6

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лаборатория клинической рефлексотерапии института рефлексотерапии Федерального научного клинико-экспериментального центра традиционных методов диагностики и лечения МЗСР РФ и в Государственном научно-исследовательском испытательном институте военной медицины МО РФ

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Адаптационные реакции организма: связь с функциональной активностью комплемента, возможности коррекции

14.03.03 - патологическая физиология

Кузнецова Лариса Николаевна

Москва - 2009

Работа выполнена в лаборатории клинической рефлексотерапии института рефлексотерапии Федерального научного клинико-экспериментального центра традиционных методов диагностики и лечения МЗСР РФ и в Государственном научно-исследовательском испытательном институте военной медицины МО РФ.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Малышев Игорь Юрьевич

Доктор медицинских наук, профессор Василенко Алексей Михайлович

Доктор медицинских наук Головкина Лариса Леонидовна

Ведущее учреждение - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «23» сентября 2010 года в «14» часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Лариса Николаевна Скуратовская.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Комплементом называют большую группу (насчитывающую, по данным разных авторов, от 9 до 20 компонентов) взаимодействующих между собой белков и гликопротеинов крови, имеющихся у всех позвоночных и синтезирующихся клетками всех тканей организма. Концентрация в нормальной плазме компонентов комплемента составляет 4% от всех белков и около 10 % глобулиновой фракции сыворотки крови человека (Барбер X., 1980). Комплемент был описан в конце девятнадцатого века. Пристальное внимание к нему привлекли результаты научных исследований, в ходе которых была открыта способность свежей сыворотки крови вызывать гибель чужеродных клеток и микроорганизмов. Значение этого свойства свежей сыворотки было сразу осознано, что послужило толчком для исследований, направленных на изучение биохимических и биологических причин лизиса клеток. Начиная с 1980 года, многие ученые активно изучали in vitro влияние комплемента на функциональные свойства тромбоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, тучных клеток (Шитикова А.С., 1982; Ложкина А.Н., 1987; Тец В.В., 1987; Кузник Б.И., 1989; Kurata Y., 1985; Warheit D.B., 1988; и др.). Тогда же выяснили, что система комплемента имеет жесткую последовательность активации компонентов в каскаде in vitro и опосредует свое влияние через рецепторы, расположенные на клеточных мембранах. Было показано, что комплемент in vitro усиливает фагоцитоз и стимулирует секрецию биогенных аминов и факторов свертывания крови (Логун В.А., 1983; Будажабон Г.Б., 1984; Кузнецова Н.Н., 1987; Haprel P.C., 1982; Hugli Т.Е., 1984; Cooper N.R., 1985; Lucisano J.M., 1988; Johnson E., 1988; Sundsmo J.S., 1983; Presta M., Camozzi M., Salvatori G., Rusnati M., 2007; Kastl S.P., Speidl W.S., Kaun C. et al., 2008 и др.). В 1990-х и в начале 2000-х годов исследования были посвящены изучению сложной структуры компонентов комплемента (Анташев А.И., Шкурко В.Л., 1996; Yoshikawa T., Takano H., Yoshida N., Kondo M., 1995; Menger M., Aston W.P., 2003 и др.). В результате проведенных научных работ было установлено влияние на систему комплемента in vitro гистонов и протаминов, естественных антител, пропердина, ионов магния и кальция, интерферона и других веществ (Кашкин К.П. с соавторами, 2003 и др.). С учетом обнаруженных in vitro свойств реакции комплемента выделили классический, лектиновый и альтернативный пути его активации.

Не смотря на многочисленные исследования, сохраняется представление, что комплемент играет роль преимущественно в воспалительных процессах, опсонизирует чужеродные материалы для их последующего фагоцитоза и опосредует уничтожение различных клеток и микроорганизмов (Bugla-Pіoskoсska G., Doroszkiewicz W., 2006; Bonaparte RS, Hair PS, Banthia D. et al., 2008; Granoff D.M., 2009 и др.). Продолжением традиционного подхода к исследованиям in vitro является интерес к терминальным белкам комплемента как к причине развития заболеваний вследствие гемолиза клеток (Antashey A.V., Shkurko V.I., 1996; Greenstein J.D., Peake P.W., Charlesworth J.A., 1996; Urbich C., Fritzenwanger M., Zeiher A.M., Dimmeler S., 2000; Kijlstra A., La Heij E., Hendrikse F., 2005; Inglis J.E., Radziwon K.A., Maniero G.D., 2008; Magro C.M., Dyrsen M., Kerns M.J., 2008 и др.). Исследования, выполненные преимущественно in vitro, не давали представление о системных процессах регуляции системы комплемента in vivo. В последнее время стали появляться работы, в которых для изучения терминальных белков комплемента использовалась модель экзогенного или эндогенного стресса (Ayensu W.K., Pucilowski O., Mason G.A.,1995; Wang W., Kirschfink M., Ruppel A., 2006; Gao C., Liu X., Shi H. et al., 2009), что также не отличается от традиционного подхода к исследованию комплемента. Вместе с тем, компоненты комплемента не рассматривались в качестве структур неспецифической защиты в формировании адаптационных реакций организма и их роль при стрессе не выяснена. За рамками внимания исследователей остались основные патофизиологические механизмы, реализующиеся с участием комплемента in vivo. Хотя было установлено, что изменение структуры белков сыворотки крови объективно отражает процессы, происходящие в организме, в том числе и возрастные (Шабалин В.Н. с соавт., 2003).

Влияние на организм различных неблагоприятных воздействий, экстремальных условий труда, нарушений сбалансированности питания, медикаментозного вмешательства, экологической обстановки и т.д. сопровождает человека в процессе всей его жизни и ведет к значительной перестройке обменных процессов и к развитию заболеваний (Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И., 1983; Агаджанян Н.А., Ермакова Н.В., 1997 и др.).

Устойчивость к стрессорным повреждениям в значительной мере определяется балансом между активностью стресс-системы и стресс-лимитирующих систем, который определяется генетическими особенностями организма и формируется в процессе жизнедеятельности под влиянием различных факторов (Пшенникова М.Г., 2001). Важную роль в механизмах устойчивости играют центральная нервная и иммунная системы, взаимосвязь которых осуществляется и при формировании генераторов патологически усиленного возбуждения в структурах головного мозга, ответственных за регуляцию функций иммунитета (гипоталамус, гиппокамп, сенсорная кора и др.) (Крыжановский Г.Н., 1999).

Для того чтобы срочная адаптационная реакция сменилась устойчивой адаптацией, необходимы время и повторные действия стрессора, а так же формирование структурного следа (Меерсон Ф.З., 1993; Пшенникова М.Г., 1994). Все более важным аспектом данной проблемы становится изучение роли иммунной системы и иммунологических механизмов в развитии адаптационных реакций. Однако на сегодняшний день в этом направлении проводились лишь разрозненные научные работы, результаты которых имеют противоречивый характер. Единого мнения о значимости обнаруженных отклонений в развитии внутренних процессов среди ученых нет.

Мы предположили, что комплемент, участвующий во многих процессах in vitro, должен реагировать и в случае острой адаптации организма к экстремальным воздействиям. Исследовали первые пять компонентов комплемента, надеясь получить данные о включении гуморального иммунитета в патофизиологические механизмы под влиянием внешних факторов и внутренних регуляторов организма. Такое исследование представляется весьма актуальным, поскольку может дать новые представления о регулирующих белках крови в период срочной адаптации организма и создать основу для разработки адекватных, эффективных и безопасных методов коррекции собственно стресса и спровоцированных им патологических состояний.

Цель исследования

Разработать и научно обосновать систему идентификации изменений срочных и переходных адаптационных реакций организма на основе системного изучения врожденной резистентности на модели компонентов комплемента.

Задачи исследования

1. Изучить особенности взаимодействия комплемента и адренореактивных систем при моделировании стресса в эксперименте. Оценить роль системы комплемента в формировании ответных реакций в условиях введения адреналина или адреноблокаторов (тропафена и индерала) in vivo.

2. Определить динамическое изменение концентрации компонентов комплемента при действии неблагоприятных факторов среды (гипоксии, температуры 50°С) и оценить включение белков в патофизиологические механизмы адаптационных реакций организма.

3. Используя данные исследования системы комплемента, провести оценку эффективности фармакологической коррекции гипоксии (препаратами амтизола сукцинат, гидазепам, ноотропил, пробукол, яктон) и неблагоприятного действия температуры 50°С (ацефен + аскорбиновая кислота), сопоставив их с результатами, полученными на фоне плацебо при тех же воздействиях.

4. Установить диагностическую информативность комплемента при гипертонической болезни и ее коррекции блокаторами кальциевых каналов (сискор, нитрендипин).

5. Оценить чувствительность системы комплемента к алиментарным нагрузкам (углеводным, жировым) при физической активности человека.

6. Выявить возможные общие закономерности и отличия в ответных реакциях системы комплемента на разные возмущающие действия. На основе полученных результатов создать систему идентификации срочных и переходных адаптационных реакций организма с помощью иммунологических маркеров.

Научная новизна работы

Впервые обнаружено и научно доказано, что динамическое изменение концентрации компонентов системы комплемента связано с реализацией адаптационных реакций организма к острому стрессу и в условиях его фармакологической коррекции.

Впервые определены особенности отклика комплемента в ответ на действие адреналина, - и - адреноблокаторов in vivo как в остром периоде, так и в длительном эксперименте (30 суток). Установлена связь параллельного изменения концентрации С4 и С2 компонентов комплемента при наличии высокого содержания адреналина in vivo. Выявлена аналогичная ответная реакция С4 и С2 компонентов комплемента в исследованиях с участием человека при физической активности и при «подъеме на высоту 7,0-7,5 км».

Впервые доказана связь повышения концентрации С3 компонента комплемента с выраженным действием гипоксии на организм человека в исследованиях при «подъеме на высоту 8 км». Установлена эффективность коррекции данного влияния препаратами пробукол и гидазепам, ограничивающими каскад комплемента активацией его первых белков.

Впервые доказана зависимость реакции системы комплемента от фармакодинамики ряда препаратов (амтизола сукцинат, гидазепам, ноотропил, пробукол, яктон; эйконол, блокаторы медленных кальциевых каналов группы 1,4-дигидропиридинов: сискор, нитрендипин) и найдены точки соприкосновения между комплементом и фармакологическим средствами на уровне биохимических реакций, регулирующих обмен веществ в организме человека.

Впервые выявлено истощающее действие температуры 50°С на активность всей системы комплемента, что может в дальнейшем ложиться в основу формирования структурного следа в механизме адаптации организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Определена эффективность коррекции этого влияния препаратом ацефен в сочетании с аскорбиновой кислотой, которые ограничивают комплементарный каскад возбуждением первых компонентов С1 и С4.

Теоретическая и практическая значимость работы

Основное теоретическое и практическое значение работы состоит в развитии важной области патологической физиологии - выяснению за счет какой цепи явлений неадаптированный организм превращается в адаптированный. На основании системного подхода, реализованного в экспериментально-клинических и фармакологических исследованиях, обосновано место системы комплемента в реализации адаптационных реакций организма к острому стрессу и в условиях фармакологической коррекции его неблагоприятного действия. Выявленные изменения концентрации компонентов комплемента при острых адаптационных реакциях организма углубляют теоретические представления о механизмах их формирования и могут быть использованы не только для изучения стресса и патогенеза заболеваний, но и для разработки подходов к индивидуализированным патогенетически обоснованным схемам лечения. Представлены экспериментально-клинические подтверждения необходимости системного подхода к медицинским вмешательствам. Научно обоснована концепция оценки фармакологической коррекции неблагоприятных воздействий на состояние врожденной устойчивости организма. В работе установлена существенная для практической медицины зависимость между фармакодинамикой препаратов и откликом системы комплемента, что позволит повысить клиническую эффективность организации медицинских программ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При неблагоприятных воздействиях на целостный организм вследствие приспособительных адаптационных механизмов (перераспределения жидкостей в организме, биохимических реакциямй, регулирующих обмен веществ и др.) меняется концентрация отдельных компонентов комплемента, что позволяет оценить состояние врожденной резистентности in vivo.

2. Индикатором выраженного стресса in vivo, сопровождающегося высокой дозой адреналина в крови, является параллельное изменение концентрации С4 и С2 компонентов комплемента.

3. Иммунологическим маркером формирования адаптационных реакций организма в ответ на выраженное воздействие гипоксии («подъем на высоту 8 км») является повышение концентрации С3 компонента комплемента.

4. При позитивной фармакологической коррекции неблагоприятных воздействий каскад комплемента ограничивается реакцией его первых компонентов: С1 и/или С4.

Внедрение результатов работы

На основе полученных данных были подготовлены методические рекомендации «Иммуно-биохимические критерии начальных форм нейроциркуляторной дистонии и гипертонической болезни у летного состава и средства их коррекции» (Москва: Государственный научно-исследовательский испытательный институт авиационной и космической медицины МО РФ, 1991) и «Использование иммуно-биохимических критериев в целях оценки переносимости нагрузочных проб, используемых во врачебно-летной экспертизе» (Москва: Государственный научно- исследовательский испытательный институт авиационной и космической медицины МО РФ, 1997).

Апробация работы

Основные результаты и положения работы доложены и обсуждены: на 3 Международном Рабочем Совещании по определению действия вибраций на организм человека в научно-исследовательском институте медицины труда РАМН (Москва, 1993 г.); на ежегодных конференциях кафедры Гражданской авиации в Академии постдипломного образования (Москва, 1997-1999 гг.); на расширенной конференции врачей и научных сотрудников Российского научно-исследовательского института геронтологии РАМН (Москва.11 сентября 2003 г.); на VII Международной конференции «Современные технологии восстановительной медицины» (Сочи, 11-16 мая 2004 г); на совещании в Спорткомитете России, в рамках планового обучения врачей спортивных команд (Москва, 30 ноября 2005 г.); на Симпозиуме Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития и гематологического научного центра РАМН «Безопасность переливания компонентов крови» (г. Москва, 7 декабря 2006 г.).

Материалы диссертации представлены, доложены и обсуждены на заседании совместной межлабораторной научной конференции Федерального научного клинико-экспериментального центра традиционных методов диагностики и лечения МЗСР РФ, г. Москва, 16 декабря 2009 года.

Публикации

По теме диссертации опубликована 31 работа; среди них монография и 11 статей в журналах, рекомендованных для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов, практических рекомендаций. Общий объём работы составляет 243 страницы. Текст иллюстрирован 40 таблицами и 37 рисунками. Список литературы включает 280 работ отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования

Материал исследования. В качестве биологического материала для определения функциональной активности комплемента были использованы пробы сыворотки крови.

Экспериментальные исследования проведены на 42-х белых беспородных крысах, массой 250-330 грамм. Для изучения реакции системы комплемента крысам внутрибрюшинно вводили адреналин (в дозе 1 мг/кг веса), - (тропафен в дозе 10 мг/кг веса) и - (индерал в дозе 10 мг/кг веса) адреноблокаторы. Введение препарата проводили однократное. Кровь брали из хвоста: до начала воздействия, через 5 и 20 минут, через 2 и 24 часа; на 3, 7, 10, 20 и 30 сутки.

В исследованиях по изучению концентрации компонентов комплемента при моделировании гипоксической гипоксии, при многократном воздействии высокой температуры внешней среды (50°С) и при физической нагрузке приняли участие 97 практически здоровых мужчин в возрасте от 22 до 42 лет, допущенных к освидетельствованиям по состоянию здоровья, в соответствии с заключением врачебно-летной комиссии Материал набран под руководством доктора медицинских наук, профессора Васина М.В. и доктора медицинских наук, профессора Бобровницкого И.П.. Кровь брали из пальца до начала воздействия и в соответствии с целью каждого исследования: через 20 минут, 3 часа, 1-7 сутки после воздействия.

Определение концентрации комплемента у 30 пациентов (11 мужчин и 19 женщин, средний возраст 532 года) с гипертонической болезнью I-II стадий проводили до начала терапии и после курса лечения (через 2 месяца). Для коррекции артериального давления применяли фармакологические препараты, относящиеся к блокаторам медленных кальциевых каналов группы 1,4-дигидропиродинов (сискор и нитрендипин). Контрольная группа состояла из больных с гипертонической болезнью, терапия которых не включала прием блокаторов кальциевых каналов.

Метод исследования системы комплемента. Определение функциональной активности белков системы комплемента (С1-С5) в сыворотке крови проводили в микропанелях с помощью комплекта реагентов (НИИ гематологии и переливания крови г. Киров), в соответствии с инструкцией. Комплект реагентов предназначен для определения функциональной активности С1-С5 компонентов комплемента в сыворотке и плазме крови человека методом гемолитического титрования. Для постановки реакции использовали 40 мкл реагента в соответствующем разведении, указанном на этикетке флакона (рабочие разведения). Анализ проводили следующим образом:

1. Для приготовления изотонического веронал- мединалового буфера (VBS)²⁺: растворяли 2,8 г веронала, 1,5 г мединала, 42,5 г натрия хлорида доводят до 1 л дистиллированной водой, добавляли 2,5 мл 1М раствора магния хлорида и 0,75 мл 1М раствора кальция хлорида (рН 7,4). Перед употреблением буфер разводили 1:4 дистиллированной водой.

2. Для приготовления сенсибилизированных эритроцитов барана (ЕА) использовали кровь барана стерильно заготавленную в равном объеме раствора Олсвера, отмывали до прозрачного супернатанта и стандартизировали: 0,2 мл суспензии с 2,8 мл Н₂О должны обладать поглощением 0,7 ОЕ₅₄₁, что составляет 110⁹ клеток в мл. Для стандартизации пользовались формулой Vк=Vо Д₅₄₁/0,7, где Vк - конечный объем суспензии, Vо - начальный объем с концентрацией, определяемой на спектрофотометре при длине волны 541 нм. К 10 мл взвеси эритроцитов 110⁹ клеток в мл прибавляли 10 мл гемолитической сыворотки, разбавленной буфером согласно наставлению по применению гемолитической сыворотки, тщательно перемешивали и выдерживали 30 минут при 37С, периодически перемешивая. Взвесь ЕА доводили до концентрации 1,510⁸ клеток в мл, добавляли 46,7 мл буфера; 0,2 мл ЕА с 2,8 мл Н₂О должны иметь поглощение 1 при длине волны 412 нм.

Растворение сухих реагентов производили добавлением дистиллированной воды при легком встряхивании: 0,5 мл - для R2-R5 и 1 мл для R1. Непосредственно перед титрованием готовили рабочее разведение реагентов буфером (VBS)²⁺ как указано на этикетке флакона. При работе руководствовались указанными рабочими разведениями.

3. Постановка реакции: в 5 рядов микропанели вносили по 25 мкл веронал- мединалового буфера, в первую лунку каждого ряда добавляли 25 мкл исследуемой сыворотки. В каждом ряду готовили разведения в геометрической прогрессии. В каждую лунку вносили по 5 мкл соответствующего реагента, 20 мкл ЕА с концентрацией 1,510⁸ клеток в мл. В 6 ряду смотрели общую гемолитическую активность сыворотки без добавления реагентов. Микропанели выдерживали 60 минут при температуре 37С.. Результаты учитывали визуально по последней лунке с полным гемолизом (Вавилова Л.М., Кузнецова Н.Н., Голосова Т.В., 1991).

Концентрацию сывороточных иммуноглобулинов трех классов М, А и G определяли спектрофотометрическим методом (Чиркин В.В., Венгеров Ю.Ю., Кожевникова Г.Н. и др., 1990).

Доступность, простота, высокая эффективность, точность методов, отечественные наборы реактивов позволяют применять используемые нами методы в любых лечебно-профилактических учреждениях.

Моделирование неблагоприятных факторов внешней среды. Острую гипоксическую гипоксию моделировали путем проведения ступенчатого подъема испытателей в барокамере на высоту до 9 км с 5-ти минутными площадками на высоте 5 км и более. Скорость подъема 15- 20 м/сек. Количественная оценка высотной устойчивости включала определение «высотного потолка» и «резервного времени» нахождения испытателей на высотах от 5 км и выше Высотный потолок определялся индивидуальной чувствительностью. Для оценки состояния испытуемых им предлагали простейшие арифметические задачи. Во время пребывания на «площадках» испытатели выполняли в течение 1 мин тест «письменный счет» (последовательное вычитание из трехзначного числа цифры 17), заполняли бланки теста дифференцированной самооценки личности, а также устно решали предъявляемые примеры из таблицы умножения. Неправильные ответы, замедление решения простых примеров или полная неспособность испытателя их решать считались достоверными признаками нарушения долговременной памяти и служили сигналом для подачи кислорода и прекращения гипоксического воздействия. Для оценки реакций сердечно-сосудистой системы на высотную гипоксию проводили регистрацию ЭКГ, а также определение систолического и диастолического артериального давления; среднего АД методом тетрополярной реографии с последующим расчетом систолического объема, общего периферического сопротивления, минутного объема кровотока. К медицинским показаниям к прекращению исследований при любом виде экстремального воздействия являлись: отказ испытателя от продолжения исследования по субъективной непереносимости воздействия; признаки заболеваний, угрожающих состоянию здоровья и жизни испытателя.

Для выявления более четкой реакции организма на прием углеводов и жиров использовали физическую нагрузку у нетренированных лиц (велоэргометрия 600 кгм/мин в течение 10 минут).

Для тренировки к высокой температуре была использована термокамера, в которой моделировались следующие условия: +50єC, влажность 30-35%, скорость ветра 2 м/сек, экспозиция ежедневная по 2 часа, в течение 5 дней. Затем два дня испытуемые отдыхали, после чего проводилось заключительное исследование (7-е сутки).

Характеристика используемых в работе фармакологических препаратов:

Тропафен относится к группе б-адреноблокаторов. Вызывает уменьшение или полное снятие б-адренергических эффектов, вызываемых адреналином, норадреналином и адреномиметическими веществами, а также раздражением симпатических нервов. Сильно расширяет периферические сосуды и вызывает понижение артериального давления.

Анаприлин (Обзидан, Индерал) является специфическим -адреноблокатором уменьшает или снимает аффекты, связанные с возбуждением -адренорецепторов. Ослабляя влияние симпатической импульсации на -адренорецепторы сердца, препарат уменьшает частоту сердечных сокращений, блокирует эффект адреналина, норадреналина.

Амтизола сукцинат (0,1г) - циклическое производное первого отечественного атигипоксанта гутимина. Изучение действия амтизола при массивных кровопотерях и неотложных состояниях, сопровождающихся гипоксией различного генеза, показало, что этот препарат является новым перспективным фармакологическим средством с антигипоксическим действием.

Гидазепам (0,1 г) 7-Бром-1-(Гидразинокарбонил)метил-5-фенил-1,2-дигидро-ЗН-1,4- бензодиазепин-2 он обладает анксиолитическим, противосудорожным, миорелаксирующим действием.

Ноотропил (пирацетам) (1,6 г) - 2-оксо-1-пирролидин ацетамид препарат из класса ноотропов, который относится к числу препаратов метаболического типа действия.

Пробукол (1г), препарат являющийся структурным аналогом синтетического фенольного антиоксиданта ионола, широко используется в клинической практике.

Яктон (0,3 г) - сукцинат моно/(2-диметиламино) этилового эфира янтарной кислоты. Выявлено защитное действие препарата, как в отношении функциональной активности ЦНС, так и развития основных патофизиологических проявлений стресс - синдрома.

Комбинация препаратов представляет собой сочетанное применение пробукола, амтизола сукцината и яктона в той же дозе, что и каждый препарат в отдельности.

Эйконол - 1 желатиновая капсула содержит жирные полиненасыщенные кислоты семейства омега-3 (эйкозапентаеновая и докозагексаеновая и др. кислоты) до 28%, насыщенные жирные кислоты 30%, мононенасыщенные жирные кислоты 42%, витамины A, D и Е.

Ацефен (0,3 г) - стимулятор ЦНС и «регулятор обмена» в центральных, периферических и вегетативных нейронах. Активирует нервно-психическую деятельность, регулирует обмен в нервной клетке, оказывая влияние на обмен углеводов и клеточное дыхание.

Аскорбиновая кислота (0,25 г) восполняет дефицит витамина С, оказывает метаболическое, регулирующее окислительно-восстановительные процессы и антиоксидантное действие.

Реакцию комплемента на плацебо дополнительно контролировали исследованием воздействия того же неблагоприятного фактора без коррекции фармакологическими препаратами.

Общее количество выполненных работ составляет 328350 анализа. Статистическая обработка результатов проведена по общепринятым методикам параметрической и вариационной статистики. Расчет достоверности различий данных по критерию Стьюдента, дисперсионный анализ повторных измерений и корреляционная связь между показателями рассчитывались с помощью пакета компьютерной программы «BIOSTAT». Различия между двумя средними величинами считались достоверными при Р0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

В основе стимулирующего эффекта стресса на иммунную систему лежит активация симпатической системы и действие физиологических концентраций катехоламинов, вазопрессина и глюкокортикоидов. Процессы, происходящие при остром стрессе первые 48 часов, демонстрируют запас прочности врожденной резистентности в конкретный момент времени. Для уточнения ответной реакции белков системы комплемента проведено экспериментальное исследование на модели стресса у животных (таблица 1).

Через 5 минут после введения адреналина in vivo животным мы обнаружили параллельное снижение как концентрации С2 белка до 5,846 ± 1,091 титрационных единиц (P < 0,001), так и С4 белка до 3,692 ± 0,7284 (P < 0,001), а через 20 минут - повышение концентрации С2 белка до 12,0 ± 1,109 (P = 0,038) и С4 белка до 11,69 ± 1,237 (P = 0,008), в сравнении с фоновыми данными (9,077 ± 1,293 и 7,846 ± 1,25 соответственно).

Динамические изменения С2 и С4 компонентов комплемента отражают функцию этих белков в организме. Растрата С2 компонента комплемента в качестве фермента, необходимого для расщепления аргинина в цепочке адаптационных процессов «С2 > аргинин > NO», ведет к снижению его концентрации.

Таблица 1 Изменения концентрации компонентов комплемента в ответ на введение адреналина животным in vivo

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: *Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001

Концентрация С4 компонента комплемента может снижаться вследствие связывания его с рецепторами клетки. Кроме того, под влиянием адреналина происходит перераспределение крови. И если вызываемое б- адренорецепторами сужение сосудов и сокращение миометрия ведут к депонированию крови и снижению компонентов комплемента в ее русле, то сокращение капсулы селезенки, безусловно, способствует выбросу компонентов комплемента в ток крови. Этим объясняется, на наш взгляд, перепад концентраций С4 и С2 белков на 5-ой и 20-й минутах исследования после введения адреналина in vivo животным.

Через 20 минут после «подъема на высоту 7,0-7,5 км» без коррекции мы обнаружили похожую реакцию комплемента в организме человека (таблица 2), а именно: параллельное повышение концентраций С4 компонента комплемента (от 10,58 ± 1,702 до 14,85 ± 1,944 титрационных единиц; P < 0,001) и С2 (от 7,423 ± 1,02 до 9,846 ± 1,125 титрационных единиц; P = 0,001).

Таблица 2 Изменения концентрации компонентов комплемента в организме человека при «подъеме на высоту 7,0-7,5 км» без коррекции

Физическая активность нетренированных лиц (велоэргометрии 600 кгм/мин в течение 10 минут без фармакологической коррекции) приводила к повышению концентрации С4 компонента комплемента от 13,26 ± 1,629 до 18,51 ± 2,876 титрационных единиц (P = 0,010). При исследовании влияния жировых нагрузок на фоне физической активности человека выявлено повышение концентрации С4 белка между 20-и минутным и 9-и часовым измерениями от 8,875 ± 3,77 до 24 ± 4,536 титрационных единиц (Р = 0,036). Все перечисленные реакции обусловлены способностью адреналина вызывать деполяризацию клеточной мембраны, повышать содержание Са²⁺ и свободных жирных кислот в крови.

Наши экспериментальные и клинико-лабораторные исследования доказывают, что высокая доза адреналина в крови сопровождается характерным параллельным изменением концентрации именно С4 и С2 компонентов из всей системы комплемента. По скорости ответа изменения в системе комплемента на 3 часа опережают реакцию клеток в периферической крови и в костном мозге, обнаруженную Горизонтовым П.Д. с сотрудниками (1983) после введения той же дозы адреналина, что и в наших исследованиях (1 мг/кг).

В процессе работы выяснилось, что при выраженном воздействии неблагоприятных факторов на организм («подъем на высоту 6-8 км», действие температуры 50°С и тому подобном) прием 0,25 г крахмала не меняет ответную реакцию организма на экстремальный фактор и может использоваться в качестве плацебо. Но меньшие по силе воздействия (например, велоэргометрия) вызывают реакцию со стороны системы комплемента в ответ на прием 0,25 г крахмала (таблица 3). Поскольку реакция комплемента на крахмал, обычно применяемый в качестве плацебо, оказалась значимой на фоне физической активности человека, для достоверного анализа полученных результатов в контрольной группе велоэргометрию проводили без применения каких-либо препаратов (результаты описаны выше).

Таблица 3 Изменения концентрации компонентов комплемента и иммуноглобулинов в организме человека в ответ на физическую активность (велоэргометрия) на фоне приема крахмала

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: *Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001

Мы обнаружили, что физическая активность на фоне крахмала вызывала в организме человека повышение концентрации С1 белка через 3 часа от 15 ± 5,908 титрационных единиц в фоновых данных до 25,29 ± 7,618 титрационных единиц после воздействия (P = 0,025). Через 9 часов повысилась концентрация С1-С5 компонентов комплемента. Вероятно, данная реакция также связана с адренергическими системами, в частности со стимуляцией гликогенолиза 2 - адренорецепторами, но доза адреналина для такого ответа несравнимо меньше, чем при остром стрессе. В наших исследованиях в ответ на введение адреналина животным концентрация С1 постепенно нарастала за период от 20 минут (15,54 ± 4,369) до 3 суток (31,38 ± 4,388; P = 0,024), то есть по мере снижения содержания адреналина в крови. Исследования выявили параллельные изменения между ответом системы комплемента и обменом веществ в организме.

Адреноблокаторы на практике используются как стресс-протекторные препараты, в том числе при лечении заболеваний, например: гипертонической болезни. Изучение их воздействия на внутренние процессы представляет собой актуальную задачу. Поэтому мы посвятили часть экспериментов изучению ответной реакции комплемента на введение адреноблокаторов. Широкое применение индерала и тропафена в практической медицине обусловило выбор препаратов для исследований.

При введении - адреноблокатора индерала животным в дозе 10 мг/кг достоверных изменений концентрации отдельных компонентов комплемента не выявлено (таблица 4). Достоверно повышалась только общая гемолитическая активность комплемента уже через 5 минут до 128,0 ± 28,6 титрационных единиц (Р = 0,045), по сравнению с фоновыми значениями (56,0 ± 19,27).

Таблица 4 Изменения концентрации компонентов комплемента в ответ на введение - адреноблокатора индерала (анаприлина) животным in vivo

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: *Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001

Повышение гемолитической активности комплемента в других исследованиях, например при его изучении у лиц с гипертонической болезнью или при введении адреналина животным, проявлялось значительно позже, что говорит о высоком травмирующем действии блокады - адренорецепторов, то есть о ситуации, когда преобладает активность - адренорецепторов. Такая ситуация аналогична чрезмерному стрессу в организме. Вероятно, поэтому мы обнаружили не дифференцированные изменения концентрации отдельных компонентов комплемента, а сразу же и в короткий срок повышение его общей гемолитической активности. Возможно, реакция компонентов комплемента маскируется выраженной гемолитической активностью комплемента при блокаде - адренорецепторов препаратом индерал. Нельзя исключить некое функциональное сродство белков комплементарного каскада с - адренорецепторами, тем более учитывая выявленное нами повышение концентрации С1 на углеводную нагрузку (гликогенолиз стимулируется 2- адренорецепторами) и С4 - на жировую нагрузку (липолиз зависит от 1- адренорецепторов).

Таблица 5 Изменения концентрации компонентов комплемента в ответ на введение б- адреноблокатора тропафена животным in vivo

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: *Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001

Наблюдения в течение суток показали, что через 5 минут после введения б- адреноблокатора тропафена in vivo животным уменьшилась концентрация С4 компонента комплемента в 1,69 раза по сравнению с фоновыми данными (от 15,2 ± 2,653 до 9,0 ± 2,49 титрационных единиц; P = 0,031) (таблица 5). В связи с тем, что б-адренолитики блокируют лишь адренореактивные системы, воспринимающие сосудосуживающие импульсы, а системы, участвующие в восприятии тормозных эффектов (сосудорасширяющих симпатических импульсов), остаются свободными, возможно извращение действия адреналина. В нашем эксперименте эффект тропафена в первые 5 минут совпал с результатом воздействия адреналина. В том и другом случае снижалась концентрация С4 компонента комплемента. Но на фоне тропафена исчезла реакция С2 белка, возможно, из-за блокады б- или уменьшения функции 2- адренорецепторов, на которые действует этот препарат. Допустимо предположить 1- адреномиметическое свойство реагирующего С4 компонента комплемента, поскольку б- адреноблокатор тропафен не препятствует действию 1- адреномиметиков.

Через 48 часов начинается вторая стадия стресс-реакции: стадия резистентности. И если в течении двух суток острого стресса мы обнаруживали преимущественно изменения концентрации отдельных белков, то, начиная с третьих суток, общая гемолитическая активность комплемента преобладала над реакцией его компонентов. Повышение гемолитической активности комплемента на третьи сутки не зависело от состояния адренорецепторов (рисунок 1).

Рис. 1. Проявление общей гемолитической активности комплемента в течение 30-и суток в ответ на введение адреналина животным и при блокаде адренорецепторов in vivo.

Исследуя близкую к физиологической реакции модель процесса выброса адреналина в кровь, мы обнаружили самое медленное достижение максимального значения общей гемолитической активности комплемента, только через 20 суток после введения адреналина животным. Введение - адреноблокатора индерала in vivo способствовало достижению максимума гемолитической активности комплемента на 10-е сутки эксперимента. б - Адреноблокатор тропафен создает не естественную реакцию in vivo, извращая эффект адреналина, что проявилось в эксперименте быстрым достижением максимальной величины общей гемолитической активности комплемента на 3-и сутки эксперимента. В наших исследованиях индерал и тропафен вводились однократно, а в медицинской практике курс лечения этими препаратами продолжается 10-20 дней и более. Поэтому необходимо исследование гемолитической активности комплемента в процессе всего курса терапии. Выявленные нами периоды подъема гемолитической активности комплемента (3, 10 и 20-й дни) совпадают со временем возможного образования любых антител в организме.

Эффекты активации адренергических систем, в частности выраженное влияние адреналина на сердечно-сосудистую систему и в первую очередь на уровень артериального давления, имеют значение в развитии гипертонической болезни и непосредственно проявляются при воздействии стрессогенных факторов на организм. Даже в контрольной группе (без приема блокаторов кальциевых каналов) у больных гипертонической болезнью, по нашим данным, общая гемолитическая активность комплемента за 2 месяца увеличивалась в среднем в 1,99 раза (до 22,46 ± 3,713 титрационных единиц; P < 0,001), относительно фоновых данных (11,31 ± 1,82). Вероятно, у больных гипертонической болезнью нарушена регуляция врожденной резистентности, что может быть связанно с недостаточностью функции стресс-лимитирующих систем и приводить не только к нарушению реакции организма на стрессоры, но являться патофизиологической основой данного заболевания или предрасположенности к нему. При клиническом наблюдении в наших исследованиях было обнаружено, что после лечения в течение двух месяцев блокаторам кальциевых каналов у больных гипертонической болезнью в 5,3 раза увеличивались показатели общей гемолитической активности комплемента (до 44,2 ±11,83 титрационных единиц; P = 0,007) в сравнении с фоновыми данными (8,267 ± 2,429). Течение гипертонической болезни до 7 лет сопровождалось повышением гемолитической активности комплемента в 2,7 раза (P = 0,013), а более 7 лет - в 6,99 раза (P = 0,019) относительно фоновых данных. Выяснилось также, что у лиц принимающих блокаторы кальциевых каналов общая гемолитическая активность комплемента вдвое превышала таковую в контрольной группе.

При приеме внутрь блокаторы кальциевых каналов быстро и почти полностью всасываются, связываются с белками крови на 98%, что может способствовать повышению гемолитической активности системы комплемента. Нельзя исключить, что побочные действия блокаторов кальциевых каналов, такие как: анемия и тромбоцитопения являются результатом гемолитической активности комплемента.

В показаниях к применению фармакологических средств указано, что блокаторы кальциевых каналов при артериальной гипертензии используют как в качестве монотерапии, так и в сочетании с - адреноблокаторами и мочегонными препаратами. Но в наших исследованиях выявлено, что - адреноблокатор индерал вызывает повышение гемолитической активности комплемента уже через 5 минут после введения in vivo до 128,0 ± 28,6 (Р = 0,045), на 3-и сутки до 179,2 ± 23,9 (Р = 0,017), на 10-е сутки до 204,8 ± 23,9 (Р < 0,0001) титрационных единиц в сравнении с фоновыми данными (56,0 ± 19,27). Лишь после этого гемолитическая активность комплемента начинала снижаться и к 20-му дню равнялась 166,6 ± 25,6 (Р = 0,03) титрационным единицам. У кальциевых блокаторов период полувыведения составляет от 8-24 часа. Значит, за этот период, в случае сочетания их с - адреноблокаторами, препараты обеих групп будут усиливать гемолитическую активность комплемента. Это в свою очередь приведет к разрушению клеток, что, вероятно, и является причиной таких побочных явлений как анемия и тромбоцитопения. Более длительный период лечения приведет к еще большему росту гемолитической активности комплемента. Фармакодинамика мочегонных препаратов и блокаторов кальциевых каналов обладает общими признаками: те и другие увеличивают выведение натрия и воды из организма. При выведении жидкости из организма объем циркулирующей в нем крови уменьшается, что является фактором, активирующим гемолитическую активность комплемента. Исследование комплемента на этапе планирования и подбора корректирующей терапии избавит пациентов от побочного действия неподходящих препаратов.

Начальный импульс, вызывающий стресс, обычно не известен. В нашей работе мы сами задавали и дозировали начальный импульс - в данном случае гипоксию, что позволило сопоставить обнаруженные изменения концентрации отдельных компонентов комплемента и силу внешнего воздействия на организм.

Оказалось, что увеличение высоты «подъема» от 7 км до 8 км приводит к переключению реакции системы комплемента в организме человека с параллельного повышения концентрации С4 и С2 компонентов - характерного для высокой дозы адреналина в крови - на повышение концентрации С3 белка от 6,4 ± 0,7483 до 9,4 ± 1,077 титрационных единиц (P < 0,001) через 20 минут после воздействия. Высокая достоверность результатов свидетельствует о том, что индивидуальная направленность ответной реакции комплемента была однородной внутри группы. Наши исследования показывают, что отклик С3 компонента комплемента проявляется на определенной стадии адаптационных реакций, а именно: при выраженном воздействии гипоксии на организм повышается концентрация этого белка (таблица 6).

Организм отвечает на воздействие гипоксии формированием приспособительных механизмов, в частности перераспределение объема жидкости может играть роль в повышении концентрации С3. Известно, например, что при гипоксии рефлекторно сокращается селезенка, и эритроциты из депо поступают в ток крови. Возможно, С3 компонент комплемента имеет связь с этим адаптационным явлением, поскольку удаление селезенки приводит к снижению С3 компонента комплемента (Вавилова Л.М., Голосова Т.В., 1990). Развитие гиперглобулии при гипоксии способствует сохранению кислородного обмена на обычном уровне и вполне может выразиться в повышении концентрации белка С3.

Таблица 6 Изменения концентрации компонентов комплемента в организме человека при «подъеме на высоту 8 км» на фоне плацебо

Примечание. Значимость различий при сравнении показателей: *Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001

Наличие углеводов в составе молекулы С3 компонента комплемента может играть не последнюю роль в его ответной реакции при воздействии гипоксии, так как для различного происхождения гипоксических состояний характерны нарушения обмена глюкозы. При гипоксии усиливается обмен глюкозы для полноценного обеспечения клеток энергией в виде АТФ, что сопровождается значительным накоплением пирувата, молочной кислоты и дефицитом глюкозы. Поскольку по ряду причин (в том числе включение анаэробного гликолиза) расходуется гораздо больше глюкозы, то в биохимические процессы могут вовлекаться все вещества, содержащие углеводы. Нельзя исключить влияние углеводного обмена в качестве стимулятора активности С3 компонента комплемента. Хорошо известна способность С3 компонента комплемента связываться с простыми сахарами, глицеролом, раффинозами. Таким образом, составные части молекулы С3 компонента комплемента (цистеин, глутаминовая кислота, углеводы) и его функциональные способности могут вызывать повышение данного белка при гипоксии.

При стресс-реакции в организме неизбежно включается стресс-лимитирующая система. Во избежание избытка образования гидроперекисей и свободных радикалов активируется антиоксидантная защита. Эффект антиоксидантной системы слагается из действиия витаминов Е и К, аскорбиновой кислоты и цистеина, входящего в состав С3 белка, и дополняется так называемым структурным антиоксидантом, представляющим собой определенную организацию липидов в биологических мембранах. Нельзя исключить пересечения биохимических реакций между белком С3 и составляющими антиоксидантной системы в условиях гипоксии. Во-первых, легкое превращение сульфгидрильных групп цистеина в дисульфидную связь цистина и обратимость этой реакции играют важную роль в регуляции процессов обмена и, вероятно, в реализации комплементарного каскада. Расщепление цистеина под влиянием десульфогидразы приводит к образованию пировиноградной кислоты, накопление которой характерно для гипоксии. Во-вторых, С3 компонент комплемента может связываться с аскорбиновой кислотой и вовлекается в каскад при «подъеме на высоту 8 км». Кортикостероиды истощают аскорбиновую кислоту при стресс-реакции. Следовательно, аскорбиновая кислота, как звено стресс-лимитирующей системы, на определенном этапе адаптационных реакций не может связывать С3 компонент комплемента, что приводит к повышению его концентрации.

На образование С3-конвертазы расходуются С4 и С2 компоненты комплемента, что способствует продолжению каскада и объясняет отсутствие реакции этих белков, но не повышение концентрации С3. Если все же на данном этапе адаптации расщепление С3 происходит, то высвобождающиеся субкомпоненты С3а и С3b, вероятно, не могут преодолеть ряд приспособительных реакций, развивающихся при гипоксии. Например, С3а может связываться с рецепторами многих клеток периферической крови и кровеносных сосудов: эритроцитов, нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, тромбоцитов, лимфоцитов, тучных и эндотелиальных. Поэтому каскад комплемента не продолжается, мы не обнаружили отклика С5 белка. Обнаруженная нами реакция системы комплемента при «подъеме на высоту 8 км» ограничивалась повышением концентрации С3 белка, который может служить иммунологическим маркером выраженной степени действия гипоксии на организм. Поскольку мы использовали в методике определения комплемента бараньи эритроциты, которые не активируют альтернативный механизм активации комплемента в сыворотке человека, то все сказанное относится к классическому пути его активации.