Репродуктивная функция мужчин при хроническом бактериальном простатите: клинические и иммунологические аспекты

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Репродуктивная функция мужчин при хроническом бактериальном простатите: клинические и иммунологические аспекты

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Современный этап развития общественной жизни в России характеризуется наличием острого демографического кризиса (Белов В.Б. с соавт., 2008). По социологическим прогнозам в предстоящие 50 лет население России может сократиться вдвое (Материалы заседания Экспертного совета Совета Федерации «Мужское здоровье как демографический фактор», 8 июня 2007 г.). Наряду с проблемой высокой смертности мужчин в трудоспособном возрасте, не менее остро стоит проблема сохранения и улучшения репродуктивной функции у мужчин (Рожавский Л.А., 2008; Lutz W., 2006).

Одним из факторов, снижающих фертильность мужчин, многие урологи считают хронический бактериальный простатит (ХБП) (Божедомов В.А. с соавт., 2004; Dohle G.R., 2003; Diemer T. et al., 2008; Wagenlehner F.M. et al., 2008). Распространенность ХБП составляет до 40% среди мужчин трудоспособного возраста (Денисов И.Н. с соавт., 2001; Schaeffer A.J. et al., 2003). Опубликованы данные, объясняющие снижение фертильных свойств эякулята при ХБП нарушениями физико-химических параметров семенной жидкости, повреждающим воздействием реактивных форм кислорода, прямым или опосредованным влиянием патогенных микроорганизмов, развитием патологических аутоиммунных реакций (Бойко И.М., 2007; Everaert K. et al., 2003; Diemer T. et al., 2003; Punab M. et al., 2003; La Vignera S. et al., 2006; Wagenlehner F.M. et al., 2008). В то же время отсутствуют убедительные данные о том, что ХБП оказывает влияние на качество спермы и является причиной мужского бесплодия (Сухих Г.Т., Божедомов В.А., 2009; Guidelines on Male Infertility, EAU, 2010). Очевидно, в ряде случаев ХБП снижает фертильность, в ряде - нет, и причины этих различий пока не понятны. Фрагментарность и системная разобщенность имеющихся данных затрудняют формирование доказательной базы для включения ХБП в перечень причин мужской инфертильности. Противоречивы сведения о распространенности ХБП среди мужчин из бесплодных пар. Остается непонятной последовательность возникающих гомеостатических изменений при ХБП, определяющих фертильный статус больных. Иммуноопосредованный характер мужского бесплодия при ХБП остается предметом дискуссий. Не определены факторы риска снижения фертильности у больных ХБП. Не проведен системный анализ механизмов нарушения и сохранения фертильности у больных ХБП. Не изучены возможности терапии ХБП в восстановлении фертильности, продолжается применение невалидизированных методов лечения мужского бесплодия при ХБП (Аполихин О.И., 2004).

Цель исследования

Установить степень влияния хронического бактериального простатита на фертильность мужчин, охарактеризовать клинические и иммунологические факторы снижения качества эякулята для совершенствования мер комплексной профилактики мужского бесплодия.

Задачи исследования

1. Изучить клиническую эпидемиологию мужского бесплодия и уточнить удельный вес ХБП в структуре нарушений репродуктивного здоровья мужчин.

2. Охарактеризовать клинико-анамнестические факторы риска нарушения фертильности у больных ХБП.

3. Изучить морфологические и функциональные особенности простаты и семенных пузырьков у бесплодных больных ХБП.

4. Установить закономерности изменений клинической спермограммы, морфологических и электрофизиологических параметров сперматозоидов у больных ХБП в зависимости от состояния фертильности.

5. Определить значение нарушения функциональной активности лейкоцитов в эякуляте и роль аутоиммунных реакций против сперматозоидов в патогенезе мужского бесплодия у больных ХБП.

6. Установить закономерности изменения антиинфекционной резистентности спермальной плазмы и микробного пейзажа эякулята в зависимости от фертильного статуса больных ХБП.

7. Оценить эффективность патогенетического лечения ХБП при нарушениях мужской репродуктивной функции.

8. Определить оптимальные пути профилактики мужского бесплодия при ХБП.

Научная новизна

Впервые количественно определено значение различных клинико-анамнестических данных, результатов инструментального и лабораторного обследования в прогнозе нарушения фертильности у мужчин с ХБП.

Впервые раскрыты общие закономерности нарушений функции иммунной системы (снижение содержания цитотоксических лимфоцитов в сперме, нарушение их апоптоза и нарушение функциональной активности семенных моноцитов и нейтрофилов) у больных ХБП, имеющие фазовый характер, и верифицирована их взаимосвязь с состоянием фертильности и выраженностью патоспермии у обследованных мужчин.

Впервые определено, что реализация патогенного воздействия нарушенных показателей метаболизма (гиперпродукция NO, активация процессов липопероксидации) у больных ХБП происходит через повреждение мембраны сперматозоида.

Впервые выявлены и концептуально обоснованы изменения метаболизма и иммунного гомеостаза компенсаторно-приспособительного характера, способствующие сохранению фертильности у больных ХБП, включающие в себя сбалансированный и адекватный иммунный ответ, умеренное увеличение продукции NO, обеспечивающие повышение антиинфекционной резистентности спермальной плазмы.

Впервые верифицированы дезадаптационные изменения метаболизма (гиперпродукция оксида азота, катаболические реакции в липидном обмене, снижение продукции Zn, Mg, лимонной кислоты и фруктозы), иммунной системы (дисбаланс субпопуляций семенных Т-лимфоцитов, угнетения апоптоза активированных цитотоксических лимфоцитов) и антиинфекционной защиты (понижение антиинфекционной резистентности спермальной плазмы), ведущие к нарушению фертильности у больных ХБП.

Систематизирована и дополнена схема патогенеза нарушений фертильности у больных ХБП.

Доказана возможность терапевтической коррекции нарушений фертильности у больных ХБП, оценена эффективность патогенетической терапии при ХБП.

Практическая значимость

Полученные в данной работе результаты позволили определить факторы риска снижения фертильности у больных ХБП, выделить основные признаки компенсаторно-приспособительных и дезадаптационных изменений метаболизма и иммунного гомеостаза, определяющие нарушения фертильности у больных ХБП.

Предложены методы и определены оценочные маркеры прогнозирования нарушения фертильности у больных ХБП, способы прогнозирования восстановления фертильности у бесплодных мужчин, страдающих ХБП в процессе лечения заболевания. Разработаны рекомендации, направленные на повышение эффективности комплексной профилактики мужского бесплодия.

Положения, выносимые на защиту

1. ХБП снижает фертильность мужчин. Вероятность развития бесплодия у больных ХБП определяется выраженностью и продолжительностью воздействия таких патогенетических факторов, как нарушение структуры и функциональной активности добавочных половых желез, снижение антиинфекционной резистентности спермальной плазмы, гиперпродукция активных форм кислорода. Реализация патогенного воздействия происходит главным образом через повреждение мембран сперматозоидов, что сопровождается снижением их жизнеспособности, подвижности и нарушениями морфологии.

2. Патогенез мужского бесплодия у больных ХБП носит иммуноопосредованный характер. Факторами риска снижения фертильности при ХБП является дисбаланс субпопуляций семенных Т-лимфоцитов, уменьшение содержания естественных киллеров, угнетение апоптоза активированных цитотоксических лимфоцитов.

3. Снижение антиинфекционной резистентности спермальной плазмы у бесплодных больных ХБП является следствием дизрегуляции локального иммунного ответа, обуславливает увеличение частоты идентификации E.coli и микробных ассоциаций; бактерицидность семенной жидкости поддерживается преимущественно за счет гиперпродукциии оксида азота, снижающего фертильные свойства эякулята вследствие негативного воздействия на мембрану сперматозоида.

4. Сохранение и восстановление фертильности при ХБП возможно при реализации комплекса мер первичной, вторичной и третичной профилактики заболевания.

5. ХБП является причиной снижения качества спермы у 9% мужчин из бесплодных пар.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований и вытекающие из них рекомендации внедрены в работу урологической клиники ГУЗ Ивановская ОКБ, Ивановского городского урологического центра при МУЗ ГКБ №7. Материалы исследований используются в учебном процессе на кафедре урологии ГОУ ВПО ИвГМА Росздрава.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены на 3-й и 4-й научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1999 и 2000); на Международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000); на 7-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000); на I конгрессе Профессиональной ассоциации андрологов России (Кисловодск, 2001); на 5-м Конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (Москва, 2002); на X Российском съезде урологов (Москва, 2002); на 1-й, 2-й и 4-й Всероссийских конференциях «Мужское здоровье» (Москва, 2003, 2005, 2008); на Пленуме Правления Российского общества урологов (Саратов, 2004); на Международном конгрессе по андрологии (Сочи, 2006); на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007); на заседаниях Ивановского областного отделения Российского общества урологов, областных научных обществ терапевтов, дерматовенерологов, физиотерапевтов, врачей-лаборантов в 1999-2007 гг.; на IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010); на 8-м Российском научно-образовательном Форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2010), Международном Конгрессе по андрологии (Тунис, Сусс, 2010). Апробация работы состоялась на расширенной межкафедральной конференции в ГОУ ВПО ИвГМА Росздрава (Иваново, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 42 научные работы, из них 13 - в журналах, рекомендованных ВАК. Получено 5 патентов Российской Федерации на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, выводы и практические рекомендации. Библиографический список включает 100 отечественных и 244 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 48 рисунками.

Содержание работы

бактериальный простатит бесплодный спермограмма

Материалы и методы исследования

Для выполнения поставленных задач представляемое исследование было разделено на ретроспективную и проспективную части.

С целью получения статистически значимых данных о структуре мужского бесплодия и распространенности ХБП среди мужчин из бесплодных пар был проведен ретроспективный анализ 1654 историй болезни и амбулаторных карт мужчин репродуктивного возраста из бесплодных пар с установленным мужским фактором бесплодия в браке.

В проспективную часть данного исследования было включено 269 больных ХБП и 46 практически здоровых мужчин, составивших контрольную группу. В исследование включались мужчины в возрасте от 20 до 45 лет, состоящие в гетеросексуальных брачных отношениях и живущие регулярной половой жизнью. Диагноз ХБП у наблюдаемых пациентов соответствовал критериям диагноза «хронический простатит категории II» классификации Национального института здоровья США (Nickel J.C., 1998). Из исследования исключались мужчины, имеющие тяжелые интеркуррентные заболевания, проходившие курсы иммунносупрессивного или иммуномодулирующего лечения в сроки до 6 месяцев на момент обследования, а также больные, снижение фертильности у которых можно было связать с другими заболеваниями (азооспермия, хромосомные аберрации, аномалии органов мошонки, варикоцеле, гипогонадизм, перенесшие операции на органах мошонки). В контрольную группу включались здоровые фертильные мужчины, имеющие детей в возрасте моложе одного года.

На первом этапе проспективной части исследования, для оценки факторов риска и выявления причин нарушения фертильности, а также для проведения системного анализа механизмов нарушения фертильности при ХБП, из включенных в исследование больных ХБП, были выделены две группы. В группу фертильных больных ХБП было включено 105 мужчин, страдающих ХБП более одного года и имеющих детей моложе одного года. В группу бесплодных больных ХБП было включены 164 мужчины, страдающих ХБП при условии, что продолжительность анамнеза ХБП превышала продолжительность периода вынужденного бесплодия. Данное деление на группы было предпринято для того, чтобы наиболее эффективно сравнить изучаемые параметры бесплодных больных ХБП с аналогичными показателями мужчин двух «контрольных» групп (фертильные здоровые и фертильные больные ХБП). Используя данный подход, мы получили возможность выделить изменения, характерные для всех больных ХБП, с одной стороны, или только для бесплодных с ХБП, с другой, а также определить факторы, имеющие патогенетическое значение в развитии бесплодия при ХБП. Затем пациенты из бесплодных пар были разделены на тех, у кого нарушение фертильности было первичным (n = 64) и вторичным (n = 100). Поскольку обнаружение ХБП при сниженном качестве спермы не означает отсутствие иных, не установленных, в том числе генетических причин бесплодия, пациенты с первичным бесплодием были исключены из дальнейшего анализа. В результате в исследуемую группу вошли только больные с вторичным бесплодием, продолжительность которого была меньше продолжительности анамнеза простатита.

На втором этапе проспективной части исследования, с целью изучения возможности терапии ХБП в восстановлении мужской фертильности, на основании анализа восстановления репродуктивной функции больных мужчин была проведена оценка эффективности лечения ХБП (n = 87). Всем пациентам проведен курс мультимодальной терапии, включающий применение только валидизированных в РФ методов лечения. Атибактериальная терапия проводилась в течение четырех недель и включала ежедневный прием фторхинолонов в терапевтических дозах (ципрофлоксацин 1000 мг/сут. или ломефлоксацин 400 мг/сут., per os). Все мужчины получали б₁-адреноблокаторы (доксозозин 1-2 мг/сут.). В качестве физиотерапевтического воздействия больным проводилась трансректальная тепловибромагнитотерапия. Всем пациентам рекомендовали прием токоферола (300 мг\сут., 8 нед.). Результаты эффективности лечения ХБП оценивались дважды: непосредственно после завершения лечения и через 10 недель. Выводы о влиянии терапевтических мероприятий на состояние фертильности были сделаны по каждому пациенту на основании количественного анализа дискриминационных показателей спермограммы и верифицированных нами патогенетически значимых факторов потери фертильности при ХБП.

При обследовании пациентов использованы следующие методы:

Клинические: общий и андрологический анамнез, анкетирование с применением «Системы суммарной оценки симптомов хронического простатита» (Лоран О.Б., Сегал А.С., 2001) и рутинное физикальное обследование.

Ультразвуковые исследования добавочных половых желез и органов мошонки проводились с применением конвексного абдоминального и ректального мультипланового датчиков по стандартным методикам. Для оценки эвакуаторной способности семенных пузырьков их УЗ-исследования выполнялись до- и после эякуляции.

Исследование эякулята. Эякулят получали путем мастурбации при условии 3-5 дневного полового воздержания и предварительного гигиенического туалета наружных половых органов. Изучение семенной жидкости производилось по протоколу ВОЗ «Исследование эякулята и спермцервикального взаимодействия» (4 редакция, 1999). Для исключения ошибок, спермограмма при первичном обследовании в случае наличия патоспермии, дублировалась через 2 недели.

По завершению исследования спермы по основным дискриминационным параметрам (концентрация, подвижность, морфология) вычислялся интегральный индекс качества спермы (ИКС), показывающий, какое количество морфологически нормальных, прогрессивно подвижных сперматозоидов содержится в 1 мл эякулята: ИКС = K (a + b) (100 - m)/10000, где (К) ? концентрация спермы (млн/мл); (а) ? сперматозоиды с быстрой и прогрессивной линейной подвижностью (%); (b) ? сперматозоиды с медленной линейной и нелинейной прогрессивной подвижностью (%); (m) - относительное количество морфологически аномальных сперматозоидов (%).

Электрокинетический потенциал (ЭКП) сперматозоида измерялся амплитудно-частотным методом в микроэлектрофоретической камере в электрическом поле низкой частоты (0,25 Гц, 7 В) по методике К.К. Смирнова (1985). В каждой пробе производили измерение 100 отдельных сперматозоидов и вычисляли среднее значение.

Для анализа размеров и формы сперматозоидов, использован метод компьютерной морфометрии с помощью аппаратно-програмного комплекса «ВидеоТест-Мастер» (Россия). Оценивались средняя площадь, длина, ширина и периметр сперматозоидов, а также ряд величин, характеризующих морфометрические особенности половых клеток, основанных на методах математического моделирования (диаметр эквивалентный, факторы формы круга и эллипса, округлость и удлиненность сперматозоидов).

Исследование на наличие антиспермальных антител производились в нативном эякуляте. Методом MAR-test («Ferti Pro», Бельгия) вычисляли долю подвижных сперматозоидов, покрытых антителами IgG (MAR % IgG).

Биохимические исследования: определение концентрации фруктозы и лимонной кислоты производилось аналитическим методом на ФЭК при длине волны 530 нм и 430 нм соответственно (Горюнов В.Г. с соавт., 1993). Концентрацию ионов Zn и Mg в эякуляте изучали атомно-адсорбционным методом на плазменном спектрофотометре при длине волны 213,8 нм и 285,2 нм соответственно. Содержание малонового диальдегида (МДА) в спермальной плазме определяли спектроколориметрически (СФ-200) по методу K. Jagy (1968). Идентификация нитратов в сперме осуществлялась потенциометрически по Д. Скугу (1979) после предварительного осаждения белков сернокислым цинком. Для исключения искажения результатов анализа под влиянием экзогенных нитратов, в течение пяти дней из пищевого рациона мужчин исключались консервы, копчености, свежие овощи и другие богатые нитратами продукты, употребление которых, возможно, могло отразиться на уровне NO в организме в целом и эякуляте в частности.

Исследование секрета простаты и материала из уретры проводили по стандартным методикам. По показаниям в мазках-соскобах из уретры и секрете простаты методом ПЦР в реальном масштабе времени определяли наличие ДНК Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis с использованием коммерческих систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и амплификатора iCycler iQTM (BIORAD, USA) с оптической насадкой по стандартной методике.

Бактериологическое исследование секретов половых желез включало в себя идентификацию микроорганизмов, вычисление числа колониеобразующих единиц (КОЕ), оценку антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом (Сидоренко С.В., 1998) и интегрального показателя антиинфекционной резистентности (ПАИР) эякулята с помощью планшетного фотометра Multiskan-Ascent (Termo-Labsystems, Финляндия). Тестирование осуществлялось по трем штаммам микроорганизмов: Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa. За основу была взята методика оценки бактерицидных свойств сыворотки крови (Скала Л.З., 2004).

Иммуноферментные исследования: в периферической крови определяли гипофизирные (ФСГ, ЛГ, пролактин) и стероидные гормоны (тестостерон, эстрадиол), использовались тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и ИФА-ридер «Multiskan» (Финляндия).

Иммунологические исследования: определение относительного содержания основных популяций лимфоцитов и моноцитов в периферической крови и сперме с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD11b и CD95 (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на цитометре FACScan («Becton Dickinson», USA) с использованием программы Lysys II. Функциональные тесты включали определение количества НСТ-позитивных клеток в спонтанном (НСТ) и стимулированном зимозаном (НСТ-з) тесте с расчетом индекса фагоцитарного резерва (ИФР) по формуле: ИФР = (НСТз - НСТ) / НСТ (Демин А.А., 1976).

Для статистической обработки результатов исследования использовался пакет прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., USA). Поскольку распределение результатов исследования отличалось от нормального, а также в ряде случаев имелся малый объем выборки, применялись методы непараметрического анализа, результаты представлены в виде медианы с указанием верхнего и нижнего квартилей. О достоверности различий судили при помощи критериев Вилкоксона, Манна-Уитьни и хи-квадрат. Различие между сравниваемыми величинами признавалась достоверным при p < 0,05. Статистический анализ частот встречаемости изучаемых признаков проводился по принципам анализа классической четырехпольной таблицы абсолютных частот с использованием точного критерия Фишера. Чтобы избежать так называемой «проблемы множественных сравнений» (Реброва О.Ю., 2003), в статистической обработке полученных результатов использован однофакторный дисперсионный анализ по методу Краскелла-Уоллиса для независимых выборок. При принятии альтернативной гипотезы о различии групп (при p < 0,05) делался вывод о том, что группы получены из разных генеральных совокупностей и проводилось парное сравнение групп с использованием теста Манна-Уитни. Для проведения корреляционного анализа использовался метод ранговой корреляции Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение

Медиана возраста бесплодных больных ХБП составила 35,0 (29,0 - 40,0) лет, различия с контрольной группой и группой фертильных пациентов являлись статистически не достоверными. Медиана периода вынужденного бесплодия (ПВБ) бесплодных больных ХБП составила 24,0 (18,0 - 36,0) месяца. Медиана продолжительности анамнеза ХБП у фертильных больных была меньше (p = 0,041), чем у бесплодных: 3,0 (2,0 - 4,0) и 4,0 (2,5 - 4,0) лет соответственно

Выявлены положительные корреляционные связь между возрастом больных и ПВБ (r = 0,19 при p < 0,048), между продолжительностью анамнеза ХБП и возрастом больных (r = 0,48 при p < 0,001), а также между продолжительностью анамнеза ХБП и фактом констатации бесплодного брака (r = 0,14 при p = 0,040). Среди бесплодных больных ХБП (рис. 1) имелась положительная взаимосвязь продолжительности заболевания и ПВБ.

Рис. 1. Взаимосвязь продолжительности ПВБ и анамнеза ХБП

Рис. 2. Взаимосвязь продолжительности ПВБ и частоты обострений ХБП

Расчеты показали, что вероятность нарушения фертильности при продолжительности анамнеза ХБП > 2 лет составляет 70,3% (ОШ 2,72), > 5 лет - 77,1% (ОШ 4,02). При анамнезе ХБП от 3-х до 5 лет абсолютный риск снижения показателей спермограммы ниже нормативных значений составляет 59,9% (ОШ 1,47), от 5 до 10 лет - 75,4% (ОШ 3,07), более 10 лет - приближается к 100%.

Медиана частоты обострений ХБП у бесплодных больных достоверно превышала аналогичный показатель группы фертильных пациентов: 2,0 (2,0 - 3,0) и 2,0 (1,0 - 2,0) раз в год соответственно (p = 0,018). Среди бесплодных больных ХБП имелась положительная зависимость (рис. 2) частоты обострений заболевания и ПВБ (r = 0,21 при p = 0,010). Вероятность нарушения фертильности при частоте обострения ХБП > 2 раз в год составляет 57,3% (ОШ 2,58).

Жалобы больных соответствовали классической клинической картине ХП и в большинстве случаев были представлены болевым и дизурическим симптомокомплексами. У фертильных больных ХБП отмечена большая частота встречаемости симптомов по сравнению с бесплодными. Следует отменить меньшую частоту встречаемости болей / парестезий в промежности, прерывистого мочеиспускания и ощущения неполного опорожнения мочевого пузыря у бесплодных больных ХБП при большей частоте выявления простатореи и жалоб на появление или усиление болей / дискомфорта после эякуляции (p < 0,05 во всех случаях). По трем основным параметрам симптоматики (боль, дизурия, качество жизни) характеризующим интенсивность и частоту проявлений заболевания и его влияние на жизнь больного человека, а также по двум интегральным показателям, отражающим суммарные клинические проявления изолированно (ИС-ХП) и комплексно, с учетом влияния на качество жизни (КИ-ХП), бесплодные больные ХБП имели достоверно меньшие проявления болезни (p < 0,001 во всех случаях). Корреляционный анализ не выявил достоверных взаимозависимостей между отдельными клиническим проявлениями ХБП и наличием бесплодия.

Исследования состава и качества эякулята выявили ряд характерных особенностей в состоянии репродуктивного здоровья бесплодных больных ХБП (рис. 3). Различные варианты патоспермии были характерны для всех обследованных мужчин. Следует отметить, что вопрос о влиянии семенных лейкоцитов на фертильные свойства эякулята остается дискутабельным, в то время как одни авторы не наблюдают нарушений функций сперматозоидов при лейкоцитоспермии (Ziyyat A. et al., 2008; Korrovits P. et al., 2008), другие считают, что лейкоцитоспермия связана со снижением количества сперматозоидов и нарушением их подвижности, морфологии и функциональных возможностей (Gambera L. et al., 2007; Piomboni P. et al., 2008). J. Erenpreiss с соавт. (2002) и G. Ricci с соавт. (2002) предлагали считать лейкоспермию следствием, а не причиной нарушения фертильных свойств эякулята, так как семенные лейкоциты необходимы для фагоцитоза сперматозоидов с поврежденной ДНК.

Рис. 3. Основные показатели спермограмм мужчин по группам

Примечание: группа 1 - фертильные здоровые мужчины; группа 2 - фертильные больные ХБП; группа 3 - бесплодные больные ХБП.

* - различия с группой 1 достоверны при p < 0,05; ** - различия с группой 1 достоверны при p < 0,001; ^# - различия между группами 2 и 3 достоверны при p < 0,01; ^# # - различия между группами 2 и 3 достоверны при p < 0,001

Мы выявили, что если отклонения качественных и количественных показателей спермограмм от нормы ВОЗ у здоровых мужчин достаточно редки (10,9%), то у фертильных пациентов с ХБП они встречаются уже в 31,4% случаев, а в группе бесплодных патоспермия констатирована у 79,5% больных (различия в частотах патоспермии между группами достоверны при p < 0,01). Медиана концентрации лейкоцитов в сперме была существенно повышена в обеих группах пациентов с ХБП, причем достоверных различий между группами не выявлено. По частоте констатации лейкоцитоспермии (> 1 млн/мл), также не выявлено различий между группами фертильных и бесплодных с ХБП, она выявлена у 6,5% здоровых мужчин, у 66,7% фертильных и у 65,2% бесплодных больных ХБП (рис. 4).

Рис. 4. Частоты встречаемости лейкоцитоспермии и некоторых других вариантов патоспермии у мужчин по группам.

Примечание: группа 1 - фертильные здоровые мужчины; группа 2 - фертильные больные ХБП; группа 3 - бесплодные больные ХБП.

* - различия с группой 1 достоверны при p < 0,05; ** - различия с группой 1 достоверны при p < 0,001; ^# - различия между группами 2 и 3 достоверны при p < 0,01; ^# # - различия между группами 2 и 3 достоверны при p < 0,001

Несмотря на имеющуюся лейкоцито- и бактериоспермию, основные дискриминационные параметры спермограммы пациентов группы фертильных больных ХБП соответствовали критериям нормозооспермии ВОЗ. По сравнению с группой здоровых мужчин, у фертильных больных ХБП имело место умеренное, но достоверное (p < 0,05) снижение количества прогрессивно-подвижных сперматозоидов [56,0 (46,0 - 64,0)%] и увеличение концентрации патологических форм мужских гамет [70,0 (57,0 - 75,0)%], не выходящее за рамки нормозооспермии. По величине показателя pH, ИКС, частотам констатации гипоспермии, агломерации сперматозоидов, терато- и некрозооспермии достоверных различий между группой здоровых и группой фертильных больных ХБП не получено. У них было отмечено статистически достоверное увеличение концентрации спермы [180,0 (120,0 - 210,0) млн/мл] и частоты констатации полизооспермии > 200 млн/мл (27/105, 25,7%) как по сравнению с группой здоровых мужчин (2/46, 4,4%), так и группой бесплодных больных ХБП (8/100, 8,0%). Возможно, что повышение концентрации сперматозоидов у этих мужчин способствовало поддержанию пула прогрессивно-подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов на «фертильном» уровне.

В отличие от фертильных больных ХБП, спермограммы большинства бесплодных пациентов имели отклонения от нормы. Для 65,9% включенных в группу мужчин была характерна астенозооспермия различной степени выраженности [38,0 (20,0 - 54,0)%], у 23,2% констатирована тератозооспермия [78,0 (70,0 - 85,0)%], в 9,8% случаев выраженная некроспермия (> 50%). Кроме этого, у бесплодных больных ХБП по сравнению с фертильными пациентами достоверно чаще констатировалась гипоспермия (p < 0,01), повышенная вязкость спермы (p < 0,001), снижение pH эякулята (p < 0,001) и агломерация сперматозоидов (p < 0,05). Следует отметить, что случаев олигозооспермии выявлено не было.

Биохимический анализ эякулята показал достоверное снижение концентраций Zn [0,50 (0,33 - 0,69) мкмоль\мл], фруктозы [31,71 (23,36 - 44,00) мкмоль\мл] и лимонной кислоты [41,05 (22,65 - 54,40) мкмоль\мл], а также суммарного содержание Zn и Mg в эякулятах в группе бесплодных больных ХБП по сравнению с аналогичными параметрами двух контрольных групп. Для фертильных пациентов было характерно лишь умеренное снижение концентрации фруктозы [42,16 (24,26 - 64,77) мкмоль\мл]. Известно (Lin Y.C. et al., 2000; Gуmez Y. et al., 2007), что снижение спермальных концентраций Zn, Mg и цитрата свидетельствует о нарушении функциональной активности простаты, а уменьшение концентрации фруктозы является возможным следствием затруднения опорожнения семенных пузырьков (Marconi M. et al., 2009). Выявленное ранее снижение pH семенной жидкости у бесплодных больных также подтверждает данное умозаключение. Поэтому, для оценки структуры и функциональной активности семенных пузырьков был проведен динамический ультразвуковой мониторинг размеров семенных пузырьков до и после эякуляции, в результате которого мы смогли получить информацию о частоте нарушения опорожнения данных придаточных половых желез.

Рис. 5. Частоты выявления нарушений структуры и функциональной активности простаты и семенных пузырьков у мужчин по группам.

Примечание: группа 1 - фертильные здоровые мужчины; группа 2 - фертильные больные ХБП; группа 3 - бесплодные больные ХБП

* - различия с группой 1 достоверны, p < 0,05; ** - различия с группой 1 достоверны, p < 0,001; ^# - различия между группами 2 и 3 достоверны, p < 0,05

По частоте выявления нарушенного опорожнения (уменьшение размеров после эякуляции менее чем на 65% от исходного состояния) хотя бы одного семенного пузырька (рис. 5) группа бесплодных мужчин (61/67, 91,1% обследованных) достоверно отличалась от группы здоровых волонтеров (4/34, 11,8%, p < 0,001) и группы фертильных больных ХБП (34/51, 66,7%, p = 0,031): отсутствие полноценного опорожнения семенных пузырьков у бесплодных больных ХБП встречалось относительно чаще. Риск бесплодия при нарушении опорожнения хотя бы одного семенного пузырька составляет 63,8% (ОШ = 3,85), при двусторонней обструкции он возрастает до 65,6% (ОШ = 5,97). Ранее уже была показана необходимость поддержания нормальной концентрации фруктозы в эякуляте для сохранения его фертильных свойств, поэтому выраженное нарушение опорожнения семенных пузырьков, следует также признать вероятным фактором нарушения фертильности.

Анализ результатов УЗИ простаты показал (см. рис. 5), что у бесплодных больных ХБП на фоне типичных для этого заболевания особенностей эхоструктуры простаты, достоверно чаще выявлялся фиброз и простатолитиаз. Причем частота констатации нарушенного опорожнения хотя бы одного семенного пузырька находилась в положительной корреляционной зависимости от факта выявления простатолитиаза (r = 0,56 при p = 0,004) и продолжительности анамнеза простатита (r = 0,37 при p = 0,008). Эти данные согласуются с описанными выше результатами изучения анамнеза больных ХБП - для бесплодных больных характерна большая продолжительность заболевания, необходимая для формирования простатических конкрементов. Фиброз простаты способствует снижению функциональной активности семенных пузырьков и самой предстательной железы: выявлены достоверные негативные корреляции между наличием фиброза и суммарным содержанием Zn (r = - 0,33 при p = 0,001) и концентрацией фруктозы в эякуляте (r = - 0,31 при p < 0,001). Расчеты показали, что вероятность нарушения фертильности у больных ХБП при наличии простатолитиаза составляет 73,8% (ОШ = 2,17).

При ультрасонографии органов мошонки у больных ХБП не было отмечено нарушений нормальной эхоструктуры гонад и различий в изолированных объемах яичек и суммарном тестикулярном объеме между группами. Исследования половых гормонов в периферической крови показали, что во всех сравниваемых группах мужчин концентрации тестостерона, ФСГ, ЛГ и пролактина находились в пределах возрастных норм (Jockenhovel F., 2004), достоверных различий между группами не обнаружено.

Учитывая отмеченное выше отсутствие достоверных различий в концентрации лейкоцитов в эякулятах фертильных и бесплодных больных ХБП, а также для исследования роли иммунных процессов в патогенезе мужского бесплодия у больных ХБП, нами проведено изучение фенотипа, экспрессии активационных маркеров и функциональной активности лейкоцитов периферической крови и эякулята обследованных мужчин.

Мы выявили, что популяционный состав, уровень активации и функциональная активность лейкоцитов периферической крови бесплодных больных ХБП не отличались от аналогичных показателей фертильных пациентов.

Рис. 6. Особенности фенотипа семенных лимфоцитов у мужчин по группам.

Примечание: группа 1 - фертильные здоровые мужчины; группа 2 - фертильные больные ХБП; группа 3 - бесплодные больные ХБП.

* - различия с группой 1 достоверны, p < 0,01; ^# - различия между группами 2 и 3 достоверны, p < 0,05; ^## - различия между группами 2 и 3 достоверны, p < 0,01

Исследования локального иммунного статуса показали отсутствие достоверных различий фенотипов лимфоцитов эякулята между группами здоровых фертильных мужчин и фертильных больных ХПБ. Напротив, у бесплодных больных ХБП имело место статистически значимое снижение доли Т-лимфоцитов, обусловленное преимущественным снижением уровня цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) на фоне умеренного роста популяции Т-хелперов (рис. 6). Кроме ЦТЛ, достоверно сниженной оказалась популяция естественных киллеров (ЕК).

Имеются экспериментально полученные данные (Vykhovanets E.V., 2005), свидетельствующие о том, что для нормальной простаты является характерным значительно увеличение доли Т-лимфоцитов по сравнению с В-клетками (в 5-10 раз больше, чем в других тканях) и относительного количества лимфоцитов с цитотоксической активностью (ЦТЛ и ЕК), до двух третей от всех клеток. В нашем исследовании субстратом изучения выступала не ткань простаты, а эякулят, однако мы выявили схожие тенденции в профилях субпопуляций лимфоцитов: соотношение CD4+/CD8+ у здоровых мужчин, а также у фертильных больных ХБП (различий между этими группами нет) значительно ниже аналогичного показателя периферической крови. Эти сдвиги обусловлены как раз преобладанием ЦТЛ (CD8+) в секрете половых желез фертильных мужчин. У бесплодных больных ХБП было отмечено достоверное увеличение данного соотношения в результате уже описанных выше субпопуляционных сдвигов и снижения уровня ЦТЛ (см. рис. 5). О преобладании ЦТЛ в эпителии ПЖ, полученных при аутопсии здоровых мужчин, сообщали D.G. Bostwick с соавт. (2005), также описавшие инверсию соотношения CD4+\CD8+ лимфоцитов и сделавшие вывод о преимущественно клеточном характере иммунного ответа в ПЖ.

Анализ данных литературы и собственного материала позволяют нам заключить, что первую линию обороны от чужеродных агентов в простате составляют цитотоксические клетки. Поэтому, не менее актуальным является изучение их функциональной активности. Оценка экспрессии рецепторов ИЛ-2 (CD25) и Fas (CD95) на CD4+ и CD8+ лимфоцитах изолированно выявила интересные тенденции. Оценка уровня названных маркеров активации на CD4+ лимфоцитах, обладающих преимущественно хелперной активностью, не показала наличия различий между группами мужчин. Напротив, различия выявлены в количестве ЦТЛ, имеющих молекулу CD95 на своей поверхности: у бесплодных мужчин отмечено достоверное снижение данных клеток. Известно, что экспрессия рецептора к ИЛ-2 (CD25) свидетельствует об активации клеток, а уровень экспрессии Fas-антигена (CD95) - о готовности клеток к апоптозу, который является основным механизмом элиминации активированных клеток (Ярилин А.А., 1999).

В связи с этим мы сочли целесообразным оценить соотношение активированных и готовых вступить в апоптоз лимфоцитов в семенной жидкости в зависимости от состояния фертильности больных ХБП. Проведенные расчеты показали, что величина соотношения спермальных ЦТЛ с фенотипами CD25+/CD95+ в группе здоровых фертильных мужчин составляет 1,03 (0,92 - 1,15) и статистически соответствует величине данного индекса в группе фертильных больных ХБП - 0,93 (0,82 - 1,02); тогда как у бесплодных пациентов величина его увеличивается до 2,17 (1,62 - 2,84), различия с группами здоровых мужчин и фертильных больных ХБП достоверны (рис. 7). Корреляционный анализ (рис. 8) также подтвердил достоверную взаимосвязь индекса ЦТЛ CD25+/CD95+ с концентрацией сперматозоидов (r = - 0,47 при p < 0,05) и степенью некроспермии (r = 0,36 при p < 0,01).

Известно, что фактором, определяющим результат воспалительного процесса в простате, является баланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами (Ковальчук Л.В. с соавт., 2005; Jang T.L. et al., 2003). Угнетение апоптоза активированных ЦТЛ, вне зависимости от причины возникновения, потенциально опасно для сперматогенеза. Иммунный ответ и связанные с ним воспалительные реакции могут вызвать неспецифическое поражение близлежащих тканей (Фильченков А.А., 2002; Perdichizzi A. et al., 2007). Мы можем предположить, что активированные клетки, не подвергнувшиеся процессу апоптоза своевременно, могут реализовать свою активность в отношении других клеток-мишеней, например, сперматозоидов.

Также нами установлено, что неблагоприятное влияние на состояние фертильности больных ХБП оказывало снижение активационных возможностей спермальных моноцитов (предшественников тканевых макрофагов), что подтверждено уменьшением экспрессии молекул CD95 и CD11b на моноцитах у бесплодных больных (маркеры апоптоза и межклеточной костимуляции), и нарушением функциональной активности семенных нейтрофилов. Если у фертильных больных ХБП бактерицидные свойства семенной плазмы поддерживаются на достаточно высоком уровне, благодаря достоверному повышению спонтанной НСТ-активности нейтрофилов и повышенной генерации активных форм кислорода в результате «респираторного взрыва», то у бесплодных больных, вероятно, происходит декомпенсация указанного механизма - нами выявлено дальнейшее снижение индекса фагоцитарного резерва (ИФР) нейтрофилов, свидетельствующее об истощении их функциональных резервов.

Таким образом, к иммуноопосредованным факторам риска снижения фертильности у больных ХБП следует отнести снижение содержания лимфоцитов с цитотоксической активностью в семенной жидкости и нарушение апоптоза данных клеток. АР бесплодия при увеличении соотношения CD4+ / CD8+ в эякуляте более 1,72 составляет 63,2% (ОШ 3,40); при увеличении соотношения ЦТЛ спермы с фенотипами CD25+ / CD95+ более 1,62 - 92,3% (ОШ 19,05). Расчеты показали, что АР бесплодия при снижении концентрации CD11b+ моноцитов эякулята менее 26,1% составляет 78,6% (ОШ 4,65), при снижении ИФР нейтрофилов менее 0,25 - 80,0% (ОШ 5,63).

Полученные нами данные позволяют предположить, что имеющиеся иммунологические нарушения могут способствовать снижению бактерицидных свойств семенной плазмы у бесплодных больных ХБП. Анализ результатов бактериологических исследований эякулята выявил достоверные различия в частотах бактериоспермии между изучаемыми группами. Количество нестерильных эякулятов в группе бесплодных мужчин (87,8%) достоверно превышало показатель здоровых мужчин (4,4% при p < 0,001) и группы фертильных больных (77,3% при p < 0,01). Группы отличались также по структуре идентифицированных микроорганизмов. Если у здоровых фертильных мужчин спорадически встречающаяся бактериоспермия во всех (2/46) случаях была представлена условнопатогенной флорой (КНС), а в группе фертильных больных ХБП кроме КНС, часто встречался Enterococcus spp. (24/97), то у бесплодных пациентов в значительной части исследованных образцов (27/95) определялась E.coli (рис. 9). Аналогичные данные представлены и другими исследователями, указавшими на способность E.coli оказывать патогенное воздействие на акросому, среднюю часть и хвост сперматозоида, снижая его подвижность, а также о том, что гемолизин, продуцируемый этим микроорганизмом, способен разрушать мембраны сперматозоидов (Diemer T. et al., 2003). В нашем исследовании микробные пейзажи в группах фертильных и бесплодных больных ХБП различались между собой именно по частоте идентификации кишечной палочки (p < 0,001). Было определено, что АР бесплодия при выявлении в эякуляте E.coli составляет 84,0% (ОШ 4,1).

В 16,9% случаев бактериоспермии (14/83) у бесплодных больных ХБП были выявлены бактериальные миксты (см. рис. 9). По частоте определения микробных ассоциаций группа бесплодных достоверно отличается от группы фертильных больным ХБП (p < 0,05). Выявлена отрицательная корреляция между наличием более одного диагностически значимого штамма в эякуляте и фактом констатации фертильного брака (r = - 0,22 при p < 0,001). АР бесплодия при наличии микробных ассоциаций равен 90,9% (ОШ 6,94).

Результаты исследования антиинфекционной резистентности спермальной плазмы показали, что для бесплодных больных ХБП было характерно достоверное увеличение ПАИР (увеличение% колоний микроорганизмов, выросших в бульоне с добавлением спермальной плазмы исследуемого человека по сравнению с бульоном без спермальной плазмы) по всем тестируемым штаммам (p < 0,001 во всех случаях по сравнению с итоговыми показателями двух контрольных групп).

В группе бесплодных больных ХБП количество мужчин, имеющих ПАИР эякулята более 100% (то есть состояние полного отсутствия антибактериальной резистентности in vitro: добавление спермальной плазмы ускоряло рост тестируемого штамма) достоверно превышало аналогичный показатель групп здоровых мужчин и фертильных больных ХБП во всех случаях. Превышение ПАИР 100% рубежа при исследовании резистентности к St.epidermidis было отмечено в 60,0% протестированных эякулятов в группе бесплодных больных ХБП при отсутствии таких случаев в группе фертильных больных и группе здоровых мужчин; по штамму E.coli: в 82,5%, 8,3% и 0% соответственно; по штамму Ps.aeruginosa: 25,0%, 4,2% и 0% соответственно (p < 0,05 во всех случаях). У фертильных больных ХБП, напротив, имели место обратные тенденции: повышение антибактериальной резистентности эякулята ко всем тестируемым штаммам микроорганизмов, выразившееся в снижении медианы ПАИР по сравнению с аналогичными параметрами группы здоровых фертильных мужчин.

Кроме изучения иммунологических аспектов антиинфекционной защиты, наше внимание было обращено на изучение механизмов реализации бактерицидности семенной жидкости при ХБП. Известно, что основным эффектором иммунной системы является оксид азота (NO) (Forstermann U., 2000). Исследования уровней спермальных нитратов позволяют получить косвенную информацию о продукции NO в органах мужской репродуктивной системы (Battaglia C. et al., 2001). Мы выявили достоверное повышение концентрации нитратов в семенной жидкости обеих групп больных ХБП, косвенно свидетельствовавшее о повышении продукции NO. NO и его метаболиты отличаются значительными бактерицидными свойствами, и поэтому, возможно их участие в поддержании антибактериальной резистентности семенной плазмы у больных ХБП. Известно, что при воспалении в макрофагах индуцируется iNOS, обеспечивающая гиперпродукцию NO в количествах, превышающие нормальные в тысячи раз. Биологический смысл данного процесса заключается в реализации антимикробного эффекта указанных иммунокомпетентных клеток (Li H., 2000).

В группе бесплодных больных ХБП концентрация нитратов была еще более повышена и достоверно превышала параметры обеих групп сравнения. Гиперпродукция NO в эякуляте, вероятно, превратилась у бесплодных больных ХБП из звена компенсации в звено патогенеза утраты фертильных свойств эякулята, так как для этих пациентов одновременно был характерен выраженный рост продукции МДА (достоверно превышающий аналогичный показатель группы фертильных больных ХБП), свидетельствовавший о преобладании процессов ПОЛ. Известно, что липидная фаза действует как NO-губка, высасывая NO из водной фазы и концентрируя его в малом объеме липидной (Недоспасов А.А., 1998). J.M. Potts с соавт. (2000) выявили уменьшение «текучести» мембран сперматозоидов при повышении уровня реактивных субстанций кислорода в семенной плазме и снижение оплодотворяющей способности спермы. О снижение осмотической стойкости мембраны сперматозоидов под воздействием процессов ПОЛ сообщал S. Gadkar с соавт. (2002). Вероятной причиной индукции патоспермии в данной ситуации могло явиться окислительное повреждение мембран сперматозоидов и связанное с ним нарушение аппарата движения мужских гамет.

Известно (Chen F. et al., 1999), что NO в малых физиологических концентрациях способен защищать клетки от окислительного повреждения. Обладая неспаренным электроном, NO может вступать во взаимодействие с липидными радикалами, инактивируя их реакционную способность, обрывая тем самым цепные реакции пероксидации и распространение окислительного повреждения. Высокая скорость реакции NO со свободными радикалами позволяет представить его в качестве «скавенджера» (мусорщика, поглотителя) радикалов in vivo (Zhang H. et al., 2006). Б. Брюне с соавт. (1998) сообщали о способности NO в низких концентрациях предотвращать токсические эффекты ФНО-б. Еще один из защитных эффектов NO связан с его способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов (Kuo J.H. et al., 2009) и экспрессию кодирующих их генов (Sengupta R. et al., 2009). Таким образом, NO, первоначально рассматриваемый как яд, может выступать в роли эффективного детоксикатора и протектора. Вполне возможно, что отсутствие грубой патологии спермограммы у фертильных больных ХБП на фоне лейкоцитоспермии, объяснялось протективным воздействием NO, препятствующему развитию каскадных реакций ПОЛ.

Таким образом, нами было подтверждено, что для бесплодных больных ХБП характерно повышение концентрации активных кислородных радикалов в эякуляте. Расчеты показали, что при сочетанном увеличении концентрации нитратов и МДА в семенной жидкости выше 1,10 ммоль\л и 8,56 ммоль\л соответственно (рис. 11), риск бесплодия составляет 68,0% (ОШ 2,13).

Мы предположили, что реализация патогенного воздействия нарушенных показателей метаболизма (гиперпродукция NO, активация процессов липопероксидации) у больных ХБП происходит через повреждение мембраны сперматозоида. Оценка состояния клеточных мембран половых клеток для объективизации возможного ущерба осуществлялась с помощью морфометрии сперматозоидов и измерении электрокинетического потенциала (ЭКП).

Морфометрические исследования показали достоверную тенденцию к увеличению доли сперматозоидов с нарушением формы и размеров у бесплодных больных ХБП по сравнению с параметрами мужских гамет у фертильных мужчин. В эякулятах бесплодных мужчин преобладали сперматозоиды с достоверно увеличенной площадью, периметром, экваториальным диаметром клетки и диаметром Фере (рис. 12). Было характерным увеличение ширины головки сперматозоида и приближение ее формы к шарообразной, о чем свидетельствовало увеличение таких показателей морфометрии, как фактор формы круга и степень округлости и снижение показателя удлиненности биологического объекта. 95% ДИ для периметра сперматозоида у фертильных здоровых мужчин составляет 10,62 - 10,92 мкм; диаметра Фере 3,43 - 3,52 мкм; среднего габарита клетки 3,37 - 3,46 мкм. В эякулятах фертильных больных ХБП также были отмечены тенденции к увеличению габаритов гамет, но они носили не столь выраженный характер и различия с параметрами половых клеток здоровых мужчин были не достоверными (так как вышеописанные патологические изменения были характерны для меньшей части клеток эякулята). Расчеты показали, что при уменьшении доли гамет, соответствующих морфометрическим нормативам менее 25% всех сперматозоидов в эякуляте, вероятность нарушения фертильности составляет 62,5% (ОШ 5,06).