Возрастные особенности репаративного процесса в коже и костной ткани (экспериментальное исследование)

Уже на сроке наблюдения 14 сутки на месте раны обнаруживался мягкий эластичный гладкий рубец до 1,7 см диаметром. В области рубца наблюдался рост шерсти. На 14 сутки в центре рубца располагалась гранулирующая рана до 1 мм диаметром.

В микропрепаратах на сроке 14 сутки были представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем несколько полей зрения, определялся эпителизированный рубец с умеренным количеством зрелых фибробластов и новообразованных сосудов и компактно упакованными соединительнотканными волокнами, сложенными в пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи.

В микропрепаратах на сроке наблюдения 21 сутки были представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем. Эпидермис присутствует на всем протяжении препарата, сосочки дермы одинаково хорошо выражены во всех полях зрения. Морфологических проявлений механического повреждения кожи в гистологических препаратах на данном сроке наблюдения не выявляется.

С целью изучения возможности негативного влияния аппликаций с экстрактом эмбриональных хрящевой и костной тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса на пролиферативные процессы в тканях кожи было осуществлено мониторирование состояния кожной поверхности через 6 месяцев после окончания исследования. Явлений атипичного роста структурных элементов тканей кожи как при применении экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей, так и при применении пептидного биорегулятора хондролюкса не выявлено. Это свидетельствует о безопасности применения данного метода для ускорения репаративных процессов в коже.

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что в контрольной группе старых животных завершение репаративных процессов происходит спустя 4 недели от момента нанесения эксцизионной раны: Образование de novo коллагеновых волокон и ангиогенез отмечаются на 14 сутки наблюдения; на 28 сутки отмечается образование соединительнотканного рубца (табл. 5).

Установлено, что экстракт из эмбриональных хрящевой и костной тканей и пептидный биорегулятор на основе экстракта из хрящевой ткани телят - хондролюкс повышают скорость и улучшают качество заживления эксцизионных ран кожи у экспериментальных животных. Зачатки грануляций под слоем повреждённой ткани у животных подопытных групп появились на неделю раньше, чем в контроле, уже на 7 сутки наблюдения. У кроликов подопытной группы с применением хондролюкса отмечено заживление эксцизионной раны путём эпителизации, с формированием мягкого, гладкого, эластичного рубца.

Таблица 5. Сравнительный анализ развития репаративного процесса в эксцизионной ране кожи старых животных

Параметр	Срок наблюдения, сутки
	Контрольная группа	Подопытные группы
		Действие экстракта хрящевой и костной тканей	Действие хондролюкса
Появление грануляций	14	7	7
Эпителизация	28	14	14
Ангиогенез	14	7	7
Образование коллагеновых волокон	14	7	7
Полное заживление	28	21	21

Результаты исследования свидетельствуют о том, что пептидный биорегулятор хондролюкс, созданный на основе экстракта из хрящевой ткани телят, обладает выраженными репаративными свойствами и способствует ускорению заживления эксцизионных ран кожи у старых животных.

Электронная микроскопия эксцизионых ран старых кроликов при применении пептидного биорегулятора хондролюкса

С целью выявления более глубоких морфологических изменений, происходящих в тканях кожи старых кроликов при заживлении эксзиционных ран естественным путем или с применением пептидного биорегулятора хондролюкса, было проведено исследование с использованием метода электронной микроскопии, включающего морфометрический анализ изображений.

Контрольная группа

Клеточный состав дна эксцизионной раны старых животных контрольной группы на 7 сутки наблюдения преимущественно представлен фибробластами юного типа. В дне раны обнаруживаются переходы от областей с очень плотным расположением фибробластов с малым количеством или почти полным отсутствием межклеточного вещества к участкам, богатым основной субстанцией, окружающей отдельные, большей частью веретенообразные клетки.

Юные фибробласты имеют веретенообразную форму и обладают короткими или длинными клеточными выростами, которые зубцеобразно соединяются между собой (рис. 2). В юных фибробластах на этот срок отмечаются цитоплазматические явления дистрофии - обеднение митохондриями и рибосомами, скудный рисунок гипертрофированного пластинчатого комплекса, большое количество лизосом и вакуолей, умеренное количество поврежденного шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума (ШЭР и ГЭР, соответственно), цистерны ШЭР расширены и иногда содержат мелкозернистый материал.

Количество поврежденных митохондрий варьирует. Часто обнаруживаются клетки с многочисленными липидными каплями, миелиновыми фигурами. Целостность плазмалеммы часто нарушена. Отмечается экзоцитоз гранул в межклеточное пространство.

Ядра клеток причудливой формы, нередко содержат включения. Кроме того встречаются аутофагические вакуоли, часто неупорядоченные филаменты диаметром около 10 нм, которые иногда формируют рыхлые пучкообразные структуры, которые лежат под плазматической мембраной.



Эксцизионная рана кролика, 7 сутки. Контроль. Юные фибробласты имеют вытянутую веретенообразную форму. Плазмалемма их гладкая, местами с нарушенной целостностью. Ядро вытянутой формы с выраженной кариолеммой, хорошо развитым ядрышком и преимущественно конденсированным хроматином. В цитоплазме выявляется ШЭР, цистерны которого расширены и иногда содержат мелкозернистый материал. х8500

Нередко встречаются микротрубочки диаметром около 20 нм. В областях плотно расположенных клеток обнаруживаются многочисленные поврежденные кровеносные капилляры, тесно связанные с клетками. Особого внимания в дне раны заслуживают сосуды, среди которых преобладают капилляры с гипертрофированными и набухшими эндотелиальными клетками и несколькими слоями перицитов, разделенных тонкими коллагеновыми волокнами.

В дне раны отмечается появление макрофагов с признаками слабой функциональной активности. Они имеют полиморфные ядра, в их кариоплазме выявляются ядерные включения в виде скоплений нежно-фибриллярных структур, расположенных клубками, окаймленными просветленной зоной. Такие клетки имеют небольшое количество псевдоподий и фагоцитированных вакуолей, единичные гранулы округлой формы слабой электронной плотности и мелкие митохондрии.

На 14 сутки наблюдения в кусочках ткани, взятых из дна эксцизионной раны старых животных, отмечается гиперплазия фибробластов, ультраструктура которых в основном соответствует электронно-микроскопическому строению фибробластов «миоидного» типа со слабо выраженной функциональной активностью. При этом величина и форма клеток варьируют. Часто клетки имеют многочисленные распространенные отростки. Форма ядер овальная, вытянутая, неправильная.

В цитоплазме этих клеток, как правило, обнаруживаются внутрицитоплазматические филаменты, особенно на периферии под мембраной. В местах скопления филаментов часто выявляются участки, подобные фокальным уплотнениям в сократительных элементах гладкомышечных клеток. В фибробластах выявляется хорошо развитый ШЭР, узкие канальцы и цистерны которого иногда расширены, просвет их заполнен мелкозернистым или фибриллярным материалом с плотными участками, часто имеющим вид колец, лент или причудливых концентрических фигур.

Также в дне раны на данном сроке заживления встречаются гистиоциты, которые имеют округлое или почкообразное ядро, часто с диффузным расположением хроматина и слаборазвитым ядрышком. Плазмалемма этих клеток неровная, образует псевдоподии, цитоплазма выглядит пустой, в которой иногда различаются профили ШЭР, митохондрии, пластинчатый комплекс, липидные капли, часто встречаются лизосомы, мультивезикулярные тельца и миелиновые фигуры.

В кровеносных капиллярах эндотелиальные клетки увеличены в объеме, количество органелл в них увеличено, на обращенной в просвет сосудов поверхностн выявляются ворсино-подобные выросты. Перицитоподобные клетки располагаются по-соседству с эндотелиальной выстилкой и проявляют признаки функциональной активности, о чем свидетельствуют гиперплазированные митохондрии и расширенные цистерны пластинчатого комплекса.

На 21 сутки наблюдения в ране старого животного появляются ультраструктурные признаки формирования грануляционной ткани с присутствием фибробластов с более выраженной функциональной активностью и гистиоцитов. При этом в фибробластах и гистиоцитах образуются пучки неспецифических, как правило, тонких филаментов, хаотично расположенных в цитоплазме. Реже встречаются клетки, в которых филаменты располагаются параллельно вдоль длинной оси клетки.

Многочисленные капилляры сформированы из крупных эндотелиальных клеток, которые проявляют функциональную активность: ядра в таких клетках большие, вытянутой формы, с инвагинациями. Цитоплазма богата органеллами, развит ШЭР, выражен пластинчатый комплекс, много митохондрий, пиноцитозных пузырьков, присутствуют тонкие выросты плазматической мембраны, иногда филаменты.

Обнаруживаются макрофаги с высокой функциональной активностью, о чем свидетельствуют цитоплазматические отростки (псевдоподии) и инвагинация цитоплазмы. В цитоплазме макрофагов наряду с лизосомами, митохондриями и небольшим количеством ШЭР, отмечается присутствие фагоцитарных вакуолей и сидеросом.

На 28 сутки наблюдения в ране формируется грануляционная ткань, в которой обнаруживается большое количество зрелых фибробластов, в их цитоплазме, наряду с лизосомами, митохондриями и хорошо развитым ШЭР, узкие цистерны которого ориентированы вдоль оси клеток, отмечается присутствие жировых вакуолей и сидеросом, а также пальцевидных сцеплений клеток.

Подопытная группа

В межклеточном пространстве на 7 сутки наблюдения присутствует большое количество новообразованных коллагеновых фибрилл.



Эксцизионная рана кролика, 7 сутки. Применение пептидного биорегулятора хондролюкса. В цитоплазме юных фибробластов «гистиоидного» типа обнаруживается развитый ШЭР и большое количество рибосом. Под плазматической мембраной выявляются филаменты и пиноцитозные пузырьки. х10500

В цитоплазме обнаруживается хорошо развитый ШЭР и большое количество рибосом. Митохондрий мало, многочисленные лизосомы встречаются лишь в отдельных клетках. В периферических отделах цитоплазмы под плазматической мембраной иногда выявляются филаменты и пиноцитозные пузырьки (рис. 3).

Фибробласты как тесно контактируют между собой, так и разбросаны группами из нескольких клеток среди сети соединительнотканных волокон. Ядра фибробластов имеют в основном вытянутую форму, иногда неправильную за счет вдавлений. В дне раны также встречаются тучные клетки.



Эксцизионная рана кролика, 7 сутки. Применение пептидного биорегулятора хондролюкса. Формирующиеся капилляры выстланы крупными эндотелиальными клетками с большими ядрами округлой формы и с инвагинациями. х6500

В дне раны старого животного подопытной группы, получавшего аппликации с пептидным биорегулятором хондролюксом, на 7 сутки наблюдения обнаруживается большое количество юных фнбробластов «гистиоидного» типа, которые имеют отростки и проявляют более выраженную функциональную активность по сравнению с тем же сроком без применения пептида.

Формирующиеся капилляры выстланы крупными эндотелиальными клетками с большими ядрами округлой формы и с инвагинациями. В цитоплазме эндотелиоцитов определяются в той или иной степени развитый пластинчатый комплекс, митохондрии, пиноцитозные пузырьки, тонкие выросты плазматической мембраны, иногда филаменты (рис. 4).

На 14 сутки наблюдения клеточный компонент активно формирующейся грануляционной ткани представлен в основном зрелыми функционально активными фибробластами «миоидного» типа. Встречаются функционально активные клетки с большим количеством везикул и интрацитоплазматическими фрагментами волокон, в большинстве случаев окруженных мембраной.

В межклеточном веществе обнаруживаются различной ширины коллагеновые волокна размером около 10 нм, среди которых расположены многоядерные фибробласты.

В многочисленных макрофагах встречаются светлые вакуоли и различное количество тонких филаментов диаметром около 8 нм. Мембрана макрофагов в основном гладкая, иногда образует отростки, соединяющие свободные поверхности клеток. В отдельных макрофагах встречаются цитоплазматические включения, образованные в результате инвагинации коллагеновых фибрилл. Эти включения повторяют структуру коллагеновых волокон, окружающих клетки. Межклеточные пространства заполнены многочисленными коллагеновыми волокнами. Активно формируются новообразованные кровеносные сосуды типа капилляров. В сосудах эндотелиальные клетки увеличены в объеме, относительно богаты органеллами. Число перицитов увеличено, они расположены по типу луковицы вокруг центральной эндотелиальной трубки и разделены коллагеновыми волокнами.

На 21 сутки наблюдения практически сформированная грануляционная ткань представлена тонкостенными кровеносными сосудами, между которыми лежит соединительнотканная строма с веретенообразными и звездчатыми фибробластами, лимфоцитами, плазматическими и тучными клетками, макрофагами. Фибробласты представлены «классическим» типом, они содержат расширенные цистерны ШЭР, большое количество внутрицитоплазматических филаментов.

Мембрана ядра в «классическом» фибробласте образует структуры в виде петель и карманов, ядро содержит уплотненный гетерохроматин.

Встречаются также фибробласты «гистиоцитоподобного» типа. В них обнаруживается гипертрофия пластинчатого комплекса, многочисленные везикулы, в том числе и под клеточной мембраной, иногда филаменты, единичные лизосомы, отдельные капли жира.

При введении хондролюкса на 21 сутки в грануляционной ткани наряду со зрелыми «классическими» фибробластами встречаются и миофибробласты. Оба типа клеток имеют вытянутую форму с ровными контурами, иногда этот ровный контур нарушается за счет неглубоких вдавлений фибрилл стромы, в цитоплазме присутствуют многочисленные, местами расположенные параллельно филаменты диаметром 7-8 нм (рис. 5). Ядра клеток имеют овальную форму с инвагинациями кариолеммы.

В цитоплазме клеток обнаруживаются хорошо развитый с расширенными цистернами ШЭР и гипертрофированный пластинчатый комплекс, который в большинстве клеток окружен шаровидными образованиями, ограниченными мембраной, заполненными плотными концентрическими тонкими фибриллами и мелкими гранулами.

Фибриллы в этих структурах напоминают фибриллы межклеточной стромы. Поперечная исчерченность в них не обнаруживается. Кроме описанных структур, в цитоплазме клеток встречаются митохондрии, единичные лизосомы.

В электронно-микроскопической картине грануляционной ткани в эксцизионной ране старого животного на 28 сутки после нанесения аппликаций с хондролюксом преобладают типичные «классические» фибробласты, содержащие включения специфических телец диаметром от 5 до 24 нм, которые, по-видимому, возникают в результате накопления в расширенных цистернах гранулярного электронно-плотного материала, к которому иногда присоединяются также везикулярные или нежно-филаментарные структуры.



Эксцизионная рана кролика, 21 сутки. Применение пептидного биорегулятора хондролюкса. В миофибробластах выявляются крупные ядра с изрезанными контурами, в цитоплазме присутствуют многочисленные филаменты. х6200

Между клетками располагается множество коллагеновых волокон. Веретенообразные фибробласты имеют обычное строение: выраженный ШЭР, развитый пластинчатый комплекс, многочисленные везикулы, которые содержат нежнофибриллярный материал. Достаточно часто встречаются гистиоциты, в цитоплазме которых выявляются набухшие митохондрии, многочисленные лизосомы и тонкие филаменты.

Межклеточное вещество состоит из нежных фибрилл диаметром 7-10 нм, типичных коллагеновых волокон. В нем хорошо развиты капилляры и лимфатические сосуды, в которых эндотелиоциты проявляют выраженную функциональную активность - цитоплазма их богата органеллами, пластинчатый комплекс гипертрофирован, обнаруживаются секреторные гранулы различной формы, свидетельствующие о локальной экспрессии биологически активных сигнальных молекул, регулирующих развитие и рост микроциркуляторного русла.

Морфометрический анализ ультраструктуры фибробластов (табл. 6) показал, что при введении хондролюкса происходит достоверное увеличение объемной плотности гипертрофированных митохондрий. Этот факт отражает усиление энергетических метаболических процессов в фибробластах, положительно сказывающихся на процессах регенерации

Увеличение объемной плотности ШЭР, наряду с изменением ультраструктуры его цистерн и заполнением их мелкозернистым содержимым свидетельствует об усилении внутриклеточных транспортных процессов при введении хондролюкса. Выявляемая при этом гиперплазия рибосом, как прикрепленных к мембранам ШЭР, так и свободных, отражает, прежде всего, что усиление транспортных процессов связано с белково-синтетической функцией клеток.

Таблица 6. Результаты морфометрического анализа фибробластов эксцизионной раны старого животного на 28 сутки наблюдения (M±m)

Исследованный параметр (Vv)	Контроль	Применение хондролюкса
Митохондрии	5,2±0,2	9,0±0,3*
Шероховатый эндоплазматический ретикулум	9,2±0,1	13,4±0,1*
Рибосомы прикрепленные	11,2±0,3	15,1±0,2*
Рибосомы свободные полисомальные	14,3±2,4	20,8±2,5*
Лизосомы	13,6±2,2	15,4±2,2
Люминальные МПВ	2,2±0,05	2,4±0,08
Цитоплазматические МПВ	13,6±1,16	20,1±1,45*
Базальные МПВ	20,2±2,2	29,3±2,4*

Примечание: Vv - объемная плотность структур (% от объема цитоплазмы); МПВ - микропиноцитозные везикулы

^* - р<0,05 по сравнению с показателем в контроле

Увеличение объемной плотности микропиноцитозных везикул, отражает активную секреторную функцию фибробластов, а особенно концентрация МПВ у базальной мембраны клеток указывает на активную секрецию фибробластами сигнальных молекул в межклеточное пространство, что, в свою очередь, стимулирует образование коллагеновых волокон и формирование рубца.

Таким образом, результаты проведенного электронно-микроскопического исследования свидетельствуют о том, что пептидный биорегулятор хондролюкс обладает выраженным репаративным действием - он значительно ускоряет и оптимизирует заживление эксцизионных ран кожи.

При введении хондролюкса сокращаются сроки заживления раны, при этом активное развитие грануляционной ткани наблюдается уже на 14 сутки после нанесения раны (в контроле на 21-28 сутки). Морфометрические показатели состояния органелл фибробластов при использовании хондролюкса отражают значительное усиление их функциональной активности на 28 сутки заживления по сравнению с контролем.

Влияние экстрактов эмбриональных тканей и пептидного биоргулятора на заживление термических ожогов

Для изучения эффективности воздействия экстрактов эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса на процесс заживления термических ожогов сравнивали между собой 3 группы старых животных. Контрольная группа состояла из 8 кроликов, у которых процесс заживления ожога протекал только с повторением перевязок. 1 подопытная группа состояла из 10 кроликов, которым с момента повреждения и до полного заживления ожога производили аппликации экстракта из эмбриональных хрящевой и костной тканей. 10 кроликов, которым производили аппликации с пептидным биорегулятором хондролюксом, составили 2 подопытную группу.

Проведённый мониторинг заживления экспериментальных ожоговых ран у старых животных контрольной и подопытных групп включал в себя визуальную оценку и гистологическое исследование места ожога в различные периоды наблюдения с интервалом в 7 дней (на 7, 14, 21, 28 сутки).

Морфологическая характеристика репаративного процесса при термическом ожоге у старых животных контрольной группы

Изучение процессов восстановления термических ожогов экспериментальных животных проводили по методикам, описанным в главе «Материалы и методы». Кроме внешнего вида места повреждения, оценивали также наличие и выраженность процессов ангиогенеза, образование коллагеновых волокон и формирование на поверхности раны эпителия или же соединительной ткани, что свидетельствует о завершении процесса регенерации повреждённого участка ткани.

Первый контрольный срок наблюдения в данной группе исследований составил 7 суток от момента нанесения повреждения.

На указанном сроке имелся ожог кожи 3б-4 степени до 2,2 см диаметром. В области ожога виден струп, из-под которого сочится скудное серозное отделяемое.

В микропрепаратах этого срока наблюдения представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем несколько полей зрения, определяется очаг коагуляционного некроза, захватывающий эпидермис, поверхностные и глубокие слои дермы, вплоть до фасции. В перифокальных зонах наблюдается формирующийся клеточно-волокнистый вал, в клеточном составе которого преобладают фибробласты, встречаются участки нейтрофильно-лимфоцитарной и макрофагальной инфильтрации.

Со стороны эпителиального пласта отмечаются явления пролиферации: эпителиальные клетки увеличены в объеме, имеют просветленную цитоплазму и округлые ядра, увеличено количество клеточных слоев в эпителии, отмечаются явления «наползания» эпителиального пласта на раневую поверхность. Соединительнотканная основа формирующейся грануляционной ткани представлена молодыми малоизвитыми короткими коллагеновыми волокнами, ориентированными преимущественно хаотично. Новообразованные сосуды частично с дифференцированными стенками и эндотелиальной выстилкой, частично незрелые, имеющие вид «сосудистых почек» или бесклеточных щелей, заполненных кровью.

На сроке наблюдения 14 суток у животных контрольной группы отмечалась ожоговая поверхность под струпом до 2 см диаметром. Струп плотно прилегает к поверхности раны. У краев раны вялые грануляции до 2 мм шириной. Эпителизация отсутствует.

В гистологических препаратах представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем; морфологические изменения в них однотипны. На участке, занимающем несколько полей зрения, определяется очаг коагуляционного некроза, захватывающий роговой слой, эпидермис, сетчатый и глубокие слои дермы слой поперечнополосатой мышечной ткани, вплоть до фасции. В сосудах видны компактные ярко-оранжевые гомогенные массы. В роговом слое, эпидермисе и поверхностных слоях дермы определяются множественные мелкие пустоты в виде сотовидных структур. Некротизированные соединительнотканные волокна дермы уплотнены, имеют выраженный базофильный оттенок, сближены между собой, с утратой извитости, сосочки дермы сглажены.

Ядра клеток базального слоя эпидермиса, волосяных фолликулов и адвентиции сосудов вытянуты, переориентированы в виде фигур «метелок» и «щеток». Очаг некроза отграничен от интактных тканей демаркационным валом, представленным массой нейтрофильных лейкоцитов с явлениями распада с примесью клеток лимфоидного ряда и макрофагов. На отдельных участках отмечается пролиферация фибробластов и новообразование соединительнотканных волокон. В эпидермальном пласте на границе с очагом некроза - пролиферация клеток базального слоя с миграцией их под очаг некроза. Во всех полях зрения, за исключением зоны некротических изменений, отмечается венозное и капиллярное полнокровие с картиной эритростазов, умеренный отек межуточной ткани.

В других микропрепаратах этого же срока наблюдения - небольшие фрагменты кожи с тонким роговым слоем. Эпидермис присутствует на небольшом протяжении и представлен фрагментом с явлениями акантоза и гиперкератоза. В сосочках дермы на этом уровне - очаговая нейтрофильно-лимфоцитарная инфильтрация.

На сроке наблюдения 21 сутки на коже старого животного видна ожоговая поверхность после отхождения струпа до 2 см диаметром, края раны подрыты. Имеется повреждение сосочкового слоя кожи. Эпителизация отсутствует. У краев раны слабые вялые грануляции до 3 мм шириной. Рана сухая.

В гистологических препаратах на указанном сроке наблюдения представлены фрагменты кожи с тонким роговым слоем. На участке, занимающем менее одного поля зрения, определяется очаг коагуляционного некроза, представленный бесструктурными, плотными гомогенными массами с интенсивным базофильным оттенком. Под очагом некроза определяется пласт грануляционной ткани, распространяющийся до глубоких слоев дермы. В составе грануляционной ткани видны множественные новообразованные сосуды всех калибров. В клеточном составе преобладают молодые формы фибробластов с примесью макрофагов и клеток лимфоидного ряда. В сосудах на границе с неповрежденными тканями - явления лейкодиапедеза. Строма представлена грубыми, хаотично расположенными коллагеновыми волокнами.

На 28 сутки наблюдения на месте ожоговой поверхности образовался грубый рубец на уровне кожи. В области рубца наблюдается рост шерсти.

В гистологическом препарате на сроке наблюдения 28 суток представлен фрагмент кожи с тонким роговым слоем. В дерме на участке, занимающем несколько полей зрения, определяется эпителизированный рубец, в клеточном составе которого преобладают зрелые фибробласты. Коллагеновые волокна грубые, малоизвитые, сложены в компактные пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи.

Влияние экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей на репаративный процесс при термическом ожоге кожи у старых животных

Через 7 суток после нанесения термического повреждения на коже старых кролкиов 1 подопытной группы наблюдался ожог кожи 3б-4 степени 2,3 см. диаметром со струпом, из-под которого сочилось серозное отделяемое.

В гистологическом препарате на этом сроке наблюдения один из фрагментов представлен кожей с тонким роговым слоем, состоящей из двух слоев эпидермиса, между которыми расположены поверхностные слои дермы и придатки кожи - волосяные фолликулы.

В другом представлен фрагмент клеточного детрита, массы распадающихся лейкоцитов и сгусток крови, представленный нитями фибрина, в петлях которого лежат компактные массы гемолизированных эритроцитов и группировки клеток белой крови.

На 14 сутки наблюдения у животных 1 подопытной группы после аппликаций с эксрактом хрящевой и костной тканей ожоговая поверхность под струпом до 2 см диаметром. Имеется повреждение сосочкового слоя кожи. Эпителизации нет. Струп плотно прилегает к поверхности раны. У краев раны грануляции до 2 мм шириной.

В гистологическом препарате представлен фрагмент кожи с тонким роговым слоем. Роговой слой и эпидермис присутствуют на всем протяжении препарата. Сосочки дермы хорошо выражены во всех полях зрения. Производные кожи (волосяные фолликулы и сальные железы) равномерно распределены по всей протяженности препарата. Дерма представлена соединительнотканной основой, волокна ее умеренно извиты, ориентированы преимущественно параллельно поверхности кожи. Гиподерма представлена тонкой прослойкой жировой ткани.

На 21 сутки наблюдения на коже животных 1 подопытной группы отмечается ожоговая поверхность под струпом до 2 см диаметром. Имеется повреждение сосочкового слоя кожи. Струп плотно прилегает к поверхности раны. У краев раны грануляции до 3 мм шириной. Начинающаяся эпителизация с краев раны до 1 мм шириной.

На гистологическом препарате кролика 1 подопытной группы на 21 сутки наблюдения на участке, занимающем несколько полей зрения, отсутствует эпидермис и поверхностные слои дермы. В глубоких слоях дермы - венозное и капиллярное полнокровие, на уровне дефекта ткани - лейкостазы в капиллярах с явлениями миграции лейкоцитов за пределы сосудистых стенок с формированием муфтообразных периваскулярных нейтрофильно - лимфоцитарных инфильтратов. В некоторых полях зрения встречаются гигантские многоядерные клетки. Отмечается пролиферация фибробластов. Соединительнотканные волокна дермы грубые, сближены между собой, сложены в компактные малоизвитые пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи. Эпидермальный пласт по краю дефекта ткани тонкий, клетки имеют небольшие, интенсивно окрашенные ядра.

На 28 сутки наблюдения на месте ожоговой раны сформировался мягкий эластичный рубец на уровне кожи. В области рубца наблюдается рост шерсти.

На гистологическом препарате на 28 сутки наблюдения представлен фрагмент кожи с тонким роговым слоем. Роговой слой и эпидермис присутствуют на всем протяжении препарата. Сосочки дермы хорошо выражены во всех полях зрения. Производные кожи (волосяные фолликулы и сальные железы) равномерно распределены по всей протяженности препарата. Дерма представлена соединительнотканной основой, волокна ее извиты, в поверхностных слоях ориентированы параллельно поверхности кожи, в глубоких слоях расположены хаотично. Гиподерма представлена тонкой прослойкой жировой ткани. В мышечной ткани - полнокровие капилляров и вен, фасция тонкая, умеренно разволокнена.

Влияние пептидного биорегулятора хондролюкса на репаративный процесс при термическом ожоге кожи у старых животных

Через 7 суток после нанесения термического повреждения на коже старых животных 2 подопытной группы наблюдалась ожоговая поверхность до 2 см диаметром. Отмечалось повреждение сосочкового слоя кожи. После отхождения струпа рана чистая, отделяемое из раны скудное серозное. У краев раны грануляции до 3 мм шириной. Начинающаяся эпителизация с краев раны до 1 мм шириной.

В гистологическом препарате на участке, занимающем несколько полей зрения, эпидермис уплощен, истончен, сосочки дермы сглажены, волокна дермы разрыхлены, дезорганизованы, раздвинуты отечной жидкостью, между волокнами - инфильтраты из клеток лимфоцитарного ряда с примесью макрофагов и участки пролиферации фибробластов. В гиподерме - густая инфильтрация распадающимися нейтрофилами. Грубые коллагеновые волокна сложены в компактные пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи. В фасции - очаги некроза и фибриноидное набухание сосудистых стенок.

Таблица 7. Сравнительный анализ развития репаративного процесса термического ожога кожи старых животных

Параметр	Срок наблюдения, сутки
	Контрольная группа	Подопытные группы
		Действие экстракта хрящевой и костной тканей	Действие хондролюкса
Появление грануляций	14	7	7
Эпителизация	28	14	14
Ангиогенез	14	7	7
Пролиферация фибробластов	21	21	14
Появление нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации	21	21	14
Образование коллагеновых волокон	14	7	7
Образование рубца	28	21	21

На 14 сутки у животных, которым делали аппликации с хондролюксом, ожоговая поверхность под струпом до 2 см диаметром. Струп плотно прилегает к поверхности раны. Начинающаяся эпителизация под струпом до 5 мм шириной от края раны.

В гистологическом препарате на 14 сутки наблюдения на участке, занимающем несколько полей зрения, определяется формирующийся соединительнотканный рубец с большим количеством коллагеновых волокон, формирующих пучки, ориентированные параллельно поверхности кожи. В клеточном составе - преобладание фибробластов и множественные, в основном, периваскулярные, очаги нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации. Новообразованные сосуды имеют дифференцированные стенки и эндотелиальную выстилку. Эпидермис присутствует только в пограничных с неизмененной кожей участках. В этих областях определяются явления пролиферации клеток базального слоя, увеличение количества клеточных слоев в эпидермальном пласте.

На 21 сутки наблюдения на месте ожоговой поверхности кожи старых животных 2 подопытной группы определяется мягкий эластичный рубец, на котором наблюдается рост шерсти.

В гистологическом препарате (21 сутки) на участке, занимающем несколько полей зрения, в дерме определяется пласт зрелой рубцовой ткани с умеренным количеством клеточных элементов (преимущественно - зрелых фибробластов) и большим количеством компактно упакованных грубых малоизвитых хаотично ориентированных коллагеновых волокон. На поверхности рубцовой ткани - ожоговый струп с густой инфильтрацией распадающимися лейкоцитами, представленный пластом эпидермиса в состоянии коагуляционного некроза, с включениями полигональных частиц желтовато - коричневого окрашивания.

Сравнительный анализ процесса заживления термического ожога кожи у старых животных свидетельствует о стимулирующем влиянии экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса на репарацию тканей кожи. Так, основные этапы репарационного процесса у старых животных подопытных групп наступали в среднем на 7 дней раньше, чем у кроликов контрольной группы (табл. 7). Следует отметить, что применение пептидного биорегулятора хондролюкса способствовало более раннему наступлению этапа пролиферации фибробластов и появления нейтрофильно-лимфоцитарной инфильтрации, что приводило к более быстрому образованию эластичного мягкого рубца, чем у животных 1 подопытной группы, которым применяли аппликации с экстрактом эмбриональных хрящевой и костной тканей.

Влияние экстрактов эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора на репарацию костной ткани

Морфологическая характеристика репаративного процесса в плоских костях у старых животных

В исследование были включены 15 кроликов в возрасте 4,5 лет с массой тела 4,5-4,8 кг, которые были разделены на 2 группы. Кроликам в теменной области производили трепанацию черепа (площадь дефекта равна 2Ч2 см).

У животных контрольной группы (6 особей) заживление дефекта костной ткани происходило естественным путем. У 9 животных подопытной группы осуществляли пластику костного дефекта сингенным хрящом из рёберно-грудинного сочленения, вложенным между двумя слоями тонко нарезанной гемостатической губки (по типу «сэндвича»). Одновременно с этим на место костного дефекта делали аппликации с пептидным биорегулятором хондролюксом.

Контрольные гистологические исследования и рентгенографию черепа проводили последовательно с интервалом в 7 дней с момента операции вплоть до полного замещения дефекта костной ткани.

В гистологическом препарате через 28 суток после трепанации черепа представлен фрагмент плоской губчатой кости животного контрольной группы. На участке, занимающем несколько полей зрения, определяется дефект кости. Костная ткань стенок дефекта гомогенизирована, с усилением восприятия кислого фуксина. Со стороны надкостницы видны реактивные изменения, заключающиеся в увеличении количества фибробластов и увеличении толщины коллагеновых волокон.

В гистологических препаратах кости старого животного подопытной группы после пластики сингенным хрящем и аппликации с пептидным биорегулятором хондролюксом на сроке наблюдения 7 суток определяются фрагменты плоской губчатой кости. На участке, занимающем несколько полей зрения, выявляется дефект кости, выполненный разобщенными фрагментами хряща.

Фрагменты хряща соединены с костными балками клеточно-волокнистыми тяжами, в составе которых преобладают молодые формы фибробластови немногочисленные нежные коллагеновые волокна. Кроме того, в клеточном составе встречаются нейтрофильные лейкоциты с примесью клеток лимфоидного ряда и небольшое количество макрофагов.

В гистологических препаратах старых кроликов подопытной группы на сроке наблюдения 14 суток после пластики сингенным хрящем и аппликаций с пептидным биорегулятором хондролюксом на участке, занимающем несколько полей зрения, определяется дефект кости, выполненный разобщенными фрагментами хряща. Фрагменты хряща соединены с костными балками клеточно-волокнистыми тяжами, в составе которых выявляется большое количество молодых форм фибробластов. Содержание коллагеновых волокон увеличено по сравнению с предыдущим сроком исследования. В составе формирующейся грануляционной ткани видны новообразованные сосуды.

На сроке наблюдения 21 сутки морфологическая картина в новообразованной грануляционной ткани существенно не изменилась по сравнению с предыдущим сроком исследования. Однако фрагменты хряща более плотно прилегают к стенкам дефекта костной ткани за счет более компактной упаковки новообразованных коллагеновых волокон. Отмечаются также явления резорбции хряща остеокластами.

На сроке наблюдения 28 суток в гистологических препаратах кости черепа старых кроликов подопытной группы определялись фрагменты плоской губчатой кости. На участке, занимающем несколько полей зрения, определяется дефект кости, выполненный небольшими фрагментами хряща. Фрагменты хряща с полной утратой ядер, соединены с костными балками плотными соединительнотканными сращениями с небольшим количеством клеточных элементов и плотно упакованными грубыми малоизвитыми коллагеновыми волокнами. В клеточном составе новообразованной плотной соединительной ткани преобладают зрелые веретеновидные формы фибробластов. Содержание коллагеновых волокон существенно увеличено по сравнению с предыдущим сроком исследования.

Таким образом, применение метода пластики сингенным хрящом и аппликаций с пептидным биорегулятором хондролюксом позволяет значительно ускорить процесс репарации костной ткани у старых животных, приводя к образованию полноценной плоской губчатой кости к 28 суткам наблюдения, в то время как у животных контрольной группы на этом сроке наблюдения обнаруживается значительный дефект кости.

Закономерности регенерации ткани костного мозга при трансплантации его в брыжейку тонкого кишечника кролика

Суть модели культивирования сингенного костного мозга в брыжейке тонкого кишечника экспериментального животного заключается в том, что взятая из бедренной кости кролика взвесь клеток костного мозга вводится между листками брыжейки, создавая некую полость. С течением времени в трансплантированной взвеси клеток начинаются процессы организации, приводящие, в конце концов, к образованию полноценной гемопоэтической ткани. При проведении повторной лапаротомии в установленные сроки наблюдения обращают на себя внимание красноватые очаги (диаметром до 0,5 см) на фоне белесоватой брыжейки, а прозрачность и некоторая растяжимость самой брыжейки делают возможной световую микроскопию. К концу 3-ей - началу 4-ой недели эксперимента весь объём этой искусственной камеры заполняется зрелой костно-мозговой тканью.

Таким образом, данная модель представляет собой удобный и доступный способ исследования регенераторной способности костного мозга при трансплантационном повреждении.

В микропрепаратах на сроке 8 недель представлен полосчатой формы фрагмент жировой ткани, окруженный тонкими соединительно-тканными пластами с мезотелиальной выстилкой. Во всех полях зрения в толще жировой ткани определяются участки разрастания плотной соединительной ткани с умеренным количеством клеточных элементов и компактно упакованными малоизвитыми коллагеновыми волокнами. В клеточном составе преобладают зрелые веретеновидные формы фибробластов. Вокруг новообразованных соединительнотканных тяжей - отложения зерен гемосидерина как в свободном виде, так и в составе гемосидерофагов.

Закономерности регенерации ткани костного мозга в области образованной полости в костном остове бедренной кости кролика

Исследование проведено с использованием модели фистулы в костном остове бедренной кости у 9 кроликов в возрасте 4 лет с массой тела 4,5-4,7 кг. Фистула представляет собой круглый тоннель от поверхности кости до костного мозга в области эпифиза, диаметр ? 2 мм, глубина ? 5 мм. Образующийся таким образом тоннель, стенки которого ограничены костной тканью, создаёт условия для изучения характера миграции костномозговых элементов в получившееся пустотное пространство.

Данное положение нами контролировалось визуально в различные сроки после образования тоннеля в костной ткани (1, 2, 3, 4 недели). Это позволило отметить, что в течение 1-й недели из ткани интактного костного мозга старых животных контрольной группы (4 кролика) в области образовавшейся пустоты начинает появляться нарастающий объём ткани костного мозга. К концу 3-й недели этот объём ткани костного мозга практически заполняет всё пустотное пространство и представляет собой округлый цилиндр, состоящий из костномозговой ткани.

5 кроликам подопытной группы в просвет фистулы, начиная с 1-го дня эксперимента, в течение 1 недели 1 раз в день вводили 1,25 мл (0,5 мг) пептидного биорегулятора хондролюкса для изучения стимулирующего действия препарата на процесс образования костной ткани.

Таким образом, данная модель фистулы в костном остове бедренной кости кролика представляет собой удобный доступный способ морфо-функционального исследования регенераторных возможностей костного мозга.

Морфологическая характеристика процесса регенерации костного мозга при заполнении полости в бедренной кости кролика

Препараты регенерирующего костного мозга на сроке 1 недели представляют собой зону, в которой от внутреннего входа в просвет фистулы образовывается тканевой столбик, исходящий своим основанием из структуры неповреждённого костного мозга. Характерная гистологическая картина в срезах на указанных сроках демонстрирует наличие фибробластов и формирование из них мощных «пучков». Это стадия экспансии роста фибробластов.

Срок 2 недели у животных контрольной группы характеризовался появлением участков разрежения фибробластных «пучков», когда между плотно прилежащими друг к другу фибробластами образуются промежутки.

В гистологических препаратах костного мозга животных подопытной группы после применения пептидного биорегулятора хондролюкса появление промежутков в «пучках» фибробластов и разрежения в области «пучков» отмечалось уже к 10 дню.

В гистологических препаратах костного мозга животных контрольной группы на сроке эксперимента 4 недели по-прежнему остаётся выраженный по всей длине тяж из фибробластов, но интенсивно испещрённый очагами кроветворения. Такие островковые образования окружены сосудистым эндотелием, а полости внутри заполнены большим количеством эритроцитов и миелоидными элементами крови. Расположение этих очагов кроветворения преимущественно периферическое по отношению к основной оси фибробластного тяжа, в центре которого имеется большое количество таких кроветворных структур.

На сроке 3 недели обращает на себя внимание, что в основании наросшего в просвет фистулы фрагмента костномозговой ткани, а именно, по периферической окружности, наблюдается формирование костной ткани. Это явление объясняется особенностями нашей модели, а именно, тем, что тоннель образован в костном остове. При этом стенки его выстланы тонкой стальной пластинкой. В связи с этим регенерирующий костный мозг в области фистулы не имеет естественного контакта со структурами трубчатой кости. Поскольку эволюционное развитие костномозговой ткани всегда ограничивается костной муфтой, необходимость её представляется нам очевидной и при заполнении полого объёма фистулы в эксперименте. Именно поэтому по достижении костномозговой тканью в области фистулы определённой зрелости возникает необходимость в образовании естественного костного барьера. Именно это мы и наблюдаем на последних сроках эксперимента, когда от основания фистулы вверх по краям тоннеля начинает появляться костная ткань - у животных контрольной группы к концу 4 недели, а у животных подопытной группы после применения пептидного биорегулятора хондролюкса - на 3 неделе.

Следует особо отметить, что контрольные гистологические исследования, проведенные через 6 месяцев после окончания экспериментов на моделях эксцизионных ран, термических ожогов и костных дефектов, показали, что применение экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса не вызывает негативных пролиферативных процессов в коже и костной ткани: гистологическая картина соответтсвующей ткани кроликов подопытных групп через 6 месяцев свидетельствует о том, что атипичные элементы тканей в препаратах отсутствуют. Таким образом, отдаленные результаты исследования подтверждают безопасность применения экстрактов эмбриональных тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса для ускорения заживления дефектов кожи и костной ткани.

Заключение

Одной из актуальных проблем современной геронтологии является восстановление утраченных функциональных способностей стареющего организма. В рассматриваемом аспекте особого внимания заслуживает способность стареющего организма к реализации репаративного процесса при повреждениях различных тканей организма. В нашем исследовании представлены возможности репарации повреждений кожи и дефектов костного скелета.

При различных видах патологии, требующих включения репаративного процесса, стареющему организму требуется «посторонняя» помощь в виде стимулирующих средств. Это необходимо для ускорения репаративного процесса или перевода вяло текущего восстановления на уровень эффективного по времени восстановления.

В наших исследованиях представлены морфологические образцы заживления эксцизионных кожных ран, а также течение пролиферативного процесса у старых животных под влиянием аппликаций с экстрактом эмбриональных хрящевой и костной тканей и пептидного биорегулятора хондролюкса, представляющего собой экстракт из хрящевой ткани телят. Обращает на себя внимание замедленное начало репарации у старых животных. Если начальное формирование воспалительной реакции у взрослых особей обычно занимает 5 дней, то у старых животных выраженность этой стадии отсрочена на 3-4 дня. Проявлением этой особенности является слабая скорость инфильтрации лейкоцитами повреждённой области, пассивная мобилизация фибробластов и неповреждённых клеток по краям раны. Это приводит к задержке пролиферации во всех слоях повреждённого участка кожи. Впоследствии это задерживает закрытие раневого дефекта.

Безусловно, медленная миграция клеток миелоидного и лимфоидного рядов, отвечающих за выработку и секрецию различного типа цитокинов, сдерживает важные для репаративного процесса клеточно-клеточные взаимодействия. Поэтому в области раны у старых животных преобладают некротические проявления, сдерживающие полноценное заживление раны. Как упоминалось ранее, в обычных условиях миграция клеток миелоидного и лимфоидного рядов происходит в более быстром темпе.

В связи с этим нами была испытана возможность стимулирования ранней фазы репаративного процесса за счёт аппликаций с экстрактом хрящевой и костной тканей 14-дневного куриного эмбриона, а также с пептидным биорегулятором хондролюксом. Хондроциты и остеобласты на данном периоде развития эмбриона характеризуются высокой степенью интенсивности пролиферативного процесса, поскольку идёт рост массы костного скелета. Кроме того, в специальных экспериментах в условиях in vitro исследовали ряд важных свойств этого экстракта. Прежде всего, нас интересовали хемоаттрактивные свойства экстракта хрящевой и костной тканей эмбриона. Хемотаксический индекс этого экстракта в агарозе практически равнялся хемотаксическому индексу классического хемоаттрактанта С5а (индекс С5а составил 2,22±0,05, индекс экстракта эмбриональных хрящевой и костной тканей Ї 2,86±0,05).

Таким образом, аппликации экстрактов эмбриональных хрящевой и костной тканей на раневую поверхность значительно стимулировали раннюю фазу репаративного процесса у старых животных за счёт значительно индуцированной миграции клеток и последующей секреции ими биологически активных субстанций. Об этом свидетельствуют данные о более раннем появлении грануляционной ткани по краям раны. Морфологически это подтверждается констатацией выраженной инфильтрации лейкоцитами в области поврежденной кожной поверхности. В итоге, экстракты эмбриональных хрящевой и костной тканей, применяемые в виде аппликаций, не только ускоряли раннюю стадию репарации, но и оказывали влияние на восстановительные процессы в матриксе.

Одной из актуальных проблем геронтологии является особенность формирования и течения репарационного процесса в костной ткани. Это объясняется, в первую очередь, тем, что риск возникновения костных дефектов при старении организма чрезвычайно высок, особенно учитывая проблему остеопороза. К этому следует добавить трудности в лечении травматических переломов в старческом возрасте. Всё это, безусловно, характеризует важность изучения особенностей репарации костной ткани в геронтологическом аспекте.

В нашем исследовании для решения обозначенной выше проблемы были использованы две модели повреждения костного скелета - дефект трубчатой кости и плоской кости черепа старых животных.

Дефект трубчатой кости воспроизводили в виде сквозного тоннеля через все слои бедренной кости кролика. Диаметр тоннеля составлял 2-3 мм. Стенки созданного дефекта покрывали тонкой стальной плёнкой с целью предотвращения закрытия его при длительном наблюдении. Как показало наблюдение за ходом заполнения костного «вакуума» через определённые временные промежутки, репаративный процесс можно охарактеризовать несколькими стадиями. Начиная с 3-ей недели, в начале тоннеля со стороны костного мозга отмечалось начало образования костной ткани, которая постепенно поднималась на поверхность тоннеля и покрывала образовавшийся столбик костного мозга. Процесс формирования костного футляра заканчивался к 30-35 дню от начала эксперимента.

Данный процесс остеогенеза в условиях тоннельного дефекта трубчатой кости обусловлен выработанным в процессе эволюции механизмом взаимодействия между кроветворными клетками-предшественниками и предшественниками костной ткани, остеобластами. Поэтому в настоящее время вполне обоснованно выделяется как единая функциональная система «костный мозг - костная ткань». В нашем исследовании этот парадигм был подтверджден специальными экспериментами с аутотрансплантацией костного мозга в брыжейку кишечника, атипичное для кроветворения место [Патент РФ №227741]. Между листками брыжейки вводилось 0,2-0,3 мл пунктата костного мозга бедренной кости кролика. Через 5-7 дней после повторной лапаротомии на месте инъекции взвеси костного мозга отмечались настоящие островки гемопоэза. При анализе гистологических срезов констатировали рост миелоидного и эритроидного ростков кроветворения. В конце эксперимента участки кроветворения покрывались костным футляром. Это происходило на 30-35 дни после аутотрансплантации. Поскольку в видимом гемотрансплантате присутствовали клетки стромы костного мозга, то именно эти клетки явились источником образования остеобластов, которые и формировали костный покров для растущего очага костного мозга.

Эти данные указывают на важность взаимодействия предшественников гемопоэтических клеток с элементами стромы, что важно учитывать при оценке репарационного процесса в костной ткани. У старых животных туннелирование трубчатой кости характеризовалось, прежде всего, резко замедленным процессом миграции фибробластов в просвет тоннеля - к 25-30 суткам этот врастающий столбик достигал длины одной трети всего пространства. Кроме того, растущие фибробласты были расположены рыхло, образование очагов гемопоэза было весьма скудным. Костный футляр в эти сроки только начинал организовываться, так и не достигая вершины растущего столбика фибробластов.

...