Клинико-патогенетическое значение факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов и антиоксидантной защиты крови при некоторых ревматических заболеваниях

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Клинико-патогенетическое значение факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов и антиоксидантной защиты крови при некоторых ревматических заболеваниях

Ильин Михаил Витальевич

14.01.22 - ревматология

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Ярославль - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Хрусталев Олег Анатольевич;

доктор медицинских наук, профессор Романов Виталий Александрович.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Решетняк Татьяна Магомедалиевна;

доктор медицинских наук, профессор Шостак Надежда Александровна;

доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович.

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академии им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «10» июня 2010 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.119.01 при ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5.

Автореферат разослан: 2010г.Ученый секретарь диссертационного совета Чижов П.А.

Введение

Актуальность проблемы.

Ревматические заболевания, характеризующиеся иммунно-воспалительным поражением многих органов и тканей, приводят к сокращению продолжительности жизни больных вследствие раннего атеросклероза, артериальной гипертензии и связанных с ними сердечно-сосудистых катастроф (В.А. Насонова, 2008; Т.М. Решетняк, 2008; U. Nussinovitch, 2009; H. Zinger et al., 2009). Эти заболевания требуют применения комплекса лечебно-диагностических и реабилитационных мероприятий, длительного лечения, сопряженного с частыми госпитализациями, а также значительных экономических затрат на содержание членов общества, утративших из-за болезни возможность трудиться (Е.Л. Насонов, 2007; О.М. Фоломеева и соавт., 2008; В.А. Насонова, 2009).

Патологические изменения сердца при ревматических заболеваниях многообразны и диагностируются реже, чем встречаются на самом деле (Н.А. Шостак и соавт., 2009; Т.В. Попкова и соавт., 2009; D.C. Knockaert, 2007; A. Kahan et al., 2009). Развернутая клиническая картина поражения сердца с симптомами хронической сердечной недостаточности, нарушениями ритма и внутрисердечной проводимости, приводящими нередко к внезапной смерти, наблюдается на поздних стадиях, когда лечебные мероприятия малоэффективны и существенно не влияют на прогноз заболевания (P.M. Seferovic et al., 2006; S.E. Gabriel, 2008).

В настоящее время проблема изучения роли системной воспалительной реакции в нарушениях гемоциркуляции, а также формировании эндотелиальной и миокардиальной дисфункции окончательно не решена. Предложена теория прогрессирования сердечной недостаточности, в основе которой лежит представление об иммунной активации и системном воспалении как маркерах высокого кардиоваскулярного риска и неблагоприятного прогноза заболевания (С.Ш. Шабанова и соавт., 2007; Ю.Н. Беленков, В.Ю. Мареев, 2008; H.R. Miranda, 2007; A. Blum, 2009). Показано, что нейтрофилы принимают участие в патогенезе ревматических заболеваний и хронической сердечной недостаточности (V. Rudolph et al., 2007; Z. Jakus et al., 2009).

Приоритетность комплексного подхода в оценке состояния популяции нейтрофилов подтверждается отсутствием целостного представления о взаимосвязи ключевых событий в жизни этих эффекторных клеток, что объясняет трудности определения участия нейтрофилов в различных патологических событиях. Исследование кислородзависимого метаболизма и апоптоза нейтрофилов представляет собой актуальную задачу, так как позволит не только оценить интенсивность воспалительных реакций и их роль в патогенезе сердечно-сосудистых осложнений при системных заболеваниях, но также прогнозировать их течение и исход.

Таким образом, очевидна необходимость изучения механизмов формирования хронической сердечной недостаточности при ревматических заболеваниях. Будучи звеньями одной цепи, эти процессы, в том числе нарушение метаболической активности и апоптоза нейтрофилов, повреждение эндотелийзависимой вазореактивности, дисфункция миокарда, взаимозависимы и взаимообусловлены. Несомненна перспектива терапевтического воздействия на биоцидность и программированную гибель нейтрофильных гранулоцитов, играющих ключевую роль в системном воспалении, повреждении сосудов и сердца.

Цель исследования.

Выявить клинико-патогенетические закономерности экспрессии факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями с дисфункцией миокарда и хронической сердечной недостаточностью.

Задачи исследования.

1. Исследовать показатели окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и состояния системы антиоксидантной защиты крови у больных анкилозирующим спондилитом (АС), системной красной волчанкой (СКВ), системной склеродермией (ССД), ревматической болезнью сердца (РБС) и ишемической болезнью сердца (ИБС) в зависимости от пола и возраста, формы, длительности, активности и характера течения заболевания.

2. Сопоставить изменения показателей функциональной активности, апоптоза нейтрофилов и антиоксидантного потенциала крови при различных ревматических заболеваниях.

3. Выявить наличие взаимосвязей между показателями кислородзависимого метаболизма, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови при АС, СКВ, ССД и РБС.

4. Установить клинико-патогенетическое значение изменения экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов у больных ревматическими заболеваниями.

5. Определить факторы прогнозирования неблагоприятного исхода и повторной госпитализации у больных АС, СКВ, ССД и РБС в течение 12 месяцев после выписки из стационара.

6. Выявить изменения показателей метаболической активности, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови в зависимости от характера дисфункции миокарда и функционального класса хронической сердечной недостаточности.

7. Изучить параметры эндотелийзависимой вазореактивности и оценить зависимость функционального состояния эндотелия от факторов биоцидности, апоптоза нейтрофилов и активности системы антиоксидантной защиты.

8. Исследовать влияние терапии с использованием ингибиторов АПФ эналаприла и моэксиприла на показатели окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота, системы антиоксидантной защиты крови и состояние функции эндотелия у больных АС, СКВ, ССД и РБС.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование показателей экспрессии факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови у больных АС, СКВ, ССД и РБС с наличием дисфункции миокарда и предложена концепция развития хронической сердечной недостаточности при ревматических заболеваниях.

Впервые определены общие признаки и различия показателей функциональной активности, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови при ревматических заболеваниях в зависимости от пола и возраста пациентов, формы, длительности, активности и характера течения патологического процесса.

Впервые дана сравнительная характеристика изменения кислородзависимого метаболизма, синтеза оксида азота, экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов и антиоксидантного потенциала крови у больных ревматическими заболеваниями и ишемической болезнью сердца. В отличие от ИБС, ревматические заболевания, осложненные развитием хронической сердечной недостаточности, характеризуются снижением резерва продукции супероксид-аниона, синтеза оксида азота и экспрессии антигена bak на поверхности нейтрофилов.

Впервые установлена клиническая значимость определения уровня экспрессии проапоптозного белка bak нейтрофилами у больных ревматическими заболеваниями, выявлено существование нозологически детерминированной взаимосвязи между уровнем апоптоза нейтрофилов и состоянием кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, обнаружена корреляция между уровнем апоптоза нейтрофилов и клинико-лабораторными показателями, характеризующими активность воспалительного процесса.

Впервые определен характер связи между показателями резерва продукции супероксидного анион-радикала и экспрессии проапоптозного антигена bak на поверхности нейтрофилов, обнаружена взаимосвязь между уровнем продукции оксида азота и резервным потенциалом нейтрофильных гранулоцитов у больных ревматическими заболеваниями.

Впервые выявлены различия показателей метаболической активности, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови у больных АС, СКВ и ССД в зависимости от характера нарушения сократительной функции миокарда. Обнаружено, что усиление окислительного стресса нейтрофилов при ревматических заболеваниях сопровождается увеличением функционального класса хронической сердечной недостаточности.

Впервые получены данные о роли окислительного стресса и апоптоза нейтрофилов в механизмах развития ХСН при ревматических заболеваниях, которые обосновывают выбор диагностических лабораторных маркеров и позволяют применять показатели метаболической активности и спонтанного апоптоза нейтрофилов для контроля эффективности проводимого лечения и прогнозирования течения заболевания.

Впервые продемонстрирована возможность применения ингибиторов АПФ эналаприла и моэксиприла для коррекции нарушений эндотелийзависимой вазореактивности, кислородзависимого метаболизма, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями.

Практическая значимость.

Полученные результаты позволяют научно обосновать и рекомендовать к практическому использованию новые подходы к обследованию и лечению больных ревматическими заболеваниями, осложненными кардиоваскулярной патологией, а также дополнить рекомендации по диагностике и динамическому наблюдению в условиях стационара.

Комплексное изучение эндотелийзависимой вазореактивности в сочетании с исследованием показателей метаболической активности нейтрофилов и активности системы антиоксидантной защиты крови позволяет оценить нарушения функциональной способности эндотелия и их изменения в процессе динамического наблюдения за больными.

Изучение показателей резервного потенциала нейтрофилов, определяемых с помощью тестов хемилюминесценции, позволяет прогнозировать развитие хронической сердечной недостаточности у больных ревматическими заболеваниями.

Применение методов исследования продукции нейтрофилами активных форм кислорода и оксида азота в дополнение к стандартному обследованию рекомендуется для прогнозирования повторных госпитализаций и неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после выписки из стационара.

Коррекция дисбаланса в системе образования и утилизации активных форм кислорода, наблюдаемая при назначении эналаприла и моэксиприла больным ревматическими заболеваниями, позволяет предполагать, что положительные эффекты ингибиторов АПФ могут быть связаны не только с воздействием на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему, но также с влиянием на механизмы биоцидности клеток и активность системы антиоксидантной защиты крови.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Изменения кислородзависимого метаболизма, апоптоза нейтрофилов и активности системы антиоксидантной защиты крови играют важную роль в развитии ревматических заболеваний и хронической сердечной недостаточности. Общность патогенетических механизмов данных заболеваний связана с увеличением флогогенного потенциала нейтрофилов, гиперпродукцией факторов окислительного стресса с последующим истощением резервных возможностей и снижением уровня апоптоза клеток.

2. Ревматические заболевания характеризуются снижением уровня продукции оксида азота и уменьшением экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов. Различия определяются изменением продукции и резерва образования нейтрофилами активных форм кислорода, а также состоянием системы антиоксидантной защиты крови в зависимости от формы, активности и характера течения заболевания.

3. Уровень апоптоза нейтрофилов взаимосвязан с интенсивностью окислительного стресса, резервным потенциалом клеток и клинико-лабораторными показателями, характеризующими активность патологического процесса и поражение внутренних органов. Продукция активных форм кислорода, апоптоз нейтрофилов и состояние системы антиоксидантной защиты крови оказывают влияние на сосудодвигательные реакции и состояние эндотелия у больных ревматическими заболеваниями.

4. Исследование показателей окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови позволяет прогнозировать характер течения заболевания, а также эффективно оценивать результативность лечения.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Артериальная гипертония: органные поражения и сопутствующие заболевания» (Ярославль, 2004), VII Российском научном форуме «Кардиология 2005» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения» (Ярославль, 2005), Ежегодной (XIII) научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы кардиологии» (Тюмень, 2006), Всероссийском форуме «Интеллектуальные ресурсы регионов России», VII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и внедрения информационных технологий двойного применения (Ярославль, 2006), Съезде кардиологов и терапевтов Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы современной аритмологии» (Рязань, 2006), Всероссийском форуме «Интеллектуальные ресурсы регионов России», VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и внедрения информационных технологий двойного применения (Ярославль, 2007), XLIX Ежегодной научно-практической конференции Ярославской областной клинической больницы (Ярославль, 2007), III Всероссийской конференции «Социальные аспекты ревматических заболеваний: боль - междисциплинарная проблема» (Смоленск, 2007), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Некоронарогенные заболевания сердца: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2008), Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 27 работ, в том числе 10 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ для публикации материалов исследований, представляемых на соискание ученой степени доктора медицинских наук.

Внедрение в практику.

Методы исследования показателей кислородзависимого метаболизма, продукции оксида азота, спонтанного апоптоза нейтрофилов, системы антиоксидантной защиты крови, эндотелийзависимой вазореактивности внедрены в работу отделений ревматологии и кардиологии Ярославской областной клинической больницы, Межкафедральной иммунологической лаборатории Ярославской государственной медицинской академии, что позволило усовершенствовать и расширить методы диагностики ревматических заболеваний, осложненных кардиоваскулярной патологией. Исследование параметров апоптоза нейтрофилов применяется для оценки эффективности проводимого лечения в стационаре и прогнозирования течения заболевания на амбулаторном этапе. Результаты работы включены в лекционный материал и программу практических занятий для интернов, ординаторов и слушателей кафедры терапии факультета последипломного образования Ярославской государственной медицинской академии.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 72 таблицами и 55 рисунками. Библиографический указатель содержит 448 источников, в том числе 135 отечественных и 313 иностранных.

Работа выполнена на кафедрах терапии факультета последипломного образования (зав. кафедрой - Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Н.И. Коршунов) и микробиологии c вирусологией и иммунологией (зав. кафедрой - Почетный работник высшего профессионального образования РФ, доктор медицинских наук, профессор В.А. Романов) Ярославской государственной медицинской академии (ректор - Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор А.В. Павлов), на базе экстренной лаборатории, ревматологического, кардиологического отделений и отделения функциональной диагностики Ярославской областной клинической больницы (главный врач - Заслуженный врач РФ, кандидат медицинских наук О.П. Белокопытов).

сердечный недостаточность ревматический кардиоваскулярный

Обследованы 265 больных, в том числе 77 больных анкилозирующим спондилитом, 50 больных системной красной волчанкой, 32 пациента с системной склеродермией, 81 пациент с хронической ревматической болезнью сердца и 25 больных ишемической болезнью сердца, включенных в группу сравнения. Контрольную группу составили 25 относительно здоровых доноров, из них 14 мужчин и 11 женщин, в возрасте от 19 до 54 лет (в среднем 35,1±10,6 лет).

Распределение пациентов по нозологическим формам, полу, возрасту и длительности заболевания представлено в таблице 1.

Таблица 1. Распределение больных по нозологическим формам, полу, возрасту и длительности заболевания

Для достижения цели и решения поставленных задач, наряду с общепринятыми клиническими, лабораторными и инструментальными методами, использовались специальные иммунологические, иммуноцитохимические, функциональные (эргометрические) и психологические методы исследования.

Исследование функциональной активности нейтрофилов.

Выделение нейтрофилов периферической крови проводили на двойном градиенте плотности фиколла-урографина. Функциональную активность нейтрофилов исследовали хемилюминесцентным методом (В.М. Земсков и соавт., 1988). Для усиления хемилюминесценции (ХЛ) использовали люминол, индуцирующий хемилюминесценцию пероксида водорода, супероксидного радикала, гидроксил-аниона, аниона гипохлорной кислоты и нитроксильного радикала, или люцигенин, являющийся селективным индикатором супероксид-аниона, (В.Л. Воейков, И.В. Баскаков, 1994).

О функциональном резерве клеток судили по коэффициентам активации хемилюминесценции (КА ХЛлл и КА ХЛлн), которые рассчитывали как отношение индуцированного показателя (иХЛлл и иХЛлн) к спонтанному (сХЛлл и сХЛлн). В качестве индуктора кислородзависимого метаболизма нейтрофилов использовали 110⁹ взвесь убитых нагреванием клеток S. aureus штамма p-209.

Оценка состояния системы антиоксидантной защиты крови.

О потенциале системы антиоксидантной защиты крови (САОЗ) судили по результатам хемилюминесценции, индуцированной пероксидом водорода (А.К. Журавлев, М.И. Шерстнев, 1994). С этой целью к 0,5 мл крови добавляли 1,0 мл Н₂О₂. Скорость спада хемилюминесценции рассчитывали как отношение разницы максимума интенсивности ХЛ и интенсивности ее свечения через 4 минуты после инициации к максимуму интенсивности, выражая в процентах, что характеризовало антиоксидантный потенциал крови (ХЛ индекс, ХЛи).

Определение продукции оксида азота нейтрофилами.

Количественное определение суммарного содержания метаболитов оксида азота (NO₃/NO₂) в среде инкубации нейтрофилов проводили с помощью реактива Грисса (П.П. Голиков и соавт., 2003). Для анализа продукции оксида азота нейтрофильными гранулоцитами 150 мкл культуральной среды, полученной после 6-ти часового культивирования клеток, переносили в пробирку, измеряли оптическую плотность полученных растворов.

Исследование апоптоза нейтрофилов.

Для определения уровня экспрессии проапоптозного белка семейства Bcl-2 bak нейтрофилами в процессе спонтанного апоптоза использовали стрептавидин-биотиновый метод. Применяли bak-специфические поликлональные кроличьи антитела («DAKOCytomation», Дания). В качестве положительного контроля использовали моноклональные мышиные антитела к гранулоцит-ассоциированному антигену CD15, отрицательный контроль - разводящая жидкость для антител. Подсчет проводили, определяя абсолютное число и процент положительно окрашенных клеток (bak-положительные нейтрофилы, %).

Определение циркулирующих иммунных комплексов.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом преципитации сывороточных белков раствором полиэтиленгликоля при рН 8,4 (В. Гашкова и соавт., 1979). Использовали 3,5% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в боратном буфере. Оптическую плотность разведения исследуемой сыворотки в растворе полиэтиленгликоля измеряли против ее разведения в боратном буфере при длине волны 450 нм.

Исследование эндотелийзависимой вазореактивности.

Эндотелийзависимая функция эндотелия изучалась с помощью холодовой пробы (К.У. Вильчук, 2001). Исследование проводилось на ультразвуковом аппарате «SONOS 100 CF» («Hewlett-Packard Corporation», США), использовался линейный датчик 5-7,5 MHz. Объектом исследования являлась сонная артерия (M. Rubenfire et al., 2002). Холодовая проба проводилась по стандартной методике (P. Singh, 1991). Рассчитывался показатель напряжения сдвига на эндотелии (ф, Н/м²), а также показатель изменения напряжения сдвига на эндотелии (dф, %). Для оценки чувствительности эндотелия сонной артерии к напряжению сдвига (К, Ед) был использован модифицированный метод (О.В. Иванова, 1998).

Функциональные методы исследования.

Показатели внутрисердечной гемодинамики оценивались ультразвуковым методом с помощью системы компьютерной сонографии «SONOS 100 CF» («Hewlett-Packard Corporation», США) по стандартной методике, рекомендованной Американской ассоциацией эхокардиографии (1987). Структурно-морфометрические показатели изучались по методу L. Teichholtz (1976). Исследовалось состояние клапанного аппарата, верифицировался характер порока сердца. Систолическая функция левых отделов сердца оценивалась с использованием показателей конечного систолического объема, ударного объема, фракции выброса левого желудочка. Диастолическая функция левого желудочка исследовалась путем регистрации трансмитрального допплеровского кровотока. Рассчитывалась максимальная скорость потока раннего диастолического наполнения (Ve) и максимальная скорость наполнения левого желудочка в предсердную систолу (Va), определялся коэффициент скоростей (Ve/Va). Оценивалось время изоволюмического расслабления, время замедления раннего диастолического наполнения левого желудочка.

Суточное мониторирование ЭКГ проводилось при помощи мониторного компьютерного комплекса «Кардиотехника-4000» («ИНКАРТ», Россия) с регистрацией трех отведений и записью на цифровом носителе. При анализе учитывались нарушения ритма сердца и внутрисердечной проводимости. Методика анализа соответствовала требованиям, разработанным Рабочей группой Европейского общества кардиологов и Североамериканского общества стимуляции и электрофизиологии (1996).

Для определения способности больных к выполнению физических нагрузок и оценки функционального класса сердечной недостаточности, в соответствии с классификацией Нью-Йоркской ассоциации сердца (1964), проводился тест с 6-минутной ходьбой.

Клиническое состояние больных ХСН оценивалось на основании результатов заполнения опросника, модифицированного В.Ю. Мареевым (2008). Оценка качества жизни осуществлялась по результатам заполнения Миннесотского опросника MLHFQ (1987). Определялись функциональные возможности больного справляться с обычными повседневными нагрузками, общественные связи пациента, социально-экономические аспекты и эмоциональное восприятие жизни.

Статистическая обработка данных.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). Осуществлялась проверка нормальности распределения количественных признаков. Для сравнения двух независимых групп по одному признаку применяли критерий Манна-Уитни, зависимые группы сравнивались с использованием критерия Вилкоксона.

Для однофакторного сравнения трех и более независимых групп использовались метод ANOVA по Краскелу-Уоллису. Непараметрический дисперсионный анализ трех и более зависимых групп осуществлялся с применением ANOVA Фридмана. Для изучения взаимосвязи двух признаков использовался корреляционный анализ по Спирмену. Исследование вида зависимости признака от одного или нескольких других признаков проводилось на основании логистического регрессионного анализа.

Критическое значение уровня статистической значимости принималось равным 5%. Приводимые в работе данные имеют представление: Me (25%; 75%).

Результаты исследования и обсуждение.

Результаты проведенного исследования свидетельствовали о разнородности процессов кислородзависимого метаболизма и апоптоза нейтрофилов при различных ревматических заболеваниях, указывая на повреждение механизмов регуляции жизнедеятельности клеток и наличие дисбаланса в системе образования и утилизации активных форм кислорода. У больных ревматическими заболеваниями, по сравнению с группой контроля, наблюдалось снижение уровня экспрессии белка bak нейтрофилами, свидетельствующее об уменьшении склонности клеток к апоптозу, а также уменьшение продукции оксида азота нейтрофилами (таблица 2).

Таблица 2. Характеристика показателей кислородзависимого метаболизма, продукции оксида азота, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями

Примечание. * - p < 0,05 по сравнению с контрольной группой

Наиболее высокий уровень продукции активных форм кислорода, в сравнении с группой контроля, демонстрировали нейтрофилы больных АС, у которых одновременно наблюдались низкие показатели резервного потенциала клеток, а также высокий уровень активности антиоксидантной защиты крови. При СКВ было обнаружено повышение уровня продукции супероксид-аниона нейтрофилами. Значительное увеличение активности САОЗ крови было выявлено у больных ССД. Изменения функционального состояния нейтрофилов при РБС были связаны с гиперпродукцией супероксид-аниона и увеличением резервного потенциала клеток.

Установлено, что синтез оксида азота нейтрофилами находится в обратной зависимости от резерва продукции супероксид-аниона при АС (r=-0,31; p=0,03), СКВ (r=-0,31; p=0,032), ССД (r=-0,45; р=0,01) и РБС (r=-0,25; p=0,024). Обнаруженная прямая корреляция между уровнем продукции NO и экспрессией проапоптозного белка bak нейтрофилами при АС (r=0,41; p=0,024).

Сравнительный анализ показателей биоцидности нейтрофилов обнаружил значительное усиление процессов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных АС, по сравнению с пациентами, страдающими СКВ и ССД (рисунок 1).

Рисунок 1. Различия показателей продукции нейтрофилами активных форм кислорода у больных ревматическими заболеваниями

Увеличение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов, наблюдающееся при АС, может быть связано с пребыванием клеток в состоянии прайминга, характеризующегося увеличением резервного потенциала и интенсификацией свободнорадикальных реакций, способных регулировать апоптоз клеток. В отличие от СКВ, при ССД наблюдался более низкий уровень образования активных форм кислорода нейтрофилами, а СКВ характеризовалась более высокой степенью биоцидности нейтрофильных гранулоцитов, в сравнении с РБС.

Более высокий уровень продукции супероксид-аниона наблюдался при АС, по сравнению с таковым при СКВ (рисунок 2).

Рисунок 2. Различия показателей продукции нейтрофилами супероксидного анион-радикала у больных ревматическими заболеваниями

Снижение продукции супероксид-аниона было зарегистрировано в группах больных ССД и РБС, в отличие от группы пациентов, страдающих СКВ, где данный показатель был статистически значимо повышен. Количество клеток, демонстрирующих склонность к апоптозу, коррелировало с показателем резерва генерации супероксид-аниона у больных АС (r=0,39; p=0,007), СКВ (r=0,39; p<0,01) и ССД (r=0,49; p=0,01).

Было установлено, что, несмотря на высокий уровень метаболической активности, нейтрофилы, выделенные у больных АС, обладают низким функциональным резервом, в отличие от нейтрофилов больных, страдающих ССД, резервный потенциал которых был максимальным. При ССД функциональный резерв клеток был значимо выше, по сравнению с группами пациентов, страдающих АС и СКВ (рисунок 3).

Рисунок 3. Различия показателей резерва продукции АФК нейтрофилами у больных ревматическими заболеваниями

Известно, что дисбаланс в САОЗ крови, наблюдающийся при аутоиммунных заболеваниях, является важным фактором патогенеза и определяет характер течения патологического процесса. Полученные результаты свидетельствовали о значимом повышении антиоксидантного потенциала крови у больных АС, ССД и РБС, по сравнению с группой контроля (рисунок 4).

Показатели метаболической активности нейтрофилов при РБС характеризовались низким уровнем продукции АФК, что не требовало значительной активации ферментов, которые их утилизируют. В то же время при СКВ, в отличие от РБС, было отмечено усиление процессов метаболизма нейтрофилов, что определяло необходимость усиления системы антиоксидантной защиты крови.

Рисунок 4. Различия показателей активности системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями

Высокий флогогенный потенциал и функциональная активность клеток при АС, в отличие от СКВ и РБС, сопровождалась максимальной интенсификацией деятельности САОЗ крови. Больные АС демонстрировали более высокие показатели активности САОЗ, в сравнении с больными СКВ и РБС. У больных РБС, по сравнению с пациентами, страдающими СКВ и ССД, отмечены наиболее низкие показатели антиокислительной активности крови.

Показатели функциональной активности, продукции оксида азота, апоптоза нейтрофилов и состояния системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями и ИБС.

Анкилозирующий спондилит.

У больных АС, имеющих первую степень активности (14,6 имп/мин (12,3; 16,4)>13,4 имп/мин (10,8; 16,8); p<0,05), в сравнении с пациентами со второй степенью активности заболевания, выявлено повышение уровня апоптоза нейтрофилов.

При продолжительности заболевания менее пяти и более десяти лет наблюдалась высокая функциональная активность клеток, характеризовавшаяся уменьшением флогогенного потенциала нейтрофилов (0,52 имп/мин (0,09; 1,15)<0,88 имп/мин (0,42; 1,12)<1,14 имп/мин (0,53; 1,26); p<0,05). Указанные изменения происходили на фоне снижения синтеза оксида азота, более выраженного при длительности болезни, не превышающей пяти лет (0,37 мкМ/л (0,19; 0,61)<0,45 мкМ/л (0,25; 1,01)<0,95 мкМ/л (0,38; 1,41); p<0,05).

Развитие центральной формы АС сопровождалось активацией продукции нейтрофилами супероксид-аниона (5,4 имп/мин (1,6; 6,2)>0,7 имп/мин (0,35; 1,3); p<0,05). Периферическая форма АС характеризовалась наиболее высоким показателем флогогенной активности нейтрофильных гранулоцитов, который значимо отличался от показателя контрольной группы (8,1 имп/мин (5,5; 10,2)>1,15 имп/мин (0,5; 1,8); р<0,05).

При подостром характере течения заболевания, в отличие от затяжного варианта, отмечалось увеличение резервного потенциала клеток (1,36 Ед (1,25; 2,7)>0,08 Ед (0,018; 0,3); p=0,04), а также снижение числа клеток, демонстрирующих склонность к апоптозной гибели (10,3% (10,2; 13,5)<13,6% (11,8; 16,3); p=0,048).

Установлено, что нейтрофилы женщин, страдающих АС, обладали более высоким резервом продукции супероксид-аниона (6,4 имп/мин (1,0; 6,9)>2,1 имп/мин (0,5; 6,7); р<0,05), и низким резервом продукции АФК (0,006 Ед (0,001; 0,2)<0,09 Ед (0,02; 0,99); p<0,05). Выявлено статистически значимое увеличение уровня апоптоза клеток у больных АС молодого возраста (15,0% (12,8; 17,0)>13,5% (10,8; 16,1); p=0,031), в группе которых наблюдалась тенденция к снижению резервного потенциала нейтрофилов (0,55 имп/мин (0,2; 1,0)<0,7 имп/мин (0,33; 2,4); p=0,07).

Системная красная волчанка. При СКВ снижение показателей продукции оксида азота и экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов сопровождалось ростом продукции супероксид-аниона (1,2 имп/мин (0,5; 2,0)>0,55 имп/мин (0,2; 1,1); p=0,033). У больных молодого возраста наблюдалась тенденция к увеличению показателей резерва продукции супероксид-аниона нейтрофилами (0,9 имп/мин (0,2; 1,0)>0,3 имп/мин (0,1; 0,9); p=0,07), по сравнению с больными зрелого возраста.

Наиболее выраженные изменения показателей функциональной активности клеток были характерны для пациентов, страдающих СКВ на протяжении 10 лет и более. В этой группе наблюдались высокие показатели биоцидности нейтрофилов, которые значимо отличались от таковых в группе пациентов с длительностью заболевания менее 5 лет (4,6 имп/мин (1,0; 6,5)>2,25 имп/мин (1,0; 5,5); p<0,05 и 2,0 имп/мин (1,0; 3,0)>0,95 имп/мин (0,5; 1,8); p<0,05).

Нейтрофилы больных с подострым течением СКВ демонстрировали более высокие показатели функциональной активности по сравнению с нейтрофилами, выделенными у пациентов с хроническим течением заболевания. Увеличение активности патологического процесса сопровождалось статистически значимым снижением резервных возможностей синтеза супероксид-аниона нейтрофилами (0,4 Ед (0,25; 0,5)<0,6 Ед (0,33; 1,0); p=0,04), а также уменьшением эффективности антиоксидантной защиты крови (82,1% (54,6; 89,9)>60,3% (30,4; 80,0); p=0,03).

У больных СКВ, осложненной развитием антифосфолипидного синдрома, наблюдалось значительное усиление процессов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, в отличие от показателей, выявленных в группе пациентов без антифосфолипидного синдрома (10,0 имп/мин (0,8; 13,2)>2,2 имп/мин (1,0; 6,4); p=0,021).

В сравнении с пациентами, у которых эпизоды тромбообразования не регистрировались, у больных СКВ с наличием тромбоэмболических осложнений выявлено увеличение метаболической активности нейтрофилов (10,8 имп/мин (5,4; 12,3)>2,3 имп/мин (1,0; 6,4); p=0,036), сопровождавшееся снижением их резервного потенциала (0,1 Ед (0,1; 2,0)<1,0 Ед (1,0; 4,9); p=0,05), которое происходило на фоне усиления активности САОЗ крови.

Системная склеродермия.

В отличие от молодых пациентов, у больных ССД пожилого возраста было выявлено увеличение резерва продукции АФК нейтрофилами (5,6 Ед (1,8; 12,0)>0,3 Ед (0,1; 2,8); p=0,01). По сравнению со зрелым возрастом, в пожилом возрасте наблюдается значительное снижение образования супероксид-аниона нейтрофилами (0,3 имп/мин (0,1; 0,5)<1,5 имп/мин (0,9; 3,0); р=0,03), а также увеличение склонности нейтрофилов к спонтанному апоптозу (18,7% (14,7; 19,7)>10,9% (8,5; 13,7); р=0,028).

Значительное увеличение показателей продукции АФК и функционального резерва нейтрофилов (3,5 имп/мин (0,7; 6,4)>0,95 имп/мин (0,4; 3,8); p=0,021) и (3,6 имп/мин (0,8; 14,7)>2,3 имп/мин (0,55; 7,5); p=0,013), а также повышение уровня спонтанного апоптоза нейтрофилов (14,7% (12,4; 18,8)>10,6% (8,5; 16,6); р=0,042) было обнаружено при лимитированной форме ССД в отличие от диффузной формы заболевания.

В группе больных ССД при длительности заболевания, превышающей 10 лет, наблюдалось статистически значимое уменьшение образования АФК (0,4 имп/мин (0,1; 5,2)<2,5 имп/мин (0,7; 7,2); p=0,02), и снижение уровня продукции супероксид-аниона (0,3 имп/мин (0,1; 3,0)<1,5 имп/мин (0,7; 2,2); р=0,013), а также подавление резерва продукции АФК нейтрофилами (1,7 имп/мин (0,6; 4,1)<3,7 имп/мин (0,1; 10,6); р=0,011), по сравнению с группой пациентов, в которой продолжительность болезни ограничивается 5-10 годами.

В отличие от хронического течения, при подостром течении ССД наблюдалось значительное снижение резерва продукции супероксид-аниона (0,09 Ед (0,05; 0,33)<0,42 Ед (0,22; 2,7); р=0,041), а также увеличение синтеза оксида азота (0,75 мкМ/л (0,37; 1,73)>0,31 мкМ/л (0,23; 0,82); р=0,032).

Ревматическая болезнь сердца.

Изменения функционального состояния нейтрофилов при РБС были связаны с гиперпродукцией супероксид-аниона (1,0 имп/мин (0,7; 2,2)>0,7 имп/мин (0,35; 1,3); p<0,01), увеличением резервного потенциала клеток (2,3 имп/мин (1,1; 6,5)>1,1 имп/мин (0,25; 2,75); p<0,01) и снижением синтеза оксида азота (0,44 мкМ/л (0,21; 0,77)<0,86 мкМ/л (0,78; 0,96); p<0,001). В отличие от группы контроля, в группе больных, страдающих РБС, наблюдалось уменьшение количества нейтрофилов, демонстрирующих склонность к апоптозу (14,6% (11,4; 17,8)<17,6% (16,7; 18,6); p<0,01). Указанные изменения сопровождались значительным увеличением активности ферментов САОЗ крови (63,8% (37,5; 77,8)>50,0% (11,1; 71,0); р=0,034).

Установлено, что при длительности заболевания, не превышающей 10 лет, наблюдается наиболее низкий показатель продукции супероксид-аниона, который достигает максимума при длительности заболевания от 10 до 20 лет и повторно снижается при длительности болезни более 20 лет (0,8 имп/мин (0,4; 1,0)<1,6 имп/мин (1,0; 3,0)>1,0 имп/мин (0,7; 2,1); p<0,05).

Наличие стенозирующих пороков митрального и аортального клапанов сердца характеризовалось изменением показателей резерва продукции супероксид-аниона, уровень которого значимо снижается при митральном стенозе (0,3 Ед (0,1; 1,0)<0,6 Ед (0,3; 1,5); р=0,045), а также повышением склонности нейтрофилов к спонтанному апоптозу при наличии аортального стеноза (14,5% (10,6; 17,7)<17,7% (15,0; 19,4); р=0,02). В группе больных с недостаточностью аортального клапана, в отличие от группы больных с аортальным стенозом, обнаружено уменьшение количества bak-положительных нейтрофилов (17,7% (15,0; 19,4)>13,5% (11,4; 17,3); р=0,012).

Причиной летального исхода больных РБС в течение 12 месяцев после выписки из стационара было прогрессирование хронической сердечной недостаточности, сопровождавшееся значимыми нарушениями гемодинамики или развитием фатальных аритмий. Зарегистрировано шесть случаев летального исхода. В этой группе пациентов наблюдалось увеличение показателей образования и резерва продукции АФК нейтрофилами (2,5 имп/мин (2,0; 3,0)>1,3 имп/мин (0,6; 3,1); р=0,018). Корреляционный анализ выявил наличие умеренной обратной корреляции между показателями продукции оксида азота и супероксид-аниона (r=-0,37; р=0,008), синтеза оксида азота и резерва образования АФК (r=-0,44; р=0,036) в данной группе.

Ишемическая болезнь сердца.

В группе больных ИБС, по сравнению с группой контроля, наблюдалось увеличение образования нейтрофилами оксида азота (1,6 мкМ/л (1,15; 1,9)>0,86 мкМ/л (0,78; 0,96); p<0,001), ассоциированное с повышением экспрессии антигена bak (20,6% (19,8; 23,1)>17,6% (16,7; 18,6); p<0,001). Стабильное течение ИБС характеризовалось уменьшением резерва образования супероксид-аниона (0,3 Ед (0,1; 0,6)<0,75 Ед (0,11; 1,0); p=0,039).

У пациентов, страдающих ИБС, было отмечено значительное увеличение активности ферментов САОЗ крови, наблюдаемой в группе мужчин (70,0% (46,9; 85,7)>14,8% (11,1; 62,5); p<0,05). У больных женского пола отмечено повышение показателей образования нейтрофилами оксида азота (1,6 мкМ/л (1,3; 2,1)>0,86 мкМ/л (0,78; 0,96); p<0,05), сопровождающееся увеличением склонности клеток к апоптозной гибели (20,0% (19,3; 23,8)>17,6% (16,7; 18,5); p<0,05). Выявлено увеличение синтеза нейтрофилами оксида азота в группе больных ИБС пожилого возраста по сравнению с пациентами зрелого возраста.

В группе больных ИБС, имеющих индекс массы тела менее 25,9 кг/м², в отличие от группы контроля, отмечен рост резерва продукции нейтрофилами активных форм кислорода (2,3 Ед (1,1; 4,3)>1,1 Ед (0,74; 1,83); p<0,05). При наличии артериальной гипертензии наблюдалось снижение ХЛи (50,0% (34,5; 60,4)<78,4% (60,1; 91,0); p<0,05).