Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

Материалы и методы исследования

1. Образцы пуповинной крови (ПК) 3964 доношенных новорожденных полученные при физиологических и оперативных родах, прошедшие тестирование и внесенные в реестр неродственных доноров в г. Москве за период с 2003 по 2010 год. Сведения об общем объеме проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Объем проведенных исследований

Поскольку ряд показателей оценивались ретроспективно по данным медицинской документации, то не во всех случаях количество данных, включенных в расчет, совпадает с количеством образцов ПК.

После пережатия и пересечения пуповины производили пункцию сосудов пуповины специальной закрытой системой для забора пуповинной крови фирмы Green Cross объемом 250 мл, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA. Сбор крови осуществляли в течение 2-15 минут после родов (менее 5 минут - 3345 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут - 345 случаев (8,7%) и более 10 минут - 274 (6,9%)), до отделения плаценты (n=3904 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (n=50 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 36 часов после процедуры сбора ПК.

Особенности течения беременности проанализированы у 1564 роженицы. Из 1564 обследованных рожениц - полностью здоровы - 248. Из 3964 новорожденных 2261 родились в результате первых родов, 1136 - вторых, 350 - третьих и 100 - роды четвертые и более (90 человек - 4-е роды, 14 человека - 5-е и 13 человека - 6-е). Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по порядковому номеру родов, не отличался. В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну. Вес плаценты проанализирован в 3299 случаях. Средний вес плаценты в группе составил - 580,57±4,92, диапазон: 77,0 г - 1138,0 г. Течение и осложнение родов прослежены у 1331 новорожденного. Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения: самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часов (от 20 минут до 19 часов 20 минут). Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 минут (от 10 минут до 1 часа 35 минут). Из 3964 образцов, для которых доступны данные относительно пола ребенка, мальчиков и девочек было 2069 (52,2%) и 1895 (47,8%), соответственно. Средняя масса при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25 г.; диапазон: 2270-5000 г.), чем у девочек (3467,23±18,17 г.; диапазон: 2300-4650 г.) (р<0,0001). Из 1564 новорожденных у 232 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (224 - зеленые воды и 8 - кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода, у 180 - во время беременности была диагностирована внутриутробная гипоксия плода, у 361 -отмечалось обвитие пуповины при рождении, у 109 - отмечалось внутриутробная задержка развития плода. Медиана гестационного возраста в группе без внутриутробной задержки развития составила 40 недель (диапазон - 33-42), а в группе с задержкой развития - 38 недель (диапазон - 37-41). Все новорожденные, у которых имеются сведения о степени зрелости плаценты на момент родов, были разделены на три группы по степени зрелости плаценты.

Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в асептических условиях, в «чистом» помещении класса D двумя методами: методом двойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью аппарата «Sepax S100», Biosafe, Switzerland (1986 и 1978 образца, соответственно). Все обработанные образцы были подвергнуты криоконсервации в роботизированном криокомплексе “BioArchive®”, ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый образец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от объема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата ПК под воздействием сверхнизких температур.

Степень разведения образцов ПК антикоагулянтом была различна и зависела от объема собранной крови. Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35,5 мл, объем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл. Пересчет результатов автоматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца для каждого показателя.

Подсчет клеток ПК производился двумя методами:

· все 3964 образцов ПК были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови ABX Pentra 60 C+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров;

· для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского).

Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100лейкоцитов).

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток определялось по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD4, CD8, CD13, CD14, CD16, CD19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «Becton Dickinson», США при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», США.

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определялась двумя методами:

1. культивирование в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1 х 10⁵ эксплантированных клеток

Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля - жидкая среда» в течение 7 суток с расчетом следующих показателей:

колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность - число колоний (малые-20-40 клеток, средние- 41-100 клеток и большие - более 100 клеток) и кластеров (малые - 5-9 клеток, большие - 10-19 клеток) на 1 х 10⁵ эксплантированных клеток.

эффективность клонирования (ЭК) - общее число колоний и кластеров на 1 х 10⁵ эксплантированных клеток

для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл крови, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

пролиферативный потенциал (ПП) - отношение числа колоний к кластерам в культуре.

Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов ПК. Исследование проводилось при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidium iodid (PI) и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin V FITC ("Phar Mingen"), согласно инструкциям производителей. Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan ("Becton Dickinson”, США). Обработку полученных данных производили при помощи программы WinMDI 2.8 for Windows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток ПК определяли как сумму PI⁺/Annexin V⁺ и PI^-/Annexin V⁺ клеток, а уровень некроза, как количество PI⁺/Annexin V^- клеток.

Исследование генетического полиморфизма HLA системы ПК. Были исследованы 2650 образцов пуповинной крови условно здоровых детей. Геномная ДНК выделялась из образцов ПК методом сепарации на магнитных частицах, который основан на способности магнитных частиц адсорбировать на своей поверхности высвобожденную из клеток ДНК с помощью специфических лиганд. Характеристики выделенной ДНК, её концентрацию и степень чистоты, измеряли с помощью спектрофотометра. Концентрация ДНК измерялась против чистого элюирующего раствора по оптической плотности OD_260/280 Образцы для исследования соответствовали предъявляемым стандартным требованиям: концентрация ДНК была > 50 нг/мкл, и А260/280 составляло 1,7-1,9. Генотипирование проводилось методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов. Считывание и интерпретация результатов проводилась с помощью сканирующего устройства и компьютерной программы PMP. Данным методом выявлялись HLA-специфичности по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей. Образцы, у которых были получены двойные интерпретации результатов, дополнительно типировались методом ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров. Регистрация сигналов электрофореграммы, фотографирование изображения и документирование их в электронном виде осуществлялось с помощью гельдокументирующей системы «ДиДжиДок» (США) и с использованием компьютерной программы UPV. Интерпретация результатов проводилась с помощью таблиц.

2. Образцы периферической крови 187 детей с диагнозом ОЛЛ и 146 детей с диагнозом ОМЛ (112 мальчиков и 75 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,3 лет ± 4,6) и 146 детей, больных ОМЛ (88 мальчиков и 58 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,9 лет ± 5,2). Все пациенты имели неблагоприятный прогноз и нуждались в дальнейшей трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

В зависимости от иммунологического варианта дети, больные ОЛЛ, были разделены на три группы: 1 группа В-ОЛЛ (98 пациентов); 2 группа Т-ОЛЛ (37 пациентов); 3-ю группу составляли дети, с не установленным иммунологическим вариантом (52 пациента). Дети, больные ОМЛ, были разделены в зависимости от цитоморфологической характеристики заболевания в соответствии с FAB классификацией на группы: М2 - 28 больных, М4 - 26 больных, М5 - 28 больных и М7 - 18 больных. Группы больных вариантами ОМЛ М0 (5 детей), ОМЛ М1 (5 детей) и М6 (4 ребенка), были малочисленными и потому не были включены в исследование. Помимо этого, была выделена группа с не установленным морфологическим вариантом (32 ребенка).

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. Для оценки полученных результатов и степени достоверности ассоциативных связей между генами системы HLA и изучаемыми заболеваниями в работе были использованы показатели: частота встречаемости гена (f), критерий Z c поправкой Йейтса на непрерывность, точный двусторонний критерий Фишера, если один из параметров был меньше 5, уровень достоверности (р). В случае, когда нулевая гипотеза отвергалась с вероятностью ошибки меньше, чем 5%, рассчитывался относительный риск RR и отношение шансов OR с доверительными интервалами 95% CI, если один из показателей был равен 0, относительный риск вычислялся по модифицированной формуле Haldane для малых чисел. В случаях, когда RR>2 (OR>2) вычислялась этиологическая/превентивная фракция. Статистический анализ исследования ассоциаций проводился с использованием двупольной таблицы при помощи программы «Open Epi» (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики пакета Excel Microsoft и программы «Biostat», «SISA» и «EpiMax Table Calculator». При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

Результаты исследования

В развитии клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного клеточного материала, применение которого при различных заболеваниях повысит регуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Особенности клеточного состава ПК новорожденных

Результаты исследования количества клеток и их основных параметров при помощи автоматического гематологического счетчика были проанализированы и представлены в таблице 2.

Таблица 2. Референтные значения клеточного состава ПК

Скрининг состава и характеристик клеток пуповинной крови, проводимый при помощи автоматических счетчиков клеток крови в работе банков ПК не вполне удовлетворителен, поскольку ПК имеет некоторые физиологические отличия от периферической крови взрослого человека, а большинство автоматических анализаторов крови откалиброваны под нормативы крови взрослого человека. Современные гематологические анализаторы являются специализированными автоматизированными приборами с компьютерной обработкой сигналов с неоспоримыми преимуществами (высокая производительность, возможность практически полной автоматизации, высокая информативность и точность) по сравнению с ручными методами. ПК характеризуется тем, что наряду со зрелыми элементами нейтрофильного ряда, содержит повышенное количество палочкоядерных нейтрофилов и более молодые формы - метамиелоциты и миелоциты.

При исследовании ПК окрашенные мазки оценивались с помощью световой микроскопии. Полученные результаты (средние величины по группе) затем сравнивались с величинами, полученными при исследовании тех же образцов пуповинной крови при помощи автоматического анализатора клеток крови. Отмечено, что при автоматическом анализе занижается процентное соотношение нейтрофилов, а лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов увеличивается. Все изменения были статистически достоверны (табл.3.).

Таблица 3. Различия клеточного состава ПК при подсчете клеток при помощи автоматического анализатора и светооптической микроскопии, в %

Прмечание. p<0,0001-степень достоверности отличий

Показано, что при большом содержании в ПК лейкоцитов увеличивается степень различий в определении в ПК базофилов (r=-0,44, p<0,0001), лимфоцитов (r=-0,25, p<0,0001), нейтрофилов (r=-0,22, p<0,0005). При большом содержании в ПК нормобластов увеличивается степень различий в определении в ПК базофилов (r=-0,36, p<0,0001), лимфоцитов (r=-0,4, p<0,0001), нейтрофилов (r=-0,27, p<0,0001). Полученные закономерности не зависели от сроков гестации, степени разведения образца ПК антикоагулянтом, времени, прошедшего после родов до начала сбора и обработки ПК.

Иммунологическая характеристика клеточного состава ПК (количество CD34⁺ клеток в ПК) определялась с помощью проточной цитометрии и оценивалась как 2 параметра: процент от общего количества лейкоцитов - 0,827+ 0,023 и абсолютное количество CD клеток - 0,100+0,003 в 1мл ПК.

Оценивалось количество CD34⁺CD133⁺ клеток, как наиболее ранних предшественников гемопоэза, количество CD133⁺ клеток и их субпопуляций CD133⁺CD31⁺ - эндотелиальные предшественники, CD133⁺CD106⁺ - мезенхимальные стволовые клетки, количество пролиферирующих гемопоэтических предшественников по уровню экспрессии трансферринового рецептора (CD71) в ПК и концентрате - достоверных различий не было выявлено, что говорит о качестве полученного концетрата стволовых клеток.

Количество колоний оценивалось на 10⁵ MNC и на 1 мл ПК. Также подсчитывался процент колоний каждого вида от их общего количества., было выявлено преобладание ранних ГСК- КОЕ-ГЕММ-35,3 % (рисунок 1.).

Рисунок 1. Распределение колониеобразующих единиц пуповинной крови.

Была выявлена статистически значимая положительная корреляционная взаимосвязь как между процентом CD34⁺ клеток в ПК и количеством КОЕ-mix в 1 мл образца (r=0,231; р=0,013), так же и абсолютным количеством CD34⁺ клеток в ПК и КОЕ-mix в 1 мл образца (r=0,3888; р=0,001), КОЕ-ГМ (r=0,4285; р=0,001), КОЕ-Г (r=0,2887; р=0,0018), КОЕ-М (r=0,3197; р=0,0005) и общим количеством КОЕ в мл образца (r=0,4187; р=0,001). Прямых корреляционных взаимосвязей между сроком гестации и количеством КОЕ не было выявлено.

Уровень некроза лейкоцитов ПК составил 3,49 ± 0,28 %, при этом, уровень некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2,99 ± 0,34 %) и статистически значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59 ± 0,72 % и 6,12 ± 0,65 % соответственно (р < 0,0001) (рис. 2.).

Рисунок 2. Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК

Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9,18 ± 1,19 %, при этом, уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, был также ниже значений в общей группе (4,32 ± 0,7 %), и также статистически значимо отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившего 15,35 ± 2,02 % и 28,22 ± 2,51 % соответственно (р < 0,0001).

Такое соотношение показателей позволяет предположить большую жизнеспособность лимфоцитов, что представляется позитивным результатом, учитывая тот факт, что популяция ГСК находится в пуле лимфоцитов. Это предположение подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью количества лимфоцитов и колониеобразующей активностью ПК (табл. 4.).

Таблица 4. Взаимосвязь количества лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК

При изучении взаимосвязи уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности клеток пуповинной крови и оказалось, что отмечается положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активностью пуповинной крови, что доказывает однонаправленность процессов апоптоза и пролиферации (табл. 5.).

Таблица 5. Взаимосвязь уровня апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК

При исследовании клеточного состава ПК в зависимости от пола было выявлено, что у девочек уровень лейкоцитов выше (17,74±0,24 х10⁹/л; М±m), чем у мальчиков (16,8±0,23 х10⁹/л; р=0,005), преимущественно за счет нейтрофилов, которых у девочек больше, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. В абсолютных количествах у девочек также больше нейтрофилов, а меньше эозинофилов (табл. 6.).

Таблица 6. Процентное соотношение клеток в лейкоцитарной формуле в зависимости от пола новорожденного( M+m)

Количество эритроцитов (4,33±0,02 х10¹²/л) и содержание гемоглобина (155,1±0,7 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02 х10¹²/л; 159,5±0,6 г/л; р<0,0001). Гематокрит у девочек (31,79±0,2 %) также меньше, чем у мальчиков (32,76±0,19 %; р=0). Различий в эритроцитарных индексах (MСV, MCH, MCHC, RDW) в зависимости от пола новорожденного не обнаружено. Количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98 х10⁹/л) больше, чем у мальчиков (300,72±2,62 х10⁹/л; р<0,0001). Средний размер тромбоцитов не имеет различий.

Было выявлено, что у мальчиков CD34⁺ клеток больше в процентном (0,88±0,03 - мальчики; 0,77±0,03 - девочки; р=0,01) и в абсолютном количестве (0,106±0,005 - мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002) (табл. 7.).

Таблица 7. Количество CD34⁺ клеток в пуповинной крови доношенных новорожденных мальчиков и девочек

При анализе данных колониеобразующей активности ПК выявлено, что у мальчиков статистически значимо большее количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК (745,71±65,11 - девочки; 1216,7±185,45 - мальчики; р=0,022), и имеется тенденция к увеличению (статистически незначимо) количества КОЕ-М (691,64±78,6 - девочки; 1052,1±252,09 - мальчики; р=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 - девочки; 6070,8±691 - мальчики; р=0,16) в 1 мл образца ПК. При анализе эффективности клонирования (на 10⁵ MNC) у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 - девочки; 22,42±1,6 - мальчики; р=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества КОЕ-mix (р=0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,13) и КОЕ-Эр (р=0,14).

Связь клеточного состава с массой тела новорожденного очень слабая: достоверная положительная корреляция с массой тела ребенка обнаружена для нейтрофилов (r=0,12; р=0,0002), эозинофилов (r=0,14; р=0,0001), базофилов (r=0,12; р=0,0002) и гематокрита (r=0,2; р<0,0001). Все новорожденные были разделены на группы согласно массе тела при рождении: ?2500 г; 2500-3000 г; 3000-4000 г и >4000 г. При сравнении полученных данных отмечено, что с увеличением массы тела ребенка при рождении увеличивается количество лейкоцитов - от 15,52±0,59 х10⁹/л в группе с массой тела 2,5-3 кг до 17,51±0,44 х10⁹/л в группе с массой тела >4 кг (р=0,01). Также увеличивается абсолютное количество нейтрофилов и эозинофилов (р<0,0001 и р=0,004, соответственно), а количество моноцитов уменьшается (р<0,0001). В процентном соотношении у детей с большей массой тела нейтрофилов и эозинофилов больше, а лимфоцитов и моноцитов меньше. Концентрация гемоглобина и количество эритроцитов не менялись в зависимости от массы тела ребенка при рождении. Отмечено увеличение гематокрита с увеличением массы тела ребенка (от 28,48±2,47% при массе тела ?2,5 кг до 33,86±0,39 % при массе тела >4 кг; р<0,0001). Отмечено также уменьшение MCHC (р<0,0001) и увеличение MPV (р=0,025) с увеличением веса ребенка. При проведении регрессионного анализа достоверных корреляционных взаимосвязей количества CD34⁺клеток и колониеобразующей активностью ПК и массы ребенка при рождении не получено. Наиболее статистически значимо увеличение среди KOE-mix (р=0,096).

Влияние технологического процесса на биологические свойства ПК

Известно несколько методов редукции объема ПК, но очевидны и некоторые их недостатки, например, длительный процесс центрифугирования, неудобный для производственного потока банков пуповинной крови и недостаточная надежность, сильно связанная с опытом и квалификацией оператора. Был разработан и внедрен в эксплуатацию принципиально новый клеточный сепаратор, адаптированный к клеточным суспензиям малого объема (Sepax, Biosafe S.A., Eysins/Nyon, Швейцария). Эта система состоит из компьютеризированной автоматизированной процедуры цитафереза, гарантирующей очень эффективную редукцию объема и маленькое количество эритроцитов в конечном продукте в функционально замкнутой системе. Конечный продукт собирается прямо в мешки для замораживания и может быть заморожен немедленно после добавления диметилсульфоксида (ДМСО). Однако, ряд факторов, влияющих на клеточный состав и характеристики клеток пуповинной крови, может выходить за стандартные рамки программирования процесса сепарации требовать использования метода двойного центрифугирования. Для этого сравнили эффективность метода автоматического выделения клеточного концентрата ПК при помощи технологии Sepax и метода двойного центрифугирования оператором с использованием гидрооксиэтилированного крахмала (HES) в условиях ситуаций, влияющих на клеточный состав ПК, равных для каждого из методов.

Проводимая для уменьшения объема ПК крови процедура лейкоконцентрации, основанная на седиментации эритроцитов раствором гидроксиэтилкрахмала, влияет на соотношение количества клеток ПК, так как, вероятно, степень потери различных субпопуляций лейкоцитов отличается. Полученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8. Клеточный состав ПК и концентрата (х 10⁹/л)

Показано, что при проведении процедуры концентрации ПК, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается (рис.3) за счет того, что доля моноцитов, эозинофилов и базофилов статистически значимо снижается (рис.4). Это, по-видимому, связано с большей потерей этих клеток при концентрации.

Рисунок 3. Доля нейтрофилов и лимфоцитов в пуповинной крови и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

Рисунок 4. Доля моноцитов, эозинофилов и базофилов в ПК и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

Абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов (CD3⁺клетки, CD19⁺клетки, CD3⁺CD4⁺клетки, CD3⁺CD8⁺клетки, CD16⁺CD56⁺клетки, HLA-DR⁺клетки) также повышается в процессе процедуры концентрации, но статистически незначимо. Степень повышения повторяет динамику лимфоцитов, определенную при помощи автоматического счетчика клеток крови.

Полученные данные позволили охарактеризовать состав лимфоцитов ПК и продемонстрировали отсутствие влияния процедуры концентрации ПК на количество и состав CD3⁺лимфоцитов в сочетании с достоверным увеличением после концентрации доли NK-клеток и CD33⁺CD13⁺клеток. Доля натуральных киллеров (NK) CD16⁺CD56⁺клеток среди ядросодержащих клеток пуповинной крови составила 5,97 ± 0,67% и статистически значимо увеличилась после процедуры концентрации - 8,54 ± 0,91% (р = 0,027). Такое соотношение связано с тем, что при проведении процедуры концентрации лейкоцитов ПК, происходит статистически незначительная потеря лейкоцитов вместе с седиментирующимися эритроцитами, за счет эозинофилов, базофилов и моноцитов и, следовательно, относительное количество NK-клеток и миелоидных предшественников возрастает. Количество CD3⁺лимфоцитов, опосредующих развитие РТПХ, в результате процедуры лейкоконцентрации практически не менялось и составило 17,9 ± 1,44% и 19,2 ± 1,4% от всех ядросодержащих клеток соответственно. Количество и соотношение субпопуляций CD3⁺лимфоцитов - CD3⁺CD4⁺клеток и CD3⁺CD8⁺клеток в процессе концентрации также не изменилось и составило до концентрации CD3⁺CD4⁺клетки - 12,62 ± 1,12%, CD3⁺CD8⁺клетки - 5,62 ± 0,53%; после концентрации CD3⁺CD4⁺клетки - 13,23 ± 1,12%, CD3⁺CD8⁺клетки - 5,52 ± 0,48% от всех ядросодержащих клеток. Относительное количество предшественников миелопоэза - D33⁺CD13⁺клеток составила 12,5 ± 0,76% и статистически значимо увеличилось 15,82 ± 0,81% (р=0,005) после процедуры выделения, что может быть связано с большей поте...