Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.01.12 - Онкология

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований

Казубская Татьяна Павловна

Москва 2010 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук, онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

(Директор академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор

Раиса Федоровна Гарькавцева,

доктор медицинских наук, профессор, Владимир Юрьевич Сельчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Петр Васильевич Новиков,

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Николай Евгеньевич Кушлинский,

доктор медицинских наук, профессор Валентин Сергеевич Мазурин.

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования Минзравсоцразвития России

Защита диссертации состоится « » 2010 года в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02.) по адресу:115478 Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан « » 2010г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Интерес клиницистов к роли генетических факторов, как первичных факторов риска в этиологии рака повышался с последовательными открытиями герминальных мутаций генов Rb, BRCA1/2, RET, ассоциированных с развитием ретинобластомы (Friend SH. et al.,1986, Lee WH.et al.,1987), рака молочной железы (Wooster R. at al.,1994, Ford D. at al.1994), синдромов множественных эндокринных неоплазий 2 типа (МЭН2) (Takahashi M.еt al.,1985). Интерес стал более интенсивным, когда выяснилось, что анализ клинической картины болезни, выявление связи между клиническими проявлениями заболевания и лежащими в их основе молекулярными повреждениями, открывают возможности идентификации новых форм болезни и установления причин их возникновения, что может привести к более нацеленному изменению ракового контроля и таргетной терапии.

С генетической точки зрения главной особенностью неоплазий является клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность, а для так называемых мультифакториальных злокачественных опухолей - существование их наследственных и ненаследственных форм без четких границ. Проблема генетической гетерогенности наследственных форм опухолей занимает важное место, поскольку кажущееся фенотипически однородным, генетически гетерогенное заболевание, может включать в себя несколько клинически, генетически и биохимически самостоятельных форм (Гинтер Е.К.,2001). Анализ клинической картины болезни (фенотипа) и выявление взаимосвязи между генотипом и фенотипом, предоставляет возможность установить не только какие генетические изменения лежат в основе формирования предрасположенности к неоплазии, но и разработать стратегию формирования прицельно однородных групп риска, оптимизировать процедуру проведения ДНК-анализа. Изучение особенностей проявления неоплазий и причин, которые их формируют, является одним из важнейших направлений в медицине вообще и клинической генетике в частности, и лежит в основе успешной диагностики и медико-генетического консультирования больных и их семей.

Указанные особенности характерны и для рака щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично-множественных злокачественных опухолей (ПМЗО). Имеющиеся на сегодняшний день работы, посвященные гетерогенности этих форм опухолей, не имели системного подхода и ограничивались областью профессиональных интересов (молекулярно-генетическими изучениями отдельных нозологических форм неоплазий). Однако недостаточная изученность отдельных генетических вариантов злокачественных опухолей может привести к тому, что в рамках одной нозологической формы рака, могут рассматриваться заболевания с различной генетической природой и различными патогенетическими механизмами развития.

Проблема своевременного выявления РЩЖ, МК, ПМЗО заключается не только в бессимптомном развитии, но и в отсутствии надежных маркеров, способствующих их раннему выявлению. Наряду с этим, первично-множественные опухоли представляет собой особую диагностическую проблему. Изучения, прицельно направленные на выявление специфических признаков, которые могли бы у пациентов увеличивать риск проявления вторых первичных раков, являются актуальными с клинической и биологической точек зрения. Значение проблемы возрастает еще и в связи с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от этих новообразований (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). В этой связи особое значение имеет идентификация наследственных форм РЩЖ, МК, ПМЗО, разработка стратегии преодоления генетической гетерогенности с использованием биологических параметров на клиническом, генетическом и молекулярном уровнях, которая позволит идентифицировать семьи со сходными клиническими признаками. При этом активное выявление даже относительно небольшого числа случаев злокачественных новообразований среди практически здоровых родственников из семей больных этими заболеваниями может рассматриваться как важная научно-практическая задача.

И хотя оценка генетических параметров наследственных форм опухолей затруднена, решение этих вопросов имеет первостепенное значение для разработки программы клинико-генетической диагностики, профилактики (в том числе и пренатальной) и патогенетически ориентированной терапии. Все эти вопросы планировались и разработаны на модели рака щитовидной железы, меланомы кожи, первично множественных злокачественных опухолях.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: определить роль наследственных факторов в этиологии рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично множественных злокачественных опухолей, выделить генетически детерминированные формы этих заболеваний, изучить их генетическую гетерогенность, разработать тактику медико-генетического консультирования при разных их вариантах.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить размах вариабельности клинико-генетического проявления рака щитовидной железы (РЩЖ) меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО).

2. Определить фенотипические и генетические корреляции различных форм опухолей в семьях больных РЩЖ, МК и ПМЗО.

3. Изучить клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности РЩЖ, МК и ПМЗО.

3.1 Изучить частоту и спектр молекулярных изменений при медуллярном РЩЖ (МРЩЖ).

3.2 Определить частоту и спектр повреждений некоторых участков хромосом в клетках крови больных МК и диспластических невусов (ДН).

3.3 Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения гена р16/CDKN2A в образцах опухолей МК.

3.4 Оценить значимость биологических микрочипов в диагностике герминальных мутаций генов BRCA1,2 и CHEK2 у больных первично множественным раком с поражением яичников.

3.5 Изучить статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: RASSF1A, RARв2, SEMA3B, определить их значение в молекулярном патогенезе и диагностике солитарного и первично множественного рака молочной железы и яичников.

4. Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РЩЖ, МК и ПМЗО.

5. Разработать основные принципы медико-генетического консультирования семей РЩЖ, МК и ПМЗО.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые на основе комплексного клинико-генетического и молекулярно- биологического изучения больных раком щитовидной железы, меланомой кожи и первично множественными злокачественными опухолями выявлены основные клинико-генетические особенности этих заболеваний. Расширены представления о генетической гетерогенности (аллельного или локусного происхождения) РЩЖ, МК, ПМЗО, определена структура и соотношение их генетически детерминированных форм, разработаны критерии для выделения генетически самостоятельных вариантов.

Показано, что молекулярной основой МЭН2 являются мутации в гене RET, установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с синдромами множественных эндокринных неоплазий 2 типа, определен спектр его мутаций, обнаружены новые мутации гена RET у российских больных, что позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. Установлено, что причиной клинического полиморфизма медуллярного РЩЖ является разное положение точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов гена RET, обнаруживая аллельную гетерогенность этого заболевания. Впервые в стране по результатам ДНК-диагностики медуллярного РЩЖ проведено профилактическое удаление щитовидной железы, внедрена в практику пренатальная диагностика этого заболевания. Разработана комплексная программа выявления лиц предрасположенных к развитию МРЩЖ, позволяющая не только уточнить индивидуальный генетический диагноз, дать более точный прогноз течения заболевания, но и осуществить своевременные лечебно-профилактические мероприятия, направленные на предотвращение развития этой опухоли.

Выявлено наличие характерных для МК и ДН генетических и эпигенетических нарушений. У индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей диспластических невусов в трех участках короткого плеча хромосомы 1-1р22,1р31, 1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью, что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью и является ранним событием в цепи изменений, предшествующих МК. Аномальное метилирование промоторного района гена CDKN2A является неслучайным изменением у больных МК и выявляется у всех больных ПМЗО с поражением МК.

С использованием технологии олигонуклеотидных биочипов показано, что частота наиболее распространенных герминальных мутаций в гене BRCA1 у больных ПМЗО с поражением яичников выявляется в 53% случаев.

Впервые проведено определение статуса метилирования СрG-островков генов RASSF1A, RARв2 и SEMA3B в опухолевых и нормальных тканях молочной железы, яичников больных первично множественными опухолями, больных солитарным РМЖ и РЯ и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Показана высокая частота аномального метилирования промоторных районов этих генов в тканях больных ПМЗО с поражением молочной железы и яичников и солитарных РМЖ и РЯ, с частотами от 30% до 90%. Впервые показано, что больные с аномальным метилированием генов RASSF1A, RARв2 могут иметь тенденцию к первично множественному поражению РМЖ и РЯ. Выявлена достоверная положительная корреляция частоты метилирования генов RARв2 и SEMA3B со стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ. Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей, что позволяет рекомендовать их в качестве молекулярных маркеров диагностики и прогноза этих заболеваний и свидетельствует о больших возможностях метилирования ДНК для разработок неинвазивной диагностики рака.

Внедрение в практику.

Результаты исследования внедрены и используются в клинической практике различных подразделений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российских онкологических конгрессах:VII,X,XI,XII (Москва 2003, 2006-2008 г.); научно-практической конференции "Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты", Украина, Киев, 2002; Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research (USA, Boston, 2002), научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2003); Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research (Toronto, 2003); Human Genome Meeting“HGM'99”( Scotland, Edinburgh, 2001); 28th Meeting of the Federation of European Biochemica Societies (Turkey, Istanbul, 2002); Российской конференции по онкогинекологии (Москва, 2009); European School of Oncology “Меланома” (Москва 1995), “Thyroid cancer” (Moscow, 2004); cъезде онкологов республики Казахстан (Алма-Ата, 2003); I Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 2005); IV съезде онкологов и радиологов СНГ (Баку, 2006); конференции с международным участием "Генетика в России и мире" (Москва, 2006); 30th Conference of American Society of Preventive Oncology (USA, Bethesda, 2006); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии “Петровские Чтения”, (Санкт-Петербург, 2008); 19th International Congress on Anti Cancer Treatment (ICACT) (Paris, France, 2008); III конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», (Сочи, 2009); II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, 2009).

Апробация работы состоялась 11 декабря 2009 года на совместной научной конференции с участием лаборатории клинической онкогенетики, отделения биотерапии опухолей, отделения гинекологического, отделения опухолей молочных желез, проктологического отделения, отдела опухолей головы и шеи НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН; а также кафедры генетики и кафедры онкологии факультета последипломного образования Московского государственного медико-стоматологического университета Министерства здравоохранения и социального развития.

По теме диссертации опубликовано 83 печатных работы в российских и зарубежных журналах, из них - 36 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, 3 работы оформлены как главы в справочниках и учебных пособий.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, который содержит 22 отечественных и 290 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 2 графиками, 52 рисунками.

Материалы и методы исследования.

В НИИКО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН за 1988-2008 годы сформирован канцер-регистр лаборатории клинической онкогенетики, cтавший основой исследуемой выборки, объем которой составил 1495 больных и 8700 их родственников 1-2-й степени родства. Из них 208 больных РЩЖ (140 папиллярным и фолликулярным РЩЖ и 68 больных медуллярным РЩЖ), 460 больных МК, 400 больных ПМЗО, жителей Москвы и области. Каждая семья регистрировалась через одного члена семьи, т.е. путем одиночного отбора. Особое внимание уделялось подтверждению диагноза онкологического заболевания у родственников I степени родства: родителей, сибсов (братьев и сестер), детей, которые затем включались в дальнейший анализ.

В анализе использовались клинические, эпидемиологические, клинико-генеалогические, цитогенетические, молекулярно-генетические, генетико-математические методы исследования. У всех пациентов было получено информированное согласие об участии в исследованиях. Все случаи рака классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.)

В качестве контроля использовались популяционные частоты распространенности различных злокачественных новообразований, которые были вычислены по данным учетных форм № 090/V поступивших из всех районных онкологических отделений г. Москвы в отдел медицинской статистики МГОД. Данные о половозрастном составе населения г. Москвы в изучаемый период были получены в Московском городском статистическом управлении. Показатели заболеваемости были стандартизованы по возрасту прямым методом с использованием мирового стандарта возрастного распределения населения.

Идентификация наследственных синдромов проводилась в соответствии с установленными международными критериями для каждого из них.

Изучение распространенности ДН в г. Москве проводилось на основании результатов осмотра 509 человек, случайно отобранного контингента взрослого населения. Для поиска специфических опухолевых ассоциаций в семьях больных МК использовались клинико-генеалогические данные, включавшие 98 человек имеющих на коже множественные меланоцитарные невусы и их 259 родственников 1-й степени родства и 22 человека с множественными невусами, отобранных при осмотре 247 близких родственников из семей 91 больного с гистологически подтвержденным диагнозом МК. Каждый пациент-носитель множественных невусов получил лечение и наблюдался от 5 до 18 лет в клинических отделениях РОНЦ в период с 1988 по 2005 г. В качестве контрольных групп служили 2 выборки: одна из них состояла из 1001 больного с гистологически подтвержденным диагнозом - рак желудка и 3793 их родственника 1-й степени родства; вторая включала 1048 клинически здоровых лиц, не имевших злокачественных опухолей и их 4654 родственника 1-й степени родства также собранных среди московского населения в период с 1985 по 2003 годы. Все анализируемые группы были подобраны по полу и возрасту и были жителями Москвы и Московской области.

Молекулярные исследования, ДНК-диагностика наличия точковых мутаций в протоонкогене RET проводилась на базе Медико-генетического научного центра РАМН совместно с лабораторией молекулярной генетики и клиникой Гамбургского университета. Материалом для исследований служила ДНК пациентов медуллярным РЩЖ находившиеся в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с 1998 по 2007г. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови, образцов опухолевых и нормальных тканей щитовидной железы (кусочки или гистологические срезы) и использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации экзонов гена RET.

Цитогенетическое изучение наиболее частых перестроек встречающихся при МК, включающих в себя сайты повышенной ломкости хромосом(СПЛХ), конститутивные (кСПЛХ) или fragile sites проводили на G-окрашенных метафазных пластинах лимфоцитов периферической крови, культивируемых по стандартной методике, проводилось совместно с лабораторией цитогенетики в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Молекулярно-генетические исследования МК проводились в лаборатории эпигенетики Медико-генетического научного центра РАМН. Материалом исследования служила ДНК лимфоцитов периферической крови и ткани опухолей больных МК. Для исследований использовали 10 микросателлитных маркеров на хромосоме 9р, расположенных в районе гена р16/CDKN2A. Анализ метилирования промоторной области гена р16/CDKN2A был проведен методом метилчувствительной ПЦР.

Определение спектра и частоты наиболее частых точковых мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 у больных первично-множественными опухолями с поражением яичников и больных органоспецифическим раком яичников в популяции российских женщин проводились на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельдгардта. Методом аллель-специфичной гибридизации, сочетающего мультиплексную ПЦР и гибридизацию с олигонуклеотидными биочипами, определялась частота встречаемости мутаций в гене BRCA1- 185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158A>G и 5382insС, в гене BRCA2- 695insT, 6174delТ и в гене CHEK варианта 1100delC.

Исследование уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RARЯ2, SEMA3B проводилось на базе Государственного Научного Центра РФ ГосНИИ генетика и совместно с Каролинским институтом (Швеция). Исследование включало комбинацию методов: ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщипленной с помощью набора метилчувствительных рестриктаз (МЧРА), бисульфитной модификации ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР. В анализ включены 330 пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой и гистологически нормальной ткани больных раком молочной железы, яичников и первично-множественными опухолями с поражением молочной железы и яичников. В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых индивидов (15 человек). ДНК выделяли из ткани опухоли и из лимфоцитов крови по стандартной методике.

Пересмотр гистологических препаратов проведен в отделе патоморфологии РОНЦ им. НН.Блохина РАМН.

Исследование проведено с использованием генетико-математических методов изложенных в методических разработках (Трубников В.И., Москва, 1998), в пакете программ “Biometrika”. Для создания базы данных использовался программный продукт фирмы VNIINSoft КАРАТ. Основные статистические методы - критерии Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием t-теста Стьюдента и критериев чІ.

Результаты и обсуждение

Проведенное исследование посвящено одной из сложных проблем в клинической онкологии: изучению генетической обусловленности и генетической гетерогенности и клинического полиморфизма рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично-множественных злокачественных опухолей.

Клинико-генетический анализ рака щитовидной железы. Раннее выявление РЩЖ, клинико-генетическая идентификация его наследственных вариантов, разработка методов выявления аналогичного заболевания среди родственников больных РЩЖ и тактика лечения бессимптомных носителей патологических мутаций гена/ов, ответственных за развитие РЩЖ, является важной задачей онкологии и генетики. Хотя папиллярный и фолликулярный (немедуллярный) РЩЖ (НМРЩЖ) является наиболее частой формой рака этой локализации, о его наследственном эквиваленте известно очень мало.

для решения вопроса о наследственной предрасположенности к НМРЩЖ были изучены 140 больных, у которых папиллярный рак наблюдался у 74%, папиллярно-фолликулярный в 23% и в 3% случаев - фолликулярный. При анализе установлены различия в проявлении этого заболевания в зависимости от пола (соотношение мужчин и женщин -1:5), что указывает на существование различных величин риска развития НМРЩЖ для мужчин и женщин. Возраст диагностики заболевания в среднем составляет 47,7 ±1,61 года, у 78% больных первые признаки заболевания проявляются в среднем на 6 -7 лет раньше. У больных с НМРЩЖ обнаружено сочетанное поражение разных органов, частота первично-множественных неоплазий составила 5,7%, что выше частоты в популяции (0,003%)(р?0,01). Анализ показал наличие семейного накопления разных неоплазий, частота которых составила 4% и доброкачественных опухолевых и неопухолевых заболеваний щитовидной железы - составила 3,2%. . При изучении семейных случаев НМРЩЖ впервые установлен наследственный синдром семейного папиллярного РЩЖ (ПРЩЖ), признаками которого являются преимущественно мультифокальное и двустороннее поражение папиллярным раком только ткани щитовидной железы у трех и более членов семьи, рис.1. Возраст диагностики ПРЩЖ оказался много моложе общей выборки больных НМРЩЖ, составив 34,1± 6,8 года против (47,7 ± 1,6 года) (р? 0,05), в целом, показывая более тяжелый фенотип и аутосомно-доминантный тип (родители-дети) наследования заболевания.

Родословная семей больных С и В, диагноз: синдром семейного ПРЩЖ

I

II

III

Рис.1. Отец больной (II-2) умер в 36 лет от ПРЩЖ, (II-1) умер в 38 лет от ПРЩЖ, (III-2) -папиллярный РЩЖ, его бабушка (I-4) умерла от ПРЩЖ на фоне множественных аденоматозных узлов щитовидной железы, а (I-5) -умерла в 73 года от рака поджелудочной железы.

В результате исследования выявлены наследственно обусловленные синдромы, компонентом которых является папиллярный и фолликулярный РЩЖ. Эти синдромы характеризуются двумя клинико-генетическими вариантами. Первый, ассоциирован с множественными типами опухолей, возникающих в тканях разных органов и наследуемых по аутосомно-доминантному типу. Это синдромы -Гарднера, Каудена и МЭН1, которые в анализируемой выборке больных идентифицированы в 3,6% случаев. Второй - синдром семейного ПРЩЖ(СПРЩЖ), при котором преобладающим и постоянным признаком является папиллярный РЩЖ, обнаружен в 1,4% случаев.

Проведенное исследование показало существование наследственно обусловленных форм НМРЩЖ и в отдельно взятых семьях косегрегацию НМРЩЖ с неоплазиями почки, молочной железы, кожи (меланомы), нервной системы и толстой кишки. В целом, среди больных НМРЩЖ наследственно детерминированные формы этого заболевания выявлены в 5% случаев.

Полученные данные позволяют идентифицировать семьи с наследственно обусловленными формами НМРЩЖ и формировать группы "высокого риска" среди родственников из семей больных НМРЩЖ, а также осуществлять индивидуальный прогноз развития заболевания для членов семьи больного в зависимости от конкретной семейной ситуации. На основании полученной информации, разработаны критерии идентификации лиц с высоким риском развития НМРЩЖ, которые включают: 1) поражение НМРЩЖ до 40 лет и наличие пораженных членов семьи аналогичным заболеванием; 2) наличие в анамнезе или в семье других неоплазий: в почках, толстой кишке, молочной железе, нервной системы, кожи и наличие гамартом; 3) наличие в анамнезе или у членов семьи доброкачественных опухолей в щитовидной железе; 4) наличию в семье ПМЗО с поражением щитовидной железы; 5) внимание к щитовидной железе при идентификации у пациентов наследственных мультиопухолевых синдромов.

Важной проблемой является выявление С-клеточной гиперплазии или медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) на ранней стадии заболевания. В этой связи, достижения в молекулярной биологии, позволили не только понять причины развития медуллярного рака, но и реально подойти к решению вопроса ранней диагностики и профилактики этой формы РЩЖ.

Проведенный анализ 68 семей больных МРЩЖ выявил генетически детерминированный МРЩЖ в 24,9% случаев, которые имели разные формы проявления, такие как МЭН2А, МЭН2Б, синдром СМРЩЖ и медуллярный РЩЖ как компонент нейрофиброматоза 1 типа. Исходя из важного наблюдения, что ген RET экспрессируется только в определенных тканях нейроэндокринной дифференцировки, включая парафолликулярные С-клетки щитовидной железы, экстра и интраадреналовые хромафинные клетки надпочечников, периферические нервы, описываемые случаи совместного поражения этими редкими формами заболеваний как нейрофиброматоз и МРЩЖ предполагают возможность существования общего биологического механизма, ответственного за их развитие. Частота спорадического МРЩЖ составила 75,1%, среди которых, могут быть случаи обусловленные мутацией "de novo" в половых клетках одного из родителей.

При изучении семей с синдромами МЭН 2 типа установлен широкий спектр клинического проявления МРЩЖ, высокая вариабельность риска развития неоплазии среди родственников. Для синдрома МЭН2А характерно билатеральное развитие феохромоцитом у больных и их родственников, которые являлись частой причиной внезапной смерти. Наличие феохромоцитомы установлено в 50% семей, у одного из больных, помимо МРЩЖ и феохромоциомы, был обнаружен третий первичный рак молочной железы. Выявлена ассоциация МРЩЖ с аномалией почек, обнаруженная у носительницы мутации гена RET.

Анализ семей с синдромом МЭН2Б показал, что 90% больных является результатом мутации de novo. МРЩЖ при этом синдроме возникает гораздо раньше (как правило, до 5 летнего возраста) и протекает более агрессивно. Для синдрома семейного МРЩЖ характерно поражение родственников сайт-специфическим медуллярным раком при отсутствии клинических или биохимических признаков поражения паращитовидных желез или надпочечников.

Возраст манифестации МРЩЖ у пациентов и их родственников с МЭН2 варьирует в зависимости от метода диагностики. При МЭН2А возраст диагностики в среднем 28 лет (колебался от 7 до 45 лет), а у некоторых родственников к моменту изучения этих семей возраст превышал 50, 62 и 75лет. При СМРЩЖ он в среднем составил 30 лет, в то время как при МЭН2Б развитие заболевания наблюдалось в среднем 8,6 года, показывая самый тяжелый фенотип.

Впервые в России проведен скрининг герминальных мутаций в гене RET в семьях больных с МЭН2. В результате установлена четкая ассоциация мутаций в этом гене с МЭН2 синдромами. В семьях с МЭН2А идентифицированы 2 специфические мутации в кодоне 634 гена RET, в семьях с МЭН2Б выявлена мутация в кодоне 918 гена RET. При синдроме семейного МРЩЖ обнаружена мутация в кодоне 620 гена RET. Характерные для этих синдромов межиндивидуальная изменчивость, как по возрасту начала заболевания, так и по тяжести его проявления (даже в пределах одного подтипа) могут быть обусловлены не только варьирующей экспрессивностью и пенетрантностью гена RET, но и положением точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов этого гена. Молекулярная ДНК-диагностика гена RET, стала реальным подтверждением выявленных наследственных форм МРЩЖ.

Наличие аллельной гетерогенности находит свое отражение в выявленной взаимосвязи между фенотипом- RET генотипом и тяжестью проявления заболевания. У больных с MЭН2A мутация в кодоне 634 ассоциируется с феохромоцитомой и гиперпаратиреозом и до сих пор, не была обнаружена ни в одной из семей с синдромом семейного МРЩЖ, что позволяет рассматривать ее в качестве маркера при прогнозировании риска развития этих заболеваний у бессимптомных носителей этой мутации. Герминальные мутации в кодоне 918 характерны исключительно для МЭН2Б и связаны с пороками развития скелета и слизистых. Выявленная ассоциация позволяет дать более точный прогноз течения заболевания у больных МЭН2.

Единственным эффективным методом лечения МРЩЖ является тиреоидэктомия, поэтому так важна ранняя и доклиническая диагностика этого заболевания. Однако вопрос о профилактической тиреоидэктомии остается предметом постоянной дискуссии, поскольку все еще отсутствуют данные длительного наблюдения за пациентами, перенесшими в раннем детском возрасте тиреоидэктомию, основанную на прямом тестировании гена RET, и которые могли бы показать, что МРЩЖ радикально излечен. Прямое тестирование гена RET среди родственников больных МЭН2А обнаружило 8 бессимптомных носителей герминальных мутаций этого гена в возрасте от 3,5 до 42 лет из 4-х обследованных нами семей (табл.1). Первый российский опыт профилактического хирургического лечения выполнен у 6 из них, согласившихся на оперативное лечение. Как оказалось, только у двух из них, самых юных пациентов (3,5и 9 лет), операция была профилактической, у остальных обнаружены очаги С-клеточной гиперплазии и медуллярный рак.

Таблица 1.

Клиническая характеристика родственников семей с МЭН 2А и результаты тестирования гена RET (выявленный генотип) каждой семьи.

Эти данные показали, что носители мутаций могут быть подвергнуты тиреоидэктомии до появления МРЩЖ. Послеоперационное наблюдение от 1,5 до 8 лет (в среднем 4,8 года) позволило установить, что тиреоидэктомия проведенная на доклиническом уровне, позволяет избежать метастазирования и имеет более благоприятный исход заболевания (табл.2), раннее выявление заболевание на основе ДНК-тестирования может изменить течение МРЩЖ.

Изучение исходного и стимулированного уровня кальцитонина - как диагностического маркера показало, что этот тест не всегда является абсолютным критерием. У пациентки 3,5 лет из семьи с МЭН2А наблюдаемый уровень кальцитонина был выше нормы почти в 2,5 раза (76,8 пг\мл), однако при гистологическом исследовании признаков МРЩЖ обнаружено не было (табл.2). Неоспоримая ценность этого метода в возможности оценить полноту хирургического лечения.

Таблица 2.

Клиническая характеристика членов семей больных МЭН 2А, до и после тиреоидэктомии

Исходя из приобретенного опыта, пациентам с мутацией в кодоне 634, мы рекомендуем проводить тиреоидэктомию независимо от уровня кальцитонина. Выявленная взаимосвязь генотипа и фенотипа у носителей этих мутаций может способствовать планированию тиреоидэктомии, принятию решения относительно объема и времени провения профилактической тиреоидэктомии, разработке терапевтических подходов по отношению к пациентам-носителям мутаций. Комбинированный с молекулярными технологиями подход к клинической, биохимической диагностике и ведению пациентов из семей с МЭН2А может стать основным в уменьшение летальности от МРЩЖ.

Первый опыт дородовой диагностики синдрома МЭН2 в нашей стране проведен в семьях с МЭН2А и синдромом семейного МРЩЖ. Пренатальная диагностика проведена в семье №1 (табл.1), где у пациента 32 лет с синдромом МЭН2А (носителя мутации в кодоне 634) ожидалось появление потомства. На сроке беременности 10 недель проведена из клеток ворсин хориона, у его будущего ребенка, была выделена геномная ДНК и выполнена прямая ДНК-диагностика гена RET. Для исключения контаминации исследуемого материала материнскими тканями проведено контрольное исследование. Мутации гена RET не обнаружено, выявлен мужской пол плода, родился здоровый мальчик. В возрасте 1 месяца, ему проведено повторное тестирование ДНК, анализ оказался отрицательным. В семье с синдромом СМРЩЖ, у пациентки с мутацией TGC(Cys)>CGC(Arg) в кодоне 620 (экзон10), в 35 лет на фоне лечения МРЩЖ встал вопрос о дородовой диагностике. На сроке беременности 13-14 недель проведено прямое тестирование гена RET, у плода выявлена аналогичная мутация гена RET. Пациентка приняла решение прервать беременность.

Таким образом, применение RET-анализа дает возможность диагностировать (или исключить) наследственную форму МРЩЖ, подготовить родителей к рождению больного ребенка или предотвратить рождение такового.

Проведенный поиск соматических мутаций в гене RET у больных со спорадическим МРЩЖ позволил идентифицировать мутации в 28,6%. Выявлено 6 типов соматических мутаций, три из которых - гетерозиготные мутации в кодонах 639, 641 и 922 оказались неизвестными ранее. Это дает новые сведения по молекулярной генетике синдромов МЭН2 и позволяет расширить спектр мутаций, который можно рекомендовать для рутинного лабораторного анализа. При изучении мутаций гена RET в образцах крови 13 больных со спорадическим МРЩЖ, обнаружена герминальная мутация “de novo” тем самым показана необходимость ДНК-тестирования спорадических форм МРЩЖ. Созданы предпосылки для формирования банка генетической информации клинически верифицированных больных с МЭН2 в России.

На основе полученных в ходе исследования данных, высокий риск развития гиперпаратироза и феохромоцитомы в семьях с синдромом МЭН2А предполагает необходимость включения в скринирующие программы диагностику этих заболеваний. Выявление мутации в кодоне 918 гена RET свидетельствует о самом агрессивном типе синдромов - МЭН2Б и возможности раннего метастазирования заболевания и соответственно планирования возраста тиреоидэктомии, выбор которого проводится индивидуально, но не позднее первых 5 лет жизни. Синдром семейного МРЩЖ протекает менее тяжело и возникает в более позднем возрасте. ДНК-диагностику в семьях с МЭН2 следует проводить основываясь на вариантах этого синдрома и в соответствии с характеристиками мутаций гена RET.

Структура и соотношение генетически детерминированных форм МРЩЖ включает: 1) семейный синдром МЭН2А (7,4%); 2) МЭН2Б (11,7%); 3) синдром СМРЩЖ (4,4%); 4) в составе синдрома Реклингхаузена (1,4%).

Проведенный генетический анализ МРЩЖ позволил разработать комплексную программу выявления лиц, предрасположенных к развитию этого заболевания, включающую три этапа мероприятий:1) выявление и регистрация семей с MЭН2; 2) ДНК-диагностика бессимптомных членов семей с наследственным МРЩЖ («группа риска»), дающая индивидуальный прогноз, предусматривающий в зависимости от типа герминальных мутаций тактику ведения пациентов; 3) клинический мониторинг индивидов из группы риска, включающий общее клиническое обследование, определение уровня базального и пентагастрин-стимулированного кальцитонина, а также диагностику симптомов феохромоцитомы и гиперпаратиреоза (табл.3). Программа включает тактику создания профилактического регистра носителей онкопатологических генов, которая основана на соблюдении принципов добровольного проведения ДНК-диагностики, конфеденциальности генетической информации, права человека самому решать быть или не быть проинформированным о результатах генетического анализа и его последствиях. Только после согласия пациента-носителя, он включается в профилактический регистр с последующей организацией и координацией клинико-генетического мониторинга за состоянием его здоровья, профилактических операций, психологической помощи.

Таблица 3.

Выявление наследственных форм МРЩЖ и формирование «групп риска»

Разработанная нами система комплексной диагностики этих заболеваний позволила эффективно провести ДНК-диагностику в онкологическую практику.

Клинико-генетический анализ меланомы кожи.

Генетическая детерминация МК в определенной степени может определяться частотой поражения членов семьи. Изучено 460 больных МК, оценка семейной частоты этого заболевания (2,62±0,42%) в 4 раза превысила таковую “накопленную” заболеваемость (0,66%) в популяции, свидетельствуя о неслучайной сегрегации МК в семьях этих больных.

Анализ выявил особенности семейного проявления МК. Развитие МК у женщин наступает в более молодом возрасте (37,10±3,98) против общей выборки женщин (44,53±0,70) (р<0,05). Возраст проявления МК у мужчин (52,20± 5,26) превышает этот показатель общей выборки (44,65±1,09). Полученные данные о половых различиях возраста проявления МК указывают на существование различных критериев риска для мужчин и женщин и поддерживают идею генетической гетерогенности этого заболевания. Частота появление первично-множественных очагов МК - 0,22 во много раз выше аналогичной частоты несемейных форм (0,02) (р?0,01 при чІ=28,067). В 17% случаев ПММК развилась на фоне атипичных и ДН, против 2,6% для общей выборки больных. Частота накопления ДН у родственников больных с семейными формами (0,86), достоверно выше таковых, без семейных накоплений МК (0,41) (р?0,05 при чІ =3,87), а наличие меланоцитарных и ДН оказалось типичным, как для больных МК, так для здоровых родственников из семей с накоплениями МК.

Изучена степень внутриклассовой корреляции фенотипического сходства по возрасту начала заболевания семейных форм МК, данные представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Данные возраста манифестации заболевания МК в парах родственников, их средняя оценка и коэффициенты корреляции.

Полученные значения коэффициентов корреляции для пар: пробанды-родители 0,418, пробанды-дети 0,742, пробанды-сибсы 0,068 не показали достоверных различий по методу чІ, подтверждая гипотезу доминантного наследования семейных случаев МК. Следовательно, характерные для семейных форм МК такие признаки как, сегрегация этого заболевания, появление первично-множественных очагов опухоли, наличие ДН и атипичных меланоцитарных невусов и могут быть использованы в диагностике наследственных вариантов этого заболевания.

Оценивая степень участия меланоцитарных и ДН в развитии МК, были изучены три группы пациентов с большим количеством меланоцитарных невусов, изначально имеющих разный риск развития МК. Первая включала 29 человек, отобранных одномоментно среди 509 индивидов организованного населения г.Москвы. Вторую группу составили 70 человек, обратившихся в поликлинику РОНЦ с жалобами на наличие множественных пигментных невусов на коже. Третья группа, отобрана при осмотре 247 родственников 91 больного МК и составила 22 человека с большим количеством разнообразных невусов на коже туловища. ДН выявлены и подтверждены гистологически во всех трех изученных группах индивидов и у членов их семей. Полученные данные показали, что множественные меланоцитарные невусы, также как и ДН, имеют тенденцию накапливаться в семьях. Лица-носители множественных меланоцитарных и атипичных невусов имеют повышенный, хотя и разный риск развития МК, который значительно повышается при наличии в семье родственника пораженного МК. Об этом свидетельствует 0,8% обнаруженных нами новых случаев МК среди близких родственников больных МК, что в 3 раза превысило популяционную частоту (0,34%) этого заболевания. Из полученных данных следует, что ДН не всегда несут злокачественный потенциал и, по-видимому, существует ряд изменений в меланоцитарных невусах, часть из которых, на определенной биологической стадии меланоцитарных повреждений, способна трансформироваться в меланому и это является причиной того, что клинические и морфологические признаки атипичных (диспластических) невусов не всегда совпадают. Активный метод выявления МК у лиц с большим количеством меланоцитарных невусов является предпочтительным.

Свидетельством гетерогенности МК в пределах категории наследственных меланом стали моногенно наследуемые синдромы, компонентом которых является МК, выявленные в 3,9% случаев. Одни из них, характеризуются развитием опухолей разных локализаций, такие как синдром «семейного рака» (синдрома Линча II), синдром Li-Fraumeni. Другие, включают нейрокожные нарушения, так называемые нейрокристопатии, такие как нейрокожный меланоз, синдром базальноклеточного невуса, Реклингхаузена, Гарднера, изучение которых, даёт основание для предположения о существовании общей патогенетической основы семейной предрасположенности к меланоме, поражению нервной системы и дериватов кожи. К нейрокристопатиям относится и синдром диспластических невусов, который установлен в 1,1% от общей выборки больных МК.

Частота поражения разными неоплазиями членов семей больных МК составила 14%, превысив аналогичную частоту в популяции - 4,0% (р?0,01). Чтобы уяснить наличие или отсутствие закономерностей в развитии тех или иных форм опухолей, поражающих родственников больных МК, проведен анализ частоты разных неоплазий встречающихся в семьях: больных МК, лиц-носителей множественных невусов, больных раком желудка и здоровых лиц контрольной группы, данные приведены в таблице 5.

Как видно из таблицы родственники лиц-носителей множественных меланоцитарных невусов, наиболее часто поражаются МК (p<0,01), опухолью мозга (p<0,01), раком кожи (p<0,01) по сравнению с таковыми из группы здоровых индивидов. Сравнительный анализ частоты поражения неоплазиями членов семей больных МК с аналогичной частотой лиц носителей множественных невусов достоверных различий не выявил. Однако сравнение частоты поражения неоплазиями родственников этих двух групп с таковыми, поражающими родственников здоровых индивидов из контрольной группы, показало, что члены их семей статистически достоверно чаще поражаются МК, опухолями мозга и раком кожи. Следовательно, опухоли, которыми наиболее часто поражаются родственники из семей больных МК и лиц-носителей множественных невусов, имеют тенденцию к косегрегации МК, опухоли мозга и рака кожи, достоверно отличаясь от таковых, накапливающихся не только среди родственников здоровых лиц контрольной группы, но и в семьях больных раком желудка.

Таблица 5.

Частота различных форм опухолей в семьях исследуемых выборок

*Расчет частоты поражения проводился только на женщин.

Выявленная закономерность подтверждена посредством расчета оценок корреляций между установленными формами опухолей на основе частоты этих заболеваний: у родственников носителей меланоцитарных невусов, в популяции и лиц контрольной группы ( табл. 6).

Таблица 6. Оценки генетических корреляций между изучаемыми признаками на основе семейной выборки лиц-носителей меланоцитарных невусов

Оценки генетических корреляций: ДН-МК - 87%, ДН - опухоль мозга - 81% показали существование высокого генетического сходства между ДН, МК и опухолью мозга. Установленную в ходе исследования связь между опухолевой и предопухолевой патологией, у родственников из семей больных МК и у родственников лиц с множественными невусами, можно рассматривать как фактор формирующий повышенный риск развития вышеуказанных заболеваний, а появление этих заболеваний в семьях лиц-носителей множественных меланоцитарных невусов и МК, более закономерно, чем следует из традиционных клинических представлений. Возможность поражения этими злокачественными опухолями должна учитываться при определении риска в семьях больных МК и лиц с множественными невусами. . Цитогенетическое изучение частоты и характера распределения сайтов повышенной ломкости хромосом (СПЛХ), проведено у пациентов, условно распределенных на 4 группы: больные МК, больные МК и ДН, пациенты носители диспластических невусов, здоровые доноры (табл.7). Как видно из таблицы, наиболее высокая частота спонтанных аберраций наблюдается у пациентов с ДН. Средний процент аберрантных метафаз в группе «ДН» составил 6,69±0,8, в группе «меланома +ДН» -6,79 ±0,7, по сравнению с 2,43±0,6 у здоровых индивидов (Р?0,01). У 6 из 8 обследованных больных МК идентифицирован синдром ДН и для каждого из них зафиксирован повышенный уровень спонтанных аберраций. Полученные данные позволяют рассматривать синдром ДН как заболевание с хромосомной нестабильностью, что соответствует современным представлениям об этом синдроме.

Таблица 7.

Результаты цитогенетических исследований разных групп пациентов

У индивидов с МК, ДН и МК+ДН в трех участках короткого плеча хромосомы 1 -1р22,1р31,1р32 наблюдается общность в индивидуальном распределении разрывов и отличается от нормы с высокой достоверностью. Что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью ( рис.2).

Рис.2. Сайты повышенной ломкости хромосом, экспрессия которых увеличена у больных МК и или ДН по сравнению со здоровыми индивидами контрольной группы.

Поскольку эти изменения присутствуют у пациентов с ДН, локальная хромосомная нестабильность относится к ранним событиям предшествующих развитию МК.

Анализ потери гетерозиготности в районе локализации гена p16/CDKN2A по микросателлитным маркерам (D9S157, D9S161,D9S171,D9S169, D9S301) у 37 больных МК показал, что в 24% случаев больных МК наблюдается гемизиготность по различному набору используемых маркеров.

Изучение аномального метилирования промоторного района гена CDKN2A показало, что метилирование этой области ДНК гена CDKN2A определяется в 24,3% образцов МК. Причем гиперметилирование промоторного района гена CDKN2A выявлено у всех больных с первично-множественными злокачественными опухолями, включающими МК, позволяя предположить, что больные МК с аномальным метилированием гена CDKN2A имеют тенденцию к развитию полинеоплазии.

Структура генетически детерминированных форм МК включает: 1) семейные формы заболевания (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множественную МК (2,6%); 4) первично-множественные злокачественные опухоли в сочетании с МК (4,1%); 5) МК в составе наследственных синдромов (3,9%).

Как показали наши исследования, семейный анамнез позволяет установить, является ли МК изолированной патологией, одним из проявлений опухолевых поражений в семейном кластере или является интегральной частью опухолевого спектра наследственных синдромов, ассоциируясь с другими опухолями. Полученные в ходе исследования данные, явились основой для формирования групп риска среди семей больных МК, индивидуального прогнозирования развития заболевания для родственников больного в зависимости от формы МК и конкретной семейной ситуации. Показанием для включения пациента в группу риска, является: 1) МК у членов семьи (риск повышается при наличие более одного родственника больного МК); 2) наличие в семье первично...