Лечение воспалительных заболеваний кишечника аллогенными мезенхимальными стромальными клетками

При сравнении двух кривых выживаемости - стабильности ремиссии, у пациентов с проктосигмоидитом различий выявлено не было (р=0.708), продолжительность ремиссии в группе МСК составила 19,2±2,4 месяца, в группе 5-АСК/ГКС - 17,6±3,1 месяца.

В группах больных с левосторонним поражением (рис.6) толстой кишки есть значимое различие в продолжительности ремиссии в зависимости от вида терапии (р=0.012).

Продолжительность ремиссии у больных, которым проведена трансплантация МСК составила 20,0±1,1, в группе, получающих стандартную терапию препаратами 5-АСК/ГКС - 11,6±1,5.

При сравнении кривых выживаемости (стабильности ремиссии) у больных с тотальным поражением толстой кишки (рис.7) так же выявлено различие в зависимости от метода лечения больных язвенным колитом (р=0.036).

Продолжительность ремиссии у больных с тотальным поражением толстой кишки, получивших МСК, составила 11,5±1,7 месяцев, в группе 5-АСК/ГКС - 7,4±0,6 месяцев.

Рис. 6. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения заболевания; для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и стандартной терапией препаратами 5-АСК и ГКС у больных ЯК с левосторонним поражением.

При сравнении кривых выживаемости (стабильности ремиссии) у больных с тотальным поражением толстой кишки при проведении трансплантации МСК и терапии инфликсимабом различий не было выявлено (p=0.554).

Продолжительность ремиссии у больных, получивших МСК, составила 11,5±1,7 месяцев, в группе ИНФ - 11,6±0,6 месяцев.

Ремиссия заболевания сохранялась у большинства больных, которым проведена терапия инфликсимабом и трансплантированы МСК более года.

Средняя продолжительность ремиссии у больных язвенным колитом в зависимости от метода терапии за 24 месяца наблюдения представлена на рисунке 8.

Рис. 7. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения заболевания у больных ЯК с тотальным поражением; для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и стандартной терапией препаратами 5-АСК и ГКС.

Рис. 8. Средняя продолжительность ремиссии (мес.) у больных язвенным колитом в зависимости от метода терапии за 24 месяца наблюдения.

Таким образом, продолжительность ремиссии зависит от метода выбранной терапии язвенного колита: более длительная ремиссия зарегистрирована у больных, которым проведена системная трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и проводится поддерживающая терапия инфликсимабом.

Оценка рисков возникновения рецидива язвенного колита в зависимости от проводимого лечения

В ретроспективном исследовании мы сравнивали три группы больных в зависимости от метода выбранной терапии. Вопрос о проведении такой терапии должен решаться индивидуально с учетом риска рецидива заболевания. После проведенной оценки рисков на основе данных исследования получены следующие результаты.

Риск развития рецидива ЯК за период наблюдения (12 месяцев) у больных, получивших МСК (1-я группа сравнения) составил 0,2051, у больных, получавших только препараты 5-АСК, ГКС и цитостатики (2-я группа сравнения), этот показатель составил 0,5333, таким образом, относительный риск (RR) составил 0,3486.

При расчете отношения шансов (OR) риск развития рецидива в 1-й группе составил 0,2582, во 2-й - 1,1428, а отношение шансов - 0,2258. Следовательно, абсолютный риск развития рецидива (ARR) ЯК после системной трансплантации МСК был ниже, чем при проведении терапии препаратами 5-АСК, ГКС и цитостатиками (RR и OR меньше 1).

На основании показателя «снижение абсолютно риска» был рассчитан показатель Number needed to treat (NNT). Оказалось, чтобы избежать одного случая раннего рецидива язвенного колита, необходимо провести трансплантацию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток 3 больным язвенным колитом (таблица 8).

При сравнении оценки рисков между группой МСК и ИНФ были получены результаты, свидетельствующие о сопоставимости данных методов терапии ЯК по своей эффективности. Оценка рисков развития раннего рецидива язвенного колита при проведении терапии ИНФ и системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.

Таблица 8.

Расчет абсолютного снижения риска (Absolute risk Reduction (ARR)) и числа пациентов, которых необходимо пролечить(Number needed to treat (NTT))

Абсолютное снижение риска	Absolute risk Reduction (ARR)=	0,5333- 0,2051	0,3282%
Число пациентов, которых надо пролечить	Number needed to treat (NTT)=	1/0,3282	=3 человека

После проведенной оценки рисков на основе данных исследования получены следующие результаты. Относительный риск развития рецидива язвенного колита за период наблюдения (12 месяцев) при проведении системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга составил 1, отношение шансов - 1. Риск развития рецидива ЯК за период наблюдения (12 месяцев) у больных, получивших МСК (1-я группа) составил 0,22, у больных, получавших инфликсимаб (3-я группа), этот показатель составил 0,2, таким образом, относительный риск (RR) составил 1,1. При расчете отношения шансов (OR) риск развития рецидива в 1-й группе составил 0,29, во 3-й - 0,25, а отношение шансов - 1,2. Следовательно, абсолютный риск развития рецидива (ARR) ЯК после системной трансплантации МСК был сопоставим c терапией инфликсимабом (RR и OR равны 1) (таблица 9).

Таблица 9.

Расчет абсолютного снижения риска (Absolute risk Reduction (ARR)) и числа пациентов, которых необходимо пролечить(Number needed to treat (NTT))

Абсолютное снижение риска	Absolute risk Reduction (ARR)=	0,2- 0,22	0,02%
Число пациентов, которых надо пролечить	Number needed to treat (NTT)=	1/0,02

На основании полученных данных можно сделать вывод, что риск развития рецидива при проведении системной трансплантации аллогенных МСК костного мозга в комплексной терапии язвенного колита и в группе при проведении терапии инфликсимабом равнозначный (так как RR и OR равны 1).

Рис. 9. Процент госпитализированных больных с обострением ЯК за 12 месяца наблюдения

Трансплантация МСК так же снижает частоту госпитализаций (рис.9): процент госпитализированных больных за 12 месяцев наблюдения составил и 20,5% в 1-й группе и 66,6% во 2-й группе (р<0,05), госпитализация по поводу обострения язвенного колита у больных, которым проводится терапия инфликсимабом составила 16,6%.



Рис. 10. Подтверждение биологического эффекта МСК.

Сравнивая индексы клинической и эндоскопической активности при рецидиве ЯК, выяснилось, что эти показатели ниже у больных, леченных МСК, нежели у больных, леченных только препаратами 5-АСК/ГКС. Индекс клинической активности в 1-й группе составил 5.86±0.6, во второй - 7.9±0.9 (р<0,05), эндоскопической - 4.0±0.53 и 6.6±0.65 (р<0,05) соответственно.

Таким образом, нашло подтверждение биологического эффекта МСК - даже при рецидиве ЯК индексы клинической и эндоскопической активности (D.Rachmilevitz) ниже у больных, леченных МСК, нежели у больных, леченных препаратами 5-АСК/ГКС (рис.10).

Оценка эффективности различных методов лечения болезни Крона в зависимости от метода лечения

Ответ на лечение БК должен определяться как снижение индекса Беста на 100 пунктов или более. Ответ на лечение должен определяться как снижение СDАI на 100 пунктов или более.

Ранний рецидив БК расценивается как обострение, возникшее менее чем через 3 месяца после медикаментозно достигнутой ремиссии. По характеру рецидивирования различают нечастое обострение (1 раз в год или реже), частое (2 и более раз в год) и непрерывное течение БК с постоянным персистированием симптомов без периодов ремиссии.

Руководствуясь данными рекомендациями ECCO, мы наблюдали 36 пациентов БК (илеитом, колитом или илеоколитом), с частым обострением и непрерывным течением заболевания, которым была проведена системная трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга - 4-я группа (n=15), больных, которые получали стандартную терапию глюкокортикостероидами и азатиоприном (ГКС/АзА) - 5-я группа (n=15) и группа больных, которые были проведены на терапию инфликсимабом (n=6) - 6-я группа (таблица 10).

Таблица 10.

Характеристика больных БК с разными методами лечения

Показатель	4-я группа	5-я группа	6-я группа
Возраст, лет	37,0±2,9	36,9±2,8	38,8±5,8
Длительность БК, годы	6,3±1,5	6,8±1,5	8,7±2,3
Средняя продолжительность приема азатиоприна мес	6,5±0,9	7,1±0,8	18,2±1,6
Среднегодовая доза преднизолона, мг	3185,5±324	3136,9±239	3772,5±154,9
Индекс Беста,баллы	246,9±12,1	234,3±10,9	265,5±14,6
СРБ, мг/л	26,7±4,4	25,7±4,7	27,6±6,1
Гормонорезистентные	7(46,6%)	2 (13,3%)	3(50,0%)
Гормонозависимые	5(33,3%)	3(20,0%)	2 (33,3%)

Как было отмечено выше, индекс Беста (CDAI) до начала терапии в 4-й группе составлял от 196 до 361, в среднем 246,9±12,1, уровень CРБ составил - 26,7±4,4 мг/л, в 5-й группе - 234,3±10,9, уровень CРБ составил - 25,7±4,7 мг/л, в 6-й группе - 265,5±14,6, CРБ - 27,6±6,1 мг/л. У больных БК, получавших стандартную терапию + МСК (4 группа), исходный индекс активности по Бесту в среднем составил 246,9±12,1 баллов, у больных 5 группы - 234,3±10,9 баллов, у больных 6 группы - 265,5±14,6 (р>0,05), уровень СРБ составил - 26,7±4,4, 25,7±4,7 и 27,6±6,1 соответственно (р>0,05).

У больных, которым назначена терапия инфликсимабом средняя продолжительность заболевания составила 8,7±2,3, против 6,3±1,5 лет у больных 4-й группы и 6,8±1,5 лет в 5-й группе. Средняя продолжительность приема азатиоприна у больных 6-й группы составила 18,2±1,6 месяцев, в 4-й - 6,5±0,9, в 5-й - 7,1±0,8. Учитывая более тяжелое и длительное течение болезни Крона у больных, которым назначен инфликсимаб, среднегодовая доза приема преднизолона была больше чем в группах, получающих терапию ГКС и которым была осуществлена трансплантация мезенхимальных стромальных клеток, и составила 3772,5±154,9 мг.

За период наблюдения в каждой группе больных имелись особенности течения болезни Крона. У 8 больных, которым была осуществлена трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга через 2 месяца наблюдения достигнута полная клиническая ремиссия - диарея не более 2 раз в сутки, стул оформленной консистенции, без патологических примесей; боли в животе не беспокоят, общее состояние удовлетворительное, отмечалась прибавка массы тела, исчезновение болевого синдрома, у 5 больных достигнута клинико-эндоскопическая ремиссия (33,3%), зарегистрировано полное заживление слизистой оболочки толстой кишки, в то время как на стандартной терапии процент заживления слизистой составляет около 17%.

Через 6 месяцев количество больных, достигших клинико-эндоскопической ремиссии увеличилось до 9 человек (60%), через 12 месяцев ремиссия, достигнутая в первые два месяца наблюдения, сохранялась у всех 13 больных болезнью Крона, из них у 8 (61,5%) отмечено полное заживление слизистой кишки. За 12 месяцев наблюдения индекс Беста достоверно снизился и сохраняется до настоящего времени в среднем 75,8±13,8 (р=0,046). 11 больных болезнью Крона, которым осуществлена трансплпантация МСК, ранее получавшие глюкокортикостероиды (преднизолон, Буденофальк®), в настоящее время получают только препараты 5-АСК (Пентаса®, Салофальк®). У 8 больных из 13 (61,5%) зарегистрирована клинико-морфологическая ремиссия, у остальных 5 - полная клиническая ремиссия, с частичной эндоскопической ремиссией.

Таблица 11

Динамика индекса Беста (СDAI) у пациентов с болезнью Крона на протяжении 12 месяцев

Группа	Исходный индекс Беста (CDAI)	2 месяца	6 месяцев	12 месяцев
4-я (МСК)	246,9±12,1	78,9 ±11,6*	65,8 ±25,8*	75,8 ±13,8*
5-я (ГКС/АзА)	234,3±10,9	61,8 ±8,97*	100,7 ±6,57*	121,5 ±24,7*
6-я (ИНФ)	265,5±14,6	83,6 ±9,6*	91,2 ±18,2*	76,8 ±25,8*

*р<0,05 по сравнению с исходным уровнем в группах

В группе больных, получавших стандартную терапию ГКС/АзА, через 2 месяца клиническая ремиссия достигнута у 13 больных, у 7 (46,7%) больных с заживлением слизистой оболочки кишки. Через 6 месяцев клинико-эндоскопическая ремиссия сохранялась у 2-х больных (13,3%), клиническая - у 7 (46,7%), рецидив болезни Крона произошел у 6 больных (40%). За год наблюдения больных в данной группе результаты терапии выглядели следующим образом: клинико-эндоскопическая ремиссия сохранялась у одного больного (6,7%), клиническая ремиссия - у 6 (40%), в связи с рецидивом заболевания на высокие дозы ГКС и иммуносупрессоры были переведены 5 (33,3%) больных, а 3 (20%) - на терапию инфликсимабом. Динамика индекса Беста (СDAI) по группам больных представлена в таблице 11.

Уровень индекса Беста (CDAI) через 24 месяца наблюдения у больных с положительной клинической динамикой в группах так же отмечалось различие по конечной точке. В 4-й группе (n=13) индекс Беста составил 62,0±8,87, в группе больных, которые получали ГКС (n=7) (5-я группа) - 90,4±9,0, в 6-й группе, получавших инфликсимаб - 64,7 ±19,7.

Как и у больных язвенным колитом мы использовали шкалу Гебса для оценки активности воспалительного процесса в СОТК. До трансплантации МСК в 4-й группе больных БК индекс Гебса составил 4,1±0,3, и в 5-й группе - 4,2±0,16, в 6-й - 4,6±0,16. Степень патогистологической активности БК у больных, которым начата терапия инфликсимабом был несколько выше. Через 2 месяца у пациентов 4-й группы составил 1,2±0,03, в 5-й группе - 1,3±0,1, в 6-й - 1,3±0,1, через 12 месяцев наблюдения индекс Гебса у больных, которым осуществлена трансплантация МСК и которые получали терапию инфликсимабом составили 1,1±0,02 и 0,7±0,17 соответственно, в то время как у больных, получавших терапию ГКС он составил 1,4±0,14.

В группе больных, которым проведена терапия инфликсимабом, через 6 недель положительная динамика отмечена у всех больных - индекс активности снизился к концу 8 недели на 58-106 пунктов у 4 больных, и на 50 пунктов у 1 больной. Через 14 и 24 недели от начала терапии Ремикейдом® у 4 больных индекс активности снизился менее 150, у них же в течение года отмечается ремиссия, поддерживаемая 5-АСК (Пентаса®). Инфликсимаб позволяет достичь клинической и эндоскопической ремиссии у больных, не ответивших на стандартные средства, включая иммуносупрессивные; индукция и сохранение ремиссии достигается в большинстве случаев без стероидов.

При сравнении двух кривых выживаемости (стабильность ремиссии) у пациентов с болезнью Крона, которые получали комплексную терапию с введением МСК (n=10) и больным, которым проведена терапия инфликсимабом (Ремикейдом®) (n=6) различий выявлено не было (р=0.279) (рис.11).

Продолжительность ремиссии в группе МСК составила 12,6±1,6 месяца, в группе ИНФ - 11,8±0,6 месяца.

Есть значимое различие в группах больных, которым проведена трансплантация МСК и которым проводится терапия препаратами ГКС/АзА (рис.12) (р=0.001).

Продолжительность ремиссии у больных, которым проведена трансплантация МСК, составила 12,6±1,6 месяцев, а в группе, получающих стандартную терапию препаратами ГКС/АзА - 7,9±0,5 месяцев. Продолжительность ремиссии зависит от выбранной терапии болезни Крона: более длительная ремиссия зарегистрирована у больных, которым проведена системная трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и у больных, которым проводилась терапия Ремикейдом®. Оба метода терапии сопоставимы по конечному результату.

Рис. 11. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения ЯК; для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и терапия инфликсимабом.

Помимо основных показателей, характеризующих активность болезни Кона, индекса Беста и уровня СРБ, мы проанализировали среднекурсовую дозу преднизолона, принимаемую больными в зависимости от выбранной терапевтической тактики. Мы сравнили между собой группы больных, получающих терапию ГКС и комплексную терапию с применением МСК через 2, 6, 12 и 24 месяца.



Рис.12. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения БК; для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и терапией глюкокортикостероидами/иммуносупрессорами.

Сравнивая терапевтическую эффективность инфликсимаба и системной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) у больных с непрерывным течением и рефрактерной формой болезни Крона, выяснилось, что оба метода позволяют достичь клинической и, в некоторых случаях, эндоскопической ремиссии, сохранение клинической ремиссии достигается в большинстве случаев без стероидов (р=0,95).

Полученный сравнительный анализ представлен в таблице 12.

Таблица 12

Динамика индекса Беста, уровня СРБ и среднекурсовой дозы преднизолона в течение 24 месяцев в группах больных БК

Группы	Сроки	Среднекурсовая доза преднизолона, мг	Индекс Беста, баллы	СРБ, мг/л
МСК (4-я группа)	Исходные показатели	2173,3±69,6	246,9±12,1	26,7±4,4
ГКС(5-я группа)		2144,0±96,2	234,3±10,9	25,7±4,7
ИНФ (6-я группа)		2376,7±82,0	265,5±14,6	27,6±6,1
МСК (4-я группа)	2 мес.	181,7±37,8*	98,6±13,2*	6,7±1,6**
ГКС(5-я группа)		112,7±23,6*	69,2±10,1*	13,2±1,7*
ИНФ (6-я группа)		150,7±27,4*	69,7 6,3*	4,5±0,5**
МСК (4-я группа)	6 мес.	88,6±46,1**	64,4±9,7**	3,6±0,6*
ГКС(5-я группа)		332,8±32,8*	88,6±13,1*	5,7±0,9*
ИНФ (6-я группа)		145,3±23,4**	64,3 4,5**	4,3±0,3*
МСК (4-я группа)	12 мес	131,7±36,8**	55,0±9,5**	4,8±0,7*
ГКС(5-я группа)		811,7±260,0*	118,5±22,8	5,3±0,6*
ИНФ (6-я группа)		150,7±28,2**	42,7±2,5**	4,47 ±0,2*
МСК (4-я группа)	24 мес	143,6±24,0**	53,6±9,6**	6,3±0,4**
ГКС(5-я группа)		1413,0±270,8	89,4±8,9*	17,1±5,2*
ИНФ (6-я группа)		180,5±31,4**	50,3±2,4**	5,0 ±0,4**

Примечание. * (р<0,05) в сравнении с исходными значениями внутри группы ** (р<0,05) в сравнении групп

Таким образом, трансплантация аллогенных МСК костного мозга может рассматриваться как перспективный метод терапии рефрактерных форм болезни Крона, сопоставимый с терапией инфликсимабом, увеличивающий продолжительность ремиссии, способствующий заживлению слизистой оболочки кишки и позволяющий уменьшить, а в некоторых случаях отказаться от ГКС.

Иммунорегуляторный эффект МСК у больных воспалительными заболеваниями кишечника

Стандартная терапия у большинства пациентов с ВЗК сопровождалась достоверным снижением увеличенного содержания сывороточных цитокинов по сравнению с уровнем, предшествующим лечению. При терапии 5-АСК содержание цитокинов у больных ЯК снижалось в среднем до 90-240 пг/мл. Внутривенное введение инфликсимаба (антитела к б-ФНО) больным ЯК приводило к снижению (р<0,05) концентрации провоспалительных цитокинов - б-ФНО, ИЛ-1в (до 55-70 пг/мл).

Длительное применение иммунодепрессантов при прогрессирующем течении ЯК сопровождалось снижением уровня цитокинов, иммуноглобулинов.

Нарушения функциональной активности иммунной системы при язвенном колите проявляются повышенной циркуляцией цитокинов, иммуноглобулинов, аутоантител к субклеточным структурам цитоплазмы нейтрофилов, выраженной в зависимости от вариантов течения, активности, стадии, продолжительности заболевания и проводимой терапии.

По мере увеличения частоты рецидивов, продолжительности заболевания, базисной терапии системными иммунодепрессантами уровень цитокинов снижался (в среднем от 110 до 224 пг/мл). Это обусловлено тяжелым прогрессирующим течением заболевания, длительным применением иммунодепрессантной терапии, угнетением функциональной активности иммунной системы, развитием вторичного иммунодефицита, что можно расценить как результат истощения, угнетения функциональной, в том числе и цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток.



Рис.13. Динамика уровня про- и противовоспалительных цитокинов после трансплантации МСК.

* - p<0,05 в сравнении с исходными показателями

Системная однократная трансплантация МСК у больных с длительным анамнезом заболевания вызывала достоверное повышение изначально сниженного уровня цитокинов (рис. 13) (с 11,4 до 23,6 пг/мл), которое, тем не менее, оставалось ниже контрольных значений (42,8 пг/мл). Минимальный уровень их выявлен у больных, длительно лечившихся кортикостероидами и цитостатиками, и составил: ИЛ-1в - 9пг/мл, б-ФНО -9,1 пг/мл , ИЛ-4 - 16,2 пг/мл. В развитии и течении хронических прогрессирующих воспалительных заболеваний кишечника важная роль принадлежит аутоиммунным реакциям, иммуноглобулинам и аутоантителам.

Так, у больных ЯК, как правило, повышается сывороточная концентрация циркулирующих аутоантител к различным антигенным структурам цитоплазмы нейтрофилов. Она отражает интенсивность аутоиммунных воспалительных процессов и, следовательно, имеет важное диагностическое и прогностическое значение. У больных ЯК концентрация аутоантител к антигенам цитоплазмы нейтрофилов оставалась повышенной (42 -56 Е/мл, в контроле - 10 Е/мл) при использовании стандартной (5-АСК), иммунодепрессантной (глюкокортикостероиды, цитостатики) и цитокиновой (Ремикейд® - антитела к б-ФНО) терапии.

Результаты проведенного нами исследования показали, что у больных язвенным колитом введение МСК вызывало достоверное снижение увеличенного содержания аутоантител к антигенам цитоплазмы нейтрофилов (IgG-BPI) с 42±2,8 до 28±1,6 Е/мл через 2 месяца. Через 6 и 12 месяцев концентрация аутоантител составила соответственно 26 и 12 Ед/мл в группе больных, у которых были выявлены аутоантитела к антигенам цитоплазмы нейтрофилов. Эти данные подтверждают снижение интенсивности системных гуморальных аутоиммунных реакций у больных ЯК после трансплантации МСК, что подтверждало снижение активности воспалительного процесса в кишечнике.

Рис. 14. Динамика уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови больных ЯК *-p<0,05 в сравнении с исходным уровнем

Содержание иммуноглобулинов (рис.14) в сыворотке крови больных ЯК до введения МСК и спустя 2, 6 и 12 месяцев соответственно составило: IgG - 11,2 - 14,8 - 12,8 и 11,8 г/л; IgM- 0,9 - 2,2 - 1,6 -1,1 г/л; IgA - 1,82 - 3,8 - 2,6 и 1,5 г/л (норма - IgM- 1,3; IgG- 13,0; IgA -2,3 г/л) (p<0,05), что подтверждает иммуномодулирующий эффект МСК- стимулирует угнетенную иммунную систему больных ВЗК и оказывает в последующем противовоспалительный эффект. Измеряя в динамике уровень про- (ИНФ-г, б-ФНО, ИЛ-1в) и противовоспалительных (ТФР-1в, ИЛ-4, ИЛ-10) сывороточных цитокинов, иммуноглобулинов G, M, секреторного IgA отмечаются следующие закономерности.

В группе больных с анамнезом заболевания не более 3-х лет средний уровень IgG составил 12.5±0.71 г/л, IgM - 1.56±0.04 г/л, IgA - 2.2±0.08 г/л, б-ФНО - 26.7±1.2 пг/мл, ИЛ-4 - 22,6±2,4 пг/мл, ИЛ-1в- 9.2±0.2 пг/мл, во группе больных в более длительным анамнезом: IgG -8.8±0.9 г/л, IgM - 0,9±0.01г/л, IgA - 1.3±0.01 г/л, б-ФНО - 13.9±1.9 пг/мл, ИЛ-4 - 10.8±0.5пг/мл, ИЛ-1в - 5.7±0.28 пг/мл (p<0,05) (таблица 13).

Таблица 13

Характеристики групп пациентов ЯК в зависимости от эффективности трансплантации МСК

Показатель	Трансплантация МСК эффективна (n = 30/68,2)	Трансплантация МСК не эффективна (n = 14/31,8)	p
IgG, г/л	12,5±0,71г/л	8,8±0,9 г/л	р < 0,05
IgA, г/л	2,2±0,8 г/л	1,3±0,01 г/л	р < 0,05
IgM, г/л	1,5±0,04 г/л	0,9±0,01 г/л	р < 0,05
Ь-ФНО, пг/мл	26,7±1,2 пг/мл	13,9±1,9 пг/мл	р < 0,05
ИЛ-1в, пг/мл	9,2±0,2 пг/мл	5,7±0,28 пг/мл	р < 0,05
ИЛ-4, пг/мл	22,6±2,4 пг/мл	10,8±0,5 пг/мл	р < 0,05

После трансплантации восстанавливается изначально пониженный уровень показателей гуморального иммунитета и циткинового профиля и баланс про- и противовоспалительных цитокинов. Через 6 и 12 месяцев после введения МСК отмечается достоверный рост противовоспалительных цитокинов ТФР-1в, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижении провоспалительных цитокинов ИНФ-г, б-ФНО, ИЛ-1в, что свидетельствует о регуляторных свойствах МСК и готовности их к индукции восстановительных (репаративных) процессов (рис.15).

Рис. 15. Динамика про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови

после трансплантации МСК

Следовательно, содержание сывороточных цитокинов при ЯК максимально повышено у пациентов с впервые выявленным заболеванием и снижается при терапии 5-АСК, Ремикейдом® и достигает минимальных значений при длительном применении иммунодепрессантной терапии по мере прогрессирования заболевания. Системная трансплантация МСК костного мозга стимулирует угнетенный синтез цитокинов, снижает интенсивность иммунопатологических процессов при ЯК, в динамике способствует выработке противовоспалительных цитокинов ТФР-1в, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижению уровня провоспалительных цитокинов ИНФ-г, б-ФНО, ИЛ-1в, в последующем обеспечивая адекватный баланс про- и противовоспалительных цитокинов, что одновременно сочетается с позитивной динамикой клинической и эндоскопической картины заболевания.

Таким образом, трансплантация МСК больным ЯК и БК сопровождается разнонаправленными изменениями иммунного статуса больных: повышением сниженной концентрации цитокинов, иммуноглобулинов, уменьшением содержания аутологичных антител, наряду с позитивной клинической динамикой заболевания.

Прогнозирование клинической эффективности трансплантации мезенхимальных стромальных клеток

Задачей нашего исследования явилось выявить критерии и показатели по которым возможно прогнозировать ответ на трансплантацию МСК.

В нашем исследовании системная трансплантации МСК оказалась эффективна у 32 больных (72,7%): безрецидивное течение ЯК за 12 месяцев наблюдения.

Малоэффективной терапия оказалась у 12 (27,3%): у 6 больных рецидив в течение 2 месяцев, у 4 - через 6 месяцев, 2 - через 12 месяцев (таблица 14).

Таблица14

Исходы терапии МСК больных ЯК за период наблюдения

Критерии эффективности терапии	Непрерывноеn= 10	Рецидивирующееn = 29	Впервые выявленный n = 5	Всего n=44
	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%
Исчезновение клинических симптомов	2	4,6	4	9,0	2	4,6	8	18,0
Исчезновение клинических симптомов + положительная клиническая динамика	1	2,3	2	4,6	0	0	3	6,8
+ эндоскопическая динамика, + клиническая динамика	2	4,6	1	2,3	1	2,3	4	9,0
+ эндоскопическая ремиссия, клинические симптомы исчезли	5	11,4	22	50,0	2	4,6	29	65,9

Таким образом, терапия оказалась эффективна в 77,3%: у 34 больного безрецидивное течение за 12 месяцев наблюдения, а неэффективной у 22,7% больных ВЗК (N=10): у 6 больных рецидив в течение 2 месяцев, у 4 - через 6 месяцев.

Мы проанализировали 2 группы больных в зависимости от эффекта от проведенной трансплантации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и больных, у которых эффекта от введения МСК не было или он был непродолжительным (таблица 15).

При анализе учитывали пол, возраст больных, длительность и тяжесть заболевания, протяженность поражения кишки, среднюю продолжительность приема азатиоприна до трансплантации МСК, индекс клинической и эндоскопической активности, исходным уровнем иммуноглобулинов G, иммуноглобулинов А, иммуноглобулинов М, исходными значениями уровня цитокинов б-ФНО и ИЛ-4 до трансплантации МСК.

Таблица 15

Характеристика групп больных в зависимости от эффективности трансплантации МСК

Показатель	Трансплантация МСК эффективна (n = 30/68,2)	Трансплантация МСК не эффективна (n = 14/31,8)	p
Возраст, годы	30,8±1,74	41,6±4,14	р < 0,05
Длительность ЯК, годы	2,3±0,2	5,85±0.56	р < 0,05
Средняя продолжительность приема азатиоприна до трансплантации МСК, мес.	5,3±0,2	10,1±1,5	р < 0,05
Индекс эндоскопической активности	7,25±0,2	7,2±0,2	р > 0,05
Индекс клинической активности	7,4±0,35	7,7±0,38	р >0,05
Частота курсов ГКС в год	0,86±0,09	2,00±0,19	р < 0,05
IgG	12,5±0,71г/л	8,8±0,9 г/л	р < 0,05
IgA	2,2±0,8 г/л	1,3±0,01 г/л	р < 0,05
IgM	1,5±0,04 г/л	0,9±0,01 г/л	р < 0,05
Ь-ФНО	26,7±1,2 пг/мл	13,9±1,9 пг/мл	р < 0,05
ИЛ-1в	9,2±0,2 пг/мл	5,7±0,28 пг/мл	р < 0,05
ИЛ-4	22,6±2,4 пг/мл	10,8±0,5 пг/мл	р < 0,05
Мужчины	56,6%	57,2%	-
Женщины	43,7%	42,8%	-
Протяженность поражения кишечника
Дистальный колит (проктосигмоидит)	3(10%)	0	-
Левосторонний колит	8(26.6%)	3(21.5%)	-
Тотальный колит	19(63.3%)	11(78.5%)	-
Течение заболевания
впервые выявленное	5(16.6%)	1(7.2%)	-
хроническое рецидивирующее	17(56.6%)	9(64.3%)	-
хроническое непрерывное	8(26.8%)	4(28.5%)	-

Как указывалось ранее в патогенезе ВЗК, особенностях течения заболевания, данные клинико-лабораторные характеристики играют важную роль, и, следовательно, они могут быть предикторами эффективности трансплантации МСК.

В среднем содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови до и после введения МСК соответственно составило: IgM - 1,6 г/л и 2,18 г/л; IgG - 11,2 и 14,8г/л; IgA - 1,42 и 2,84 г/л. Наиболее существенно возрастала концентрация IgA (р<,05), опосредующего местный гуморальный иммунный ответ.

Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови в группе больных, где трансплантация оказала положительный эффект (n=32), до введения МСК составило: IgM - 1,5±0,04 г/л, IgG - 12,5±0,71 г/л, IgA - 2,2±0,8 г/л. В группе больных (n=12), где эффект был непродолжительный, исходный уровень иммуноглобулинов составил: IgG - 8,8±0,9 г/л, IgM - 1,3±0,01 г/л, IgA - 0,9±0,01 г/л (р<0,05).

Уровень про-и противовоспалительных цитокинов в группе больных, где трансплантация эффективна, оказался достоверно выше по сравнению с группой, где эффекта от данной терапии не было. Показатели уровня Ь-ФНО были в группе с эффективной трансплантацией составил 26,7±1,2 пг/мл, ИЛ-1в-9,2±0,2 пг/мл, ИЛ-4 - 22,6±2,4 пг/мл, в группе без эффекта - 13,9±1,9 пг/мл, 5,7±0,28 пг/мл и 10,8±0,5 пг/мл соответственно. В своей работе мы продемонстрировали эффективность трансплантации МСК среди всех включенных в исследование больных ЯК, которая составила 68,2%. Динамика показателей гуморального иммунитета и цитокинового статуса через 2 месяца после трансплантации так же существенно отличалась в этих двух группах.

В группе больных (n=12), где эффект был непродолжительный, уровень иммуноглобулинов составил: IgG - 7,3±0,2 г/л, IgM - 1,4±0,01 г/л, IgA - 1,0±0,01 г/л (р<0,05), в группе с положительным эффектом (n=30) IgG-18,5±0,9 г/л, IgM - 2,5±0,1 г/л, IgA - 2,1±0,8 г/л.

Уровень про-и противовоспалительных цитокинов в группе больных, где трансплантация эффективна, так же оказался достоверно выше через 2 месяца по сравнению с группой, где эффекта от данной терапии не было показатели составили - Ь-ФНО были в группе с эффективной трансплантацией составил 12,9±1,3 пг/мл, ИЛ-1в - 8,7±0,4 пг/мл, ИЛ-4 40,1±2,5 пг/мл; Ь-ФНО - 22,3±1,1 пг/мл, ИЛ-1в - 14,2±0,2 пг/мл, ИЛ-4 - 14,6±2,4 пг/мл в группе без эффекта - соответственно. Данные изменения подтверждают концепцию о том, что трансплантация МСК наиболее эффективна на ранних стадиях заболевания.

Для того, чтобы установить связь между эффективностью МСК и возможными факторами, влияющие на положительный результат трансплантации, нами проведен корреляционный анализ между клинической и эндоскопической активностью через 2 месяца после трансплантации у больных язвенным колитом и основными клиническими и лабораторными характеристиками (таблицы 16 и 17).

Таблица 16

Корреляция между показателями клинической активности через 2 месяца после трансплантации МСК и исходными значениями клинико-лабораторных показателей у больных ЯК

Показатель	r	р
Индекс Мейо	0.87	<0,001
IgG	0.87	<0,001
IgM	0.72	<0,001
IgA	0.70	<0,001
ФНОб	0.16	>0,05
ИЛ-4	0.3	>0,05
Анамнез ЯК, лет	0.69	<0,01
Возраст, лет	0.44	<0,05
Протяженность поражения кишки	0.69	<0,01

Таблица 17

Корреляция между показателями эндоскопической активности через 2 месяца после трансплантации МСК и исходными значениями клинико-лабораторных показателей у больных ЯК

Показатель	r	р
Клинический индекс Рахмилевич	0.87	<0,001
IgG	0.68	<0,001
IgM	0.63	<0,001
IgA	0.75	<0,001
ФНОб	0.14	>0,05
ИЛ-4	0.4	>0,05
Анамнез ЯК, лет	0.65	<0,01
Возраст, лет	0.43	<0,05
Протяженность поражения кишки	0.35	>0,05

Была выявлена обратная зависимость между клинической эффективностью (индекс Rachmilewitz) иммуноглобулинов G (r=-0.87, p<0,001), иммуноглобулинов А (r=-0.70, p<0,001), иммуноглобулинов М (r=0.72, p<0,001).

Помимо лабораторных показателей, которые по нашему мнению могли играть существенную роль в прогнозировании эффективности трансплантации МСК, мы приняли во внимание длительность анамнеза язвенного колита (r=0.69, p<0,01) и возраст больных (r=0.44, p<0,05), так как общеизвестным является факт, что по мере прогрессирования аутоиммунного процесса происходит срыв механизмов адаптации и истощения резервов иммунитета. Нами так же выявлена корреляция между эндоскопической эффективностью (индекс Мейо) после трансплантации МСК и исходными значениями уровня Ig G (r=-0.68, p<0,001), Ig А (r=-0.75, p<0,001, Ig М (r=-0.63, p<0,001), длительностью анамнеза (r=0.65, p<0,01) и возрастом больных (r=0.43, p<0,05). Отсутствует корреляция между клинической эффективностью (индекс Rachmilewitz) протяженностью поражения кишки (r=0.35, p<0,05), исходными значениями уровня б-ФНО (r=-0.16, p>0,05), исходными значениями уровня ИЛ-4 (r=-0.3, p>0,05), а так же эндоскопической эффективностью (индексМейо) и протяженностью поражения кишки (r=0.35, p<0,05), исходными значениями уровня б-ФНО (r=-0.14, p>0,05), исходными значениями уровня ИЛ-4 (r=-0.4, p>0,05).

Анализ полученных результатов демонстрирует эффективность системной трансплантации МСК у больных на более ранних сроках заболевания, которые получали иммунодепрессанты непродолжительный период и с достаточным уровнем иммунного и воспалительного ответа на повреждение. Низкий уровень показателей иммунного статуса, обусловленный, вероятнее всего, прогрессированием аутоиммунного компонента заболевания и иммуносупрессивным эффектом преднизолона и иммуносупрессоров, является предиктором отсутствия положительного ответа на трансплантацию МСК у больных воспалительными заболеваниями кишечника. Представляется важным то, что повторная трансплантация МСК обеспечивает восстановление чувствительности к предварительно неэффективной терапии [Oyama Y., Traynor A.E., Barr W., Burt R.K., 2003]. Эффективность проводимой терапии МСК также напрямую связана с кратностью введения клеток.

Например, в экспериментах на животных с моделью сахарного диабета I типа было показано, что более существенное и длительное снижение уровня глюкозы наблюдается у животных с многократным введением МСК по сравнению с животными, которым трансплантация производилась однократно [Banerjee M., Kumar A., Bhonde R.R., 2005]. Необходимо продолжить исследование с целью определения кратности и частоты введения клеток для достижения наиболее оптимального эффекта в лечении больных язвенным колитом.

Преодоление гормонорезистентности и гормонозависимости у больных воспалительными заболеваниями кишечника

Больные с болезнью Крона и язвенным колитом, находящиеся в отделении патологии кишечника, получали комплексное лечение, включавшее глюкокортикостероиды (преднизолон 1-2 мг/кг/сут). Отсутствие улучшения в состоянии больных в течение 4 недель расценивали как гормонрезистентность, если при снижении дозы преднизолона до 10 мг/день или будесонида до 3 мг/день в течение 3 мес от начала заболевания развивалось обострение заболевания или обострение заболевания развивается в течение 3 мес после прекращения приема кортикостероидов - стероидозависимость.

Среди больных язвенным колитом в нашем исследовании гормонозависимость была установлена у 23 больных (23,9%) и у 14 (14,6%) гормонорезистентность, у больных болезнью Крона гормонозависимость была у 8 больных (22,2%) и у 10 (27,8%) гормонорезистентность.

Распределение гормонорезистентной и гормонозависимой формами больных по группам, в зависимости от метода терапии представлены в таблицах 18 и 19

В нашем исследовании среди 96 больных ЯК гормонорезистентность была у 14, что составило 14,6% и гормонозависимая форма ЯК у 23 больных - 24,0% (таблица 18).

Таблица 18

Количественный анализ больных ЯК (n=96) по характеру течения заболевания

Форма ЯК	Характер течения ЯК
	Острый	Рецидиви-рующий	Непрерыв-ный
	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%
Гормонорезистентная (n=14)	2	14,3	8	57,1	4	28,6
Гормонозависимая (n=23)	-	-	5	21,7	18	78,3

Среди 36 больных БК гормонорезистентность была у 10, что составило 27,7% и гормонозависимая форма БК у 8 больных - 22,2% (таблица 19).

Таблица 19

Количественный анализ больных БК (n=36) по характеру течения заболевания

Форма БК	Характер течения БК
	Легкий	Среднетяжелый	Тяжелый
	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%
Гормонорезистентная (n=10)	2	20,0	6	60,0	2	20,0
Гормонозависимая (n=8)	-	-	6	75,0	2	25,0

Распределение гормонорезистентной и гормонозависимой формами больных по группам, в зависимости от метода лечения представлены в таблицах 20 и 21.

Таблица 20.

Количественный анализ больных ЯК (n=37) по группам терапии

Форма ЯК	Группы больных
	1-я	2-я	3-я
	Абс.	Доля, %	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%
Гормонорезистентная (n=14)	8	51,2	1	7,1	5	35,7
Гормонозависимая (n=23)	15	65,3	1	4,3	7	30,4

Таблица 21

Количественный анализ больных БК (n=18) по группам терапии

Форма БК	Группы больных
	1-я	2-я	3-я
	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%	Абс.	Доля,%
Гормонорезистентная (n=10)	7	38,9	1	5,5	2	11,0
Гормонозависимая (n=8)	5	27,8	-	-	3	16,5

Среди 37 больных ЯК с гормонорезистентностью и гормонозависимостью 23 пациента было в группе получающих МСК, что составило 52,3% от 1-й группы, 2 больных из 2-й группы - 5%, в 3-й группе - 12 больных - 100%. Среди 18 больных БК с гормонорезистентностью и гормонозависимостью 12 пациентов было в группе получающих МСК, что составило 80,0% от 4-й группы, 1 больной из 5-й группы - 6,6%, в 6-й группе - 5 больных - 83,3%.

Таким образом, наибольший процент больных ВЗК с гормонорезистентностью и гормонозависимостью был в группах больных, получающих ИНФ и трансплантация МСК. У 26 (59%) в течение 2 мес наблюдения удалось постепенно полностью отменить глюкокортикостероиды.

Поддерживающую терапию осуществляли препаратами 5-АСК (сульфасалазин или месалазин) и пробиотиками. У 10 больных (22,7%) дозу преднизолона постепенно снизили до 5 мг/сут, но у 2 в связи с развившимся рецидивом она была вновь увеличена. У 6 больных этой группы улучшения не наступило: сохранялся частый жидкий стул с примесью крови, лихорадка. Двум из них был назначен инфликсимаб, а остальным вновь увеличили дозу преднизолона до 1 мг/кг м.т. Больные 2-й группы на протяжении всего периода наблюдения продолжали получать преднизолон в дозе от 10 до 15мг/ сут и азатиоприн от 100 до 150 мг/ сут. В 3-й группе больных дозу ГКС так же удалось снизить, а затем полностью отменить у 12 больных (80%). Через полгода наблюдения 34 больных, которым осуществлена трансплантация МСК не получали преднизолон, у 2 больных развился рецидив заболевания с повторным назначением ГКС. Через 12 месяцев ремиссия сохранялась у 32 больных в 1-й группе, как указывалось ранее, эффективность составила 72,7%. При этом гормонозависимость была преодолена у 12 больных, что составило 80% из данной группы больных язвенным колитом (n=15). В 3-й группе 7 больных (46,6%) были гормонозависимы. Проводимая терапия инфликсимабом позволила полностью отказаться 6 больным (85%) от ГКС.

У больных болезнью Крона в группе МСК гормонозависимость была у 5 больных, гормонорезистентность - у 7 больных, в группе больных, которые переведены на терапию инфликсимабом - 2 и 3 соответственно. После трансплантации МСК гормонозависимость и гормонорезистентность преодолена у 10 больных (83%), что сопоставимо с терапией инфликсимабом - 80%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что внедрение современных методов терапии ВЗК способствуют не только купированию атаки заболевания и увеличению продолжительности ремиссии, тем самым повышая эффективность лечения этих заболеваний, но и позволяет помочь преодолеть рефрактерность к стероидам. Механизм может быть обусловлен особенностями иммуномодулирующего эффекта МСК, особенности которого неоднократно подчеркивались и анализировались в данной работе.

Контроль онкологической безопасности анализ нежелательных побочных эффектов трансплантации МСК

Учитывая то, что клеточная терапия является медицинской технологией третьего класса, данной группе больных в период ремиссии необходимо проводить контрольные эндоскопические (КС 2 раза в год, РРС 4-6 раз в год) и рентгенологические исследования кишки.

Только во время колоноскопии можно оценить степень прогрессирования болезни, активность воспаления и наличие дисплазии слизистой кишки. Нами проводилась множественная лестничная биопсия с последующим гистологическим исследованием.

Однако даже при множественной биопсии мы не можем с полной уверенностью исключить наличие онкологического процесса. Помимо инвазивных методов ранней диагностики рака, мы ежемесячно определяли уровень онкомаркеров СА 242 и СА 19-9.

Определение уровня онкомаркеров позволяет выявить группы повышенного риска развития рака. Специфичность СА 242 позволяет проводить диагностику уже на ранних стадиях заболевания.

По различным данным с помощью этого теста удается прогнозировать развитие рецидивов колоректального рака за 5-6 месяцев. За 24 месяца наблюдения за больными, которым проведена трансплантация МСК ни в одном случае не было зарегистрировано повышения уровня онкомаркеров и злокачественной трансформации ВЗК.

Таким образом, полученные нами данные согласуются с материалами исследований, подтверждающих, что трансплантация МСК костного мозга человека не приводит к развитию опухолевого процесса. Следовательно, проведение системных (внутривенных) трансплантаций МСК, полученных из костного мозга взрослого человека, является безопасным медицинским мероприятием.

У 12 больных (20%) после введения МСК наблюдалась слабая трансфузионная реакция. Она характеризовалась появлением субфебрильной температуры, артралгии и миалгии, продолжавшейся несколько часов. У двух больных развилась аллергическая реакция по типу крапивницы и отека Квинке, которую купировали введением антигистаминных препаратов и глюкортикостероидов.

Сравнительный фармакоэкономический анализ различных методов лечения ВЗК

Лечение больных БК дорого обходится национальным системам здравоохранения. Например, в Великобритании, прямые затраты составляют более 2000 ? в год на одного больного, в Бельгии - 2500 € за 6 месяцев.

Таблица 22

Стоимость лечения (на 1 больного) ЯК в зависимости от выбранного метода терапии

Терапия	Стоимость (руб)	Безрецидивные дни.	Стоимость/эффективность (руб/день)
5-АСК/ГКС	26645±4849,4	141	189,5
МСК	35395±6532,1	238,5	148,7
ИНФ	730564,6±9894,4	220,5	3313,2

Как следует из представленных в табл.15 данных, несмотря на высокую стоимость лечения больных в группе МСК+стандартная терапия, коэффициент «затраты-эффективность» в данной группе больных оказался низким в сравнении со стандартной терапией.

Одинаковые результаты были получены независимо от выбора критерия эффективности лечения ЯК.

Результаты расчета коэффициента «затраты-эффективность» по длительности ремиссии ЯК показывают, что используя МСК + стандартную терапию, можно добиться увеличения длительности ремиссии болезни, и одновременно - экономии расходов до 214,5 руб./больн./1 день.

Экономическая и клиническая эффективность применения МСК на фоне стандартной терапии в сравнении с результатами только стандартной терапии также подтверждается расчетами коэффициентов «затраты-эффективность», а также индексов Рахмилевича и Мейо.

Таким образом, с клинической и экономической точек зрения более оправдано применение схемы лечения, при которой клиническая эффективность наибольшая, а коэффициент «затраты-эффективность» наименьший. Такой вариант лечения оказался у больных, пролеченных МСК на фоне стандартной терапии.

В течение 12 мес. исследования затраты на МСК в значительной степени компенсируются предотвращенными осложнениями и госпитализациями, связанными с ними расходами. На протяжении этого периода затраты на МСК составляют небольшую часть общей стоимости ведения больных ЯК.

Благодаря более высокой избирательности, эффективности и безопасности, по сравнению со стандартной терапией ЯК, использование МСК приводит к снижению сроков и стоимости стационарного и амбулаторного обслуживания (уменьшается число рецидивов и осложнений), что в конечном итоге приводит к значительной экономии общей стоимости лечения, бюджетных...