Известно, что угнетение активности СОД может быть обусловлено его повреждением низкомолекулярными полипептидными соединениями­ингибиторами и перекисью водорода [Valko M. et al., 2007].

В настоящее время обсуждается и другой механизм влияния на активность фермента - способность NO* формировать нитрозильные комплексы, вытесняя медь за счет нитрозилирования SH-групп белков, участвующих в транспорте и депонировании металлов переменной валентности [Liu S. et al., 2000]. Как показало проведенное исследование высокие уровни 3-НТ у больных в период симптоматической БА связаны со снижением активности СОД, и данные зависимости подтверждены отрицательными коэффициентами корреляции (R=­0,53; р=0,02576). Вероятно, одним из возможных механизмов повышения уровня токсичных метаболитов NO* может быть способность СОД конкурировать с NO* за O2. Известно, что при повышении концентрации NO* способность данного фермента конкурировать с NO* за O2 резко падает, обусловливая реакции между NO* и O2 с образованием пероксинитрита (ONOOя-), а в дальнейшем - нитритов, нитратов и 3­НТ [Radi R., 2004; Ли Д.Д. и соавт., 2005; Ponczek M.B., Wachowicz B., 2005]. В связи с этим, в настоящее время высказывается предположение, что баланс NO*/ONOO- связан с действующей концентрацией NO* [Dweik R.A., 2001; Ischiropoulos H., 2003].

Выявленный низкий уровень GSH у больных БА свидетельствует о прооксидантном сдвиге GSH>GSSG равновесия в клетке и об окислении значительной части GSH (GSH>GSSG). Как известно, тиол-дисульфидное равновесие является обратимым, оно играет ключевую роль в модулировании разных функций в физиологических условиях [Суханова Г.А., 2000; Fitzpatrick A.M. et al., 2009]. Иными словами, смена редокс-статуса является сигналом к перестройке метаболизма [Reynaert N.L. et al., 2005]. От внутриклеточного редокс-статуса пары GSSG/2GSH зависит как чувствительность целого ряда белков, участвующих в процессе передачи регуляторных сигналов, так и способность GSH восстанавливать самые важные антиоксиданты [Droge W., 2002]. Можно предположить, что накопление GSH по мере утяжеления БА происходит вследствие торможения его утилизации, обусловленного радикал-зависимым снижением активности глутатионпероксидазы [Droge W., 2002]. Но, по всей видимости, выявленное увеличение концентрации GSH по мере утяжеления БА в условиях выраженного окислительного и нитрозилирующего стрессов, свидетельствует в пользу включения компенсаторных процессов и мобилизации его функций в клетках [Valko М. et al., 2007; Fitzpatrick A.M. et al., 2009]. После курса базисной противовоспалительной терапии при легкой и среднетяжелой астме достигнута коррекция в соотношении интенсивности ПОЛ и активности АОС, уменьшилось содержание нитритов и 3-НТ, увеличился уровень GSNO. При тяжелой БА динамика содержания 3-НТ и GSNO отсутствовала. Приведенный выше фактический материал убедительно свидетельствует, что интенсивность нитрозилирующего стресса ассоциирована с развитием оксидативного стресса.

Для оценки роли метаболитов NO* в формировании клинического полиморфизма БА применили дискриминантный анализ (табл. 3; рис. 4).

Таблица 3. Диагностическая значимость метаболитов оксида азота для дифференциального диагноза разных форм бронхиальной астмы до лечения

Примечание: ЛДФ - линейная дискриминантная функция; Лямбда Уилкса и F - критерии ЛДФ; р - уровень значимости для показателей, включенных в ЛДФ.

Рис. 6. Результаты дискриминантного анализа патогенетического полиморфизма БА с учетом метаболитов нитрозилирующего стресса

Результаты анализа подтвердили, что исследуемая совокупность больных не была однородной (p<0,00001) и достоверно значимый вклад в различия между изучаемыми группами больных внесли нитриты КВВ, 3-НТ и GSNO. Причем, наибольшим был вклад уровня GSNO (лямбда Уилкса = 0,53; p=0,00366). Точность диагностики составила от 87% до 100%.

Определенно, при аллергическом воспалении ДП имеются патогенетические фенотипы, связанные с изменчивостью метаболизма NO*, причем патогенетические фенотипы демонстрируют тесную ассоциацию с клиническим полиморфизмом БА.

Систематизация закономерностей нитрозилирующего стресса в дыхательных путях позволила выделить два варианта его реализации при БА:

1. Нитрозилирующий стресс с преимущественным накоплением нитритов, повышение уровня которых в БС и КВВ ассоциировано с клинико-функциональными нарушениями у больных БА. Данный вариант нитрозилирующего стресса зарегистрирован только при легкой и среднетяжелой БА, является обратимым как с позиции биохимических, так и клинико-функциональных характеристик, что позволяет считать его механизмом терапевтически-чувствительного фенотипа болезни.

2. Нитрозилирующий стресс с преимущественным и необратимым накоплением 3-НТ, тесно коррелирующий с необратимыми нарушениями показателей функции легких, сохраняющимися даже после 6 месяцев лечения с применением системных кортикостероидов и высоких доз ИКС. Данный вариант нитрозилирующего стресса ассоциирован с формированием тяжелой неконтролируемой БА, терапевтически резистентным фенотипом.

3. Взаимосвязь нитрозилирующего стресса с иммунологическими и морфологическими параметрами воспаления при бронхиальной астме

Одной из задач исследования было выявление закономерностей и особенностей формирования структурно-функциональных нарушений в строении слизистой оболочки бронхов больных БА в зависимости от вариантов развития нитрозилирующего стресса в процессе аллергического воспаления. Для подтверждения роли метаболитов NO* в регуляции аллергического воспаления и ремоделировании бронхов при различных клинических формах БА изучено содержание Th1/Th2 цитокинов в БС и периферической крови, проведены морфометрические и цитологические исследования слизистой оболочки бронхов больных БА до- и после лечения.