Возрастные особенности репаративного процесса в коже и костной ткани (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Возрастные особенности репаративного процесса в коже и костной ткани (экспериментальное исследование)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Введение

Актуальность проблемы

Первые годы настоящего столетия характеризуются огромным интересом теоретиков и клиницистов к изучению потенциальных возможностей стволовых костномозговых клеток. Это связано с тем, что костномозговые предшественники способны дифференцироваться не только в гемопоэтические клетки и клетки костного скелета, но и в клетки других тканей организма. Всё это определяет возможность восстановления регенераторного характера практически всех видов тканей при повреждении.

Решение этого вопроса возможно при непосредственном применении экспериментального моделирования и знания закономерностей развития костного мозга в различные периоды морфогенеза. Именно это обусловливает обострившийся интерес исследователей к закономерностям морфологического и физиологического становления костного мозга. В последнее время всё больше и больше звучат высказывания о том, что возникла острейшая необходимость в интерпретации уже давно описанных процессов морфо- и гистогенеза с физиологических позиций. Эта проблема существует давно [Lash J., Whittaker J.R., 1974], но в последние годы характеризуется потребностью в глубоком проникновении в эти процессы, а именно, крайне необходимым является развитие биохимической и физиологической интерпретаций этих явлений. Основные схемы дифференцировки и пролиферации клеток при первичном развитии тканей остаются в потенциале зрелого функционирующего организма. Вот это и обусловило выбор темы диссертационной работы на примере регенераторной и восстановительной возможностей костного мозга, которые могут быть использованы в различных отраслях медицины.

Костный мозг млекопитающих локализуется внутри костного скелета. Наибольшая функциональная активность отмечается в эпифизах трубчатых костей, где костная ткань представлена в виде сетчатой структуры. Такое анатомическое соседство не случайно, поскольку костномозговая и костная ткани проявляют функциональную взаимозависимость. Прежде всего, костномозговые стволовые клетки способны дифференцироваться как в кроветворные циркулирующие элементы, так и образовывать остеобласты. Во-вторых, кровоснабжение костного мозга и кости имеет прямое соединение. Венозные синусы костного мозга обеспечиваются кровью из питающих артерий кости и периостальной капиллярной сети [Brooks P., 1961]. Следует также подчеркнуть, что остеокласты являются производными гемопоэтических клеток, моноцитов / макрофагов. В то же время, сетчатая структура эпифизов трубчатых костей обеспечивает формирование микроокружения для эффективного кроветворения. Всё перечисленное выше даёт некоторым авторам право определять функциональную взаимозависимость костный мозг - костная ткань как функциональную единицу [Compston J.E., 2002]. В самом деле, это положение подтверждается многими исследованиями в области экспериментальной гематологии. Так, экстрамедуллярная трансплантация костного мозга всегда сопровождается развитием очагов кроветворения с сопутствующим образованием в этой области костной ткани [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980]. Данный феномен является объективным критерием того, что для полноценного функционирования ткань костного мозга нуждается во взаимодействии с поверхностью эндоста.

В аспекте излагаемого вопроса актуальным представляется изучение репаративного потенциала костного мозга при различных формах повреждения. Подобные ситуации могут возникнуть как при травматических воздействиях, так и после оперативных вмешательствах по поводу остеомиелита и удаления эпифизарных кист трубчатых костей. Особый интерес должен представлять возможный способ устранения дефекта в плоских костях черепа с помощью трансплантированных сингенных клеток костного мозга. Не менее важно морфологическое исследование микроокружения после проведения цитостатической терапии при различных гематологических заболеваниях.

Осмыслению базисных процессов, лежащих в основе репарации костного мозга и костной ткани, и посвящено настоящее исследование. Нами на основе различных экспериментальных моделей представлен материал, освещающий важность клеточно-клеточных взаимодействий и возможности ускорения репаративного процесса при повреждении кожи и костной ткани под действием ряда ростковых факторов, содержащихся в экстрактах эмбриональных тканей.

Наибольшее значение проблема стимуляции репаративных процессов в различных тканях имеет при старении организма, поскольку снижение резервных возможностей стареющего организма влечет за собой замедление процессов репарации во всех органах и тканях. Это диктует необходимость поиска эффективных и безопасных средств для стимуляции пролиферативных процессов в поврежденных тканях с целью ускорения заживления повреждений кожи и костной ткани, которые наиболее часто встречаются у людей пожилого и старческого возраста и существенно снижают качество их жизни.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния экстрактов эмбриональных тканей, содержащих биологически активные пептиды, и пептидного биорегулятора хондролюкса на регенераторные процессы при повреждении кожных покровов и костного скелета у старых животных.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить особенности регенеративного процесса на модели эксцизионных ран и ожогов кожи и механических повреждений костного скелета у старых животных.

2. Выявить основные звенья в развитии репаративного процесса у старых животных, тормозящие полноценное восстановление поврежденных тканей.

3. На основе морфологических и биохимических методов оценить возможности регуляции межклеточных взаимодействий экстрактами эмбриональных тканей.

4. Изучить эффекты аппликации экстрактов эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса на длительность и качество регенерации кожи в области эксцизионных ран.

5. Изучить эффекты аппликации экстрактов эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса на длительность и качество регенерации костной ткани при повреждении трубчатых и плоских костей у старых животных.

6. Установить отсутствие отдаленных побочных эффектов у старых животных при применении экстракта эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора.

7. Обосновать возможность использования экстрактов эмбриональных тканей для проведения экспериментальных работ по созданию препаратов, стимулирующих репаративные процессы при старении.

8. Обосновать эффективность применения пептидного биорегулятора хондролюкса для ускорения регенерации тканей при повреждениях кожи и костной ткани при старении.

Положения, выносимые на защиту

1. При старении снижается скорость и ухудшается качество репаративных процессов, протекающих в коже и костной ткани.

2. Заживление эксцизионных кожных ран у старых животных замедляется за счёт удлинения раннего периода репаративного процесса, обусловленного задержкой начала образования грануляционной ткани.

3. Аппликация на область эксцизионной раны или термического ожога экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей существенно улучшает количественные и качественные показатели процесса заживления кожных ран у старых животных.

4. Применение пептидного биорегулятора хондролюкса в виде аппликаций на поврежденную кожную поверхность у старых животных способствует ускорению процессов репарации в коже и образованию мягкого эластичного рубца.

5. У старых животных отмечается медленное восстановление костного дефекта и слабая активация стромальной ткани по периферии костного дефекта.

6. Пептидный биорегулятор хондролюкс и хрящевая пластинка, помещённые на область костного дефекта, существенно сокращают срок восстановления повреждённой кости по типу эндохондрального остеогенеза за счёт ускоренной мобилизации и активации стромальных элементов в зоне повреждения.

7. Применение пептидного биорегулятора хондролюкса в виде аппликаций на область костного дефекта усиливает пролиферацию клеток костной ткани и ускоряет репаративный процесс в трубчатых и плоских костях.

8. Применение аппликаций экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса в качестве стимуляторов репаративного процесса при повреждении кожного покрова и дефектов костного скелета не вызывает в организме старых животных признаков атипичного роста, что подтверждается морфологическим мониторингом через 6 месяцев после окончания лечения.

9. Ускорение репаративных процессов при повреждении кожи и костной ткани при старении может служить дополнительным показанием к применению лекарственного средства хондролюкса.

Научная новизна исследования

Результаты исследования восстановительного процесса при заживления эксцизионных ран кожи и дефектов костного скелета у старых животных показали значительное снижение количественных и качественных характеристик пролиферативного процесса при старении. Установлено, что заживление эксцизионных и термических повреждений кожи у старых животных значительно замедляется за счёт пролонгирования раннего периода репаративного процесса, замедления миграции клеток крови и снижения активации резидентных макрофагов и фибробластов в месте повреждения. В связи с этим время начала образования грануляционной ткани в зоне эксцизионных ран у старых животных отстает от этого показателя у молодых животных.

Впервые установлено, что среди различных эмбриональных экстрактов наиболее выраженными хемоаттрактивными свойствами обладает экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей, который содержит биологически активные пептиды, обладающие пролиферативной активностью.

Впервые показано, что аппликации с экстрактами эмбриональных хрящевой и костной тканей или пептидного биорегулятора хондролюкса на область эксцизионного или термического повреждения кожи существенно ускоряют медленно развивающийся репаративный процесс у старых животных за счет уменьшения времени до начала образования грануляционной ткани и ускорения неоангиогенеза.

Установлено, что восстановление костного дефекта у старых животных характеризуется медленным течением и сниженной активацией элементов стромальной ткани по периферии дефекта. Сокращение срока восстановления поврежденной кости у старых животных путем эндохондрального остеогенеза достигается применением пептидного биорегулятора хондролюкса и хрящевой пластинки, помещённых на область костного дефекта плоских костей черепа, за счёт ускорения мобилизации и активации стромальных элементов в зоне повреждения.

В экспериментальной модели трансплантации костного мозга в брыжейку тонкого кишечника показано, что клетки костного мозга являются источником образования остеобластов, которые формируют костный футляр для очага костного мозга, что выражается в росте миелоидного и эритроидного ростков кроветворения.

Доказано, что применение аппликаций с экстрактом эмбриональных хрящевой и костной тканей или пептидного биорегулятора хондролюкса в качестве стимуляторов репаративного процесса при повреждении кожного покрова и дефектов костного скелета не вызывает в организме старых животных побочного действия.

Практическая значимость результатов исследования

Установлено, что репаративные процессы в коже и костной ткани при старении существенно замедляются. Показано, что экстракты эмбриональных тканей обладают хемоаттрактивными свойствами и содержат биологически активные пептиды, обладающие пролиферативным действием, которые наиболее выражены у экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей. Доказано, что при аппликации экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей достигается ускорение репаративных процессов при повреждении кожи и костных дефектах у старых животных. Отсутствие побочного действия позволяет рекомендовать использовать экстракты эмбриональных тканей в качестве основы для разработки лекарственных средств, ускоряющих репаративные процессы при повреждении кожи и костной ткани при старении.

Установлена эффективность применения пептидного биорегулятора на основе экстракта из хрящевой ткани телят - хондролюкса для ускорения репаративных процессов при повреждении кожи и костной ткани при старении.

Долгосрочное морфологическое мониторирование показало отсутствие патологических процессов в организме старых животных после применения экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей или пептидного биорегулятора хондролюкса в виде аппликаций на поврежденную поверхность до полного заживления дефекта кожи или костной ткани.

Доказанные эффективность и безопасность применения экстракта эмбриональных тканей позволяет рассматривать его в качестве основы для разработки средств стимуляции репаравтиных процессов при старении.

Установленное ускорение репаративных процессов при эксцизионном и термическом повреждениях кожи и костных дефектах при аппликациях на поврежденную поверхность пептидного биорегулятора хондролюкса позволяет рекомендовать расширение показаний к его применению.

Связь с планом НИР

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Челябинского государственного института лазерной хирургии Минздравсоцразвития РФ и Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 8 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 223 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав, посвященных описанию материалов и методов исследования, изложению собственных результатов исследования и их обсуждению, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 220 источников, в том числе 42 отечественных и 178 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 95 рисунками.

Апробация результатов исследования

Основные материалы исследования доложены на следующих конференциях и конгрессах: 2 и 3 Российских конгрессах по патофизиологии (Москва, 2001, 2004), Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006), Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006), II, III, IV Международных научно-практических геронтологических конференциях «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008), IV Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006), Международном Конгрессе «Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном обществе» (Санкт-Петербург, 2007), VI Европейском конгрессе по геронтологии (Санкт-Петербург, 2007), XII Конференции «Пожилой больной» (Москва, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола, 2007), Конгрессе «Человек и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008).

Основное содержание работы

регенеративный эксцизионный скелет костный

Материалы и методы исследования

Экспериментальные животные

Основу настоящего исследования составили экспериментальные наблюдения, выполненные на животных, полученных из вивария Челябинской государственной медицинской академии (ЧГМА).

Все исследования проведены на 90 беспородных кроликах обоего пола в возрасте 36-48 мес. с массой тела 4,5-5,5 кг (старые животные). Все животные до и во время проведения эксперимента содержались в условиях стационарного вивария на стандартном пищевом рационе при свободном доступе к воде.

В пределах каждой возрастной группы по каждому виду экспериментальных животных проводили разделение на животных, у которых моделировали какое-либо повреждение, и на животных, у которых повреждение сочеталось с экспериментальным терапевтическим воздействием.

Все исследования с участием животных проводили в строгом соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. с изменениями от 1975, 1983 и 1989 гг.

Исследование регенераторной способности плоских костей

Регенераторную способность плоских костей черепа изучали по авторской методике [Курилов И.Н. и соавт., 2008]. Кролику в теменной области производили трепанацию черепа (площадь дефекта равна 2Ч2 см). Состояния наркоза достигали введением кетамина в дозировке 0,5 мг/кг. Кровотечение из эмиссариев останавливали электрокоагуляцией. Пластика костного дефекта производили сингенным хрящом из рёберно-грудинного сочленения, вложенным между двумя слоями тонко нарезанной гемостатической губки (по типу «сэндвича»). Операционные раны ушивали послойно с соблюдением правил аспетики и антисептики. Контрольные гистологические исследования и рентгенографию черепа проводили последовательно с интервалом в 7 дней с момента операции вплоть до полного замещения дефекта костной ткани.

Исследование регенераторной способности трубчатых костей

Изучение регенераторной способности трубчатых костей проводили по авторской методике [Курилов И.Н. и соавт., 2000, 2001, 2005]. Животному, находящемуся в состоянии наркоза (кетамин, 0,5 мг/кг), в площадку бедра (послойно вскрывая все ткани) вводили тефлоновую фистулу длиной 0,5 см оригинальной конструкции [Курилов И.Н. и соавт., 1997, 1998], которая шёлковой лигатурой фиксировалась к бедренной кости. Раны ушивали послойно с соблюдением правил асептики и антисептики. Контрольные гистологические исследования нарастающего костного мозга проводили последовательно с интервалом в 7 дней после оперативного вмешательства.

Изучение регенераторной способности трансплантированного сингенного костного мозга in vivo

Исследование регенераторной способности костного мозга проводили на авторской модели культивирования сингенного костного мозга в брыжейке тонкого кишечника кролика [Курилов И.Н. и соавт., 2000, 2001]. Состояния наркоза достигали введением кетамина в дозировке 0,5 мг/кг. После удаления шерстяного покрова с передней брюшной стенки и области скакательного сустава кролика животному производили срединную лапаротомию с доступом к брыжейке тонкого кишечника. Из эпифиза бедра забирали цельный костный мозг в количестве 1 мл и тотчас же вводили шприцем, содержащим 4 ЕД гепарина, между листками брыжейки вблизи сосудистых аркад. Операционные раны ушивали послойно с соблюдением правил асептики и антисептики.

Оценку результатов производили последовательно с интервалом в 7 суток после оперативного вмешательства при релапаротомиях визуально (по цвету трансплантата) и гистологически (эктопические очаги гемопоэза иссекали).

Моделирование экспериментальных повреждений кожи у лабораторных животных

Модель эксцизионных ран

Симметричные участки кожи экспериментального животного (5Ч5 см) вручную освобождали от шерстяного покрова. Состояния наркоза достигали введением кетамина в дозировке 0,5 мг/кг. Хирургическим зажимом типа «Москит» кожу по центру участка захватывали и приподнимали, после чего хирургическими ножницами на обоих участках производили выстригание кожи на всю глубину вплоть до фасции.

Оценку результатов производили визуально ежедневно и гистологически последовательно с интервалом в 7 дней от момента операции.

Модель ожога

Симметричные участки кожи экспериментального животного (5Ч5 см) вручную освобождали от шерстяного покрова. Состояния наркоза достигали введением кетамина в дозировке 0,5 мг/кг. Раскаленным предметом на коже создавали участок ожога диаметром 2 см у кролика.

Оценку результатов производили визуально ежедневно и гистологически последовательно с интервалом в 7 дней от момента ожога

Гистологические методы исследования

Гистологическое исследование проводили общепринятым методом. Для этого кусочки кожи, брыжейки и костной ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,2) и заливали в парафин. Обзорную окраску проводили гематоксилином и эозином. Коллагеновые и эластические волокна окрашивали пикрофуксином по ван Гизону.

Электронно-микроскопический метод исследования

Для электронно-микроскопического исследования были взяты биоптаты из дна и краевых отделов раневого дефекта, а также рубцовая ткань. Извлеченные образцы тканей с помощью лезвия нарезали на кусочки размером 1 мм³ в капле глютаральдегида (2,5%). Для фиксации использовали смесь Карновского, состоящую из 25% раствора глютаральдегида (10 мл), 40% раствора формальдегида (5 мл) и 0,1 М раствора фосфатного буфера рН 7,2-7,4 (85 мл). Материал фиксировали в смеси Карновского в течение 2 ч при комнатной температуре с последующей дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия в течение 1 ч при комнатной температуре.

После промывки и обезвоживания в спиртах восходящей крепости образцы ткани пропитывали и заливали в смесь эпонов, состоящей из двух составных компонентов: смеси А - 62 мл эпона 812 и 100 мл DDSA (додецил-янтарный ангидрид) и смеси В - 100 мл эпона 812 и 89 мл MNA (метил-надик ангидрид). Полную смесь эпонов готовили из 2,5 мл смеси А, 2,5 мл смеси В и 0,15 мл (4 капли) отвердителя DMP-30 (2, 4, 6 три (диметил-аминометил) - фенол). Полимеризацию залитого материала проводили в течение ночи в термостатах при температуре 37°С и затем в течение 24 ч при температуре 58°С.

Ультратонкие срезы (толщиной 150-50 нм) готовили на ультрамикротоме LKB-7A (LKB, Швеция) с применением аппарата для изготовления стеклянных ножей KNIF - MARKER LKB-91 (LKB, Швеция). К ножу прикрепляли специальные ванночки, наполненные дистиллированной водой, на поверхность которой срезы переходили при резке.

Полученные таким образом ультратонкие срезы монтировали на «бленды» - медные сетки диаметром до 3 мм, которые имели на своей поверхности отверстия диаметром 0,01 мм, что позволяло исследовать в электронном микроскопе 8-10 полей зрения. Для избежания деформации срезов при действии электронного луча предварительно на чистые сетки наносили опорную пленку из раствора формвара, на которую снимали срезы с поверхности воды.

Для электронно-микроскопического исследования срезы на блендах контрастировали сначала 4,5% раствором уранилацетата в течение 10 мин. с тщательной последующей промывкой сеток дистиллированной водой, затем еще в течение 10 мин. цитратом свинца по модифицированному методу Рейнольдса в присутствии едкого натра для поглощения СО₂ также с последующей промывкой.

Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM - 100S (JEOL, Япония) в трансмиссионном режиме.

Компьютерный анализ электронно-микроскопических изображений

Морфометрический анализ ультраструктуры фибробластов на архивированных электроннограммах проводили с использованием программного обеспечения «Видеотест-Морфология 5.0». Анализировали по 10 электронно-микроскопических изображений фибробластов эксцизионной раны на 7, 14, 21 и 28 сутки заживления (соответственно, без введения хондролюкса - контроль и при введении пептида). Анализ электроннограмм проводили при увеличении Ч4500. Определяли объемную плотность органоидов (Vv) - митохондрий, шероховатого эндоплазматического ретикулума, рибосом, лизосом и микропиноцитозных везикул (МПВ) в% от общего объема цитоплазмы. Указанный параметр является общепринятым при изучении ультраструктурных признаков функциональной активности клеток.

Статистическую обработку результатов электронно-микроскопического исследования проводили с помощью компьютерной программы STATISTICA 5.0 (Statsoft).

Экстракты эмбриональных тканей

В работе использовали 14-дневные куриные эмбрионы. Скорлупу яиц обрабатывали 70% раствором этилового спирта, после чего скорлупу разбивали, грудную и брюшную полости зародышей вскрывали, а затем осторожно извлекали зародышевые органы: печень, сердце и сосудистый пучок, хрящевую и костную ткани. Полученные органы раздельно гомогенизировали в стеклянном ручном гомогенизаторе в присутствии среды RPMI с глутамином, центрифугировали в течение 10 минут при скорости вращения 5000 об/мин., надосадочную жидкость аккуратно сливали и разводили средой RPMI с глутамином в 2 раза, после чего трижды замораживали и оттаивали. Полученные комплексные препараты из эмбриональной печени, эмбрионального сердца и эмбриональной хрящевой и костной тканей разливали по стерильным флаконам и хранили при температуре - 20єС.

Препараты использовали в виде аппликаций на поверхность ожога или раны экспериментальных животных при перевязках, производимых ежедневно.

Методы изучения экстрактов эмбриональных тканей

Определение хемотаксической активности нейтрофилов в периферической крови

Под эфирным наркозом у крыс из глазного сосудистого пучка получали 4-5 мл крови. Кровь стабилизировали гепарином (125 ед/мл) с добавлением 6%-ного раствора декстрана в соотношении 4:1. Для получения лейковзвеси кровь отстаивали в темостате в течение 30 мин. Плазму наслаивали на двойной градиент плотности фиколл-урографина: плотность нижнего градиента составляла 1,095 г./см³, плотность верхнего градиента - 1,077 г./см³; объём верхнего и нижнего градиентов по 1 мл, объём плазмы - 2-3 мл. Полученную жидкость центрифугировали в центрифужной пробирке в течение 40 мин при скорости вращения 1500 об/мин. Пипеткой снимали кольцо нейтрофилов (объём около 1 мл) и трёхкратно отмывали 2 мл раствора Хэнкса по 7-10 мин при 1500 об/мин. Полученные нейтрофилы взвешивали в 100 мл питательной среды 199 и ресуспендировали пипетированием, после чего вносили в лунки агарозного геля по 10-15 мкл. В соседние лунки вносили изучаемые вещества (экстракт эмбриональной печени, экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей, экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка).

В качестве контроля оценивали хемотаксис нейтрофилов к С5а компоненту комплемента, к Staphylococcus aureus штамма 209 и к среде 199. Агарозный гель с хемоаттрактантами инкубировали в термостате в течение 2,5 часов при температуре 37^оС в среде с повышенным содержанием СО₂ (5%). По окончании инкубации материал фиксировали в 47% растворе формалина в течение 30 мин. Стёкла промывали проточной водой, высушивали. Учёт результатов исследования проводили микроскопическим методом с помощью окулярного микрометра при увеличении Ч70. Измеряли 2 зоны миграции: к хемоаттрактанту (а) и от него (в). Индекс хемотаксиса (ind) вычисляли как соотношение а/в. При значении индекса хемотаксиса более 1 хемотаксис считали положительным, при значении индекса 1 хемотаксис - сомнительным, при значении индекса менее 1 хемотаксис считали отрицательным.

Определение протеолитической активности эмбриональных экстрактов

Определение активности коллагеназ проводили методом прямой зимографии.

Приготовление геля: на водяной бане готовили 1% гель агарозы на фосфатном буфере (рН 8,0) с добавлением 2 мл глюконата кальция на 100 мл буфера и 0,1% желатина. Сразу после приготовления гель заливали в «сэндвич» из стёкол, ширина зазора между которыми (1 мм) была ограничена пластиковыми пластинами. По периметру «сэндвич» герметизировали клейкой лентой.

Проведение зимографии: через 0,5 ч после застывания гель осторожно снимали со стёкол, помещали в чашку Петри и наносили пробы тканей куриного эмбриона (экстракт эмбриональной печени, экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей, экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка), в качестве контроля использовали ткань печени взрослой крысы. Чашку Петри закрывали и помещали в термостат при температуре 37?С на 16 часов.

Фиксация и окраска: после отмывания геля в водопроводной воде осуществляли фиксацию зимографической картины в 20% растворе уксусной кислоты. Окрашивание геля производили красителем кумасси блу (состав красителя: 0,5 г кумасси блу, 20 мл 20% раствора уксусной кислоты, 5 мл изопропилового спирта, 10 мл 70% этилового спирта, воды водопроводной до 100 мл). Время окрашивания составляло 20 мин.

Затем проводили отмывку геля в смеси 70% этилового спирта и 20% раствора уксусной кислоты в соотношении 1:1 в течение 10 мин, после чего гель отмывали в 5% растворе уксусной кислоты в течение 1 ч.

Оценку коллагеназной активности тканей проводили путём измерения диаметра зон обесцвечивания геля.

Содержание белка в экстрактах эмбриональных тканей

Белок в экстрактах куриных эмбриональных тканей определяли микрометодом с реактивом Бенедикта.

Принцип метода: раствор белка в щелочной среде связывается с ионами меди, содержащимися в реактиве Бенедикта, и даёт продукт реакции фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка.

Для приготовления реактива Бенедикта 17,3 г цитрата натрия и 10 г. карбоната натрия растворяли в 50 мл дистиллированной воды при нагревании, не доводя до кипения (раствор а). Раствор фильтровали и доводили объём раствора до 85 мл дистиллированной водой. 1,73 г. сульфата меди растворяли в 10 мл дистиллированной воды (раствор б). Растворы а) и б) объединяли в общий объём в мерной колбе, доводя до 100 мл дистиллированной водой.

Для определения содержания белка в экстрактах эмбриональных тканей к 0,1 мл исследуемой жидкости добавляли 1,9 мл дистиллированной воды и 2 мл 6% раствора NaOH. Раствор тщательно перемешивали и добавляли 0,2 мл реактива Бенедикта. Встряхивали и через 15 минут фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 в ультрафиолетовом свете при длине волны 330 нм.

Для построения калибровочного графика готовили ряд рабочих стандартных растворов альбумина с концентрациями 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 г/л. Рабочие стандарты обрабатывали по той же методике, как и пробы экстрактов, и по данным спектрофотометрирования строили калибровочный график, по которому определяли содержание белка в экстрактах эмбриональных тканей в г/л.

Пептидный биорегулятор

Для ускорения репарационных процессов в коже и костной ткани применяли пептидный биорегулятор Хондролюкс^®, представляющий собой препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из хрящей крупного рогатого скота не старше 12-месячного возраста или свиней. В состав Хондролюкса входят полипептиды с молекулярной массой от 75 до 846 Да. В медицинской практике используется в виде прозрачного бесцветного раствора для инъекций.

Результаты экспериментального изучения показали, что Хондролюкс оказывает тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов хрящевой и костной тканей молодых и старых крыс в органотипических культурах. Кроме того, Хондролюкс проявляет остеопротекторное действие, выражающееся в нормализации минеральной плотности костной ткани крыс в экспериментальной модели остеопороза, вызванного овариоэктомией, и хондропротекторное действие, выражающееся в препятствовании развитию дегенеративно-дистрофических изменений в хрящевой ткани суставной поверхности в экспериментальной модели посттравматического остеоартроза у крыс [Поворознюк В.В. и соавт., 2007].

На основании результатов экспериментального изучения предполагается эффективность применения Хондролюкса для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний позвоночника и суставов (остеохондроза, остеоартроза и др.), а также для лечения и профилактики остеопороза. В настоящее время Хондролюкс находится на стадии клинического изучения [Патент РФ №2302872. 2007].

Методы статистической обработки результатов исследования

Статистическую обработку результатов исследования проводили по стандартным программам для персональных компьютеров. Использовали специализированные пакеты прикладных программ для медико-биологических исследований («Statistica-5.0» и «Microsoft Exсell»), обеспечивающих выполнение общепринятых математико-статистических методов (расчет параметров вариации признаков, t-критерий Стьюдента для зависимых равновеликих и независимых разновеликих выборок) [Григорьев С.Г. и соавт., 2002].

Результаты исследования

Характеристика биологической активности и биохимического состава экстрактов из эмбриональных тканей

Процесс старения организма характеризуется значительным снижением активности иммунной системы, а также снижением темпов и качества обменных процессов. В этой связи резервные возможности стареющего организма значительно ограничены при восстановлении целостности тканей после повреждения. Принимая во внимание всё вышеперечисленное, актуальной задаченй является необходимость моделирования механизмов, которые могли бы ускорить и усилить по выраженности вялотекущий репаративный процесс у старых особей с помощью применения биологических активаторов. Таковыми, на наш взгляд, представляются различные биологические субстанции (пептиды, цитокины, факторы роста и т.д.), обладающие свойством стимулировать миграцию клеток, их паракринную функцию, синтез необходимых для репаративного процесса компонентов.

Для реализации поставленной задачи нами избраны экстракты из эмбриональных тканей 14-дневных куриных эмбрионов (экстракт эмбриональной печени, экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей, экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка). Ниже приводятся данные некоторых биохимических показателей и биологической активности перечисленных выше эмбриональных тканей.

Содержание белка в экстрактах эмбриональных тканей

Данный показатель использовали в качестве основного маркера для приготовления препаратов из экстрактов, которыми лечили эксцизионные раны. Таким образом удавалось получить экстракт определённой концентрации и выявить оптимальную дозу, которая может быть использована в экспериментальной модели. В таблице 1 приводятся данные по содержанию общего белка в экстрактах эмбриональных печени, сердца и хрящевой и костной тканей.

Таблица 1. Содержание белка в экстрактах эмбриональных тканей

Экстракт	Содержание белка, г/л
Экстракт эмбриональной печени	13,2±1,32
Экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка	7,6±0,81
Экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей	9,2±0,96

Протеолитическая активность экстрактов эмбриональных тканей

Протеолитические ферменты, выделенные из экстрактов эмбриональных тканей, представляют интерес в аспекте возможной деградации белковых молекул. В наших экспериментах этот показатель является прямым маркёром образования пептидных молекул различной величины, которые содержат в своём составе стимуляторы пролиферации, миграции и дифференцировки клеток. Эти сведения дают нам возможность констатировать факт присутствия биологических активаторов в полученных экстрактах.

Таблица 2. Протеолитическая активность экстрактов эмбриональных тканей

Экстракт	Диаметр зоны обесцвечивания №1, мм	Диаметр зоны обесцвечивания №2, мм	Диаметр зоны обесцвечивания №3, мм
Экстракт эмбриональной печени	6,8±0,08	9,2±0,31*	7,7±0,28*
Экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей	9,5±0,41	18,0±0,48	16,5±0,41
Экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка	7,0±0,17	14,0±0,36*	12,0±0,27*
Контроль (печень взрослого животного)	7,0±0,09	20,3±0,34	15,5±0,26

* р<0,05 по сравнению с показателем в контроле

Данные, представленные в таблице 2, показывают, что экстракты эмбриональных тканей обладают высокой степенью агарозной активности, которая особенно проявляется в экстрактах хрящевой и костной тканей и сердца и сосудистого пучка, приближаясь к показателям агарозной активности в контрольных образцах, где в качестве источника агарозной активности использовали кусочки печени взрослого животного. Данное свойство является весьма важным в формировании костного скелета и, как показывает эта серия экспериментов, хрящевая и костная ткани эмбриона также обладают выраженной агарозной активностьюКак свидетельствуют данные таблицы 2, наиболее выраженная протеолитическая активность отличает экстракты из эмбрионального хрящевой и костной тканей, а также сердца и сосудистого пучка: диаметры зон обесцвечивания экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей практически не отличаются от показателей в контроле. Средней коллагеназной активностью обладает экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка; достоверно меньшей по сравнению с контролем активностью (р<0,05) обладает экстракт эмбриональной печени.

Выявленная протеолитическая активность экстрактов эмбриональных тканей свидетельствует о наличии в них биологических активаторов.

pH экстрактов эмбриональных тканей

Одним из важнейших условий для обеспечения оптимального характера обменных процессов является показатель pH в гуморальных средах организма. Учитывая последующее применение экстрактов в виде аппликаций на поврежденные ткани животного, была исследована величина pH в различных сериях применяемых в эксперименте экстрактов. Полученные результаты исследования свидетельствуют о том, что pH используемых для аппликации экстрактов эмбриональных тканей характеризуются значениями, близкими к физиологическим показателям (табл. 3).

Таблица 3. рН экстрактов эмбриональных тканей

Экстракт	рН
Экстракт эмбриональной печени	7,15±0,02
Экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка	7,05±0,05
Экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей	7,11±0,06

Хемоаттрактивные свойства экстрактов эмбриональных тканей

Исследования хемотаксической активности экстрактов эмбриональных тканей представляют в нашем исследовании наиболее важные их свойства, проявляющиеся во влиянии на клетки, циркулирующие в периферической крови, и на резидентные клеточные формы непосредственно в тканях. Это, прежде всего, обусловливается тем, что в изучаемых нами моделях тканевого повреждения (эксцизионные раны) данный феномен играет одну из ведущих ролей в формировании ранней воспалительной реакции репаративного процесса.

Таблица 4. Хемоаттрактивные свойства эмбриональных экстрактов

Экстракт	Индекс хемотаксиса нейтрофилов
Экстракт эмбриональной печени	2,22±0,07
Экстракт эмбрионального сердца и сосудистого пучка	2,64±0,11
Экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей	2,86±0,05
St. Aureus 209	1,75±0,03*
Среда 199	7,03±0,21*
С5а компонент комплемента	2,22±0,05

* р<0,05 по сравнению с показателем при действии С5а компонента комплемента

В таблице 4 приведены данные о хемоаттрактивных свойствах изучаемых экстрактов эмбриональных тканей в сравнении с классическим хемоаттрактантом С5а компонентом комплемента и аттрактивными свойствами золотистого стафилококка. Данные таблицы 4 указывают на то, что хемоаттрактивные свойства экстрактов эмбриональных тканей по силе проявления равны эффекту, полученному при действии классического хемоаттрактанта: индекс хемотаксиса нейтрофилов при действии экстрактов эмбриональных тканей не отличается от данного показателя при действии С5а компонента комплемента, но достоверно отличается при действии золотистого стафилококка штамм 209 и среды 199 (р<0,05).

На основании приведённых цифровых данных по силе аттрактивных свойств хемоаттрактанты экстрактов эмбриональных тканей можно расположить в следующем порядке: экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей, экстракт эмбрионального сердца, экстракт эмбриональной печени.

Полученные результаты по хемоаттрактивным свойствам экстрактов эмбриональных тканей в отношении нейтрофильных лейкоцитов дают все основания для применения их в используемых нами моделях с повреждением кожной поверхности.

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что экстракты из эмбриональных тканей характеризуются содержанием белка от 7,6±0,81 г./л до 13,2±1,32 г./л и обладают протеолитической и хемоаттрактивной активностью, что позволяет рассчитывать на их эффективность в усилении процессов репарации поврежденных тканей стареющего организма.

Результаты исследования показали, что наибольшей протеолитической и хемоаттрактивной активностью обладает экстракт из эмбриональных хрящевой и костной тканей, поэтому в экспериментах по стимуляции репаративных процессов у животных применяли именно этот экстракт в виде аппликаций на поврежденную раневую поверхность.

Коррекция течения раневого процесса при старении

С целью изучения эффективности воздействия различных биорегуляторов на процесс заживления эксцизионных ран сравнивали между собой 3 группы старых животных Ї контрольная группа, у которых процесс заживления раны протекал только с повторением перевязок (9 кроликов), и 2 подопытные группы: с момента повреждения и до полного заживления раны животным 1 подопытной группы (10 особей) производили аппликации с экстрактом из эмбриональных хрящевой и костной тканей, а животным 2 подопытной группы (10 особей) - аппликации с пептидным биорегулятором хондролюксом.

Проведённый мониторинг заживления экспериментальных эксцизионных ран в трех группах животных включал в себя визуальную оценку и гистологическое исследование места повреждения в различные периоды времени с интервалом в 7 суток (на 7, 14, 21, 28 сутки).

Изучение процессов восстановления поверхностных ран кожных покровов экспериментальных животных проводили на основании анализа внешнего вида раны, наличия и выраженности процессов ангиогенеза, образования коллагеновых волокон и формирования на поверхности раны эпителия или соединительной ткани, что свидетельствует о завершении процесса регенерации повреждённого участка ткани.

Морфологическая характеристика репаративного процесса эксцизионных ран кожи у старых животных

Первая - контрольная - серия опытов позволила изучить морфологические характеристики репаративного процесса в его естественном течении. Это было сделано для того, чтобы, во-первых, иметь целостное представление о характере репаративных процессов, протекающих в коже старого животного при нанесении ему эксцизионных ран, а во-вторых, для анализа эффективности влияния исследуемых веществ на скорость и качество заживления ран.

Первый контрольный срок наблюдения составил 7 суток от момента нанесения повреждения. На указанном сроке эксцизионная рана на коже старых кроликов представляла собой дефект кожи до 1,7 см диаметром. Дно раны - фасция, инъецированная сосудами. Грануляций и эпителизации не отмечалось.

В гистологических препаратах на 7 сутки наблюдения определяются участки кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем несколько полей зрения, наблюдается полнослойный дефект кожи, распространяющийся до фасции. Дефект выполнен незрелой грануляционной тканью с большим количеством клеточных элементов, новообразованных соединительнотканных волокон и сосудов. В клеточном составе преобладают молодые формы фибробластов, формирующие тяжи и пучки, во всех полях зрения встречаются мелкие очаги нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации с примесью умеренного количества макрофагов.

В перифокальных зонах со стороны эпидермального пласта отмечаются явления пролиферации клеток базального слоя с явлениями миграции на поверхность незрелой грануляционной ткани.

Через 14 суток после образования эксцизионной раны у животного контрольной группы на месте раны образуется грубый рубец до 1,5 см диаметром, возвышающийся над поверхностью кожи на 1,5 мм. В центре расположен дефект до 2 мм, выполненный грануляциями.

В гистологических препаратах на 14 сутки определяются фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем несколько полей зрения, определяется незрелый эпителизированный рубец. В эпидермисе - пролиферация клеток базального слоя, клетки всех слоев увеличены в размерах, с крупными светлыми округлыми ядрами, в цитоплазме прослеживаются базофильные гранулы. Сосочки дермы на этом уровне практически не выражены.

Соединительнотканная основа рубцовой ткани представлена пластом незрелой грануляционной ткани, в клеточном составе которой отмечается большое количество юных фибробластов, мелкие диффузно рассеянные очаги лимфоидно-клеточной инфильтрации и очаги макрофагальной инфильтрации. Определяются новообразованные сосуды всех калибров с дифференцированными стенками. Нежные коллагеновые волокна сложены в рыхлые пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи. В перифокальной зоне выражены явления акантоза с формированием эпидермальных кист, заполненных бесформенными базофильными массами.

В гистологических препаратах были представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем менее одного поля зрения, определяется эпителизированный рубец. В эпидермисе - пролиферация клеток базального слоя. Сосочки дермы на этом уровне не выражены.

Завершающие эту серию экспериментов наблюдения проводили на сроке 28 суток. На месте раны наблюдается соединительнотканный рубец до 1,6 см диаметром. Рубец возвышается над поверхностью кожи на 1,2 мм.

В гистологических препаратах обращают на себя внимание фрагменты кожи с тонким роговым слоем. По краю препаратов определяется эпителизированный соединительнотканный рубец с умеренным количеством клеточных элементов и новообразованных сосудов и большим количеством соединительнотканных волокон, сложенных в компактные малоизвитые пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи. В клеточном составе новообразованной соединительной ткани преобладают зрелые формы фибробластов и фиброциты.

Результаты проведённых экспериментов показали, что у животных контрольной группы начало образования de novo коллагеновых волокон и ангиогенез отмечались на 14-е сутки наблюдения, а на 28-е сутки, то есть через 4 недели от момента нанесения кроликам эксцизионных ран, отмечалось образование соединительнотканного рубца. Эти результаты свидетельствуют о завершении репаративных процессов в повреждённом участке кожи экспериментального животного к 28 суткам после нанесения повреждения.

Морфологические особенности репаративного процесса эксцизионных ран кожи экспериментальных животных при действии экстракта эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора

Действие экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей на заживление эксцизионной раны

На раневую поверхность старых животных 1 подопытной группы наносили экстракт эмбриональных хрящевой и костной тканей в виде повязок, смоченных раствором экстракта.

На сроке 7 суток эксцизионная рана на коже кролика под действием аппликаций с раствором экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей представляла собой дефект кожи до 1,5 см диаметром, рана с подрытыми краями. Дно раны представляло собой фасцию. Грануляции наблюдалась с краев до 1 мм, эпителизация отсутствовала.

При гистологическом исследовании определяются фрагменты кожи с тонким роговым слоем. Эпидермис присутствует на всем протяжении препарата. На участке, занимающем несколько полей зрения, отмечается нарушение стратификации в эпидермальном пласте, умеренные явления акантоза и гиперкератоза. Во всей толще дермы, вплоть до мышечного слоя, наблюдается паретическое венозное и капиллярное полнокровие с картиной лейкостазов и миграцией лейкоцитов за пределы сосудистых стенок с формированием периваскулярных лейкоцитарных инфильтратов в виде «муфт», отек межуточной ткани.

На сроке наблюдения 14 суток на месте раны образовался мягкий эластичный гладкий рубец до 1,7 см диаметром. В области рубца наблюдается рост шерсти. В центре рубца гранулирующая рана до 1 мм диаметром.

В гистологических препаратах определялись фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем менее одного поля зрения, выявлялся эпителизированный рубец. В эпидермисе наблюдается пролиферация клеток базального слоя. Сосочки дермы на этом уровне не выражены. Соединительнотканная основа рубцовой ткани представлена пластом молодой грануляционной ткани, в клеточном составе которой встречается большое количество пролиферирующих фибробластов, мелкие диффузно рассеянные очаги нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации. Определяются новообразованные сосуды всех калибров с дифференцированными стенками. Коллагеновые волокна сложены в рыхлые пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи.

На сроке наблюдения 21 сутки после начала опыта на месте раны обнаруживается мягкий эластичный гладкий рубец до 1,7 см диаметром. В области рубца наблюдается рост шерсти.

В микропрепаратах представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем несколько полей зрения, определяется эпителизированный рубец с умеренным количеством зрелых фибробластов и новообразованных сосудов и компактно упакованными соединительно-тканными волокнами, сложенными в пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи.

Анализируя всё вышеизложенное, можно сделать заключение о том, что экстракты эмбриональных тканей повышают скорость и улучшают качество заживления эксцизионных ран кожи старых животных. Это проявилось, во-первых, в том, что зачатки грануляций под слоем повреждённой ткани появились уже на 7 сутки наблюдения, в то время как в контроле тольок на 14 сутки. Во-вторых, в гистологических препаратах животных подопытной группы отмечено более раннее появление микрососудов - на 7 сутки (в контроле - на 14 сутки). В третьих, на ранних сроках (на 7 сутки после повреждения) отмечена активация фибробластов, а это приводит к образованию менее значительного рубца, зато в бульшей степени выражено естественное заживление раневой поверхности путём эпителизации.

Влияние пептидного биорегулятора хондролюкса на заживление эксцизионной раны

На сроке 7 суток эксцизионная рана на коже кролика, как и в контрольной группе, представляла собой дефект кожи до 1,5 см диаметром, Края раны ровные. Дно раны представлено фасцией. От краев раны к центру появляются грануляции до 1 мм, эпителизация отсутствует.

В микропрепаратах на сроке 7 сутки определялись фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем несколько полей зрения, определялся дефект эпидермиса, поверхностных и глубоких слоев дермы, вплоть до мышечного слоя. В дне дефекта ткани обнаруживается разрастание молодой грануляционной ткани, богатой клеточными элементами, среди которых отмечено преобладание фибробластов, на этом фоне прослеживаются очаги нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации. Новообразованные соединительнотканные волокна формируют своеобразную «сеть» с хаотичным переплетением волокон, выявляются новые сосуды с дифференцирующимися стенками. В перифокальных зонах в эпидермальном пласте выявлялись умеренные явления акантоза и нарушения стратификации, по краю дефекта ткани - пролиферация клеток базального слоя эпидермиса.

...