Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

Известно, что в результате персистирующего воспаления при БА формируются специфические морфологические изменения тканей стенки бронхов, в рамках которых регистрируются процессы ремоделирования, составляющие патогенетическую основу неконтролируемого течения астмы. В данном исследовании установлены значимые различия в инфильтрации слизистой оболочки бронхов эффекторными клетками: при легкой БА преобладали эозинофилы (р=0,01019), при среднетяжелой выявлен полиморфноклеточный инфильтрат, при тяжелой ? увеличение плотности нейтрофилов (р=0,04160) (рис. 5*).

Выявленная при тяжелой БА полиморфноклеточная инфильтрация с нейтрофилией в воздухоносных путях у больных тяжелой БА объяснима высоким уровнем синтезируемого хемоаттрактанта для нейтрофилов (ИЛ-8), приводящего к рекрутированию нейтрофилов и эскалации генерации АФК и АФА [Holgate S.T., 2008; Wang Y.H., Liu Y.J., 2008]. По мнению ряда исследователей, такой тип клеточной инфильтрации может быть связан со снижением уровня рецепторов для ИЛ-5 на реснитчатом эпителии, в связи с его выраженной деструкцией, отражением применения высоких доз кортикостероидов и свидетельством инфицирования ДП. На сегодняшний день нет единого мнения о преобладании какого-либо типа эффекторных клеток в воспалительном инфильтрате, особенно в случае тяжелой БА [Barreiro E. et al., 2004; Holgate S.T., Polosa R., 2006; Anderson G.P., 2008]. Недавние исследования патоморфологической характеристики тяжелой БА (brittle) показали преобладание в составе инфильтрата слизистой оболочки бронхов гистиомакрофагальных элементов, лимфоцитов, нейтрофилов при тяжелой БА на фоне относительно более низкого по сравнению с легкой формой болезни числа эозинофилов [Огородова Л.М и соавт., 2008]. Современные исследователи склонны считать, что преобладание нейтрофилов ассоциировано с нейтрофильной эластазой, обладающей деструктивным и ремоделирующим действием на ткани [Cundall M., 2003; Simpson J.L., 2005; Аверьянов А.В., Поливанова А.Э., 2007], что приводит к необратимым структурным изменениям ткани бронхов, имеющим крайнюю степень выраженности у пациентов с тяжелой БА. C другой стороны, объяснением цитологического полиморфизма возможно является баланс про- и антиапоптотических систем, который ассоциирован с уровнем NO* [Степовая Е.А. и соавт., 2008; Brune B., 2003; Zhang X. et al., 2003; Li C.Q., Wogan G.N., 2005; Saffar A.S. et al., 2007; Shaojin D., Chang C., 2007]. Наши результаты косвенно подтверждают, что развитие апоптоза ассоциировано с уровнем NO*. После лечения ГКС (включая СКС) наибольшее количество клеток, инфильтрирующих слизистую оболочку бронха, выявлено при тяжелой БА, причем по-прежнему достоверно доминировали нейтрофилы - от 56 до 94 клеток в 1 мм2 (медиана равна 82), (р<0,00001). Изменение клеточного состава и плотности инфильтрата на фоне терапии отмечено лишь при легкой и среднетяжелой БА.

При морфометрическом анализе ткани бронхов в рамках данного исследования установлены типичные изменения (табл. 4). При легкой - отсутствие выраженных нарушений и сохранность слизистой бронхов, что нельзя сказать о тяжелой БА, где присутствовали все признаки ремоделирования: уменьшение толщины эпителиального пласта, снижение объемной плотности покровного эпителия, уменьшение относительного объема желез, фиброз собственной пластинки, что проявлялось в увеличении относительного объема соединительной ткани и утолщении базальной мембраны. Частично эти изменения были выражены и при среднетяжелой форме болезни - снижение объемной плотности покровного эпителия с одновременным уменьшением общего числа реснитчатых и базальных клеток в сравнении с легкой. На фоне лечения, через 6 месяцев терапии ИКС, наиболее значимые улучшения структурной организации слизистой оболочки бронхов наблюдались у больных легкой БА. При среднетяжелой БА после лечения восстановилась только архитектоника эпителия, другие показатели изменились незначительно. При тяжелой БА применение адекватной степени тяжести базисной терапии не сопровождалось динамикой патоморфологических показателей слизистой оболочки бронхов.

Таблица 4. Морфометрические показатели слизистой оболочки бронхов у больных бронхиальной астмой, Мe (25%-75%), n

Примечание:

рл - уровень значимости по сравнению с легкой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни)

рср - уровень значимости различий по сравнению со среднетяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни)

pт- уровень значимости различий по сравнению с тяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни)

# - p<0,05 по сравнению с исходными показателями (критерий Вилкоксона) Таким образом, у больных с разной тяжестью БА установлены отличительные паттерны воспаления с преимущественным участием тех или иных эффекторных клеток, характеризующиеся наличием (при тяжелой БА) или отсутствием (при легкой БА) выраженных признаков ремоделирования тканей стенки бронхов, что составляет основу клинического полиморфизма БА.

Структурная перестройка бронхов является ответом на сложные взаимодействия цитокинов и медиаторов, вовлеченных в воспалительный ответ при БА [GINA, 2006]. В настоящее время известно большое количество стимулов, способных инициировать и поддерживать процесс ремоделирования бронхов, однако отдельные факторы, влияющие на ремоделинг, продолжают изучаться [Holgate S.T., 2006; Lee J.Y. et al., 2006; Cohen L. et al., 2007].

Задачей нашего исследования была оценка вклада нитрозилирующего стресса в формирование морфологического и клинического полиморфизма БА. Корреляционный анализ установил, что накопление разных метаболитов NO* ассоциировано со специфическими изменениями морфологии. Так, преимущественное накопление 3-НТ коррелирует с уменьшением объемной плотности (R=-0,50, pдо=0,01231) и высоты покровного эпителия (R=­0,57, pдо=0,00332), реснитчатых (R=-0,45, pдо=0,02306; R=­0,72, pпосле=0,00006) и базальных эпителиоцитов (R=-0,60, pдо=0,01888; R=­0,56, pпосле=0,00431), снижением относительного объема желез (R=­0,57, pдо=0,00037), значительным увеличением толщины базальной мембраны (R=0,54, pдо=0,01431) и относительного объема соединительной ткани (R=0,53, pдо=0,00007) и интенсивной аккумуляцией нейтрофилов в ДП (R=0,87, рдо<0,0001; R=0,82, рпосле<0,0001). Преимущественное накопление нитритов коррелирует с плотностью реснитчатых (R=-0,53, pдо=0,02496) и базальных эпителиоцитов (R=-0,52, pдо=0,00010) и накоплением эозинофилов (R=0,74, pдо=0,01400). Характерно, что на фоне лечения эти корреляции не изменялись, что свидетельствует о необратимости данных процессов.

Что касается GSNO, его содержание положительно коррелировало с показателями, характеризующими сохранность эпителия - плотностью реснитчатых (R=0,62, pпосле=0,0022) и базальных эпителиоцитов (R=0,62, pпосле=0,0022) и отрицательно - с объемом соединительной ткани (R=­0,61, pдо=0,029), т.е. с процессами ремоделирования. В целом данный раздел исследования показал, что закономерности цитоморфологических изменений бронхиальной стенки ассоциированы с вариантами развития нитрозилирующего стресса.

Таким образом, выраженность нитрозилирующего стресса и структура его метаболитов связаны как с функциональными, так и морфологическими изменениями ДП при аллергическом воспалении. Как показали результаты дискриминантного анализа морфологические паттерны аллергического воспаления ДП коррелируют с клиническим полиморфизмом при БА.

Результаты данной работы, полученные при исследовании цитокинопосредованной межклеточной коммуникации, подтвердили важную роль Th2-воспаления, ассоциированного с повышением уровня ИЛ-4 в БС, а также значение повышенного уровня других провоспалительных цитокинов (ФНО-б, ИНФ-г, ИЛ-8) в БС при БА. Известно, что изменение спектра медиаторов, секретируемых клетками бронхолегочного аппарата, лежит в основе селективного накопления разных популяций лейкоцитов в воспалительном инфильтрате [Старикова Э.А. и соавт., 2005]. Сравнительный анализ содержания цитокинов в БС показал существенные различия у пациентов в зависимости от тяжести БА с наименьшим уровнем медиаторов у больных легкой БА. Отмечена значимая разница в соотношении регуляторных молекул в БС при разной тяжести БА, что характеризует разную активность воспаления в ДП при БА. Более высокое соотношение ИЛ-4/ИНФ-г установлено при легкой БА - 5,4 (95% CI: 4,2-12,7), наименьшее - при тяжелой БА 1,53 (95% CI: 1,0­1,9). При среднетяжелой БА соотношение составило 4,2 (95% CI: 2,1-5,5). После лечения у всех больных изменилось соотношение Th1/Th2 цитокинов. Известно, что механизм действия ГКС на клетки иммунной системы и вырабатываемые ими цитокины связан с изменением транскрипции генов, имеющих патогенетическое значение при БА [Barnes P.J., 2002]. Так, при легкой БА достоверно уменьшилось содержание ИЛ­8 (р=0,01172), и значимо снизилось соотношение ИЛ-4/ИНФ-г (р=0,03569). При среднетяжелой БА после лечебного периода в 2 раза снизился уровень ИНФ-г и снизилось соотношение ИЛ-4/ИНФ-г (р=0,04159). При тяжелой БА содержание ИНФ-г уменьшилось в 3 раза (р=0,00222), уровень ФНО-б снизился в 1,7 раза (р=0,00187) с повышением соотношения ИЛ-4/ИНФ-г (р=0,000147). Однако уровень ИЛ-8 не претерпел динамики на фоне лечения.

В целом, содержание цитокинов отражало тяжесть воспаления и на фоне лечения их уровень снижался. Однако содержание ИЛ-4 и ИЛ-8 не изменилось в рамках лечебного периода, определяя сохраняющуюся высокую клеточность и явления ремоделирования при тяжелой БА.

Для оценки вклада провоспалительных цитокинов в патофизиологические проявления БА проведен корреляционный анализ. Выявлены отрицательные взаимосвязи с показателями ФВД (ОФВ1, ПСВ и ФЖЕЛ) как для ИЛ-4 (R=­0,61; pдо=0,00003; R=-0,55; pдо=0,00029 и R=­0,63; pдо=0,00002, соответственно), так и для ИНФ-г (R=-0,69; pдо<0,00001; R=-0,50; pдо=0,00231 и R=-0,69; pдо<0,00001, соответственно), которые сохранились и в период ремиссии. Представленные результаты свидетельствуют о том, что по мере нарастания активности аллергического воспаления усиливается вклад Th1/Th2 провоспалительных цитокинов в функциональные характеристики астмы. Закономерными, на наш взгляд, являются выявленные ассоциации высоких значений провоспалительных цитокинов на фоне нерегулярного лечения БА с повышенным образованием токсичных метаболитов NO*, усугубляющих аллергическое воспаление. C увеличением в БС концентрации ИЛ-4, ИНФ-г и ФНО-б достоверно повышался уровень 3-НТ в БС (R=0,60; pдо=0,00015; R=0,74; pдо<0,00001 и R=0,69; pдо=0,00001, соответственно) и снижался запас GSNO (R=­0,41; pдо=0,00911; R=­0,51; pдо=0,00086 и R=-0,58; pдо=0,00011, соответственно). После лечения выявленные корреляции сохранились, лишь ослабла их взаимосвязь. Данные ассоциации подтверждают возможные патогенетические механизмы дисрегуляции метаболитов NO* (с активацией нитрозилирующего стресса), опосредованные как Th1, так и Тh2 цитокинами. С другой стороны, полученные результаты раскрывают дифференцированный вклад различных метаболитов NO* БС в формирование цитокинового профиля в ДП при БА, что согласуется с данными, полученными при исследовании цитокинов сыворотки крови [Silvestri M. et al., 2006] и мокроты [Celio S. et al., 2006] больных астмой. С этой позиции развитие нашей концепции о вариантах нитрозилирующего стресса выглядит следующим образом (рис. 6):

Рис. 7. Варианты развития нитрозилирующего стресса и клинический полиморфизм бронхиальной астмы

При 1-ом варианте (реализация нитрозилирующего стресса за счет преимущественного накопления нитритов в БС и КВВ) развитие БА характеризуется повышением уровня ИЛ-4 и эозинофильным паттерном воспаления в стенке бронхов.

При 2-ом варианте (реализация нитрозилирующего стресса за счет преимущественного накопления 3-НТ в БС) развитие БА характеризуется, наряду с повышенным уровнем ИЛ-4, высоким содержанием ИЛ-8 и ФНО-б, соответственно нейтрофильным паттерном воспаления слизистой бронхов и морфологическими признаками необратимого ремоделирования ДП.

4. Уровень экспрессии генов NO-синтаз в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой

Продукция NO* находится под генетическим контролем, поэтому участие NO* в формировании патофизиологических изменений при БА может варьировать в зависимости от дифференциальной экспрессии изоформ NOS. Для оценки связи уровня мРНК NO-синтаз с количеством синтезируемого оксида азота изучена экспрессия генов NOS в бронхобиоптатах 65 больных БА (рис. 7*). При исследовании бронхобиоптатов до и после курса противовоспалительной терапии выявлена матричная активность всех изоформ NOS. Это является свидетельством того, что все изоформы в той или иной степени участвуют в синтезе NO* в ДП, но в настоящее время обсуждаются различные механизмы их участия в развитии воспаления. Предполагается, что эффекты NOS1 и NOS3 реализуются через рГЦ/цГМФ - зависимые механизмы, тогда как эффекты NOS2 ассоциированы с S­нитрозилированием и повышением уровня NO* и его метаболитов [Hess D.T., 2005; Kutzia A. et al., 2006; Bove P.F., Vliet A., 2006; Gaston B., 2007]. Исходно нами установлена статистически значимо более выраженная экспрессия генов NOS2 и NOS3 в сравнении с NOS1 при любой тяжести БА. Дифференцированная оценка уровня экспрессии генов NOS в группах пациентов с различной степенью тяжести позволила выявить ряд особенностей.

Наименьший уровень мРНК NOS1 определен при тяжелой БА - менее половины активности в сравнении с легкой, и среднетяжелой БА. Учитывая, что NOS1 известна, как нейротрансмиттер нервных синапсов, а также как регулятор физиологических процессов дыхания [Luhrs H. et al., 2002], можно предположить, что снижение экспрессии этой изоформы фермента связано с развитием бронхообструкции при тяжелой БА, обусловленным дефектностью выделения нейромедиаторов и срывом синаптической передачи.

Экспрессия NOS3 в стенке бронхов у всех больных БА, вне зависимости от тяжести, была сопоставимой. Эндотелиальная NOS относится к конститутивным изоформам фермента, она экспрессируется постоянно и обеспечивает базальную продукцию NO* [Pechkovsky D.V. et al., 2002]. 95% активности этого фермента обеспечивается эндотелиальными клетками. Идентичная экспрессия мРНК NOS3 в ткани бронхов у больных разными формами тяжести БА и незначительный удельный вклад образующегося под влиянием активации NOS3 оксида азота в общую NO*-продуцирующую функцию ДП при БА свидетельствуют о существовании конститутивных процессов образования эндогенного пула этой молекулы.

Противоположная ситуация зарегистрирована в отношении мРНК NOS2: при тяжелой форме болезни уровень экспрессии NOS2 до лечения оказался самым высоким. Следует отметить, что NOS2 обеспечивает наибольший удельный вес в структуре избыточной продукции NO* ДП и экспрессия данной изоформы активируется бактериальными полисахаридами и цитокинами, которые секретируются активированными макрофагами, легочными фибробластами, эозинофилами, нейтрофилами, лимфоцитами, тучными, эпителиальными клетками, гладкими мышцами сосудов [Murad F., 2006; Laprise C. et al., 2004]. Как показали результаты данной работы, увеличение экспрессии NOS2 опосредовано участием ИЛ-4 (R=0,53; pдо=0,01683), ФНО-б (R=0,61; pдо=0,00038) и ИНФ-г (R=0,51; pдо=0,00419), подтверждая регуляцию провоспалительными цитокинами ферментативной продукции NO*. Чаще всего повышенную экспрессию NOS2 в эпителиоцитах связывают с инфекцией ДП. Механизм реализации антивирусного и антибактериального действия NO* определяется S-нитрозилированием протеиназ и транскрипционных факторов, необходимых для репликации вирусов и бактерий, а также изменением структуры поверхностных рецепторов, ответственных за адгезию микроорганизмов [Mannick J.B., 2006].

Доказательством участия генов NOS в регуляции бронхиальной проходимости являются результаты анализа ассоциаций между активностью экспрессии этих генов и показателями функции легких. Так, в данном исследовании установлена прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии нейрональной и эндотелиальной изоформ NO-синтаз в ткани бронхов и параметрами ОФВ1 (R=0,66; pдо<0,00001 и R=0,59; pдо=0,00265, соответственно). Это подтверждает изложенные выше данные о значении недостаточной экспрессии мРНК NOS1 и NOS3 в дисрегуляции бронхиальной проходимости при БА. Напротив, отмечена статистически значимая зависимость между высоким уровнем экспрессии индуцибельной NO­синтазы и ограничением воздушного потока в легких, которая сохранилась и после курса полноценной контролирующей терапии: ОФВ1,% (R=­0,76, pдо<0,00001), ПСВ,% (R=­0,59, pдо=0,00065), ФЖЕЛ,% (R=­0,50; pдо=0,00459).

Учитывая необратимое снижение экспрессии NOS1 при тяжелой БА и более высокую экспрессию NOS2 до лечения у этих пациентов, можно утверждать, что данный молекулярный механизм принимает участие в дисрегуляции бронхиального тонуса и поддержании бронхообструктивного синдрома при тяжелой БА. Вероятно, участие NOS2 в регуляции бронхиальной проходимости является базисным молекулярным механизмом болезни, определяющим сущность патологических изменений в ДП - воспаления и бронхообструкции. Как реализуется этот молекулярный механизм на морфологическом уровне?

С целью уточнения вклада различных изоформ NO-синтаз в процесс ремоделирования бронхиальной стенки больных БА изучена связь морфологических признаков бронхобиоптатов у больных БА с уровнем экспрессии генов NOS. Интенсивное образование NO* эпителиоцитами ДП и клетками воспаления при участии NOS2 является ключевым событием воспаления при астме [Zhang X. et al., 2003; Dinakar C., 2004; Han X. et al., 2004]. Именно индуцибельная изоформа производит наномолярные количества NO*, на несколько порядков превышающие уровень синтеза оксида азота конститутивными формами синтаз. Дополнительным подтверждением значимости экспрессии генов NOS2 явились данные о том, что экспрессия NOS2 в бронхобиоптатах у пациентов БА сопровождалась значимым утолщением базальной мембраны (R=0,52; pдо=0,03338). Эффективность лечения зависела от интенсивности снижения экспрессии мРНК NOS2, что подтверждалось тесной корреляцией уровня мРНК NOS2 с показателями ремоделирования стенки бронхов - объемом соединительной (R=0,60; pпосле=0,01007) и объемом железистой ткани (R=-0,58; pпосле=0,01182), как свидетельство того, что даже после лечения экспрессия NOS2 поддерживает текущие процессы ремоделирования в бронхах.

Анализ связи уровня мРНК NOS и основных метаболитов NO* раскрывает дифференцированный вклад различных изоформ NOS в метаболизм этой молекулы. Оказалось, что экспрессия различных генов NOS опосредует аккумуляцию либо токсичных метаболитов NO* (в случае повышенной экспрессии мРНК NOS2), либо определяет циркуляцию устойчивых доноров NO* (в случае повышенной экспрессии мРНК NOS1 и NOS3). В результате корреляционного анализа установлено наличие тесной связи между активацией в ткани бронхов NOS2 и повышением уровня 3-НТ (R=0,56; p=0,00320) и дефицитом GSNO (R=-0,54; pдо=0,00198). Выявленные связи между экспрессией генов NOS в бронхобиоптатах и маркерами воспаления - содержанием метаболитов NO* в ДП, с клиническими, функциональными проявлениями астмы, морфометрическими параметрами слизистой позволяют сделать вывод о том, что NO-синтазы вносят существенный вклад в поддержание процессов ремоделирования и бронхообструкции при БА.

Как продемонстрировано в данном разделе исследования, повышение уровня мРНК NOS2 в слизистой бронхов определяет формирование нитрозилирующего стресса, ремоделирование бронхов и развитие тяжелых неконтролируемых терапевтически резистентных форм БА.

5. Роль полиморфизма генов NO-синтаз и глутатион-S-трансфераз в развитии нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме

Обнаруженные ассоциации метаболитов нитрозилирующего стресса с клинико-патофизиологическими характеристиками БА потребовали более детального изучения механизмов участия генов, ассоциированных с нарушением метаболизма NO* при аллергическом воспалении ДП. Возможно, полиморфные варианты генов NOS и GST, благодаря молекулярным механизмам участия их продуктов в изменении метаболизма NO*, могут влиять на вариабельность фенотипических проявлений БА.

Исследование роли полиморфизма генов NOS и GST в детерминации изменчивости количественных признаков проводили, анализируя различия средних рангов показателей у носителей разных генетических вариантов.

Анализ связи полиморфизма гена NOS1 с уровнем мРНК NOS1 и содержанием метаболитов NO* в КВВ и БС. Уровень мРНК NOS1 и содержание метаболитов NO* до курса противовоспалительной терапии у пациентов с разными полиморфными вариантами 276С/Т и 186А/С гена NOS1 были сопоставимы. По завершении лечебного периода у всех пациентов, гомозиготных по аллелю А полиморфизма 186А/С гена NOS1, отмечена положительная динамика в отношении нитритов в КВВ, нитритов и GSNO в БС, но при стратификации по тяжести заболевания зарегистрировано снижение уровня нитритов в КВВ и увеличение уровня GSNO в БС только у больных легкой и среднетяжелой БА, гомозиготных по данному аллелю (p<0,01). Таким образом, не выявлена взаимосвязь изученных полиморфизмов гена NOS1 с уровнем токсичных метаболитов NO* в КВВ и БС и развитием нитрозилирующего стресса при БА.

Анализ связи полиморфизма гена NOS2 с уровнем мРНК NOS2 и содержанием метаболитов NO* в КВВ и БС. В данном исследовании проанализированы полиморфизмы -954G/C и 343C/- гена NOS2. Изучение метаболизма NO* при различных полиморфизмах данного гена у больных БА после курса противовоспалительной терапии позволило установить, что только наличие гомозиготности по аллелям -954G и 343C гена NOS2 связано со значимым снижением уровня мРНК NOS2 (pдо=0,00189 и pдо=0,03820, соответственно), а также снижением содержания нитритов в БС и КВВ, увеличением уровня GSNO в БС (p<0,05). Это свидетельствует об эффективности кортикостероидной терапии в отношении изучаемых показателей у больных, не имеющих нуклеотидные замены (генотип GG полиморфизма -954G/C и генотип CC полиморфизма 343C/-) в промоторном регионе гена NOS2. В целом, это позволило выдвинуть, а в дальнейшем подтвердить гипотезу о вкладе гена NOS2 в формирование клинического полиморфизма БА, поэтому дальнейший анализ результатов проведен в группах больных, стратифицированных по тяжести БА. По окончании лечебного периода у больных, гомозиготных по аллелю -954G гена NOS2, при любой тяжести БА установлено значимое снижение уровня мРНК NOS2 (p=0,04850, p=0,04640 и p=0,04311 для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно), повлекшее за собой снижение нитритов как в КВВ (p=0,04311, p=0,00020 и p=0,00080 для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно), так и в БС (p=0,04311, p=0,02411 и p=0,04858 для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно). Напротив, у пациентов, гомозиготных по мутантному аллелю -954С, и гетерозигот отсутствовала динамика мРНК индуцибельной NOS, и как следствие, у этих пациентов не зарегистрировано снижения нитритов в БС после лечения. Это отражает персистенцию воспаления в бронхах, поддерживаемого NOS2.

Анализ связи полиморфизма гена NOS3 с уровнем мРНК NOS3 и содержанием метаболитов NO* в КВВ и БС. В данном исследовании проанализированы полиморфизмы 894G/Т и 260GCCC/- гена NOS3. До лечения у пациентов с генотипом GG полиморфизма 894G/T и GCCCGCCC полиморфизма 260GCCC/- обнаружены значимо низкие уровни нитритов в БС по сравнению с гомозиготными по мутантному аллелю и гетерозиготными больными (p894Т<0,00001 и p260-<0,00001, соответственно). После курса противовоспалительной терапии у всех больных, вне зависимости от полиморфизма гена NOS3, произошло значимое снижение нитритов в БС и КВВ и восстановление GSNO в БС. При распределении больных по тяжести БА и рассматриваемым полиморфизмам NOS3 не выявлено различий по содержанию метаболитов NO*.

Из обсуждаемых полиморфизмов генов NOS лишь аллельный вариант ­954С индуцибельной изоформы фермента являлся предиктором, ассоциированным с неблагоприятным течением БА и ответом на противовоспалительную терапию. Пациенты с данным аллелем в отличие от больных, имеющих дикий тип, демонстрировали худшие показатели функции легких и низкую чувствительность к терапии. Возможно, это связано с тем, что точечная замена G/C в положении -954 п.о., находится в сайте связывания транскрипционного фактора NF­кB. Ранее установлено, что экспрессия гена NOS2 ассоциирована с активацией NF-кB [Kim К.М. et al., 2002; Shaojin D., Chang C., 2007; Fitzpatrick A.M. et al., 2009]. Использование целого ряда стимуляторов экспрессии гена NOS2 (ИНФ, ЛПС, ФНО, ИЛ-1, прооксиданты) приводит к активации NF-кB. Ингибиторы NF-кB блокируют экспрессию гена NOS2 и индукцию белка индуцибельной NO-синтазы [Lin C.C., et al., 2000]. В свою очередь, активность NF-кB регулируется NO* [Marshall H.E., Stamler J.S., 2002]. В физиологических условиях синтезируемые конститутивными NOS количества NO* оказывают супрессивное влияние на активность NF-кB. Высокие количества NO*, синтезируемые NOS2, угнетают активность NF-кB либо непосредственно, либо стабилизируя ингибитор этого важного транскрипционного фактора, обеспечивая, тем самым, механизм саморегуляции в системе NO* ? NF-кB.

Резюмировать данный раздел работы можно новыми научными данными о том, что полиморфизм -954G/C гена NOS2 участвует в формировании нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении ДП.

Анализ связи полиморфизма генов GSTТ1 и GSTМ1 c содержанием метаболитов оксида азота. Гипотезой данного раздела диссертационного исследования было предположение, что активность генов GST связана с изменением механизмов превращения метаболитов NO* и нарушением депонирования NO*, и что эти нарушения обусловливают клинико-функциональные проявления БА. Учитывая, что процессы превращения ксенобиотиков в организме человека хорошо скоординированы, для оценки вклада генетических механизмов в контроль превращения метаболитов NO* и эффективность базисной противовоспалительной терапии при БА исследованы «нулевые» и нормальные генотипы генов GSTT1 и GSTM1 и их комбинации. Наиболее существенные результаты получены при анализе связей функционально активных (GSTТ1*1 и GSTМ1*1) и неактивных аллелей (GSTТ1*0 и GSTМ1*0) генов GST и их комбинаций с интенсивностью нитрозилирующего стресса. Оценка частот генотипов генов GST позволила определить преобладание мутантных генотипов GSTТ1*0 и GSTМ1*0 у больных БА по сравнению со здоровыми (2=12,69; p=0,00037 и 2=5,40; p=0,02018, соответственно). При анализе степени риска дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода БА установлены ассоциации как с GSTТ1*0 (OR=6,4), так и GSTМ1*0 (OR=2,63). Это согласуется с результатами проведенных популяционных исследований, свидетельствующих о повышенной частоте нулевых аллелей генов GSTТ1 и GSTМ1 у больных БА [Брагина Е.Ю. и соавт., 2003; Сардарян И.С., 2009; Pemble S. et al., 1994; Brasch­Andersen C. et al., 2004; Tamer L. et al., 2004], и подтверждает, что индивидуальная чувствительность к повреждению бронхиального эпителия существенно зависит от полноценности ферментов биотрансформации ксенобиотиков 2 фазы, а именно GST, катализирующих реакцию инактивации высокоактивных генотоксичных агентов путем их конъюгации с GSH [Bolt H.M., Their R., 2006; Sampsonas F. et al., 2007]. Дополнительно к известным данным, проведенное нами исследование и сопоставление результатов распределения частот генотипов с тяжестью БА показало, что c утяжелением БА возрастает частота функционально неактивного GSTT1*0 варианта (12,5%, 18,5% и 46,7% для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно) с достигнутым уровнем значимости по двухстороннему критерию Фишера для больных тяжелой БА (p=0,04889 и p<0,00001, в сравнении со среднетяжелой БА и контролем). Важное значение имеют данные, полученные при анализе комбинаций изучаемых полиморфных вариантов генов GSTТ1 и GSTМ1. Учитывая, что комбинация GSTT1*0/GSTM1*0 встречалась только при тяжелой БА (2=7,91, p=0,00490), был рассчитан относительный риск развития тяжелой БА у пациентов с двойным «нулевым» генотипом - OR=13,82 (95% CI: 1,73­296,91; p=0,00495), указывающий, что функциональную значимость в развитии воспаления может иметь не один конкретный рисковый генотип, а их специфическая комбинация, и свидетельствующий о наличии молекулярно-генетических предпосылок (участие генов GST) для реализации предрасположенности к формированию тяжелой БА. В результате генетически обусловленного полиморфизма ферментов может возникать дефицит, либо значительное повышение содержания отдельных метаболитов NO*, предопределяя особенности клинического фенотипа БА. На рис. 8 представлена электрофореграмма, демонстрирующая отсутствие амплификата GSTT1 и GSTM1 у 10 пациентов тяжелой БА.

Рис. 8. Результаты анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК у больных бронхиальной астмой по генам GSTT1 и GSTM1

Примечание: ER - контроль амплификации, 183 п.н; 6-15 - генотип GSTT1*0/GSTM1*0; 2, 4, 18 - GSTT1*1/GSTM1*1, 131 и 114 п.н., соответственно; 1, 3, 16 - GSTT1*0/GSTM1*1; 5 - GSTT1*1/GSTM1*0.

При анализе содержания метаболитов NO* в группах больных, стратифицированных по генотипам, установлено, что вне зависимости от тяжести у всех больных-носителей генотипа GSTT1*1 уровень GSNO был в 2 раза выше по сравнению с генотипом GSTT1*0 (p=0,00720). В группах с разной тяжестью БА не отмечено различий по исходному содержанию метаболитов NO* между больными с разными генотипами GSTT1. Однако наличие дефектного генотипа GSTТ1*0 у больных БА, обусловливало трудности в достижении контроля над заболеванием в связи с персистирующим воспалением на фоне некоррегируемого уровня нитритов, GSNO и 3-НТ в БС при всех тяжестях БА. Что касается гена GSTМ1, больные БА при любом полиморфном варианте имели сопоставимые значения нитритов и GSNO, как до, так и после курса противовоспалительной терапии. При анализе содержания 3-НТ на фоне противовоспалительной терапии выявлена патологическая значимость генотипа GSTМ1*0: отсутствие динамики у больных легкой (p=0,10881), среднетяжелой (p=0,71550) и тяжелой БА (p=0,345232). На рис. 9* представлено содержание метаболитов NO*, стратифицированных в зависимости от двух комбинаций полиморфных вариантов генов GST (двойной «нулевой» и функциональный) и тяжести БА. Получены данные, подтверждающие эффективность противовоспалительной терапии в отношении всех метаболитов NO* у больных легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, имеющих комбинацию GSTT1*1/GSTM1*1. В случае тяжелой БА у носителей GSTT1*0/GSTM1*0 - отклонения по содержанию метаболитов NO* в БС, выявленные при первоначальном обследовании, не изменяются после лечения. При сопоставлении результатов исследования метаболитов NO* у больных - носителей комбинации GSTT1*0/GSTM1*0 (тяжелая БА) с больными - носителями других комбинаций генотипов, у первых отмечены наиболее («экстремально») высокий уровень 3-НТ (202,5 мМ (95% CI: 81,5­300,0)) и низкий GSNO (0,12 мМ (95% CI: 0,10-0,46)) в БС и отсутствие динамики на фоне лечения (243 мМ (95% CI: 156,0-314,75) и 0,12 мМ (95% CI: 0,10-0,46), соответственно), подтверждая наше предположение, что от функциональной активности генов GST зависит изменение путей метаболизма NO*.

В целом представленные данные, подтверждают первоначальную гипотезу данного исследования о том, что активность генов GST (полиморфизмы GSTT1 и GSTM1) связана с изменением путей превращения метаболитов NO*, нарушением депонирования NO*, морфологическими признаками ремоделирования стенки бронхов и клинико-функциональными проявлениями БА. Возможно, именно дефект ферментативного сопровождения GST в метаболизме GSH и GSNO является ведущим фактором терапевтической резистентности БА. В подтверждение этих данных ранее установлены ассоциации полиморфных вариантов «нулевых» генотипов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 с БА, как в отдельности, так и в комбинации друг с другом [Макарова С.И. и соавт., 2004; Sampsonas F. et al., 2007; Imboden M. et al., 2008]. Наши результаты позволили раскрыть механизмы реализации этих ассоциаций.

Заключение

Нитрозилирующий стресс является одним из базисных механизмов аллергического воспаления ДП, который реализуется образованием токсичных (нитриты, 3-НТ) и нетоксичных (GSNO) метаболитов в процессе их взаимопревращения. Повышение содержания метаболитов NO* в ДП положительно коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов. Продукция NO* контролируется генами NOS, причем статистически значимый вклад в развитие нитрозилирующего стресса вносит ген NOS2 и его полиморфизм -954G/С. Специфичность регуляции нитрозилирующего стресса связана с комбинацией функционально неполноценных генотипов GSTT1*0/GSTM1*0, ассоциированной с селективным накоплением 3-НТ и выраженным дефицитом GSNO в ДП при аллергическом воспалении, которые сохраняются даже на фоне применения адекватных степени тяжести доз ИКС в течение 6 мес. У больных, имеющих данное сочетание генотипов, воспаление реализуется в формирование необратимого ремоделирования бронхов и развитие тяжелых терапевтически резистентных форм БА. Полученные нами результаты подтвердили первоначальную гипотезу исследования о том, что выявленные морфологические изменения ДП, ассоциированные с нитрозилирующим стрессом, свидетельствуют о важной роли гена GST как фактора риска реализации тяжелой неконтролируемой астмы, что позволяет отнести полиморфизм GSTT1*0/GSTM1*0 к числу новых фармакологических мишеней персонифицированной терапии БА (рис. 9).

Рис. 9. Схема участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы и фармакологические мишени для персонифицированной терапии бронхиальной астмы

ВЫВОДЫ.

1. Развитие и поддержание аллергического воспаления в дыхательных путях при бронхиальной астме связано с реализацией оксидативного и нитрозилирующего стрессов. Нитрозилирующий стресс характеризуется повышением уровней нитритов и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха, снижением содержания нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве больных бронхиальной астмой, что связано с тяжестью и периодом болезни. Данные изменения ассоциированы со снижением показателей функции легких ОФВ1, ПСВ и развитием бронхообструкции. Оксидативный стресс характеризуется повышением уровня МДА, снижением активности СОД и каталазы в зависимости о тяжести и периода болезни. Интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы отрицательно коррелирует с уровнем нитритов и 3-нитротирозина.

2. Аллергическое воспаление при бронхиальной астме сопровождается формированием различных паттернов воспаления, ассоциированных с вариантом нитрозилирующего стресса. Так, повышение уровня нитритов в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха прямо коррелирует с эозинофильной инфильтрацией, выраженным нарушением структуры слизистой бронхов, что чаще встречается при легкой и среднетяжелой бронхиальной астме. Значительное повышение уровня 3-нитротирозина в бронхиальном смыве прямо коррелирует с нейтрофильной инфильтрацией и выраженными признаками ремоделирования слизистой бронхов, а именно снижением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и базальных эпителиоцитов, снижением относительного объема железистой ткани, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани. Данный паттерн воспаления установлен при тяжелой бронхиальной астме.

3. Участие ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-б, ИНФ-г в регуляции воспаления дыхательных путей характеризуется повышением их уровня при бронхиальной астме любой тяжести и в любом периоде болезни. Что касается ИНФ-г, то его уровень повышается при тяжелых формах БА и снижается после лечения. Повышение уровня 3­нитротирозина в бронхиальном смыве прямо коррелирует с повышением уровня ИЛ-8 и нейтрофильной инфильтрацией бронхов, повышение ИЛ-4 - с увеличением эозинофильной инфильтрации бронхов. Отсутствие динамики ИЛ-4 и ИЛ-8 в бронхиальном смыве в сторону снижения ассоциировано с отсутствием динамики уровня 3-нитротирозина и нитритов при тяжелой бронхиальной астме.

4. Установлена экспрессия генов всех NO-синтаз в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой как до, так и после лечения. Выявлена значимо низкая экспрессия NOS1 при тяжелой форме болезни и значимо высокая экспрессия NOS2. После стандартного курса терапии с применением глюкокортикостероидов значимо снижается только экспрессия NOS2, что обосновывает вклад именно этого фермента в воспаление. Повышение уровня мРНК NOS2 в бронхобиоптатах больных прямо коррелирует с содержанием 3­нитротирозина и нитритов в бронхиальном смыве, снижением ОФВ1, ПСВ, ФЖЕЛ.

5. Аллельный вариант -954С гена NOS2 ассоциирован с повышенным уровнем мРНК NOS2 в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой, высоким содержанием нитритов и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

6. Аллельный вариант GSTT1*0 ассоциирован с исходно более низким уровнем нитрозоглутатиона по сравнению аллельным вариантом GSTT1*1, а также ассоциирован с отсутствием восстановления уровня нитрозоглутатиона после лечения.

7. Комбинация нефункциональных генотипов GSTT1*0/GSTM1*0 установлена только при тяжелой бронхиальной астме. Данная комбинация ассоциирована с наиболее высоким содержания 3-нитротирозина и наиболее низким уровнем нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве. У больных - носителей данной комбинации генотипов не зарегистрировано динамики функциональных, биохимических и морфологических параметров после лечения, что является механизмом развития терапевтической резистентности при тяжелой астме.

8. Нитрозилирующий стресс является базисным механизмом аллергического воспаления, который реализуется образованием токсичных (нитриты, 3-нитротирозин) и нетоксичных (нитрозоглутатион) метаболитов в процессе их взаимопревращения. Повышение содержания метаболитов оксида азота в дыхательных путях положительно коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов. Продукция оксида азота контролируется генами NOS, причем статистически значимый вклад в развитие нитрозилирующего стресса вносит ген NOS2 и его полиморфизм -954G/С. Специфичность регуляции нитрозилирующего стресса связана с носительством комбинации функционально неполноценных генотипов GSTT1*0/GSTM1*0, ассоциированной с селективным накоплением 3-нитротирозина и выраженным дефицитом нитрозоглутатиона в дыхательных путях при аллергическом воспалении. У больных астмой, носителей данной комбинации генотипов, воспаление реализуется в формирование необратимого ремоделирования бронхов и развитие тяжелых терапевтически резистентных форм бронхиальной астмы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для диагностики причин неконтролируемого течения бронхиальной астмы на фоне базисной противовоспалительной терапии ингаляционными глюкокортикостероидами рекомендовано изучение полиморфизма генов GSTT1 и GSTМ1.

2. Типирование полиморфизма -954G/C гена NOS2 рекомендуется для предсказания благоприятного и неблагоприятного течения бронхиальной астмы и ответа на противовоспалительную терапию.

3. Возможно использование 3-нитротирозина в бронхиальном смыве, как маркера интенсификации нитрозилирующего стресса и необратимого повреждения дыхательных путей при бронхиальной астме.

Литература

1. Features of production nitric oxide at patients with a bronchial asthma / O.V. Kozina, V.A. Egorоv, E.V. Komjakova, N.N.Chusova // Abstr. 16th European Respiratory Society. Annual Congress. Munich, Germany, 2006. - P. 445.

2. Метаболиты оксида азота и их значение в патогенезе бронхиальной астмы / О.В. Козина, Л.М. Огородова, В.В. Андрушкевич и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 6. - C. 34-37.

3. Клинико-биохимические аспекты развития обструкции бронхов при бронхиальной астме / О.В. Козина, В.В. Андрушкевич, А.Э. Сазонов и др. // Пульмонология. - 2008. - № 2. - C. 52-57.

4. Козина, О.В. Образование и биологическая роль NO при аллергическом воспалении / О.В. Козина, Л.М. Огородова // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - Т. 8, № 3. - С. 95-104.

5. Козина, О.В. Вклад токсических метаболитов NO в формирование эозинофильного воспаления при бронхиальной астме / О.В. Козина, Л.М. Огородова, Е.А. Геренг и др. // Пульмонология. - 2009. - № 4. - C. 69?73.

6. Структурно-функциональные изменения в слизистой оболочке бронхов при хронических воспалительных заболеваниях / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, Р.И. Плешко, Л.М. Огородова, Е.Б. Букреева, О.В. Козина и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2009. - № 5. - C. 35-39.

7. Роль генетических факторов в формировании тяжелой бронхиальной астмы / О.В. Козина, И.В. Петрова, А.Э.Сазонов и др. // Съезд терапевтов Юга России «Врач XXI века: сегодня и завтра», Ростов на Дону, 2009. - C. 56.

8. Огородова, Л.М. Участие метаболитов NO в регуляции аллергического воспаления и их вклад в ремоделирование слизистой оболочки бронхов у больных бронхиальной астмой / Л.М. Огородова, О.В. Козина, Е.А. Геренг // Российский аллергологический журнал. - 2009. - № 5. - С. 11-17.

9. Роль клеточных и молекулярных мишеней в формировании различных паттернов воспаления при гетерогенных фенотипах тяжелой бронхиальной астмы / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, Л.М. Огородова, Р.И. Плешко, Л.И. Волкова, О.В. Козина и др. // Пульмонология. - 2009. - № 5. - C. 78-82.

10. Козина, О.В. Функциональное состояние микробицидных систем при бронхиальной астме / О.В. Козина, Е.В. Комякова, В.А. Егоров // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - № 4. - C. 10-13.

11. Козина, О.В. Дефицит нитрозоглутатиона при бронхиальной астме / О.В. Козина // 19 национальный конгресс по болезням органов дыхания. Москва, 2009. - C. 172.

12. Особенности экспрессии генов NOS в слизистой бронхов при бронхиальной астме / О.В. Козина, Л.М. Огородова, П.А. Селиванова и др. // Пульмонология. - 2009. - № 6. - C. 78-82.

13. Козина, О.В. Участие метаболитов NO в регуляции атопического воспаления / О.В. Козина, Л.М. Огородова // Сборник материалов 4 национального конгресса терапевтов. Москва, 2009. - С. 121.

14. Козина, О.В. Метаболизм нитрозотиолов при аллергическом воспалении / О.В. Козина // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - № 1. - C. 109-116.

Размещено на Allbest.ru