Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

Количество CD15⁺клеток имело тенденцию к снижению, по-видимому, вследствие большей потери при процедуре выделения по сравнению с остальными субпопуляциями лейкоцитов и составило 39,32 ± 3,45% до выделения и 35,23 ± 3,26% после.

Полученные данные имеют важное практическое значение при проведении планирования технологического процесса, так как показано, что при проведении процедуры концентрации ПК, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается за счет снижения доли моноцитов, эозинофилов и базофилов. Процедура лейкоконцентрации не влияет на количество CD3⁺клеток, в том числе CD3⁺CD4⁺клеток и CD3⁺CD8⁺клеток и активированных лимфоцитов - CD25⁺клеток.

В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля CD19+клеток и натуральных киллеров (NK) CD16⁺CD56⁺клеток. Процедура лейкоконцентрации не влияет на содержание CD34⁺клеток CD133⁺клеток и субпопуляций. Таким образом, результаты работы позволили получить референтные значения показателей состава лейкоцитов ПК, которые рекомендуется использовать в качестве факторов определяющих показания и противопоказания к сбору ПК для безвозмездного донорства ГСК.

При сравнении полученных результатов выявлено, что при аппаратном методе обработки пуповинной крови (МАВК) выделение лейкоцитов в целом меньше, чем при ручном (двойном центрифугировании) (72,4±0,45 - ручной; 70,28±0,51 - аппаратный; p=0,002). Однако выделение мононуклеаров и лимфоцитов значительно выше, чем при ручном методе (MNC: 70,11±0,49 - ручной; 77,94±0,53 - аппаратный; p<0,0001; лимфоциты: 71,7±0,54 - ручной; 80,73±0,58 - аппаратный; p<0,0001). Редукция же эритроцитов при аппаратном методе выделения значительно выше, чем при ручном (36,45±0,51 - ручной; 20,85±0,5 - аппаратный; p<0,0001).

Оптимизация исследования HLA-фенотипа пуповинной и периферической крови у пациентов при различных заболеваниях

Типирование пуповинной крови по HLA-системе имеет свои специфические особенности: быстрота обработки большого количества биоматериала при ограниченном количестве крови каждого образца и невозможности его повторного сбора. Поэтому использование чувствительных методов HLA-типирования, требующих для исследования минимального количества ДНК, является критическим фактором.

Впервые в России была апробирована и успешно внедрена технология обратной дот-блот гибридизации с олигонуклеотидными зондами (SSO) в автоматическом режиме на процессоре Dynal autoRELI™ 48 mk, позволяющая проводить скрининговое HLA-типирование большого количества образцов. Одним из несомненных достоинств этой технологии является ее большая пропускная способность и возможность использования минимального количества исследуемого материала - около 40 мкл ДНК (концентрация 13 - 15 мкг/мкл). Весь рабочий процесс осуществляется за 2,5 часа. Однако, основным недостатком данного метода является возникновение двойных интерпретаций результатов типирования. Особенно это касается локусов HLA-B и HLA-DRB (около 13% случаев по каждому из них). По локусу HLA-A было получено около 6% случаев с неоднозначной интерпретацией результатов, по локусу HLA-Cw - 8,5% случаев, по HLA-DQB1- 1,5%. Для разрешения неоднозначной интерпретации результатов типирования этих образцов проводилось повторное типирование с применением метода ПЦР с аллель-специфическими праймерами (SSP), что позволило достичь 100% однозначности результатов.

Для разрешения двойной интерпретации был использован метод типирования с помощью аллель-специфических праймеров (SSP). Интерпретация полученных данных осуществлялась с помощью таблиц, где определенная комбинация сигнальных полосок соответствовала определенной группе аллелей гена.

В настоящее время в реестре неродственных доноров хранится 3964 образца ГСК, типированные по пяти локусам системы HLA-A, -B, -Cw, -DRB, -DQB1. Были выявлены 17 специфических групп аллелей локуса HLA-A, 32 специфичности локуса HLA-B, 14 специфичностей локуса HLA-Cw, 14 специфичностей гена HLA-DRB1 и 5 специфичностей гена DQB1. Частота тех или иных генов гистосовместимости среди доноров стволовых клеток во многом зависит от этнических признаков входящих в неё лиц.

Анализ распределения HLA-специфичностей (специфических групп аллельных вариантов) у московской популяции определил, что наиболее часто встречаемыми по локусам класса I являются (в долях): HLA-A*02 (0,288), A*03 (0,134), A*01 (0,114), A*24 (0,096); HLA-B - B*07 (0,120), B*35 (0,0793), B*44 (0,101), B*18 (0,084), B*08 (0,067), B*13 (0,066); Cw*07 (0,257), Cw*12 (0,134), Cw*06 (0,130), Cw*04 (0,0128).

По классу II c наибольшей частотой встречаются следующие группы аллелей гена DRB1 - *07 (0,143), *13 (0,139), *15 (0,133), *11 (0,130), *01 (0,110), *04 (0,110) и группы аллелей гена DQB1 - *03 (0,330), *06 (0,222). Наиболее редко встречающимися группами аллелей были выявлены следующие: A* 69 (0,0033), A*34 (0,00035), A*80 (0,00035), B*47 (0,0036), B* 45 (0,002), B*46 (0,002), B*53 (0,0017), B* 73 (0,0015), B*54 (0,0003) и B*78 (0,0003).

Проведенные исследования и анализ литературных данных (Зарецкая Ю.М., 2008) свидетельствуют, что характер распределения генных частот HLA класса I и II в популяции московского региона в целом соответствуют таковому для европеоидов.

Характер распределения частоты встречаемости генов HLA-системы у детей с ОЛЛ.

Были обследованы 187 детей с ОЛЛ из различных регионов России. Для изучения характера распределения генов HLA-системы пациенты, больные ОЛЛ, были разделены в зависимости от их иммунологического варианта на 2 группы: на В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ. Была исследована группа из 98 детей с В-ОЛЛ (57 мальчиков и 41 девочка) (средний возраст составил 8,2 лет ± 4,8). Особенности характера распределения генов гистосовместимости в этой группе больных по сравнению с контрольной группой здоровых детей представлены на рис. 5 и в таблице 9.

Рисунок 5. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных В-ОЛЛ.

Частота встречаемости генов HLA-системы была высокой в группе больных В-ОЛЛ по сравнению со здоровыми детьми по локусу HLA-A - A*32; по локусу HLA-B - B*15, B*50; В*47 по локусу HLA-C - Cw*04; Сw*16 по локусу HLA-DRB - DRB1*09 и DRB1*14.

Для изучения факторов риска развития заболевания использовали метод случай-контроль. Если этот показатель превышал OR > 2, то он считался значимым (Зарецкая Ю.М., 1983). При разделении пациентов по полу были выявлены особенности распределения в частоте встречаемости HLA-специфичностей с этим заболеванием (рис. 6). В контрольной группе различий по полу выявлено не было.



Рисунок 6. Частота встречаемости HLA-специфичностей у мальчиков и девочек В-ОЛЛ.

Таблица 9. Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию В - ОЛЛ у детей.

HLA- специфичности	Дети (мальчики и девочки) n=98	Мальчики n=57	Девочки n=41
	p	OR	CI	EF/ PF,%	p	OR	CI	EF/ PF,%	p	OR	CI	EF/ PF,%
A*32	0,04	2,1	1,19 4,71	5,7	-	-	-	-	0,03	2,9	1,21 7,03	10,2
B*15	0,002	2,3	1,38 3,78	11,80	-	-	-	-	0,02	2,6	1,20 5,05	13,8
B*50	0,03	2,6	1,16 6,02	4,3	0,03	3,3	1,26 8,66	6,2	-	-	-	-
B*47	-	-	-	-	-	-	-	-	0,009	10,9	2,96 40,37	6,8
Cw*04	0,007	1,9	1,21 3.05	17,4	0,05	1,95	1,06 3,58	18,3	0,02	2,56	1,18 5,51	27,1
Cw*16	-	-	-	-	0,016	3,7	1.40 9,65	8.1	-	-	-	-
DRB1*03	-	-	-	-	0,037	0,3 In:3,4	0,10 0,97	11,0	0,04	2,2	1,11 4,30	15,5
DRB1*09	0,0011	3,5	1,68 7,54	6,3	3,3	3.3	1,27 8,74	6,4	0.05	4,0	1.35 11,65	7,5
DRB1*14	0,002	3,1	1,54 6,33	6,6	1,95	5,1	2,35 10,73	13,0	-	-	-	-

n - количество больных детей; р - уровень достоверности;

OR (odds ratio) - отношение шансов; In - инвертированный показатель (1/OR)

CI (confidence interval) - доверительный интервал; EF/PF - этиологическая /превентивная фракция

Были исследованы 37 детей больных Т-ОЛЛ (25 мальчиков и 12 девочек) (средний возраст составил 10,1 лет ± 4,9). Отличительные особенности характера распределения HLA-генов в этой группе по сравнению со здоровыми детьми представлены на рис.7 и табл. 10.

Рисунок 7.Частота встречаемости специфичностей HLA у детей больных Т-ОЛЛ

Таблица 10. Иммуногенетические факторы предрасположенности к развитию T-линейного ОЛЛ у детей

HLA-специфичности	Дети (мальчики и девочки), n=37	Мальчики, n=25
	p	OR	CI	EF,%	p	OR	CI	EF,%
A*26	-	-	-	-	0,006	3,7	1,53 9,04	20,0
B*14	0,05	3,0	1,15 7,92	9,5	-	-	-	-
DRB1*01	0,0035	2,2	1,10 4,22	19,8	-	-	-	-
DRB1*13	0,002	2,35	1,21 4,51	25,5	0,03	2,55	1,14 5,54	29,0
DQB1*05	0,002	2,45	1,19 5,04	34,5	-	-	-	-

р - уровень достоверности; OR (odds ratio) - отношение шансов, CI (confidence interval) - доверительный интервал, EF- этиологическая фракция

Общая группа (все ОЛЛ) была представлена 187 детьми (112 мальчиков и 75 девочек) (средний возраст составляла 8,0 лет ±). При анализе полученных данных были выявлены отклонения в распределении частоты встречаемости HLA-специфичностей В*50, Cw*04, DRB1*09, DRB1*14 по сравнению с контрольной группой здоровых детей (табл. 11).

Таким образом, можно заключить, что варианты В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ имеют разные иммуногенетические маркеры предрасположенности и устойчивости к данным заболеваниям. Более того, выявленные маркеры имеют разную силу ассоциации с заболеванием в зависимости от пола ребенка. Обнаружено, что у мальчиков и у девочек имеются свои специфические маркеры к разным иммунофенотипическим вариантам ОЛЛ.

Таблица 11. Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию ОЛЛ у детей, (общая группа, n=187)

HLA- специфичности	Маркеры предрасположенности	Маркеры устойчивости
	р	CI	OR	CI	EF,%	р	CI	OR	CI	PF,%
B*37	0,017	1,27 4,15	2,7	1,26 5,77	2,7	-	-	-	-	-
B*50	0,012	1,26 3,57	2,4	1,25 4,65	3,4	-	-	-	-	-
B*58	0,003	1,17 3,86	2,4	1,15 5,18	2,6	-	-	-	-	-
Cw*04	0,05	1,05 1,97	1,5	1,05 2,13	-	-	-	-	-	-
DRB1*09	0,01	1,25 3,37	2,4	1,25 4,45	3,3	-	-	-	-	-
DRB1*14	0,002	1,39 3,35	2,5	1,42 4,41	4,5	-	-	-	-	-
В*13	-	-	-	-	-	0.03	0.31 0.93	0.50 I:2.0	0.29 0.91	5.6
DQB1*02	-	-	-	-	-	0.007	0.47 0.88	0.6 In:1.6	0.44 0.87	13.8

p - уровень достоверности; OR- отношение шансов, CI- доверительный интервал;

EF/PF - этиологическая /превентивная фракция

Характер распределения частот встречаемости генов HLA- системы у детей с ОМЛ.

Были исследованы 146 детей, больных ОМЛ, (средний возраст составил 8,9 лет ± 5,2), по этническим признакам относящиеся к популяции европеоидов и разделенные на группы: ОМЛ М2 (28 детей), ОМЛ М4 (26 детей), ОМЛ М5 (28 детей) и ОМЛ М7 (18 детей). Дети с М0, М1и М6 вариантами в исследование не были включены из-за их малочисленности (всего 14 детей). Исследования по выявлению HLA-ассоциированных генов с вариантом промиелоцитарного лейкоза (М3) не проводились, так как типирование антигенов гистосовместимости у них не осуществлялось. У 32 детей больных ОМЛ морфологические варианты не были выявлены. Из-за малочисленности группы больных ОМЛ статистическая обработка результатов HLA-типирования в зависимости от пола не проводилась.

В результате проведенных исследований (рис. 8-11) у больных детей с ОМЛ были обнаружены достоверные отклонения от нормального распределения HLA-генов.

Рисунок 8 Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М-2.



Рисунок 9. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М-4.

Рисунок 10. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М5.

Рисунок 11. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М7.

Таким образом, можно заключить, что различные морфологические варианты ОМЛ имеют многообразные иммуногенетические маркеры предрасположенности и устойчивости к этому заболеванию.

С целью выявления «общего маркера» для миелобастного лейкоза была исследована общая группа всех больных детей (146 пациентов) с ОМЛ, независимо от варианта, а также пола и возраста ребенка (табл. 12). Из них было 88 мальчиков и 58 девочек. Был обнаружен целый ряд аллелей HLA-генов с достоверно аномальным их распределением у детей, больных ОМЛ, по сравнению с контрольной группой у здоровых детей. Это специфичности относящиеся, как к классу I - A*24, A*68, C*05, Cw*07, так и к классу II - DRB1*11, DRB1*07, DQB1*02.

Таблица 12. Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию ОМЛ у детей (n=146).

HLA-специфичности	Маркеры риска	Маркеры устойчивости
	р	OR	CI	EF,%	р	OR	CI	PF,%
A*24	0,02	1,820	1,08-2,41	-	-	-	-	-
A*68	0,04	1,8	1,06-3,06	-	-	-	-	-
Cw*05	0,05	2,2	1,257-4,089	7,8	-	-	-	-
Cw*07	0,0001	2,1	1,45-3,22	35,5	-	-	-	-
DRB1*11	0,05	1,5	1,02-2,08	-	-	-	-	-
DRB1*07	-	-	-	-	0,001	0,6-In:1,7	0,36-0,88	11,0
DRQB1*02	-	-	-	-	0,03	0,6 In:1,7	0,41-0,93	15,0

p - уровень достоверности; OR (odds ratio) - отношение шансов; CI (confidence interval) - доверительный интервал, EF/PF - этиологическая /превентивная фракция

Следовательно, специфичности Cw*05 и HLA-Cw*07 являются маркерами риска развития ОМЛ у детей, а HLA-DRB1*07 - маркером устойчивости к этому заболеванию у детей. Причем специфичность Сw*07 имеет высокой силы ассоциацию и предрасположенность к заболеванию ОМЛ у детей.

Таким образом, примененная стратегия для HLA-типировании образцов пуповинной крови двумя методами - SSO и SSP- позволяет получать достоверные и однозначные результаты. Проведенный анализ результатов исследований выявил характерный профиль распределения специфических аллелей системы HLA у населения московского региона, соответствующий европеоидам. Результаты сопоставления группы сравнения (здоровое население) и основной группы (дети, больные острыми лейкозами) показали, что полученные данные могут быть использованы при изучении различных заболеваний, ассоциированных с HLA-системой и в популяционных исследованиях.

Научно-обоснованный алгоритм банкирования пуповинной крови с применением высокотехнологичных и молекулярно генетических методов для трансплантаций в восстановительной медицине

Для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины - банки ПК, имеющие регистр неродственных доноров, должны быть инспектированы и аккредитированы в соответствующих органах контроля. Необходима ясная политика в отношении селекции доноров ПК, скрининга материала и его тестирования. Трансплантационные центры должны предоставлять полную информацию о проведенной процедуре трансплантации, анализ которой позволит гарантировать безопасность и эффективность материала.

В соответствии со стандартами GMP (Good manufacture practice - надлежащая производственная практика) скрининг здоровья матерей, получение добровольного информированного согласия матери; сбор и транспортировка ПК; обработка, криозамораживание, хранение и мониторинг образцов ПК; маркировка и этикетирование на всех этапах работы; тестирование на стерильность, иммуногенетику, правила извещения в случае обнаружения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций в соответствии с законодательством; критерии изъятия из криохранилища и выдачи образцов ПК, включая некондиционные образцы, а также правила транспортировки в трансплантационные центры; управление контролем качества, включая правила действия при обнаружении нарушений; управление информационными ресурсами, включая критерии поиска, сравнения показателей донора и потенциального реципиента и отбора образцов пуповинной крови для трансплантаций; процедуры получения и анализа результатов проведенных трансплантаций; документация по обучению персонала и поддержанию уровня его квалификации; управление ресурсами оборудования, включая поставки расходных материалов, сервисное обслуживание, санитарную обработку, утилизацию и дезинфекцию, действия в аварийных и непредвиденных ситуациях является минимально необходимым набором технологических инструкций, используемых при банкировании ПК.

С 2003 г. по 2010 г. в ГУЗ « БСК ДЗМ» было обработано 7010 единиц ПК, заложено на хранение 3964 единиц. За период с 2008г. по май 2010 г. для проведения трансплантации ГУЗ «БСК ДЗМ» было выдано 59 единицы пуповинной крови, что составило 1,5 % от всех образцов находящихся на хранении. Этот показатель ниже, чем сообщается в международных исследованиях. Одной из причин столь низкого процента выданных банком (ГУЗ «БСК ДЗМ») образцов ПК является низкая трансплантационная активность в России, что связано как с недостаточным количеством специализированных клиник, так и низким числом ежегодно производимых трансплантаций.

На этапе HLA-типирования возникает ряд сложностей, связанных с организацией этого процесса на большом массиве биоматериала и ограниченным объемом крови каждого образца. В настоящей работе была представлена оптимальная модель для разрешения этой проблемы.

Качество и эффективность производимой продукции является одним из важнейших факторов успешного банкирования и строится на основе принципа 100 % контроля материала и системном подходе к технологическому процессу.

Таким образом, внедрение результатов проведенного исследования позволило создать научно-обоснованный алгоритм банкирования пуповинной крови и оптимизировать высокотехнологичные методы подготовки эффективного качественного трансплантационного материала для использования целях трансплантации и повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных механизмов организма.

Проведенная оценка эффективности процедуры лейкоконцентрации при различных особенностях течения беременности родов и технологических этапов сбора ПК позволила выработать алгоритм отбора образцов ПК для проведения процедуры автоматической концентрации или выделения ГСК методом двойного центрифугирования.

На основании результатов исследования клеточного состава ПК при помощи автоматического анализатора клеток крови и микроскопии окрашенных мазков, получены его референтные значения и степень расхождения значений, что позволило оптимизировать методику расчетов клеточности. Для оценки эффективности лейкоконцентрата ГСК ПК необходимо проводить определение уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в ПК, общего количества, жизнеспособности и эффективности КОЕ.

Таким образом, анализ результатов проведенного исследования позволил разработать и внедрить научно-обоснованный алгоритм оптимизации процесса банкирования пуповинной крови с применением высокотехнологичных и молекулярно-генетических методов для получения эффективного и безопасного клеточного материала для трансплантаций в восстановительной медицине.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан и внедрен научно-организационный алгоритм банкирования пуповинной крови, позволяющий обосновано применять системный подход к высокотехнологичным методам сбора, оценки, тестирования, хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и получать эффективный и безопасный материал для неродственных трансплантаций в восстановительной медицине.

2. Определены факторы, оказывающие влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, такие, анте- и интранатальные как особенности течения беременности, родов, антропометрические данных, пола новорожденного и срока гестации, различные состояния острой и хронической гипоксии плода.

3. Показано, что применение автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии позволяет получить независимо друг от друга и взаимно дополнить референтные значения клеточного состава пуповинной крови; а определение уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте характеризует эффективность материала гемопоэтических стволовых клеток.

4. Установлено, что в результате технологической обработки пуповинной крови характеристики клеточного концентрата соответствуют показателям цельной пуповинной крови по соотношению основных субпопуляций лейкоцитов. Концентрат пуповинной крови, полученный методом двойного центрифугирования, содержит больше гранулоцитов (нейтрофилов, эозинофилов и базофилов), тогда как концентрат, полученный методом автоматического выделения клеток, содержит больше мононуклеарных клеток (лимфоцитов и моноцитов). Колониеобразующая активность пуповинной крови после проведения лейкоконцентрации не изменяется при использовании обоих исследованных методов.

5. Впервые на большом количестве материала оптимизированы процессы проведения и оценки результатов HLA-типирования образцов пуповинной и периферической крови при различных заболеваниях, представленные двумя молекулярными методами, такими как SSO и SSP, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.

6. Впервые на большом количестве материала полученны данные генетического полиморфизма антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона.

7. Наиболее часто встречаемыми по локусам класса I специфичности у населения московского региона являются: HLA-A*02 (0,288), A*03 (0,134), A*01 (0,114), A*24 (0,096); B*07 (0,120), B*35 (0,0793), B*44 (0,101), B*18 (0,084), B*08 (0,067), B*13 (0,066); Cw*07 (0,257), Cw*12 (0,134), Cw*06 (0,130), Cw*04 (0,0128). По классу II наибольшая частота встречаемости специфичности HLA-DRB1*07 (0,143), DRB1* 13 (0,139), DRB1*15 (0,133), DRB1*11 (0,130), DRB1*01 (0,110), DRB1*04 (0,110); DQB1*03 (0,330), DQB1*06 (0,222).

8. Наиболее редко встречающимися аллелями специфичности у населения московского региона были выявлены следующие: A* 69 (0,0033), A*34 (0,00035), A*80 (0,00035), B*47 (0,0036), B*45 (0,002), B*46 (0,002), B*53 (0,0017), B* 73 (0,0015), B*54 (0,0003), B*78 (0,0003).

9. Общими маркерами предрасположенности к развитию В-ОЛЛ у детей являются HLA специфичности HLA-Cw*04, DRB1*14 и DRB1*09; к развитию T-ОЛЛ являются HLA специфичности HLA-DRB1*01, DRB1*13 и DQB1*05. Общими маркерами предрасположенности к развитию заболевания ОМЛ у детей являются HLA специфичности Cw*05 и Cw*07.

10. Характерными маркерами предрасположенности к развитию В-ОЛЛ у мальчиков является HLA специфичности В*50, Сw*16, RB1*14; у девочек являются HLA специфичности А*32, В*15, В*47 DRB1*03. Характерным маркером предрасположенности к развитию Т-ОЛЛ у мальчиков является специфичность A*26 и DRB1*13.

11. Характерными маркерами предрасположенности к развитию ОМЛ-М2 являются HLA специфичности А*24, Cw*07 и В*51; к развитию ОМЛ-М4 является HLA специфичности А*25, В*07, DRB1*12, Cw*05 и DQB1*06; к развитию ОМЛ-М5 является HLA специфичности А*68, DRB1*07 и DQB1*06; к развитию ОМЛ-М7 является HLA специфичности В*39, В*49, Cw*07 и DRB1*11.

12. Разработаны рекомендации системного подхода к банкированию пуповинной крови в восстановительной медицине, позволяющие подготовить трансплантационный материал, содержащий гемопоэтические стволовые клетки, применение которого при различных заболеваниях позволит повысить компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Практические рекомендации

1. Разработанный алгоритм банкирования пуповинной крови: сбор, оценка, тестирование, хранение гемопоэтических стволовых клеток для неродственных трансплантаций в восстановительной медицине рекомендуется использовать в профильных медицинских учреждениях России.

2. Определенные анте- и интранатальные факторы, влияющие на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток следует учитывать при выборе метода обработки пуповинной крови.

3. Полученные референтные значения клеточного состава пуповинной крови, количества CD34⁺клеток и клеток предшественников гемопоэза пуповинной крови и их динамику, в зависимости от способа обработки, рекомендуется учитывать в качестве группы сравнения и использовать в профильных медицинских учреждениях России.

4. Оптимизированную стратегию использования молекулярно-генетических методов HLA-типирования рекомендуется применять при организации банкирования пуповинной крови для неродственных трансплантаций в восстановительной медицине.

5. Результаты HLA-типирования рекомендуется использовать в качестве дополнительных критериев при диагностике различных заболеваний в профильных медицинских учреждениях.

6. Полученные данные частоты распределения аллельных специфичностей системы HLA у здорового населения московского региона рекомендуется использовать в качестве группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и в популяционных исследованиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Майорова О.А., Яковлева М.В., Румянцев С.А., Подколзина Э.А., Сухин Г.М., Спиридонова Е.И., Лебедева Л.Л. Организационные принципы создания и функционирования банков пуповинной крови (по стандартам NetCord и FAHCT). Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005,т.4, №2, стр.92-97.

2. Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А., Румянцев А.Г Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. монография Москва, «Медпрактика-М», 2005, 391 с (глава)

3. Боякова Е.В., Румянцев С.А., Сухин Г.М., Плясунова С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Абдуллаев Р.Т., Яковлева М.В., Майорова О.А., Субпопуляции лимфоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных, Матер. Российского Съезда гематологов и трансфузиологов (апрель 2006)// Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 134;

4. Подколзина Э.А., Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Факторы, влияющие на эффективность выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови, Матер. Российского Съезда гематологов и трансфузиологов (апрель 2006)// Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 134;

5. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Клеточный состав пуповинной крови у доношенных новорожденных. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2006, т. 5, №2, стр.23-29.

6. Абдуллаев Р.Т., Румянцев С.А., Сухин Г.М., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и CD34+ клеток пуповинной крови, периферической крови и костного мозга. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 133;

7. Плясунова С.А., Румянцев С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Зависимость клеточного состава пуповинной крови от пола и веса новорожденных. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 114;

8. Плясунова С.А., Румянцев С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Сравнительный анализ определения клеточного состава пуповинной крови при помощи микроскопии и автоматического счетчика. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9, Suppl 3, стр. 136;

9. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от осложнений беременности и родов. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9, Suppl 3, стр. 116;

10. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от гипоксии во время беременности и родов. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 115;

11. Подколзина Э.А., Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Факторы, влияющие на эффективность выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 137;

12. Подколзина Э.А., Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. Сравнение эффективности процедуры выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови ручным и аппаратным методом. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 136;

13. Podkolzina E.A., Karpova E.E., Spiridonova E.I., Boyakova E.V., Shutyeva A.B., Yakovleva M.V., Mayorova O.A., Roumiantsev S.A. Effect of pregnancy and intranatal factors on stem cell count in cord blood leukokoncentrat unit. Stem cell therapy meeting, Regensburg, Germany, 2007, p. 96.

14. Podkolzina E.A., Karpova E.E., Spiridonova E.I., Boyakova E.V., Shutyeva A.B., Yakovleva M.V., Mayorova O.A., Roumiantsev S.A. Comparison of cord blood volume reduction methods efficacy. Stem cell therapy meeting, Regensburg, Germany, 2007, p. 102.

15. Боякова Е.В., Румянцев С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Райкина Е.В., Яковлева М.В., Майорова О.А. CD34+ и CD133+ клетки пуповинной крови доношенных новорожденных. Материалы III Всероссийского симпозиума «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» Москва, 25-26 апреля 2007, стр. 12.

16. Майорова О. А., Яковлева М. В., Румянцев С. А.Проблемы трансплантации пуповинной крови Российский медицинский форум 2007, стр 152

17. Боякова Е.В., Румянцев С.А., Сухин Г.М., Плясунова С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Абдуллаев Р.Т., Яковлева М.В., Майорова О.А., Субпопуляции лимфоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9, Suppl 3, стр. 134;

18. Осипова Е.Ю., Никитина В.А., Астрелина Т.А., Устюгов А.Ю., Пурбуева Б.Б., Скоробогатова Е.В., Дышлева З.М., Румянцев С.А., Яковлева М.В., Майорова О.А., Катосова Л.Д., Бочков Н.П. Динамика скорости роста, иммунофенотипа и генетическая стабильность мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека на ранних и поздних пассажах при культивировании ex vivo. Онкогематология, 2009, №1, стр. 44-50.

19. Osipova E., Astrelina T., Purbueva B., Ystiugov A., Skorobogatova E., Dishleva Z., Roumiantsev S., Yakovleva M., Mayorova O. Immunophenotype of human bone marrow MSCs on early and late passages during ex vivo expansion. 35st Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation 25st Meeting of the Nurses Group 8th Meeting of the EBMT Data Management Group, Gцteborg, Sweden, March 28-April 1, 2009, P-422

20. Osipova E.U., Astrelina T.A., Purbueva B.B., Skorobogatova E.V., Dishlevaya Z.M., Roumiantsev S.A., Mayorova O.A., Ustyugov A.Y., Yakovleva M.V. «Dynamics of immunphenotype of human bone marrow MSCs on early and late passages during ex vivo expansion.» 35th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, 2009, P.265.

21. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Ставцев Д.С., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Иммуногенетические факторы предрасположенности и резистентности к острому лимфобластному лейкозу у детей. Сборник материалов XIV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 478, стр. 480.

22. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Ставцев Д.С., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Ассоциации антигенов HLA системы с хроническим миелолейкозом у детей. Сборник материалов XIV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 479, стр. 481.

23. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Ставцев Д.С., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Взаимосвязь антигенов HLA системы с различными морфологическими вариантами острого миелоидного лейкоза у детей. Сборник материалов XIV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 480, стр. 482.

24. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Качанов Д.Ю., Паина О.В., Скоробогатова Е.В., Дышлевая З.М., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева О.В., Яковлева М.В. Опыт трансплантации пуповинной крови банка стволовых клеток Москвы. Сборник материалов XIV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 656, стр. 658.

25. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T., Yakovleva M.V. Estabilishment of typing strategy in Moscow Stem Cell Bank., Book of Abstracts & Scietific Program. 5th East-West Immunogenetics Conferece, 4-5 March, 2010, Pilsen, Czech Republic, p 29.

26. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T., Yakovleva M.V. Study on the corelation between of HLA genes and chronic myeloid leukemia in children. // 24 th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (EFI) and 17th Annual Meetting of the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation (AIBT), Tissue Antigenes, 2010, 75(№5), р.636, P360.

27. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T., Yakovleva M.V. Immunogenetic factors of predisposition in acute lymphoblastic leukemia. // 24 th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (EFI) and 17th Annual Meetting of the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation (AIBT), Tissue Antigenes, 2010, 75(№5), р.636, P361.

28. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T. Yakovleva M.V. Communication of HLA assotiation genes in chronic children with acute myeloid leukemia. // 24 th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (EFI) and 17th Annual Meetting of the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation (AIBT), Tissue Antigenes, 2010, 75(№5), р.636, P359.

29. Shamanskaya T., Astrelina T., Kachanov D, Paina O., Skorobogatova E., Dishleva Z., Podkolzina., Karpova E., Lebedeva L., Yakovleva M. Moscow Stem Cell Bank; experience of transplantation cord blood. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th Meeting of the EBMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , Vienna, Austria, March 21-24, 2010, P-583, S154

30. Osipova E., Nikitina V., Astrelina T., Skorobogatova E., Dishlevaya Z., Roumiantsev S., Yakovleva M. Сytogenetic analysis and stability of human bone marrow MSCs during ex vivo expansion. . Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th Meeting of the EBMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , Vienna, Austria, March 21-24, 2010, P-904, S279

31. Lebedeva L.L., Potapova T. N., Puhlikova T.V., Stavtsev D.S., Skorobogatova E.V., Astrelina T.A., Yakovleva M.V. Nature of HLA-associated factors of predisposition and resistency in acute lymphoblastic leukemia. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th Meeting of the EBMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , Vienna, Austria, March 21-24, 2010, P-409,S85

32. Tatarinova O.,Osipova E., Dishlevaya Z., Astrelina T., Skorobogatova E., Roumiantsev S., Yakovleva M. Effect of allogenic bone marrow mesenchymal stem cells on the chemosensitivity of leukemia cells to antileukemic drugs in vitro. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th Meeting of the EBMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , Vienna, Austria, March 21-24, 2010, P-1327, S413

33. Puchlikova T., LebedevaL., Potapova T., Roslavtseva E., Astrelina T., Yakovleva M.V. Genetic factors in development of children coeliac diseases. 26th International Pediatric Association Congress of Pediatrics (IPA) 2010, South Africa, 4-9 August 2010, abstract &P.673.

34. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Стратегия HLA-типирования в Московском банке стволовых клеток. III научно- практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» 13-14 мая 2010, Москва, Научное издание - тезисы докладов, стр 19-20.

35. Осипова Е.Ю., Шаманская Т.В., Пурбуева Б.Б., Никитина М.А., Румянцев С.А., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Биологические свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека при экспансии ex vivo для клинического применения. III научно- практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» 13-14 мая 2010, Москва, Научное издание - тезисы докладов, стр 17-18.

36. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.Л., Скоробогатова Е.В., Паина О.В., Яковлева М.В. Использование пуповинной крови при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей (опыт работы Московского банка стволовых клеток). Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2010.-т.5.- №2.- стр.1-7.

37. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.Л., Скоробогатова Е.В., Паина О.В., Яковлева М.В. Использование альтернативных источников при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей.

38. Е.В.Боякова, В.В.Калинина, О.В.Козлитина, Т.А.Астрелина., К.Л.Кондратчик, М.В.Яковлева Особенности иммунофенотипа при остром мегакариобластном лейкозе у детей.

39. Круглова Я.А., Кашпор С.А., Калинина В.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Диагностика заболеваний лимфатической и кроветворной системы: морфология, цитохимия, иммуногистохимия.

40. Карпова Е.Э., Подколзина Э.А., Шаманская Т.В., Сергеев А.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Заготовка, вирусная и бактериальная безопасность концентратов пуповинной крови, содержащих гемопоэтические стволовые клетки, причины осложнений.

41. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Иммуногенетические маркеры предрасположенности к острым лейкозам у детей.

42. Осипова Е.Ю., Шаманская Т.В., Пурбуева Б.Б., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Биологические свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека при культивировании ex vivo в различных питательных средах.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BAS - (basophile) количество базофилов крови (х10⁹/л)

CD - (clasters of differentiations) кластер дифференцировки

EOS - (eosinophile) количество эозинофилов крови (х10⁹/л)

HCT (hematocrit) гематокрит

HES 200 - 6% гидроксиэтилкрахмал с молекулярной массой 200 000 дальтон

HGB (hemoglobin) концентрация гемоглобина (г/л)

HLA - человеческие лейкоцитарные антигены (Human leukocyte antigen)

LYM - (lymphocyte) количество лимфоцитов крови (х10⁹/л)

MCH (mean corpuscular hemoglobin) среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (пг)

MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (г/л)

MCV (mean corpuscular volume) средний объем эритроцитов (фл/фемтолитры)

MON (monocytes) количество моноцитов (х10⁹/л; %)

MON - (monocyte) количество моноцитов крови (х10⁹/л)

MPV (mean platelet volume) средний объем тромбоцитов (фл/фемтолитры)

NEU - (neutrophile) нейтрофилы

NRBC (nuclear red blood cell) нормобласты (/100лейкоцитов)

PCT (platelet crit) тромбокрит (%), отражает долю объема цельной крови, занимаемой тромбоцитами

PDW (platelet distribution width) ширина распределения тромбоцитов по объему, характеризует степень анизоцитоза (%)

PLT (platelet) количество тромбоцитов

RBC (red blood cells) количество эритроцитов крови (х10¹²/л)

RDW (red cells distribution width) показатель гетерогенности эритроцитов по объему, характеризует степень анизоцитоза

WBC - (white blood cells) количество лейкоцитов крови (х10⁹/л)

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

Размещено на Allbest.ru

...