Система комплексной интраоперационной профилактики спаечной болезни брюшины (клинико-экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

СИСТЕМА КОМПЛЕКСНОЙ ИНТРАОПЕРАЦИОННОЙ ПРОФИЛАКТИКИ СПАЕЧНОЙ БОЛЕЗНИ БРЮШИНЫ

(клинико-экспериментальное исследование)

14.01.17 - хирургия

Суфияров Ильдар Фанусович

УФА 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Хасанов Анвар Гиниятович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хунафин Саубан Нурлыгаянович

доктор медицинских наук, профессор Прудков Михаил Иосифович

доктор медицинских наук, профессор Бебуришвили Андрей Георгиевич

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Московский медико-стоматологический университет».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» (450000, Уфа, ул. Ленина, 3).

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор С.В. Федоров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Спаечная болезнь брюшины продолжает оставаться одной из сложных и до конца нерешенных проблем абдоминальной хирургии. Значимость ее растет в связи с постоянным ростом числа и объема операций на органах брюшной полости (Гатауллин Н.Г., 1966; Симонян К.С., 1966; Блинов Н.И., 1968; Арутюнян С.И., 1975; Ганцев Ш.Х., 1982; Хунафин С.Н., 1986; Женчевский Р.А., 1989; Земляной А.Г., 1989; Плечев В.В., 1990; Мынбаев О.А., 1997; Плечев В.В., Тимербулатов В.М., 1999; Воробьев А.А., Бебуришвили А.Г., 2001; Федоров В.Д. и др., 2004; Чекмазов И.А., 2008).

Одними из основных клинических проявлений спаечной болезни брюшины являются: хронический абдоминальный болевой синдром, спаечная кишечная непроходимость, у женщин репродуктивного возраста трубно-перитонеальное бесплодие. спаечный болезнь брюшина

По данным литературы, у 55-70% пациентов, после абдоминального хирургического вмешательства развивается спаечный процесс в брюшной полости, который способен привести к такому грозному осложнению, как острая спаечная кишечная непроходимость (Тимербулатов В.М. и др., 2002; Бебуришвили А.Г. и др., 2007; Menzies D. et al., 2006). Послеоперационная летальность при неблагоприятном течении острой спаечной кишечной непроходимости достигает 16-25% (Ермолов А.С. и др., 2005).

Тяжелые осложнения, которые могут развиться вследствие образования спаек, послужили стимулом для большого количества исследований методов предупреждения их возникновения. Тем не менее, этиология и патогенез развития брюшинных спаек до сих пор недостаточно изучены, а большинство из предлагаемых противоспаечных методов и средств профилактики не находят применения в клинической практике из-за низкой эффективности или сложности применения. Наиболее сложной задачей в клинике является профилактика рецидива острой спаечной кишечной непроходимости, который достигает 60-70% (Плечев В.В. и др., 2004). Поэтому поиск надежных средств профилактики развития спаечной болезни брюшины остается актуальной проблемой абдоминальной хирургии (Шавалеев Р.Р. и др., 2005; Бебуришвили А.Г. и др., 2006; Воробьев А.А. и др., 2007; Ellis H., 2005).

Наиболее эффективными методами профилактики спаечной болезни брюшины считается использование малотравматичных хирургических технологий во время операций, а также лекарственных средств, позволяющих предупреждать развитие брюшинных спаек в послеоперационном периоде (Воробьев А.А., Бебуришвили А.Г., 2001; Плечев В.В., 2008).

Существует необходимость определения в предоперационном периоде специфичных маркеров для выявления группы пациентов, предрасположенных к развитию спаечной болезни брюшины и проведения профилактических интраоперационных мероприятий (Женчевский Р.А., 1989; Чекмазов И.А., 2008).

Все изложенное выше явилось основанием к проведению целенаправленных экспериментально-клинических исследований, направленных на разработку комплексных методов профилактики спаечной болезни брюшины.

Цель исследования: улучшить результаты лечения больных, оперированных на органах брюшной полости путем прогнозирования спаечного процесса в брюшной полости и разработки интраоперационных мероприятий, направленных на предупреждение развития спаечной болезни брюшины.

Задачи исследования:

1. Провести клинический анализ больных спаечной болезнью брюшины для определения динамики и вариантов течения заболевания в зависимости от этиопатогенетических факторов.

2. Обосновать в эксперименте применение биодеградируемого биополимера на основе окисленной гиалуроновой кислоты с 5-аминосалициловой кислотой для профилактики послеоперационных спаек.

3. Оценить в эксперименте эффективность использования ферментного препарата «Коллагеназа КК» для профилактики послеоперационных брюшинных спаек.

4. Изучить в эксперименте использование «Циклофосфана» в качестве препарата, оказывающего угнетающее влияние на процесс спайкообразования в брюшной полости.

5. Определить в эксперименте степень выраженности спаечного процесса при интраоперационной серозопластике в раннем послеоперационном периоде.

6. Изучить динамику изменения содержания сывороточных гликозаминогликанов в раннем послеоперационном периоде у больных спаечной болезнью брюшины в качестве показателя избыточного спайкообразования.

7. Изучить полиморфизм генов цитокинов - интерлейкина-1В, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли - б у больных спаечной болезнью брюшины и дать оценку клинико-генетическим ассоциациям в прогнозировании риска заболевания.

8. Изучить ближайшие и отдаленные результаты применения интраоперационных способов профилактики спаечной болезни брюшины.

Научная новизна исследования. Впервые в эксперименте обоснована возможность применения препарата «Коллагеназа КК» и биополимера окисленной гиалуроновой кислоты с 5-АСК для профилактики брюшинных спаек (патент РФ №2191782 от 27.10.02г., патент РФ №2233164 от 27.07.04г., патент РФ №2282454 от 27.08.2006г., патент РФ № 2310469 от 20.11.07).

Впервые в эксперименте изучено влияние препарата «Циклофосфан» на развитие спаечного процесса в брюшной полости. Доказана эффективность интраоперационного применения препарата «Циклофосфан» с целью предупреждения рецидива спаечной болезни брюшины.

Разработан новый способ интраоперационной серозопластики для профилактики спаечной болезни брюшины, позволяющий создавать из висцерального листка брюшины противоспаечный барьер (патент РФ №2275865 от 10.05.2006г, патент РФ №2286722 от 11.10.2006).

Впервые на основании изучения изменения уровня фракций сывороточных гликозаминогликанов в раннем послеоперационном периоде доказана их прогностическая значимость в развитии спаечной болезни брюшины.

Впервые изучена взаимосвязь генотипов и гаплотипов генов, кодирующих цитокины с развитием спаечной болезни брюшины. Показано, что полиморфные варианты генов фактора некроза опухоли-б, интерлейкина 1-B, интерлейкина - 6 вносят вклад в формирование генетической структуры предрасположенности к развитию спаечной болезни брюшины, вызванного воздействием интраоперационных факторов.

Практическая значимость:

Создана унифицированная модель развития спаечного процесса в брюшной полости, позволяющая проследить этапы морфогенеза спаечной болезни в эксперименте.

Выявлена прогностическая значимость исследования фракций уровня гликозаминогликанов в крови при развитии послеоперационного спаечного процесса.

Разработан комплексный метод профилактики брюшинных спаек с применением препаратов «Циклофосфан», «Коллагеназа КК» на основе данных морфогенеза и иммуногенеза спаечной болезни брюшины.

Разработан новый биодеградируемый биополимер на основе окисленной гиалуроновой кислоты с 5-аминосалициловой кислотой, позволяющий создавать противоспаечный барьер в области травмированной брюшины.

На основании полученных результатов показана целесообразность определения полиморфных вариантов генов фактора некроза опухоли-б, интерлейкина - 1B, интерлейкина- 6 с целью выявления предрасположенности к развитию спаечной болезни брюшины у оперируемых больных.

Предложенные методики интраоперационной серозопластики десерозированных участков тонкой кишки позволяют предупредить развитие рецидива спаечной болезни брюшины в послеоперационном периоде.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В раннем послеоперационном периоде определение содержания уровня гликозаминогликанов в крови позволяет выявить предрасположенность к развитию спаечной болезни брюшины.

2. Генетическими маркерами развития спаечной болезни брюшины являются полиморфные варианты генов фактора некроза опухоли-б, интерлейкина 1-B, интерлейкина 6.

3. Применение биодеградируемого биополимера на основе окисленной гиалуроновой кислоты с 5-аминосалициловой кислотой позволяет создавать эффективный противоспаечный барьер в области десерозированной брюшины.

4. Использование препарата «Коллагеназа КК» предупреждает развитие спаечного процесса в зоне травмы серозной оболочки органов малого таза.

5. Интраоперационный способ сегментарной и лоскутной серозопластики является надежным способом профилактики спайкообразования при локальных травматических повреждениях серозной оболочки кишки.

6. Для профилактики рецидива спаечной болезни может использоваться интраперитонеально цитостатический препарат «Циклофосфан».

Реализация результатов работы. Тема диссертационной работы входила в план научных исследований Башкирского государственного медицинского университета. Научная работа в 2006 году получила первое место на конкурсе молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. В 2007 году получен грант правительства Республики Башкортостан на проведение научного исследования в рамках конкурса молодых ученых и молодежных научных коллективов. В конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (в рамках Московской медицинской академии им. Сеченова) в 2007 году исследовательская работа удостоена третьего места в номинации «Клиническая практика».

Итоговые результаты диссертационного исследования, посвященные вопросам профилактики спаечной болезни брюшины используются при чтении лекций, проведении практических занятий и научно-практических конференций для хирургов, студентов, клинических интернов, клинических ординаторов, аспирантов на кафедре хирургических болезней ГОУ ВПО БГМУ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на научной конференции «Хирургия - 2002» (г. Москва, 2002г.); VIII, IX, X, XI Всероссийском съезде по эндоскопической хирургии (г. Москва, 2005, 2006, 2007, 2008 г.г.); 11 -м и 13 -м Московском Международном конгрессе по эндоскопической хирургии (г. Москва, 2007г., 2009г.); VII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке (г. Томск, 2006); II съезде колопроктологов России с международным участием (г.Уфа, 2007г.); выездном Пленуме Проблемной комиссии «Неотложная хирургия» Межведомственного научного совета по хирургии РАМН (г. Курск, 2007 г.); 12-й, 13-й Российской Гастроэнтерологической недели (г. Москва, 2006, 2007 г.г.); Республиканской научно-практической конференции молодых ученых Республики Башкортостан (г. Уфа, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 г.г.); заседании Ассоциации хирургов Республики Башкортостан (2006, 2007, 2008, 2009 г.г.), расширенном межкафедральном совещании и проблемной комиссии «Хирургические болезни» (г. Уфа, 2007, 2008 г.г.), заседании кафедры хирургических болезней; общеклинической конференции МЛПУ ГКБ № 8 г. Уфы по проблеме спаечной болезни (2006, 2007, 2008, 2009 г.г.).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 44 печатных работах, из них 9 в изданиях, входящих в перечень ВАК Минобразования РФ. Издана 1 монография. По теме диссертации получены 6 патентов на изобретения РФ и 1 патент на полезную модель РФ, 2 рационализаторских предложения.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, восьми глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Материалы исследования изложены на 260 страницах машинописного текста. Указатель литературы включает всего 377 источника, из них 260- отечественных и 117 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований

Проведены экспериментальные исследования на животных в асептических условиях операционного блока кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии БГМУ (зав. кафедрой д.м.н., проф. М.Б. Юлдашев). Исследования выполнены на 150 белых крысах-самцах линии «Вистар» массой 180-200 г, на 105 беспородных кроликах самцах массой 3.5 ± 0,5 кг (табл.1).

Таблица 1

Распределение экспериментальных животных

Объект	Методы исследований	Кол-во животных
КРЫСА	Моделирование послеоперационного спаечного процесса.	30
КРЫСА	Применение «Коллагеназы КК» для интраоперационной профилактики спаек	60
КРЫСА	Применение биополимера окисленной гиалуроновой кислоты для профилактики брюшинных спаек	60
КРОЛИК	Изучение влияния «Циклофосфана», на развитие внутрибрюшинной адгезии	60
КРОЛИК	Разработка и применение методов интраоперационной серозопластики тонкой кишки	45

Операции и все манипуляции с животными проводились с использованием общего обезболивания, а эвтаназия - путем передозировки средств для наркоза, с учетом положений, регламентируемых приложением № 8 («Правила гуманного обращения с лабораторными животными») «Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (№1045-73), «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77).

Выраженность спаечного процесса оценивалась визуально по формуле предложенной Воробьевым А.А., Бебуришвили А.Г. (2001г.).

В первой серии опытов разрабатывалась оптимальная модель развития брюшинных спаек у животных. Проведены исследования на 30 белых крысах - самцах линии «Вистар» массой 19024 г. Все животные были разделены на 3 группы (по 10 крыс в каждой) в зависимости от вида операционной травмы, вызывающей развитие брюшинных спаек.

Во второй серии опытов рассматривался вопрос о возможности использования препарата "Коллагеназа КК" в профилактике развития послеоперационных спаек. Проведены исследования на 60 белых крысах - самцах линии «Вистар» массой 190 24 г. Все животные были разделены на 2 группы (по 30 крыс в каждой). Второй группе (основной) крыс производилось нанесение жидкого ферментного препарата "Коллагеназа КК" на области травмированной париетальной и висцеральной брюшины по разработанной нами модели индуцирования спаечного процесса.

В третьей серии опытов производилось изучение противоспаечных барьерных свойств разработанной нами пленки из окисленной гиалуроновой кислоты с 5 аминосалициловой кислотой при наложении на десерозированную париетальную брюшину, стенку тонкой кишки, а также морфологических изменений при регенерации травмированной серозной оболочки тонкой кишки и париетальной брюшины. Проведено исследование на 60 половозрелых крысах линии «Вистар» массой 180 - 200 г (2 группы по 30 животных).

В четвертой серии эксперимента изучалось влияние иммунносупрессии вызванной «Циклофосфаном» на развитие брюшинных спаек. Исследования проведены на 60 беспородных кроликах (2- группы) весом 3-3,5 кг.

В I группе (контрольная группа) на 30 кроликах вызывалась стандартная комбинированная модель развития брюшинных спаек.

Во II группе (основная группа) на 30 кроликах также производили операцию для развития спаечного процесса в брюшной полости. В конце операции по моделированию спаечного процесса брюшную полость орошали раствором «Циклофосфана» 10,0 мл (30 мг\кг). Переднюю брюшную стенку послойно зашивали непрерывными швами кетгутом.

В пятой серии на экспериментальных животных изучалось влияния интраоперационных способов серозопластики тонкой кишки на степень развития спаечного процесса в брюшной полости. Проведены экспериментальные исследования на 45 беспородных кроликах, разделенных на три группы. В опытной группе 1 (15 животных) создавалась модель лоскутной серозопластики кишки, в опытной группе 2 (15 животных) использована методика сегментарной серозопластики кишки. У 15 экспериментальных животных профилактику брюшинных спаек не производили (контрольная группа).

Гистологические и гистохимические исследования выполнялись на кафедре гистологии БГМУ (д.м.н., профессор Ф.А.Каюмов).

Количество лейкоцитов определяли в венозной крови стандартным гематологическим методом (Предтеченский В.Е. и соавт., 1950).

Лейкоцитарную формулу считали под микроскопом с иммерсией (окуляр 15, объектив 90) в окрашенных по Романовскому - Гимзе мазках. При этом определяли процент лимфоцитов и гранулоцитов (нейтрофилов).

Функциональное состояние фагоцитов оценивали по фагоцитарной активности и интенсивности кислородзависимого метаболизма (тест восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест).

Общая характеристика клинических наблюдений

Клинический анализ основан на результатах комплексной интраоперационной профилактики у 310 больных спаечной болезнью брюшины, поступивших в хирургические отделения городской клинической больницы №8 в период с 2003 по 2008 г.г. Распределение пациентов по полу и возрасту представлено в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что среди оперированных больных подавляющее большинство - 234 человека (75,4%) - составили женщины. Мужчин было 76 человек (24,6%). Соотношение женщин и мужчин составило 3,1:1.

Таблица 2

Распределение пациентов со СББ по полу и возрасту

Возраст, годы	Мужчины	Женщины	Всего
			Абс.	%
До 20 лет	4	12	16	5,2
21-30	13	25	38	12,2
31-40	16	52	68	22,0
41-50	24	61	85	27,4
51-60	11	52	63	20,3
61-70	8	21	29	9,4
Старше 70	_	11	11	3,5
Всего	76	234	310	100,0

Методы обследования

Обследование больных начинали с тщательного сбора анамнеза заболевания, учитывали наличие сопутствующих заболеваний и степень их выраженности, а также ранее перенесенные операции и их характер.

Ультразвуковое сканирование

Ультразвуковое исследование проводилось аппаратом «Toshiba» с датчиком конвекции (3,5 мГц) в режиме двухмерной визуализации и двойном доплеровском режиме. При ультразвуковом исследовании обращали внимание на размеры, расположение, внутреннюю структуру кишечника, наличие пристеночных компонентов. При эхографии последовательно определялось состояние брюшной полости (наличие свободной жидкости в латеральных каналах брюшной полости, газов и жидкости в петлях кишечника, состояние перистальтики, наличие спаечного процесса и воспалительных инфильтратов) и паренхиматозных органов (печени, поджелудочной железы, почек, селезенки).

Видеолапароскопия

Диагностическая и лечебная лапароскопия проводилась комплектом эндоскопического оборудования KARL STORZ (Германия). Для ранней диагностики и профилактики брюшинных спаек в течение первых 5-6 дней после операции проводилась динамическая лапароскопия через оставленный торакопорт во время операции. Раннюю контрольную лапароскопию производили под внутривенным наркозом.

Распределение пациентов по методам интраоперационной профилактике представлено в таблице 3.

Таблица 3

Интраоперационные методы профилактики спаечной болезни брюшины

Программа интраоперационных мероприятий	Метод профилактики СББ	Количество пациентов
		Основная группа	Контрольная группа	Итого
Противоспаечный барьер	Серозопластика	40	35	75
Миниинвазивные технологии	Лапароскопический адгезиолизис	50	65	115
Иммуносупрессия	«Циклофосфан»	15	15	30
Ферментные препараты	«Коллагеназа КК»	45	45	90
	Всего	150	160	310

Определение содержания гликозаминогликанов и их фракций в сыворотке крови

Исследования проведены в лаборатории фармакологии и токсикологии Института нефтехимии и катализа Уфимского научного центра РАН (старший научный сотрудник, кандидат химических наук И.Ю. Понеделькина).

Все больные были разделены на две группы (таблица 4).

I группа (основная) - пациенты, оперированные ранее лапаротомным способом и с проявлением спаечной болезни брюшины в послеоперационном периоде (35 человек).

II группа (контрольная) - пациенты, оперированные ранее лапаротомным способом на органах брюшной полости и не диагностированным в послеоперационном периоде спаечным процессом в брюшной полости (32 человека).

Таблица 4

Распределение пациентов, перенесших лапаротомию по полу и возрасту

Возраст, годы	Оперированные пациенты	Всего
	Основная (с проявлением СББ)	Контрольная (без СББ)
	Муж	Жен	Муж	Жен	Абс.	%
До 30 лет	4	8	3	7	22	32,8
31-49	7	12	4	11	34	50,7
Старше 50	1	3	2	5	11	16,5
Итого	12	23	9	23	67	100,0
	35	32

В сыворотке крови после протеолиза методом колоночной ионообменной хроматографии выделяли фракции гликозаминогликанов: гиалуроновую кислоту (ГК), хондроитинсульфаты (ХС), гепарансульфаты (ГС). Затем методом спектроскопии определялось общее содержание ГАГ и их фракций.

Молекулярно-генетические методы исследования полиморфизма генов цитокиновой сети у больных спаечной болезнью брюшины

Объектом исследования служили 300 пациентов, находившихся на стационарном лечении в ГКБ №8 г. Уфы в период с 2005 по 2008 г. Из них 104 пациента с клиническими проявлениями спаечной болезни составили основную группу. В контрольную группу вошло 196 пациента, без признаков спаечного процесса в брюшной полости.

Диагноз спаечная болезнь брюшины ставился на основании учета анамнеза, клинико-лабораторных и инструментальных (пневмоперитонеография, абдоминальная сонография) методов обследования, а также интраоперационно при повторных оперативных вмешательствах.

Распределение больных по полу было следующим: 39 мужчин (37,5%) и 65 женщин (62,5%).

В группу сравнения случайным образом было отобрано 196 пациентов у которых не выявлено признаков спаечной болезни брюшины, проходившие лечение в ГКБ № 8 г. Уфы в 2005-2008 гг. Мужчин в этой группе оказалось 74 (37,8%), женщин 122 (62,2%).

Выделение ДНК

Молекулярно-генетические исследования проводились на кафедре биологии БГМУ (зав. кафедрой д.м.н., профессор Викторова Т.В.). Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови.

Анализ полиморфных локусов генов TNF-б, IL1-B, IL-6 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере «Терцик» фирмы «ДНК-Технология» в автоматическом режиме.

Статистическая обработка результатов исследования

Анализ данных проводился с использованием методов математической статистики в пакетах SPSS 11.5 и Statistica 6.0. (Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных, 2002). Для всех количественных показателей вычислялись среднее, стандартное отклонение, минимум, максимум, стандартная ошибка среднего, а также выполнялась проверка на нормальность распределения сравниваемых показателей с использованием теста Колмогорова-Смирнова. Для сравнения двух независимых групп применялся t-критерий Стьюдента. В остальных случаях применялся непараметрический критерий Манна-Уитни. Для сравнения более чем двух независимых групп при подтверждении гипотезы о нормальности распределения в группах применялся однофакторный дисперсионный анализ, и если отвергалась гипотеза об отсутствии межгрупповых различий, проводились последующие сравнения групп с использованием поправки Бонферрони. Для сравнения двух зависимых выборок применялся t-критерий для зависимых выборок, если гипотеза о нормальности распределения в группах не отвергалась или непараметрический критерий Уилкоксона, если гипотеза о нормальности отвергалась. Для сравнения более чем двух зависимых выборок применялся непараметрический критерий Фридмена, и если гипотеза об отсутствии различий отвергалась, дополнительно использовался тест Уилконсона для парного сравнения групп с применением поправки Бонферрони. Кроме того, в ряде случаев для изучения связи между количественными показателями использовался коэффициент корреляции Пирсона. Для сравнения относительных частот в двух несвязанных группах применялся точный критерий Фишера. В работе под M± понимается Среднее±среднеквадратическое отклонение.

Определение частот генотипов (Р_i) и аллелей (p_i), проводили по стандартной формуле (Животовский Л., 1991): P_i=N_i/N, где N_i - число i-х генотипов (аллелей), N - объем выборки (число проанализированных хромосом). Частоты генотипов и аллелей, а также стандартную ошибку и доверительный интервал выражали в процентах (%). Разницу в распределении частот аллелей и генотипов между группами рассчитывали с использованием критерия ² с поправкой Йетса на непрерывность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение гликозаминогликанов сыворотки крови как способ прогнозирования спаечной болезни брюшины

Пациентам, имевшим ранее операции на органах брюшной полости (резекции желудка по поводу язв желудка и 12 перстной кишки, холецистэктомии по поводу желчнокаменной болезни, аппендэктомии), поступившим на плановое оперативное лечение (послеоперационная вентральная грыжа) производилось изучение уровня гликозаминогликанов сыворотки крови до операции и в раннем послеоперационном периоде. Проанализированы результаты изменений уровня гликозаминогликанов сыворотки крови в раннем послеоперационном периоде у 35 пациентов с наличием спаечного процесса в брюшной полости и у 32 пациентов без признаков спаечного процесса в брюшной полости.

Проведено статистическое сравнение групп пациентов со спаечным процессом в брюшной полости и без спаек. Средний возраст пациентов 44,09±10,37 года. Интервал между первой и второй лапаротомией составил 59,2±11,4 месяцев. Выявлена однородность сравниваемых групп по полу (критерий Пирсона) ч2=0,295, p=0,587 и по возрасту (по t - критерию Стьюдента) t=0,343, р=0,733.

Для пациентов без признаков спаечного процесса в брюшной полости характерно нарастание содержания ГАГ и их фракций в крови на 5 -е сутки и последующее снижение на 7-е сутки после операции (таблица №.5).

Выявлено колебание ГАГ в крови от 26,06 мкмоль\л до 57,09 мкмоль\л в различные сроки от момента операции (отмечено статистически достоверное увеличение ГАГ - р<0,0001). Отмечено преимущественное содержание в крови больных 1 фракции ГАГ, т.е. гиалуроновой кислоты - около 60 - 80% состава.

В послеоперационном периоде у больных в ходе комплексного клинического обследования спаечный процесс в брюшной полости не выявлен.

Таблица 5

Изменение уровня гликозаминогликанов в крови больных в различные сроки после планового оперативного лечения (M±, n=32) *

Показатели	Сроки исследования сыворотки крови после операции, сут
	До операции	3	5	7
ГАГ, мкмоль\л	26,064,8	64,77,97 (р<0,0001)	84,595,76 (р<0,0001)	57,093,8 (р<0,0001)
ГК, мкмоль/л	15,032,7	42,025,18 (р<0,0001)	55,783,79 (р<0,0001)	34,192,3 (р<0,0001)
ХС, мкмоль/л	4,011,05	8,91,1 (р<0,0001)	10,970,74 (р<0,0001)	10,230,7 (р<0,0001)
ГС, мкмоль/л	7,02,6	13,671,69 (р<0,0001)	17,841,22 (р<0,0001)	12,660,81 (р<0,0001)

* - сравнение полученных результатов с исходными данными проводилась по t - критерию с поправкой Бонферрони.

Динамика показателей гликозаминогликанов сыворотки крови у пациентов со спаечной болезнью брюшины в различные сроки после оперативного лечения

Пациентам, имевшим ранее операции на органах брюшной полости (резекции желудка по поводу язв желудка и 12 перстной кишки, холецистэктомии по поводу желчнокаменной болезни, аппендэктомии), поступившим на повторное оперативное лечение (послеоперационная вентральная грыжа) при выявлении спаечного процесса производилось изучение уровня гликозаминогликанов крови до операции и в раннем послеоперационном периоде.

Выраженность спаечного процесса оценивалось оперирующими хирургами по 4-балльной системе, предложенной В.В. Плечевым, Р.З. Латыповым (1999) (Клиника БГМУ, г. Уфа) (таблица 6).

Таблица 6

Распределение пациентов по степени выраженности спаечного процесса в брюшной полости.

Группы	Степень выраженности спаечного процесса
	1+	2+	3+	4+
Мужчины	4	9	2	-
Женщины	7	12	1	-
Всего	11	21	3	-

Содержание ГАГ в крови пациентов с выявленным спаечным процессом в брюшной полости характеризовалось нарастанием показателей всех фракций на 7-е сутки (таблица 7).

Таблица 7

Изменение уровня гликозаминогликанов в крови больных спаечной болезнью в различные сроки после оперативного лечения (M±, n=35) *

Показатели	Сроки исследования сыворотки крови после операции, сут
	До операции	3	5	7
ГАГ, мкмоль\л	31,013,07	83,293,19 (р<0,0001)	101,724,05 (р<0,0001)	111,994,45 (р<0,0001)
ГК, мкмоль/л	17,921,78	45,841,75 (р<0,0001)	57,932,31 (р<0,0001)	62,672,51 (р<0,0001)
ХС, мкмоль/л	5,530,55	16,620,62 (р<0,0001)	20,30,8 (р<0,0001)	22,360,89 (р<0,0001)
ГС, мкмоль/л	7,540,73	20,820,92 (р<0,0001)	23,480,93(р<0,0001)	26,951,06 (р<0,0001)

* - сравнение полученных результатов с исходными данными проводилась по t - критерию с поправкой Бонферрони.

Выявлено повышение уровня ГАГ в крови от 31,01 мкмоль\л до 111,99 мкмоль\л в ранний послеоперационный период (отмечено статистически достоверное увеличение ГАГ по сравнению с исходными данными - р<0,0001)

Содержание ГАГ в крови пациентов с признаками развития спаечной болезни брюшины в анамнезе были выше по сравнению с показателями ГАГ пациентов без признаков спаечного процесса в брюшной полости (111,994,45 мкмоль\л).

Согласно нашим данным, представленным на рисунке 1, при сравнении средних показателей суммарного содержания ГАГ и их фракций в сыворотке крови у больных с СББ с показателями группы без признаков СББ обнаружено достоверное их повышение в раннем послеоперационном периоде.

Группа 1	группа 2

Рис.1. Содержание уровня гликозаминогликанов в сыворотке крови больных спаечной болезнью брюшины (группа 1) и пациентов без признаков спаечного процесса (группа 2) после операции на органах брюшной полости.

Полученные данные свидетельствуют о более высоком уровне обмена соединительной ткани у людей предрасположенных к развитию спаечной болезни. Полученные результаты дают основание для использования количественного определения ГАГ сыворотки крови в качестве одного из дополнительных критериев в диагностике развития спаечной болезни брюшины.

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов цитокинов у больных спаечной болезнью брюшины

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов TNF-б, IL1-B и IL-6 среди больных спаечной болезнью брюшины и в контроле.

При сравнении общей выборки больных спаечной болезнью брюшины и группы контроля, выявлены достоверные различия по частотам генотипов полиморфного локуса -308G>A гена TNFб (таблица 8).

Таблица 8

Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса -308G>A гена TNFб в группах больных спаечной болезнью брюшины и здоровых индивидов.

Генотипы и аллели	Больные	Здоровые	ч2	P	OR (95%CI)
	Ni, pi	Ni, pi
GG	81 77,9	127 64,8	4,876	0,028	1,914 (1,106-3,311)
GA	19 18,3	64 32,7	6,324	0,013	0,462 (0,258-0,824)
AA	4 3,8	5 2,6	0,073	0,787	1,529 (0,401-5,819)
N	104	196
G	181 87	318 81,1	2,967	0,085	1,56 (0,969-2,514)
A	27 13	74 18,9	2,967	0,085	0,642 (0,398-1,034)

В группе больных СББ достоверно чаще встречался генотип GG по сравнению с группой контроля (77,9% и 64,8% соответственно, ч2=4,876; p=0,028). Напротив генотип GA достоверно чаще встречался в группе здоровых индивидов 32,7%, тогда как его частота в группе больных спаечной болезнью брюшины составила 18,3% (ч2=6,324; p=0,013). Частота аллеля G полиморфного локуса -308G>A гена TNFб в группе больных спаечной болезнью брюшины не имела достоверных отличий от группы контроля (87,0% и 81,1% соответственно, ч2=2,967; p=0,085). Различия также не наблюдались по частотам аллеля A, в контрольной группе 18,9% и 13,0% в группе больных спаечной болезнью брюшины (ч2=2,967; p=0,085). По частотам генотипа AA достоверных различий также не обнаружено(ч2=0,073; p=0,787).

В результате исследования было выявлено, что маркерами риска развития СББ являются генотип GG (OR=1,914; 95% CI 1,106-3,311), напротив маркерами устойчивости являются генотип GA (OR=0,462; 95% CI 0,258-0,824).

Анализ распределения частот полиморфного локуса -511C>T гена IL1B группы больных спаечной болезнью брюшины и группы здоровых индивидов показал статистически достоверные различия (таблица 9).

Таблица 9

Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса -511C>T гена IL1B в группах больных спаечной болезнью брюшины и здоровых индивидов.

Генотипы и аллели	Больные	Здоровые	ч2	p	OR (95%CI)
	Ni, pi	Ni, pi
CC	30 29,1	46 44,7	4,691	0,031	0,51 (0,287-0,907)
CT	51 49,5	45 43,7	0,488	0,485	1,265 (0,731-2,188)
TT	22 21,4	12 11,7	2,853	0,091	2,06 (0,959-4,425)
N	103	103
C	111 53,9	137 66,5	6,331	0,013	0,589 (0,395-0,877)
TT	95 46,1	69 33,5	6,331	0,013	1,7 (1,141-2,532)

По генотипу CC (29,1% и 44,7% соответственно, ч2=4,691; р=0,031; OR=0,51; 95% CI 0,287-0,907). Также по аллелю T частота в группе больных спаечной болезнью брюшины составила 46,1%, в группе здоровых индивидов 33,5% (ч2=6,331; p=0,013; OR=1,700; 95% CI 1,141-2,532). И по аллелю G 53,9% в группе больных спаечной болезнью брюшины против контрольной группы 66,5% (ч2=6,331; p=0,013; OR=0,589; 95% CI 0,395-0,877).

Сравнительный анализ общей выборки больных спаечной болезнью брюшины и группы контроля показал статистически достоверные различия по генотипу СС полиморфного локуса -174G>C гена IL6 (21,4% и 9,6% соответственно, ч2=4,599; p=0,032). По другим аллелям и генотипам достоверных различий не обнаружено (таблица 10). Таким образом, маркером повышенной устойчивости к развитию спаечной болезнью брюшины являются генотип СС полиморфного локуса -174G>C гена IL6 (OR=0,510; 95% CI 0,287-0,907).

Таблица 10

Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса -174G>C гена IL6 в группах больных спаечной болезнью брюшины и здоровых индивидов.

Генотипы и аллели	Больные	Здоровые	ч2	p	OR (95%CI)
	Ni, pi	Ni, pi
GG	39 37,9	44 42,3	0,261	0,610	0,831 (0,477-1,451)
GC	42 40,8	50 48,1	0,841	0,360	0,744 (0,429-1,29)
CC	22 21,4	10 9,6	4,599	0,032	2,554 (1,142-5,708)
N	103	104
G	120 58,3	138 66,3	2,553	0,110	0,708 (0,475-1,056)
C	86 41,7	70 33,7	2,553	0,110	1,413 (0,948-2,107)

Экспериментальное моделирование внутрибрюшной адгезии и пути профилактики рецидива послеоперационных спаек

Нами проведено комплексное изучение возможности применения гиалуроновой кислоты, ферментного препарата «Коллагеназа КК», а также синтезированного нами биополимера окисленной гиалуроновой кислоты с 5-аминосалициловой кислотой для профилактики развития брюшинных спаек.

Нами разработана комбинированная модель развития спаечной болезни брюшины, которая представляет собой асептический способ воспроизведения спаечного процесса в брюшной полости путем травмирования брюшины (Удостоверение на рационализаторское предложение № 2554 от 15.12.2002г., выданное БГМУ). Этот способ позволяет создать в эксперименте оптимальную модель адгезивного процесса в брюшной полости и может быть использован для изучения методов профилактики спаечной болезни брюшины на животных.

Изучение возможности применения пленки из окисленной ГК с 5-АСК в качестве противоспаечного барьерного материала

Проведено исследование на 60 половозрелых крысах линии "Вистар" массой 180-200 г (2 группы по 30 животных). Результаты оценки спаечного процесса представлен в таблице 11.

Таблица 11

Характеристика брюшинных спаек при использовании пленки из модифицированной гиалуроновой кислоты (M±, n=60) *

Группа	Частота и характер спаечного процесса
	Кол-во спаек (баллы) X	Тип спаек (баллы) Y	Площадь спаек (баллы) Z	Сумма баллов УСП
1-я контроль (n=30)	4,530,86	7,561,57	9,532,55	44,9815,14
2-я опыт (n=30)	0,430,72	0,460,76	0,430,72	1,162,09**

* - сравнение выполнялось с использованием критерия Манна-Уитни

** - различия между полученными результатами опытной и контрольной группой статистически значимы (р < 0,0001).

Во 2-й группе образование спаек вокруг места наложения защитной пленки отмечено в 10 случаях (33,3%), что достоверно отличается от контрольной группы 29 (96,6%) (р<0.05).

Экспериментальное обоснование возможности применения ферментного препарата «Коллагеназа КК» для профилактики спаечной болезни брюшины

Для предупреждения развития рецидива послеоперационного спаечного процесса нами были предложены методы обработки зоны операции препаратом «Коллагеназа КК». Во всех группах экспериментальных животных исходно спаечные сращения в органах брюшной полости отсутствовали. Оценка спаечного процесса производилась на 7-е сутки после нанесения стандартной операционной травмы.

Результаты оценки спаечного процесса представлен в таблице 12.

Таблица 12

Характеристика брюшинных спаек при использовании «Коллагеназа КК» (M±, n=60) *

Группа	Частота и характер спаечного процесса
	Частота (число случаев, %)	Кол-во спаек (баллы) X	Тип спаек (баллы) Y	Площадь спаек (баллы) Z	Сумма баллов УСП
1-я контроль (n=30)	30 (100 %)	4,530,86	7,561,57	9,232,8	44,68±15,44
2-я опыт (n=30)	11 (40 %)	0,771,1	0,91,3	0,931,46	3,05±5,1**

* - сравнение выполнялось с использованием критерия Манна-Уитни.

** - различия между полученными результатами опытной и контрольной группой статистически значимы (р < 0,0001).

При оценке спаечного процесса выявлено наличие выраженного спаечного процесса в контрольной группе у всех животных (100%), в опытной группе животных выявлен спаечный процесс у 11 животных (36,6%).

Анализ полученных данных показал, что применение ферментного препарата «Коллагеназа КК» позволяет достоверно (р<0.05) снизить образование послеоперационных спаек в брюшной полости.

Результаты профилактики внутрибрюшинной адгезии в клинической практике

Полученные положительные результаты при экспериментальных исследованиях позволили разработать способы профилактики СББ и внедрить их в хирургическую практику. Возможность использования препаратов «Коллагеназа КК» и ГК с 5-АСК при операциях на органах брюшной полости обоснована экспериментальными исследованиями на белых крысах и интерпретация результатов позволило определить показания к применению каждого вида препарата. Нами получен патенты на изобретение РФ «Средство для лечения послеоперационных спаек в органах брюшной полости» №2282454 от 27.08.2006г, «Способ лечения рецидивных послеоперационных спаек в органах брюшной полости» № 2310469 от 20.11.07 для использования Коллагеназы КК и «Способ профилактики развития послеоперационных спаек брюшной полости» №2233164 от 27.07.04г для применения модифицированной гиалуроновой кислоты с 5 АСК в профилактике послеоперационных спаек в брюшной полости. Разработаны показания и противопоказания к применению данной группы препаратов в профилактике СББ.

Показаниями к использованию препарата «Коллагеназа КК» являются:

- деструктивные воспалительные процессы в брюшной полости без нарушения целостности серозной оболочки органов;

- для предоперационной подготовки у больных СББ при повторных лапаротомий

Противопоказаниями являются:

- деструктивные воспалительные процессы в брюшной полости с нарушением целостности серозной оболочки органов;

- операции с резекцией органов и наложением анастомозов

Показаниями к использованию биополимера ГК с 5-АСК являются:

- десерозирование органов брюшной полости при оперативных вмешательствах;

- обширные резекции и анастомозирование органов;

- обширный адгезиолизис;

Противопоказаниями являются:

- кровотечения в брюшную полость;

- воспалительные и гнойно-деструктивные процессы в брюшной полости;

Изучение возможности использования «Циклофосфана» для профилактики рецидива спаечной болезни брюшины

Значения выраженности спаечного процесса в экспериментальной модели на животных представлено в таблице 13.

Таблица 13

Уровень спаечного процесса в зависимости от применения «Циклофосфана» (M±, n=60) *

Группа	Частота и характер спаечного процесса
	распространенность	тип	плотность	Сумма баллов
1-я контроль (30)	4,430,81	7,551,5	8,922,6	43,4114,49
2-я опыт (30)	0,170,46	0,160,46	0,170,46	0,41,22*

* - сравнение выполнялось с использованием критерия Манна-Уитни.

** - различия между полученными результатами опытной и контрольной группой статистически значимы (р < 0,0001).

Иммунологические аспекты применения Циклофосфана в профилактике спаечной болезни брюшины

При применении «Циклофосфана» определяется подавление лейкоцитов всех типов, преимущественно лимфоцитов, угнетение нейтрофилов незначительное. Цитостатическое воздействие проявляется в угнетении преимущественно лимфоцитов. В опытной группе животных развивается выраженная лейкопения на 7 сутки после операции. Максимальная лейкопения связана с тем, что в первые сутки идет выброс зрелых клеток из депо, частично компенсирующие иммунодефицит. Параллельно с указанными изменениями происходит усиление фагоцитарной активности нейтрофилов, по НСТ - тесту - резкий рост числа активированных нейтрофилов на 7 сутки.

На 14 сутки в периферической крови животных опытной группы наблюдается лейкоцитоз, за счет повышения общего количества, как нейтрофилов, так и лимфоцитов. Отмечается резкое снижение числа активных нейтрофилов в процентном отношении и по индексу активации НСТ - теста. Параллельно повышается уровень фагоцитоза, свидетельствующий об активности макрофагальной системы.

Таким образом, в контрольной группе происходит патологическая гиперэргическая реакция в ответ на операционную травму. В опытной группе, достоверные лабораторные данные свидетельствуют о снижении гиперэргической реакции иммунной системы макроорганизма. Увеличение фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов (качественные показатели), при относительно меньшем увеличении их количества по сравнению с контрольной группой, объясняется способностью «Циклофосфана» увеличивать механизмы перекисного окисление липидов.

Интраоперационный способ серозопластики в профилактике спаечной болезни брюшины

Нами разработаны способы перитонизации поврежденных участков кишки висцеральным лоскутом брюшины (патент на изобретение РФ № 2275865 от 10.05.2006 и патент РФ №2286722 от 11.10.2006). Результаты экспериментальных исследований на животных представлены в таблице 14.

Таблица 14

Уровень спаечного процесса при серозопластике кишки (M±, n=45) *

Группа	Частота и характер спаечного процесса
	Кол-во спаек (баллы)	Тип спаек (баллы)	Площадь спаек (баллы)	Сумма баллов
Контрольная (n=15)	4,270,79	7,31,48	8,12,34	40,2314,36
Опытная 1 (n=15)	0,270,59	0,330,74	0,270,59	0,761,89**
Опытная 2 (n=15)	0,20,56	0,230,62	0,20,56	0,561,63***

* - различия между полученными результатами в опытных и контрольной группой изучались по критерию Манна - Уитни.

** - р<0,0001 при сравнении 1-й и 2-й групп.

*** - р<0,0001 при сравнении 1-й и 3-й группы.

Использование собственной висцеральной брюшины для закрытия дефектов мезотелия кишечника обладает рядом преимуществ:

1.отсутствие реакции на чужеродную ткань

2. создание благоприятных условий для регенерации мезотелия брюшины.

Методика серозопластики кишки способствует восстановлению целостности серозного покрова кишки благодаря временному отграничению раневой поверхности и созданию благоприятных условий для ускоренной регенерации клеток мезотелия. Представляем себе следующий механизм противоспаечного барьерного действия при перитонизации кишки. На первом этапе (первые часы после операции) фиксированный лоскут брюшины закрывает поврежденный участок серозы кишки. На следующем этапе созданная защитная оболочка препятствует экссудации со стороны поврежденной стенки кишки в свободную брюшную полость, при этом создаются благоприятные условия для ускорения регенерации тканей.

Анализ клинических наблюдений пациентов со спаечной болезнью брюшины

Нами проведен анализ комплексного обследования и последую...