Молекулярно-генетические механизмы врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек при патологии инфекционного генеза

Размещено на http://www.allbest.ru/

на правах рукописи

молекулярно-генетические механизмы врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек при патологии инфекционного генеза

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ГАНКОВСКАЯ Оксана Анатольевна

Москва - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток

им. И.И. Мечникова РАМН

Научный консультант академик РАМН, доктор биологических наук

профессор Виталий Васильевич ЗВЕРЕВ

Официальные оппоненты доктор медицинских наук

профессор Ирина Петровна БАЛМАСОВА

доктор медицинских наук

профессор Людмила Ивановна КРАСНОПРОШИНА

доктор медицинских наук

профессор Александр Александрович ЯРИЛИН

Ведущая организация Институт иммунологии и физиологии УрО РАН

Защита состоится «___» ____________201_ г. в ____ часов на заседании диссертационного Совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).

Автореферат разослан «___» _________________ 201_ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Всемирная организация здравоохранения ставит инфекционные заболевания на одно из ведущих мест среди главных причин смертности (после ишемической болезни сердца, инсульта и др.) [ВОЗ, 2009]. По данным ВОЗ, ежегодно в мире умирает около 51 млн. человек, треть из них - от инфекционных болезней. Инфекционные заболевания остаются актуальной проблемой не только для развивающихся, но и для благополучных стран. В Российской Федерации ежегодно регистрируют около 35 млн. случаев инфекционных болезней [Онищенко Г.Г., 2006; Пальцев М.А., 2007].

В последние годы, благодаря прогрессу таких научных дисциплин как молекулярная биология, генетика, иммунология и клеточная биология, происходит накопление знаний о механизмах развития различных инфекционных заболеваний, а также становится возможным их точная диагностика и прогнозирование. Известно, что состояние резистентности к инфекции формируется с помощью многочисленных реакций иммунной системы, основная функция которой заключается в распознавании и элиминации инфекционных агентов, а также продуктов их жизнедеятельности [Ярилин А.А., 1999; Хаитов Р.М., 2010; Ковальчук Л.В., 2010].

В последнее время все большее подтверждение получает гипотеза К. Janeway об исключительной важности системы врожденного иммунитета в защите от патогенов и в реализации начальных стадий реакций адаптивного иммунитета [Кокряков В.Н., 2006; Janeway, 2007; Лебедев К.А., 2008]. Клетки системы врожденного иммунитета распознают консервативные в эволюционном отношении молекулы, присущие одновременно большим систематическим группам микроорганизмов. Среди распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета ключевая роль принадлежит Toll-подобным рецепторам (TLR). После взаимодействия TLR с лигандом происходит активация сигнальных путей, в результате которой продуцируются эффекторные молекулы, такие, как цитокины, противомикробные пептиды и др. При скоординированном функционировании факторов врожденного иммунитета в большинстве случаев происходит элиминация патогена. Однако гиперактивация или угнетение механизмов врожденного иммунитета в свою очередь может приводить к развитию патологического процесса [Kopp E., 2003; Назаров П.Г., 2005; Макаров О.В., 2007; Семенов Б.Ф., 2009].

Исследования по оценке патологических состояний с точки зрения функционирования молекулярных механизмов системы врожденного иммунитета фактически начались совсем недавно [Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007; Ковальчук Л.В., 2007].

Общепризнано, что развитие большинства инфекций, с которыми встречается организм, начинается с проникновения патогенов через барьерные ткани, в том числе через слизистые оболочки. Известно, что слизистые, являясь физиологическим барьером, участвуют в развитии защитных реакций врожденного иммунитета в ответ на патогены, в инициации реакций адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов (аллергии, острого и хронического воспаления и др.). Таким образом, в настоящее время клетки (в том числе эпителиальные) слизистых оболочек рассматриваются в качестве одного из факторов врожденного иммунитета [Хаитов Р.М., 2005; Лебедев К.А., 2008; Artis D., 2008; Coombes J.L., 2008; Семенов Б.Ф., 2009; Ярилин А.А., 2010].

Комплексное исследование вышеперечисленных процессов при патологии инфекционного генеза (урогенитальной инфекции, внутриутробной инфекции, вирусном кератите и др.) позволит приблизиться к пониманию роли механизмов врожденного иммунитета и определить тонкую грань между процессами функционирования системы врожденного иммунитета, обеспечивающими защиту организма, и процессами, приводящими в конечном итоге к развитию патологии. Выяснение роли Toll-подобных рецепторов, цитокинов и противомикробных пептидов, экспрессированных в слизистых при инфекционных заболеваниях позволит более точно провести своевременную диагностику, заблаговременно спрогнозировать характер течения заболевания, изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также обосновать выбор адекватной терапии.

Оценка системы врожденного иммунитета слизистых оболочек с использованием современных методов молекулярной биологии и генетики даст возможность выявить маркеры внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов и других патологических состояний. В дальнейшим накопленный фундаментальный базис позволит научно обосновать и разработать новые подходы к выбору адекватной терапии инфекционных заболеваний с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы.

Цель работы - комплексное исследование на генетическом, экспрессионном и функциональном уровнях компонентов системы врожденного иммунитета (Toll-подобных рецепторов, противомикробных пептидов, цитокинов) в слизистых оболочках организма при патологии инфекционного генеза, а также разработка на основе полученных данных прогностических и диагностических критериев течения инфекционного процесса.

Задачи исследования

1. Разработать системы ПЦР в режиме реального времени для количественной оценки экспрессии генов Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНО) и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP).

2. С помощью разработанных тест-систем на экспериментальных моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo определить уровни экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLRs, противомикробных пептидов, цитокинов).

3. Изучить изменение уровней экспрессии генов TLRs, дефенсинов и продукции цитокинов при урогенитальной инфекции (УГИ), внутриутробной инфекции (ВУИ) и преждевременных родах и определить их роль как возможных маркеров невынашивания беременности и реализации ВУИ.

4. Оценить значимость активации апоптоза в клетках плаценты, как одного из механизмов развития преждевременных родов у беременных женщин с урогенитальной инфекцией.

5. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров, локализованных в генах TLR2, TLR4, TLR9 и HBD-1, с риском развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода.

6. Определить диагностическую значимость выявленных изменений уровней экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD-1 в клетках слизистой оболочки урогенитального тракта и продукции цитокинов у больных хроническим простатитом.

7. Изучить роль сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида -дефенсина 2 в эпителиальных клетках роговицы в развитии герпетического кератита.

8. Обосновать комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек, основанный на 1) изучении полиморфизма генов TLR и противомикробных пептидов, 2) определении уровня их экспрессии и 3) функциональной активности для выявления маркеров течения инфекционного процесса.

Научная новизна

- Впервые представлен комплексный подход к оценке функционирования системы Toll-подобных рецепторов, основанный на изучении: экспрессии генов TLRs, транскрипционных факторов, эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.).

- Впервые показано, что гиперэкспрессия TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала беременных женщин с урогенитальной инфекцией, сопровождающаяся повышенной продукцией ИЛ-8, ИФН и сниженной экспрессией HBD-1, приводит к реализации внутриутробного инфицирования плода и к преждевременным родам. Выявлены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода при урогенитальной инфекции, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и HNP-1-3 в сыворотке периферической крови.

- Впервые в клетках плаценты при преждевременных родах выявлен дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP, который заключается в повышении уровня экспрессии генов каспаз, коррелирующих с увеличенной экспрессией генов TLRs и со сниженной экспрессией генов ингибиторов каспаз.

- Впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2, Asp299Gly и Thr399Ile в гене TLR4, 2848G/A в гене TLR9, G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A в гене DEFB1 с урогенитальной инфекцией у беременных, преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода. Показана ассоциация аллеля A(-20) и генотипа GG (-52) гена DEFB1 с увеличением уровня экспрессии -дефенсина 1 в эпителиальных клетках цервикального канала при выше указанной патологии.

- Впервые определены прогностические критерии иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе данных о снижении уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбалансе про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.

- Впервые изучены показатели системы врожденного иммунитета в конъюнктиве и роговице глаза у детей - уровень экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2, обеспечивающего противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза. Установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом и оказывает положительный терапевтический эффект.

- Получены новые данные по межлинейным различиям в развитии вирусного кератита и экспрессии гена TLR9 в роговице мышей линий С57BL/6 и BALB/с.

- На клетках Vero изучена экспрессия генов TLR1, TLR2, TLR4, TLR9 и др. и определена функциональная активность клеток по выработке цитокинов в ответ на воздействие различных патогенов (вируса простого герпеса (ВПГ), C.albicans и др.).

Практическая значимость

Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов TLRs, цитокинов и противомикробных пептидов в качестве прогностических и диагностических критериев у женщин с преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода, а также у пациентов с хроническим простатитом и герпетическим кератитом.

С использованием разработанных систем определены маркеры риска развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода. Комплекс маркеров на основе исследования экспрессии генов TLRs, дефенсинов, продукции противомикробных пептидов и цитокинов в цервикальном канале женщин, позволяет с большей долей вероятности прогнозировать преждевременные роды и развитие внутриутробного инфицирования плода. При гиперэкспрессии TLR2 более, чем в 5 раз и снижении экспрессии HBD-1 (в 2,5 раза и более) в 70% случаев наблюдаются преждевременные роды.

Определена панель полиморфных маркеров генов-кандидатов (TLR2, TLR9 DEFB-1) реализации внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов, что позволяет оценить риск развития патологического процесса во время беременности.

Разработаны экспериментальные системы оценки экспрессии генов и эффекторных молекул в культурах клеток (Vero, HeLa), что позволяет исследовать действие препаратов на компоненты врожденного иммунитета.

Внедрен новый метод лабораторной диагностики определения уровня экспрессии гена сигнального рецептора TLR9 в эпителиальных клетках роговицы и конъюнктивы при герпетическом древовидном кератите у детей. Обосновано применение препарата Суперлимф в комплексной терапии герпетических кератитов у детей, позволяющей снизить уровень осложнений и добиться нормализации экспрессии TLR9.

Основные положения, выносимые на защиту

ген маркер беременность иммунитет

1. Разработаны системы для определения экспрессии генов молекул врожденного иммунитета Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНО) и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP) и апробированы в моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo.

2. С использованием разработанных систем определены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов при урогенитальной инфекции, внутриутробного инфицирования плода, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и на ассоциации полиморфных маркеров генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного иммунитета. Разработана концепция развития преждевременных родов, заключающаяся в гиперактивации TLR2-опосредованного апоптоза клеток плаценты. При преждевременных родах в клетках плаценты наблюдается дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP.

3. Развитие хронического простатита сопровождается снижением уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.

4. При изучении уровня экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в клетках конъюнктивы и роговицы глаза у детей, установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом, а также снижает частоту осложнений при указанной патологии.

5. Разработан комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета, основанный на изучении экспрессии генов TLR (при действии различных лигандов); сигнальных молекул и транскрипционных факторов; эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.). Анализ компонентов TLR-системы проведен на уровне полиморфизма генов, экспрессии мРНК, секреции эффекторных молекул.

Внедрение результатов работы

Результаты исследований, представленных в диссертационной работе, внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов, а также курс лекций по повышению квалификации врачей в Российской медицинской академии последипломного образования, Смоленской Государственной Медицинской Академии и Медицинском институте Орловского государственного университета.

Применение исследования экспрессии генов TLRs представлено в Патенте на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». Официальный Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.09.2008 г.

Получено положительное решение о выдачи патента на изобретение (Заявка №2009108294/15(011092), дата подачи заявки 10.03.2009 г.).

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на заседании Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (2009), Всероссийском научном Форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004, 2006, 2007, 2009), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2007, 2010), Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 6-th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling (Poland, Krakow, 2007), Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию Н.И.Вавилова (Киев, 2007), 8-th John Humphrey advanced summer school in immunology: Immunology and Viral Infection (Москва, 2007), VI конференции иммунологов Урала (Ижевск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XXVII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Barcelona, Spain 2008), 6-th European Congress of Reproductive Immunology (Москва, 2008), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо (Казань, 2009), Съезде офтальмологов России (Москва, 2009), GA2LEN/EAACI Summer Allergy School (Great Britain, Norwich, 2009), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Great Britain, London, 2010).

Апробация диссертации состоялась ___ мая 2010 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано в 68 печатных работы, в том числе 19 в изданиях, рекомендованных ВАК, материалы включены в монографию «Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2007 и методическое пособие «Иммунология. Практикум.» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2010.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы», 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 392 источника, из которых 105 отечественных и 287 зарубежных. Работа выполнена на 300 страницах машинописного текста, иллюстрирована 50 рисунками и 51 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы

В работе использованы штаммы ВПГ-1 (VR-3) и ВПГ-2 (MS), полученные из Национальной вирусной коллекции (Великобритания). До начала экспериментов вирусы прошли 5-7 последовательных пассажей на культуре клеток Vero. Инактивированные образцы Candida albicans (АТСС 885-653) любезно предоставлены профессором Л.П. Блинковой (ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН).

Для стимуляции мононуклеарных клеток и нейтрофилов использованы антигены ВПГ [Королюк М.А., 2002] и лизат Candida albicans, а также липополисахарид (ЛПС) (Sigma, США), комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов - препарат Суперлимф («Центр иммунотерапии «Иммунохелп», РФ).

Для проведения экспериментов in vitro использованы культура клеток почек зеленой мартышки - Vero (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург) и культура клеток HeLa (аденокарцинома), которая любезно предоставлена к.б.н. Т.М. Парфеновой (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф Гамалеи РАМН). В качестве культуральной среды использована среда DMEM (ПанЭко, РФ), содержащая 10% или 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (PAA Laboratories GmbH, Австрия).

Модели вирусного кератита и генитального герпеса были воспроизведены на мышах линий C57Bl/6 и BALB/c, самцах и самках, весом 18-19 г. Животные были получены из питомника «Андреевка» ГУ НЦБМТ РАМН (Москва, РФ) и содержались в виварии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (на территории 1-й Дубровской ул., д. 15).

Получение и обработку клинического материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР - диагностики» Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ (2004г.). В качестве клинического материала в работе использованы соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала, соскобы эпителиальных клеток из уретры, соскобы клеток эпителия роговицы, ткань плаценты, сыворотка или плазма периферической крови, секрет предстательной железы.

Характеристика клинических групп

Исследования показателей в группе беременных женщин с физиологически протекающей беременностью и в группе женщин с урогенитальной инфекцией были проведены в 2004 - 2009 гг. совместно с сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета (заведующий кафедрой профессор, д.м.н., заслуженный врач РФ О.В. Макаров), на базе родильного дома при городской больнице №8 ДЗ г. Москвы (главный врач А.Б. Дуленков), на базе гинекологического отделения ГКБ №55 и женской консультации при родильном доме №10 (главный врач Е.П. Озимковская) и совместно с сотрудниками кафедры иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующий кафедрой проф. Л.В. Ковальчук, проф каф. Л.В. Ганковская) Большая часть исследований проведена в рамках совместной темы НИР №50в в период 2007-2010 гг.

Общее количество обследуемых женщин составило 409 человек, среди них 57 небеременных женщин (у 20 из которых определялась урогенитальная инфекция) и 352 беременные женщины. Возраст всех пациенток находился в интервале от 19 до 42 лет. Беременные женщины были разделены на две группы: на первом триместре (85 женщин) и на третьем триместре (267 женщин). В основную группу на первом триместре беременности входили женщины с неразвивающейся беременностью, закончившейся выкидышем на 5 - 13 недели гестации. Гиперандрогения была выявлена у 29% женщин, хронический цервицит - 10,5%, вирусная инфекция (ВПГ-2, ЦМВ) - 7,9%, хронический двусторонний сальпингоофорит - 23,7%. Группу сравнения составляли женщины с физиологически протекающей беременностью на сроке 5-13 недель. К критериям исключения пациентов из группы сравнения относили следующие показатели: гиперандрогения, маточные кровотечения, эндокринная патология, инфекционные и воспалительные заболевания, аутоиммунная патология.

Основная группа женщин, находящихся на третьем триместре, была разделена на две подгруппы: в первую входили 83 беременные женщины с вирусной инфекцией (ВПГ-2, ЦМВ), во вторую группу - 65 беременных женщин с урогенитальной инфекцией различной этиологии. Новорожденные от 20 матерей этой подгруппы имели локальные и системные проявления внутриутробной инфекции. Вторую подгруппу составили 45 беременных, с преждевременными родами без реализации ВУИ. Группу сравнения составили 25 беременных женщин с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась своевременными родами. Контрольную группу составили 94 беременных с физиологически протекающей беременностью после своевременных родов с рождением здорового жизнеспособного ребенка. У всех женщин контрольной группы была исключена урогенитальная инфекция.

Исследования клинического материала у больных с диагнозом хронический простатит были проведены в 2006 - 2008 гг. совместно с сотрудниками кафедры урологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующий кафедрой член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Е.Б.Мазо). Определение уровней экспрессии генов в клетках слизистой уретры и исследование уровня цитокинов в сыворотке периферической крови и секрете предстательной железы проводили у 55 больных хроническим бактериальным простатитом, 55 больных хроническим абактериальным простатитом и 30 здоровых добровольцев (средний возраст больных составлял 25±4 года, здоровых - 20±2,1 года). У больных хроническим бактериальным простатитом выделено и идентифицировано 19 штаммов бактерий, из которых 68,4% грамположительных и 31,6% грамотрицательных. У больных хроническим абактериальным простатитом были выявлены Сlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum. При этом у 40% больных отмечена смешанная инфекция.

Молекулярно-биологические исследования проведены в 2008 - 2010 гг. на базе кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава в Морозовской детской городской клинической больнице г. Москвы (заведующий кафедрой член-корреспондент РАМН Е.И.Сидоренко). Материалом исследования служили соскобы клеток эпителия роговицы, полученные от 37 детей в возрасте от 2 до 14 лет. Дети были разделены на две группы: здоровые (n=23) и с диагнозом герпетический древовидный кератит (n=14).

Методы

Работа с культурами клеток. Пересев клеток (Vero, HeLa) проводили на 3-4 сутки [Лацис Р.В., 2000]. Для проведения опытов использовали 96-луночные плоскодонные планшеты (COSTAR, США). В каждую лунку вносили по 200 мкл клеточной суспензии (концентрация 200 тыс. клеток в 1 мл). Через 24 ч (48ч) инкубации при 37оС в атмосфере СО2 в лунках формировался монослой клеток. При проведении экспериментов использовали среду DMEM с 2% ЭСТ. Для определения жизнеспособности клеток использовали 0,2% раствор трипанового синего (Serva, США) в культуральной среде (маточный раствор) и 0,75М NaCl (ОАО Красфарма). Для оценки цитотоксического и цитопатического действия использовали краситель Neutral Red (1,11мг/мл) и витальный краситель МТТ (Sigma, США).

Заражение культуры клеток вирусами герпеса простого. Монослой клеток заражали вирусом (ВПГ-1, ВПГ-2) в дозе 0,1 ТЦД50/кл. Клетки инкубировали в культуральной среде при 37С в атмосфере СО2 до появления вирусиндуцированного цитопатического эффекта. Через 5 суток определяли титр вируса с помощью метода Рида и Менча [Reed L., Muench H.A., 1938].

Заражение мышей ВПГ. Самок мышей инфицировали ВПГ-2 внутрибрюшинно (или интравагинально) вводя им по 500 мкл (100 мкл) вируссодержащего материала. Для исследований были взяты соскобы из цервикального канала через 7 и 21 дней после инфицирования.

Для создания модели вирусного кератита мышам в конъюнктивальный мешок после скарификации роговицы стерильной иглой закапывали 3 мкл вируссодержащей жидкости (титр ВПГ-1 - 105 ЦПД50/0,1мл). Мышам группы сравнения в конъюнктивальный мешок после аналогичной травмы закапывали 3 мкл среды RPMI-1640. Интактным животным не наносили повреждений роговицы. Для определения уровня экспрессии генов TLR9 и BD2 методом ПЦР в режиме реального времени на 1-е, 3-и и 7-е сутки после скарификации осуществляли соскоб клеток роговицы.

Выделение нуклеиновых кислот из клеток. Выделение ДНК проводили по известным протоколам [Херрингтон С., 1999; Sambrook J., 2001]. Для выделения РНК использовали метод кисло-фенольной экстракции, а также использовали наборы “Рибо-сорб” (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, АмплиСенс, РФ) и RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия). Полученные образцы нуклеиновых кислот хранили при температуре минус 700С.

Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили по известным протоколам [Edwards K., 2004; Dennis Y.M., 2006]. Часть реакций обратной транскрипции проведена с использованием наборов: Sensiscript RT Kit (Qiagen, Германия) и Реверта (ИЛС, РФ) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Праймеры и зонды для ПЦР-РВ моделированы в программе Vector NTI 8,0, в соответствии с последовательностями мРНК исследуемых генов (из базы данных GenBank), и синтезированы в фирме Синтол (РФ). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase (СибЭнзим, РФ), Hot Start Taq DNA Polymerase (Qiagen, Германия), TaqBead HotStart Polymerase (Promega, США), а также наборы «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)» (Синтол, РФ). Для определения экспрессии гена актина, помимо имеющейся системы, использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК в-актина человека» (Синтол, РФ). Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя в амплификаторе АНК-32 или АНК-16 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, РФ) при следующей программе: 500С - 2 мин., 950С - 10 мин., (56 - 680С- 50 секунд, 950С - 15 секунд) 40 циклов. Программное обеспечение приборов АНК-16 и АНК-32 позволяет получить данные по пороговому циклу.

Рестрикционный анализ. Для определения полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2 использовали рестриктазу AciI (Fermentas, Литва), Asp299Gly в гене TLR4 - рестриктазу Nco-I (Fermentas, Литва), Thr399Ile в гене TLR4 - рестриктазу Hinf-I (СибЭнзим, РФ). Температурный и временной режимы реакции полностью соответствовали таковым в инструкции фирмы-производителя.

Выделение клеток из периферической крови. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови здоровых доноров и больных с урогенитальной инфекцией проводили по стандартной методике с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-пака (=1,077; Pharmica, Швеция) по методу A.Boyum [Boyum, 1968]. Выделения нейтрофилов (НФ) из периферической крови проводили по стандартной методике [Ковальчук Л.В., 2010].

Стимуляция и культивирование мононуклеарных клеток и нейтрофилов проводили с помощью ЛПС (100, 10, 1, 0,1 и 0,01 нг на лунку), антигенов ВПГ-1, ВПГ-2 (100 мкл вируссодержащей жидкости на лунку), препарата Суперлимф (100 мкг/ на лунку), антигенов Candida alb и др. Через 3, 6, 12, 18, 24 часа определяли цитокины в культуральной жидкости методом ИФА.

Иммуноферментный анализ (ELISA). Концентрацию цитокинов в культуральной жидкости, слизи цервикального канала, секрете простаты или сыворотке, плазме периферической крови определяли с помощью коммерческих ИФА наборов: ИЛ-1, диапазон измерений 0-250 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИЛ-4 (BioSource, Бельгия), ИЛ-6 - 0-500 пг/мл (Invitrogen, США), ИЛ-8 - 0-1000 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИЛ-10 - 0-500 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИЛ-12 - 0-500 пг/мл (Invitrogen, США), ФНО - 0-1000 пг/мл (BioSource, Бельгия), ТФР - 0-2000 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИФН - 0-1000пг/мл (BioSource, Бельгия) и противомикробных пептидов HNP1-3 - 0-10000пг/мл (HBT, Нидерланды) и LL-37 (HBT, Нидерланды). В данных тест-системах использовали «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного метода с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Анализ проводили по предложенной производителями (BioSource, Invitrogen, HBT) методике. Для определения оптической плотности использовали анализатор иммуноферментных реакций (Пикон, РФ).

Статистические методы обработки данных. Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов [Гланц С., 1999]. Применяли компьютерную статистическую программу BioStat, а также программу Excel. В таблицах и рисунках результаты представлены в виде Х. Для сравнения групп данных использовали параметрический критерий Стьюдента (t), а также непараметрические методы статистической обработки данных (критерий Манна-Уитни). Для статистической обработки результатов по качественным признакам (полиморфным маркерам - сравнение частот аллелей и генотипов) использовали критерий ч2 и точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при p0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящей работе разработаны молекулярные и генетические подходы к изучению TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета при патологии инфекционного генеза на уровне слизистых оболочек. Сформулированные подходы включает оценку Toll-подобных рецепторов, сигнальных и эффекторных молекул (цитокинов и противомикробных пептидов). Каждый компонент системы TLRs может быть изучен на различных уровнях: на уровне нуклеотидной последовательности гена (полиморфизм, мутации), уровне экспрессии мРНК, уровне синтеза белковой молекулы, уровне функциональной активности (эффекта). Методические подходы исследования системы TLRs на различных уровнях представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Методические подходы, используемые в работе.

Уровень исследования	Предмет исследования	Метод исследования
Геномный уровень	SNP (single nucleotide polymorphism)	ПЦР, рестрикционный анализ
Уровень экспрессии гена	Количественное изменение экспрессии гена	Обратная транскрипция, ПЦР-РВ
Уровень синтеза белка	Продукция белков в жидкостях	Иммуноферментный анализ
Функциональный уровень	Активация рецепторов, маркеры на поверхности клеток	Эксперименты с лигандами на моделях in vitro и in vivo

Разработка систем ОТ-ПЦР в режиме реального времени для оценки экспрессии генов Toll-подобных рецепторов, противомикробных пептидов, цитокина ФНО и других молекул

Первоочередной задачей исследования являлась разработка систем на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени для определения уровней экспрессии генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного иммунитета при таких патологических состояниях, как урогенитальная инфекция женщин, внутриутробное инфицирование плода, преждевременные роды, кератит, простатит и другие. Помимо этого, были отработаны системы для определения экспрессии генов TLR2, TLR9, BD-2 мыши. Данные системы были созданы для исследования уровней экспрессии генов на модели вирусного кератита и на модели генитального герпеса in vivo. В таблице 2 представлены данные по разработанным системам. Экспериментально были подобраны условия проведения реакции обратной транскрипции, а также концентрации праймеров, зондов, MgCl2 в реакционной смеси и температура отжига праймеров.

Таблица 2.

Условия проведения ПЦР в режиме реального времени для определения уровня экспрессии исследуемых генов.

Система	Концентрации праймеров (пМ/мкл)	Концен-трация зонда (пМ/мкл)	Температура отжига праймеров (оС)	MgCl2 (mM)
	«прямой»	«обратный»
TLR1	4,6	4,0	3,0	64	2,5
TLR2	2,3	3,2	5,0	62	2,5
TLR4	4,7	4,3	2,3	62	2,5
TLR6	4,0	3,9	2,6	64	2,5
TLR9	2,0	2,7	5,0	64	5,0
HNP-1	10	10	7,6	62	5,0
HBD-1	10	10	7,0	62	5,0
HBD-2	10	10	3,6	62	2,5
NF-kB	10	10	7,0	64	2,5
Caspase 3	4,3	4,1	7,0	64	5,0
Caspase 8	3,8	4,0	3,0	64	2,5
FLIP	2,8	3,0	5,0	54	5,0
XIAP	10	10	3,0	60	10,0
ФНО	10	10	5,0	60	2,5
-актин чел.	3,96	3,66	4,0	62	2,5
Mus mus TLR22	4	4	5,0	62	5,0
Mus mus TLR9	4	4	5,0	64	5,0
Mus mus BD-2	4	4	5,0	60	2,5
-актин мыши	4	4	5,0	60	5,0

Оценка экспрессии генов молекул врожденного иммунитета в экспериментальных моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo

С помощью разработанных тест систем проведено изучение экспрессии генов TLRs, дефенсинов и цитокинов в моделях инфекционного процесса, вызванного ВПГ-1, ВПГ-2 и др.

Модели in vitro

В моделях in vitro использовали культуру клеток Vero и культуру клеток цервикального канала HeLa. На основании проведенных исследований установлено, что клетки Vero конститутивно экспрессировали гены TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, TLR9. Наиболее выражена экспрессия генов TLR2, распознающего гликопротеины вирусной оболочки, и TLR9, распознающего неметилированные CpG-богатые повторы ДНК вируса. В культуральной среде не выявлены цитокины с противовирусным действием (ФНО и ИФН). В то же время ТФР и ИЛ-12 определялись в значительных концентрациях (43664 пг/мл и 34827 пг/мл соответственно).

При заражении клеток Vero ВПГ-1 наблюдали значительное увеличение уровня экспрессии гена TLR2 (в 35 раз) по сравнению с неинфицированной культурой. Изменение уровней экспрессии генов эндосомальных рецепторов TLR3 и TLR9 в культуре Vero менее выражено, значения отличались от контрольных показателей (возрастали) не более, чем в 5 раз. При этом следует отметить, что оптимальная доза заражения ВПГ-1 составила 0,000001 ТЦД50/кл. При указанной дозе цитопатическое действие вируса наблюдалось в 12,5 - 25% клеток, экспрессия генов TLR при этом была максимальной. Если цитопатическое действие вируса проявлялось более, чем у 50% клеток монослоя, изменение уровня экспрессии генов TLRs были не столь выражены, что можно объяснить снижением количества клеток, способных экспрессировать исследуемые рецепторы. Достоверных изменений в выработке цитокинов не выявлено. Таким образом, ВПГ-1 активирует экспрессию TLRs. TLR-опосредованная активация синтетических процессов [Liu X., 2008], а также отсутствие синтеза противовирусных цитокинов в клетках Vero приводят к усилению репликации ВПГ-1. Этим объясняется широкое использование культуры Vero в качестве одной из наиболее чувствительных клеточных линий, применяемых для изучения цитопатического действия вирусов [Королюк М.А., 2002].

В культуре эпителиальных клеток цервикального канала линии HeLa был изучен TLR-опосредованный ответ на инфекцию, вызванную вирусом герпеса простого 2 типа. Монослой клеток HeLa обрабатывали вируссодержащей жидкостью (титр ВПГ-2 - 3,5 ТЦД50/0,1мл), было показано, что ВПГ-2 увеличивал экспрессию TLR9 на 3-й час после заражения, к 6-му часу уровень экспрессии возвращалась к исходному показателю. Активация экспрессии NF-kB сохранялась в течение всего периода наблюдения. Максимальная экспрессия гена ФНО была определена на 6-й час после инфицирования. Таким образом, увеличение экспрессии гена ФНО, непосредственно защищающего клетки слизистой от вирусной инфекции, является следствием активации сигнального рецептора TLR9 в клетках HeLa при действии ВПГ-2. Культура клеток HeLa может быть использована для исследования TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета на уровне клеток слизистой.

Одной из задач настоящего исследования являлось сопоставление уровней экспрессии и продукции молекул врожденного иммунитета на примере дефенсина HNP-1 в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых беременных. При исследовании динамики экспрессии гена HNP-1 при стимуляции липополисахаридом было показано, что ЛПС в концентрации 0,1 нг/мл индуцировал экспрессию HNP-1 нейтрофилами на 6 час культивирования, а концентрация ЛПС 0,01 нг/мл не оказывала стимулирующего эффекта. При действии ЛПС в дозе 0,01 нг/мл выработка HNP-1 нейтрофилами беременных с физиологически протекающей беременностью наблюдалась на высоком уровне (не менее 8000 пг/мл) в течение всего периода наблюдения (уже с 3-его часа до 24-х часов). Экспрессия гена этого дефенсина была максимальной на 6-ом часу культивирования. Следовательно, можно предположить, что в течение 6-ти часов наблюдался выброс HNP-1 из гранул, и лишь позже наблюдался его синтез, индуцированный ЛПС.

Таким образом, перспективным является параллельный анализ экспрессии противомикробных пептидов на уровне генов и синтеза белка в клетках периферической крови в связи с поиском критериев прогноза течения инфекционного процесса.

Модель вирусного кератита

Следующей задачей явилось изучение экспрессии генов TLR9 и эффекторной молекулы в-дефенсина-2 (BD-2), обладающего прямым противовирусным действием, в клетках роговицы при герпетическом кератите у мышей линий С57Bl/6 и BALB/c. За основу нами была взята модель вирусного кератита, предложенная Wuesta T. с соавторами, с некоторыми модификациями [Wuesta T., 2006]. Животных каждой линии разделили на три группы. Мышам 1-ой группы в конъюнктивальный мешок после скарификации роговицы стерильной иглой закапывали 3 мкл вируссодержащей жидкости (титр ВПГ-1 равен 105 ЦПД50/0,1мл) (n=10). Мышам 2-ой группы в конъюнктивальный мешок после аналогичной травмы вводили 3 мкл среды RPMI-1640 (n=10). Третья группа включала интактных мышей (n=10). Наблюдение проводилось в динамике в течение 7 дней. Для доказательства развития инфекции в роговице определяли ВПГ-1 с помощью метода nested-ПЦР в режиме реального времени. Для определения уровня экспрессии генов TLR9 и BD-2 методом ПЦР в режиме реального времени на 1-е, 3-и и 7-е сутки после скарификации забирали клетки эпителия роговицы.

Использование модели вирусного кератита позволило выявить существенную разницу в течение вирусного процесса в эпителиальных клетках роговицы мышей исследуемых линий. Мыши линии C57Bl/6 были более чувствительны к инфекции, вызванной ВПГ-1. К 3-м суткам у 90% мышей развивалась вирусная инфекция в роговице, в то время как у мышей линии BALB/c - лишь у 50% животных.

У мышей линии C57Bl/6, инфицированных ВПГ-1, наблюдается достоверное снижение экспрессии гена TLR9 в роговице в течение всех сроков наблюдения относительно группы сравнения (Рис. 1А). В роговице мышей линии BALB/c, инфицированных вирусом, не обнаружено статистически значимых различий по сравнению с интактными животными (Рис. 1Б). Чем обусловлены выявленные межлинейные различия в экспрессии TLR9? Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена TLR9 мышей линий С57Bl/6 и BALB/c в базе данных GeneBank показал наличие единичных нуклеотидных замен, которые приводят к изменению аминокислотной последовательности доменов TLR9. Выявленные различия, по-видимому, играют важную роль в распознавании ДНК вируса рецептором, что в конечном итоге может влиять на течение герпесвирусной инфекции.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Изменение количественных уровней экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы у мышей линии C57Bl/6 (А) и BALB/c (Б).

по оси абсцисс - сроки наблюдения (сутки); по оси ординат - lg(количество копий мРНК гена) относительно 103 копий мРНК -актина мыши.

- зона значений показателя в группе интактных мышей (группа 3).

* - значение достоверно отличается от показателя в группе 2 (скариф.) (p<0,05).

ВПГ-1 может вызывать снижение экспрессии распознающего рецептора TLR9 у мышей линии С57Bl/6, что объясняет их высокую чувствительность к развитию вирусного кератита. Наряду с этим механизмом уклонения от иммунного надзора ВПГ может ингибировать Toll-опосредованный воспалительный ответ [Liu X., 2008]. Согласно этого механизма вирусный белок ICP0, играющий важную роль в переходе ВПГ-1 из латентного состояния в состояние реактивации, блокирует ядерный фактор транскрипции NF-kB через адапторную молекулу TRAF6 сигнального пути TLR9. Это снижение соответственно приводит к супрессии выработки провоспалительных цитокинов, в частности, ФНОб, блокирующего репликацию ВПГ-1 [Wuesta T., 2006]. Уровень экспрессии противомикробного пептида BD-2 в роговице мышей исследуемых линий не изменялся. Полученные данные о разном течении герпетической инфекции у мышей исследуемых линий в большей степени связаны с различиями в экспрессии сигнального рецептора TLR9, а не молекулы противомикробного пептида BD-2.

Проведенные исследования раскрывают новые подходы к оценке роли врожденного иммунитета тканей глаза при герпетической инфекции. Модель вирусного кератита и определение экспрессии распознающего рецептора TLR9, а также эффекторных молекул, позволят оценить возможности применения иммунотропных препаратов в комплексной терапии офтальмогерпеса.

Комплексный анализ изменений показателей врожденного иммунитета у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с урогенитальной инфекцией

Слизистые оболочки урогенитального тракта представляют естественный физиологический барьер. Эпителиальные клетки слизистых контактируют с окружающей средой, первыми реагируют на патогены и включают механизмы врожденного иммунитета.

Таблица 3.

Экспрессия генов TLRs эпителиальными клетками цервикального канала при беременности.

Исследуемая группа	Экспрессия исследуемого гена
	TLR1	TLR2	TLR4	TLR6
Здоровые небеременные женщины	3,811,39 (0,06х105)	4,180,38 (0,15х105)	3,980,49 (0,09х105)	4,720,58 (0,52х105)
Группа женщин с физиологически протекающей беременностью	4,270,97 (0,19х105)	4,970,35 (0,93х105)	4,320,13 (0,21х105)	4,680,49 (0,48х105)
Группа женщин с преждевременными родами (УГИ)	5,990,39* (9,77х105)	6,58±0,95* (38,02х105)	4,71±0,35 (0,51х105)	4,70,26 (0,50х105)
Отношение показателя при патологии к показателю в норме (при физиологически протекающей беременности)**	52,5	40,7	2,4	1,0
Группа женщин с преждевременными родами (ВУИ)	6,180,54* (15,14х105)	6,77±1,08* (58,88х105)	4,87±0,32 (0,74х105)	4,780,23 (0,60х105)
Отношение показателя при патологии к показателю в норме (при физиологически протекающей беременности)**	81,3	63,1	3,5	1,3

* - показатель достоверно отличается от значения в группе женщин с физиологически протекающей беременностью (p0,05).

** - в строке представлено отношение показателей в скобках

В таблице представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах, в скобках даны значения количества копий кДНК относительно 106 копий актина.

В последние годы одной из главных проблем репродуктивного здоровья являются инфекции, передаваемые половым путем, которые связаны с такими осложнениями, как бесплодие, внутриутробное инфицирование и преждевременные роды. В данном разделе представлены результаты сравнительного анализа роли ключевых компонентов системы врожденного иммунитета: распознающих Toll-подобных рецепторов и эффекторных молекул (дефенсинов и цитокинов) у здоровых женщин, у здоровых беременных женщин (1 и 3 триместр) и у беременных с УГИ (Таблица 3).

Эпителиальные клетки цервикального канала небеременных женщин экспрессируют TLRs. В группе беременных женщин в клетках слизистой цервикального канала отмечено увеличение уровней экспрессии генов TLR1 в 2,88 раз, TLR2 в 6,16 раз, TLR4 в 2,19 раз по сравнению со здоровыми небеременными женщинами.

Известно, что в-дефенсина-1 (НBD-1) экспрессируется конститутивно клетками цервикального канала и выполняет важную защитную функцию, оказывая местное противомикробное действие, предотвращая проникновение патогенов. Особое значение приобретает экспрессия НBD-1 при беременности. Нами показано увеличение экспрессии гена HBD-1 в слизистой цервикального канала в 64 раза у беременных в первом триместре по сравнению с небеременными женщинами. К третьему триместру беременности уровень экспрессии гена HBD-1 снижался у женщин с физиологически протекающей беременностью, но остается выше, чем в группе небеременных женщин. Повышение экспрессии генов TLRs и HBD-1 можно объяснить возрастанием роли врожденного иммунитета на уровне слизистой при беременности.

В отличие от -дефенсинов, экспрессируемых эпителиальными клетками слизистой, -дефенсины (HNP1-3) выделяются из азурофильных гранул нейтрофилов при инфекции и определяют в основном развитие системного воспалительного ответа. Показано, что эти катионные пептиды активируют миграцию и фагоцитоз нейтрофилов и макрофагов, увеличивают проницаемость сосудов, секрецию ИЛ-8 клетками эндотелия [Espinoza J., 2003].

Следующий этап исследований включал определение -дефенсинов HNP1-3 в сыворотке периферической крови беременных женщин с нормально протекающей беременностью. При физиологически протекающей беременности концентрация, -дефенсинов в плазме периферической крови возрастают в десятки раз и составляет 6,73,4 нг/мл. Это свидетельствует об активации врожденного иммунитета, а именно функции нейтрофилов, при беременности. Крайне низкий показатель продукции нейтрофильных пептидов в плазме (менее 0,1 нг/мл) в 70% случаев является прогностическим фактором неразвивающейся беременности.

Выявленные изменения исследуемых показателей, по-видимому, можно объяснить тем, что происходящее при беременности снижение активности адаптивного иммунитета компенсируется за счет активации факторов врожденного иммунитета, осуществляющих противомикробную защиту матери и плода [Макаров О.В., 2007].

Урогенитальная инфекция, оставаясь ведущей проблемой акушерства и гинекологии, приводит к различным патологиям беременности, в частности к одной из основных причин невынашивания беременности, внутриутробного инфицирования и других патологий. В данной работе представлены данные по комплексному изучению компонентов врожденного иммунитета (TLRs, противомикробных пептидов, цитокинов и др.) на уровне слизистой оболочки цервикального канала. В структуре урогенитальной инфекции у беременных женщин основной группы преобладали Ureaplasma urealyticum (29,7%), Gardnerella vaginalis (19,5%), Chlamydia trachomatis (11,9%), ВПГ-2 (28,8%), ЦМВ (33,6%). При бактериологическом исследовании рост микрофлоры был выявлен у 39,5% беременных в подгруппе с бактериальной инфекцией, у 27,3% беременных со смешанной инфекцией, при этом результаты достоверно отличаются от данного показателя в контрольной группе (4,6%; p0,05).

Обследовано 90 женщин с УГИ различной этиологии. У 25 беременных женщин с УГИ, беременность закончилась своевременными родами, у 65 женщин развивались преждевременные роды. Новорожденные от 20 матерей этой группы имели локальные и системные проявления ВУИ.

На первом этапе исследованы уровни экспрессии генов TLRs клетками слизистой цервикального канала - TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 в группах здоровых беременных и беременных с преждевременными родами. Результаты исследований представлены в таблице 3. У здоровых беременных женщин наиболее выражена экспрессия гена TLR2, распознающего широкий спектр патогенов. У беременных с преждевременными родами и урогенитальной инфекцией экспрессия генов TLR1, TLR2, TLR4 клетками цервикального канала возрастала в среднем в 52,5, в 40,7 и в 2,4 раза соответственно по сравнению с группой женщин с физиологически протекающей беременностью (Табл. 3). Еще более выраженное увеличение экспрессии TLR1 и TLR2 наблюдалось в группе женщин с реализацией внутриутробной инфекции. Гиперэкспрессия генов TLRs в слизистой у женщин с преждевременными родами инфекционного генеза сопровождалась увеличением выработки провоспалительных цитокинов ИЛ-8 и ИФН. У 70% женщин с прервавшейся беременностью концентрация ИЛ-8 в цервикальной слизи была выше 3000 пг/мл, в группе здроровых беременных этот показатель был ниже 2600 пг/мл. Средние значения ИФН в слизи цервикального канала у женщин с прервавшейся беременностью были достоверно выше, чем в группе женщин с УГИ, родившими в срок и составили 11453,4 пг/мл и 3,81,9 пг/мл соответственно (р 0,05).

Наряду с увеличением выработки провоспалительных цитокинов у беременных женщин с урогенитальной инфекцией снижена экспрессия гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала в 2,5 раза по сравнению со здоровыми беременными. Можно предположить, что развитие урогенитальной инфекции у беременных спровоцировано изначально сниженной выработкой противомикробных пептидов клетками слизистой. Одной из причин этого может быть полиморфизм генов, кодирующих молекулы врожденного иммунитета (TLR, цитокинов, противомикробных пептидов, ферментов и др.) [Milanese M, 2006; Tesse R, 2008]. У женщин, родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования, наблюдалось наиболее выраженное угнетение экспрессии гена НBD-1 в 10 раз и более по сравнению с группой беременных с урогенитальной инфекцией. Согласно полученным результатам, определение недостаточной экспрессии противомикробного пептида HBD-1 является чувствительным тестом, позволяющим выделить группу риска по возникновению осложнений - преждевременных родов, внутриутробной инфекции плода и новорожденного.

...