Молекулярно-генетические механизмы врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек при патологии инфекционного генеза

Оценка роли TLR-опосредованного апоптоза в ткани плаценты при патологии инфекционного генеза у беременных

В настоящее время показано, что клетки плаценты экспрессирует практически все TLRs [Fazeli A., 2005]. Известно, что апоптоз может быть индуцирован активацией TLR4 и TLR2 [Lopez M., 2003; Chan G., 2006]. В связи с этим, нами были изучены уровни экспрессии генов TLR2 и TLR4 в клетках плаценты женщин с преждевременными родами инфекционного генеза и у женщин с урогенитальной инфекцией и срочными родами.

При сопоставлении уровня экспрессии TLR2 клетками плаценты у беременных при урогенитальной инфекции (за исключением женщин со срочными родами) отмечено значительное увеличение уровней экспрессии TLR2 (в 8,51 раз, а при реализации внутриутробной инфекции - в 7,08 раз). Далее нами были исследованы уровни экспрессии генов каспазы-3, каспазы-8 и их ингибиторов (FLIP, XIAP) в клетках плаценты. Наибольшее увеличение числа копий гена каспазы-8 и каспазы-3 наблюдалось в группе беременных с урогенитальной инфекцией и преждевременными родами, при этом количество копий этих генов превышал показатель в группе здоровых в 6 раз (р = 0,03) и в 53,7 раза (р=0,015), соответственно. Достоверного отличия уровня экспрессии гена c-FLIP в исследуемых группах женщин с урогенитальной инфекцией от группы здоровых рожениц выявлено не было (Табл. 4).

Таблица 4.

Экспрессия генов CASP 8, CASP3, XIAP, FLIP в клетках плаценты в исследуемых группах.

Параметр Исследуемая группа	TLR2	TLR4	CASP 8	CASP 3	FLIP	XIAP
Здоровые беременные	6,770,67 (58,88х105)	4,770,49 (0,59х105)	5,560,66 (3,63х105)	5,030,52 (1,07х105)	4,730,60 (0,54х105)	6,190,73 (15,49х105)
Беременные женщины с УГИ и срочными родами	7,090,97 (123,03х105)	4,770,63 (0,59х105)	5,791,16 (6,17х105)	4,79 0,09 (0,62х105)	4,950,50 (0,89х105)	6,320,42 (20,89х105)
Отношение показателя при патологии к показателю в норме**	2,09	1,00	1,70	0,57	1,66	1,35
Беременные женщины с УГИ и преждевременными родами	7,700,55* (501,19х105)	5,030,71 (1,07х105)	6,341,30* (21,88х105)	6,760,74* (57,54х105)	4,630,30 (0,43х105)	5,110,35* (1,29х105)
Отношение показателя при патологии к показателю в норме**	8,51	1,82	6,02	53,70	0,79	0,08
Беременные женщины с ВУИ и преждевременными родами	7,620,65* (416,87х105)	5,250,84 (1,778х105)	6,060,51* (11,48х105)	6,08 1,06 (12,02х105)	4,440,30 (0,27х105)	5,860,59 (7,24х105)
Отношение показателя при патологии к показателю в норме**	7,08	3,02	3,16	11,22	0,51	0,47

* - показатель достоверно отличается от значения в группе женщин с физиологически протекающей беременностью (p0,05).

** - в строке представлено отношение показателей в скобках

В таблице представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах, в скобках даны значения количества копий кДНК относительно 106 копий актина.

Рис. 2. Схема активации апоптоза в клетках плаценты при активации TLRs. (в красные рамки обведены исследуемые нами параметры).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что в плаценте беременных с урогенитальной инфекцией и срочными родами, и беременных с преждевременными родами, белок c-FLIP экспрессируется в физиологических концентрациях. Другим исследуемым ингибитором каскада апоптоза является представитель семейства IAP белок XIAP. Во всех исследуемых группах, за исключением группы женщин с УГИ и срочными родами, уровень экспрессии гена XIAP был снижен (Табл. 4).

Для установления взаимосвязи этих процессов проведен корреляционный анализ экспрессии изучаемых генов в каждой группе. Показана положительная корреляция между уровнями экспрессии каспазы - 8/TLR2 и каспазы - 3/TLR2, при этом коэффициент корреляции составлял 0,72 и 0,60, соответственно. Показана обратная корреляция между экспрессией генов каспаз и их ингибиторами. Эти данные позволяют говорить о том, что в ткани плаценты у здоровых рожениц уровень экспрессии гена CASP 3 ассоциирован с уровнем экспрессии гена CASP 8. Определена обратная корреляция между уровнями экспрессии генов CASP 3 и XIAP, а также CASP 8 и FLIP. Ассоциаций между уровнями экспрессии генов CASP 3 и FLIP и генов CASP 8 и XIAP, а также между генами двух ингибиторов выявлено не было.

На основании наших данных и данных литературы [Koga К., 2009] можно представить следующую схему TLR-опосредованного апоптоза в клетках плаценты (Рис. 2). Активация TLR2 через домен смерти (DD) приводит к последовательной активации инициаторных каспаз (каспаза - 8) и эффекторных каспаз (каспаза - 3). Этот процесс может быть заблокирован белками FLIP и XIAP. При недостаточности ингибиторов апоптоза, клетки плаценты погибают посредством программируемой гибели. TLR4-опосредованная активация макрофагов приводит к выработке ФНО, индуцирующего также апоптоз в клетках плаценты.

Исследование ассоциации полиморфных маркеров в генах Toll-подобных рецепторов и -дефенсина-1 с риском развития патологии инфекционного генеза у беременных женщин

Накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что SNPs за счет наличия различных аллельных вариантов, вносят важный вклад в индивидуальные особенности иммунного ответа. Роль генетических факторов в инфекционной патологии, в том числе в риске развития преждевременных родов инфекционного генеза общепризнанна [Wang Z.C., 2002, Hдrtel Ch., 2004, Goepfert A.R., 2005, Stonek F., 2008].

Одной из задач нашего исследования являлся поиск ассоциации между SNP-маркерами, локализованными в генах TLR2, TLR4, TLR9), и патологическими состояниями при беременности (преждевременные роды, реализация внутриутробной инфекции). Исследуемые SNP находились как в районе гена, кодирующего TIR-домен, так и - LRR-домен Toll-подобного рецептора.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg677Trp гена TLR2 в исследуемых группах беременных женщин обнаружено преобладание частоты аллеля Trp над частотой аллеля Arg и встречаемости генотипа TrpTrp над встречаемостью генотипов TrpArg и ArgArg. Отличия распределения аллелей и генотипов между группами были недостоверны. Другой полиморфный маркер Arg753Gln также локализован в районе TIR-домена TLR2, и по данным литературы этот маркер также ассоциируется с развитием инфекционных процессов. Нами было показано, что риск развития внутриутробного инфицирования плода связан с носительством аллеля Arg (относительный риск - 4,533), в то же время аллель Gln связан с пониженным риском реализации ВУИ (относительный риск - 0,221). Таким образом, можно сделать вывод об ассоциации полиморфного маркера Arg753 с риском реализации ВУИ (Табл. 5). Полученные результаты можно объяснить тем, что замена Gln на Arg в положении 753 приводит к конформационным изменениям в TIR-домене и к нарушению передачи сигнала с TLR2, что сопровождается дисбалансом выработки противомикробных пептидов и цитокинов, следствием чего является активное распространение инфекции, приводящее к инфицированию плода.

В группах беременных женщин с УГИ, преждевременными родами и реализацией ВУИ не выявлено статистически значимых различий частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров Asp299Gly и Thr399Ile гена TLR4. Возможно другие полиморфные маркеры в генах сигнальных рецепторов врожденного иммунитета, могут быть ассоциированы с риском развития преждевременных родов или реализацией внутриутробной инфекции.

Одним из таких генов - кандидатов является ген TLR9. Для изучения ассоциаций с инфекционными патологиями при беременности нами был выбран полиморфный маркер A2848G, локализованный в районе TIR-домена Toll-подобного рецептора 9. Распределение частот аллелей в группе с преждевременными родами составило 0,58 (аллель G) и 0,42 (аллель A), со срочными родами - 0,44 (аллель G) и 0,56 (аллель A) (Таблица 6). Сравнительный анализ выявил достоверные различия частот аллелей и генотипов полиморфного маркера A2848G гена TLR9; аллель А и генотип АА являлись «протективными» в случае преждевременных родов инфекционного генеза.

Таблица 5.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg753Gln в гене TLR2 в исследуемых клинических группах.

Исследуемая группа	Частота аллеля	Относительный риск**	р**
	Arg	Gln	Arg	Gln
Здоровые беременные	0,49	0,51	-	-	-
Беременные женщины с УГИ	0,47	0,53	1,43	0,70	0,147
Берем. женщины с УГИ и сроч.родами	0,49	0,51	1,51	0,66	0,149
Беременные с УГИ и прежд. родами	0,46	0,54	1,34	0,75	0,153
Беременные с ВУИ и прежд. родами	0,74*	0,26*	4,53*	0,22*	0,011*
Исследуемая группа	Частота генотипа	Относительный риск**
	Arg/Arg	Arg/ Gln	Gln / Gln	Arg/Arg	Arg/ Gln	Gln / Gln
Здоровые беременные	0,38	0,22	0,40	-	-	-
Беременные женщины с УГИ	0,34	0,26	0,40	0,84	1,25	1,00
Берем. женщины с УГИ и сроч.родами	0,34	0,30	0,36	0,84	1,52	0,84
Беременные с УГИ и прежд. родами	0,36	0,20	0,44	0,92	0,89	1,18
Беременные с ВУИ и прежд. родами	0,52	0,44*	0,04*	1,77	2,79*	0,06*

* - значение достоверно отличается от показателя в норме (р0,05),

** - относительный риск и р были посчитаны относительно контрольной группы.

Другой аллель А полиморфного маркера A2848G гена TLR9 ассоциирован со срочными родами при урогенитальной инфекции (относительный риск - 2,030). Следует отметить, что реализации внутриутробного инфицирования плода при этом не происходило. Таким образом, полиморфный маркер A2848 можно расценивать в качестве «протективного».

Таблица 6.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера A2848G в гене TLR9 в исследуемых клинических группах.

Исследуемая группа	Частота аллеля	Относительный риск**	р**
	G	A	G	A
Здоровые беременные	0,61	0,39	-	-	-
Беременные женщины с УГИ	0,50	0,50	0,64	1,57	0,10
Беременные женщины с УГИ и сроч.родами	0,44*	0,56*	0,49*	2,03*	0,05*
Беременные с УГИ и прежд. родами	0,58	0,42	0,88	1,13	0,16
Беременные с ВУИ и прежд. родами	0,62	0,38	1,04	0,96	0,20
Исследуемая группа	Частота генотипа	Относительный риск**
	G/G	G/A	A/A	G/G	G/A	A/A
Здоровые беременные	0,53	0,17	0,30	-	-	-
Беременные женщины с УГИ	0,32*	0,35*	0,33	0,42*	2,63*	1,15
Беременные женщины с УГИ и сроч. родами	0,26*	0,36*	0,38	0,31*	2,82*	1,41
Беременные с УГИ и прежд. родами	0,44	0,28	0,28	0,70	1,90	0,91
Беременные с ВУИ и прежд. родами	0,52	0,20	0,28	0,94	1,28	0,89

* - значение достоверно отличается от показателя в норме (р0,05),

** - относительный риск и р были посчитаны относительно контрольной группы.

Помимо SNP, локализованных в генах TLRs, нами были выбраны полиморфные маркеры G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A, расположенные в нетранслируемой области гена DEFB1. Предположительно данные SNPs могут влиять на уровень экспрессии гена дефенсина. При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-20)A в исследуемых группах носили недостоверный характер. Впрочем, следует отметить, что частота аллелей в группах беременных с УГИ и в контрольной группе составили: аллель G - 0,48 и 0,61, а аллель A - 0,52 и 0,39, соответственно. При этом урогенитальная инфекция у беременных женщин (как со срочными родами, так и с преждевременными родами) была ассоциирована с генотипом G/G. Различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного маркера C(-44)G между исследуемыми группами были статистически недостоверными. Анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-52)A в исследуемых группах выявил, что частоты аллелей данного маркера в группе беременных женщин с УГИ и с преждевременными родами, в группе беременных женщин с реализацией ВУИ и в контрольной группе были следующими: аллель G - 0,88, 0,91 и 0,67, аллель А - 0,12, 0,09 и 0,33, соответственно. Риск развития преждевременных родов оказался связан с носителем аллеля G и генотипа G/G.

Нами было показано, что гаплотипы G(-20)С(-44), G(-20)A(-52) и C(-44)G(-52) ассоциированы со сниженным риском развития урогенитальной инфекцией при беременности (как у женщин со срочными родами, так и у женщин с преждевременными родами). Следует отметить, что гаплотип А(-20)G(-52) связан с развитием преждевременных родов (OR=2,012). Наиболее четкие результаты получены при исследовании ассоциации гаплотипов всех трех полиморфных маркеров с патологией беременности. Нами были выделены два основных гаплотипа А(-20)G(-44)G(-52) и G(-20)C(-44)A(-52).

Первый гаплотип ассоциирован с развитием урогенитальной инфекции у беременных женщин (с преждевременными родами и внутриутробным инфицированием плода). При этом относительный риск составляет 6,14, 6,36 и 8,833, соответственно. У женщин с гаплотипом G(-20)C(-44)A(-52) урогенитальная инфекция и патология, связанная с ней (преждевременные роды, внутриутробное инфицирование плода), развиваются значительно реже, таким образом, вышеуказанный гаплотип можно считать «протективным».

Анализ ассоциации полиморфизма в нетранслируемой области DEFB1 с уровнем экспрессии -дефенсина 1 показал, что аллель A(-20) ассоциирован с увеличением уровня экспрессии дефенсина в клетках цервикального канала. Так, частоты аллеля А(-20) в группе беременных женщин с повышенным уровнем экспрессии дефенсина и с низким - составляли 0,58 и 0,22, соответственно. Генотип GG(-52) также коррелировал с повышенной экспрессией дефенсина, частота данного генотипа составила 0,71 при повышенной экспрессии и 0,25 - при низкой. Другой генотип - GА(-52), был ассоциирован с пониженной экспрессией. Другие аллели и генотипы (полиморфных маркеров G(-20)A, C(-44)G, G(-52)A) не были ассоциированы с изменениями уровня экспрессии HBD-1 в исследуемой нами группе.

Роль TLRs, противомикробных пептидов и цитокинов слизистой уретры в патогенезе хронического простатита

Эпителиальные клетки уретры и простаты выступают в роли ранних сенсоров инфекции [Gatti G., 2006]. В настоящее время появляются первые работы о роли TLRs в активации механизмов воспаления в клетках эпителия уретры и простаты. Нами было проведено изучение уровня экспрессии генов TLR2, TLR4 и TLR9 в клетках слизистой уретры больных хроническим простатитом (Табл. 7). У всех больных хроническим бактериальным и абактериальным простатитом уровень TLR2 был снижен в 13,49 и 18,20 раз, соответственно, относительно показателя в группе здоровых добровольцев. Выраженное снижение уровня экспрессии гена TLR2 наблюдалось у больных хроническим бактериальным простатитом с инфекцией, вызванной энтерококком или гемолитическим стрептококком. Схожая картина наблюдалась у больных с хроническим абактериальным простатитом, у которых был выявлен гемолитический стрептококк или энтерококк в комплексе с уреоплазмой или гарденерелезом. Достоверно значимого отличия уровней экспрессии генов TLR4 и TLR9 в клетках слизистой уретры больных ХП и здоровых добровольцев выявлено не было. Полученные данные можно объяснить тем, что TLR2 распознает широкий спектр лигандов патогенов и включает механизмы, направленные на их элиминацию из организма. Можно предположить, что энтерококки и другие бактерии вызывают снижение экспрессии TLR2, что является одним из возможных механизмов «ускользания» инфекции от надзора иммунной системы.

В группе пациентов с бактериальным простатитом наблюдалось достоверное снижение в 4,78 раз экспрессии гена HBD-1, также отмечалась тенденция к снижению этого показателя в группе с абактериальном простатитом.

Таблица 7

Уровни экспрессии и процент выявления генов TLR2, TLR4, TLR9 в клетках слизистой уретры больных хроническим простатитом и здоровых добровольцев

Параметр Исследуемая группа	Количество пациентов (%)	TLR2	TLR4	TLR9
Здоровые добровольцы	100	6,61±0,38 (40,74х105)	4,59±0,22 (0,39х105)	2,25±0,86 (0,002х105)
Больные с хроническим бактериальным простатитом	60	5,48±0,36* (3,02х105)	4,51±0,21 (0,32х105)	3,93±2,26 (0,08х105)
	40	6,39±0,15 (24,55х105)
Отношение показателя в норме к показателю при патологии **	60	13,49	1,20	0,02
	40	1,66
Больные с хроническим абактериальным простатитом	50	5,35±0,31* (2,24х105)	4,25±0,29 (0,18х105)	2,67±0,34 (0,005х105)
	50	6,79±0,18 (61,66х105)
Отношение показателя в норме к показателю при патологии **	50	18,20	2,19	0,38
	50	0,66

* - показатель достоверно отличается от контрольного значения (p0,05),

** - в строке представлено отношение показателей в скобках

В таблице представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах, в скобках даны значения количества копий кДНК относительно 106 копий актина.

Анализ цитокинов в семенной плазме показал повышение уровня ИЛ-6 у больных хроническим простатитом. В 43-85% случаев в семенной плазме определялись высокие уровни ИЛ-6 по сравнению со здоровыми добровольцами. В тоже время, уровень продукции противовоспалительного цитокина ИЛ-10 был снижен. Таким образом, повышенная концентрация ИЛ-6 в семенной плазме может быть использована в диагностике воспаления в простате у больных хроническим простатитом.

Полученные результаты показали, что в качестве прогностических критериев течения хронического простатита можно выделить сниженный уровень экспрессии гена TLR2 в клетках слизистой уретры и повышение продукции цитокина ИЛ-6 в семенной плазме. Снижение уровня экспрессии TLRs в клетках слизистой уретры и изменение цитокинового профиля семенной плазмы могут служить показанием к локальному и системному применению иммунотропных препаратов в комплексной терапии хронического простатита, которые позволят восстановить баланс факторов врожденного иммунитета, следствием чего будет улучшение качества лечения данной категории больных [Мазо, 2006].

Изменение уровня экспрессии генов TLR9 и HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы детей с герпетическим древовидным кератитом

На следующем этапе работы перед нами стояла задача изучить, как изменяются уровни экспрессии генов TLR9 и HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы детей с диагнозом герпетический древовидный кератит. У детей с герпетическим кератитом стерильно брали мазок с конъюнктивы и роговицы в зоне поражения двукратно - до лечения и через 7 дней после лечения.

Можно отметить, что у детей с древовидным кератитом наблюдалось достоверное увеличение экспрессии гена TLR9 в 17 раз и более (p0,05) по сравнению с показателем в группе здоровых детей. При действии вирусной инфекции также была выявлена тенденция к увеличению уровня экспрессии гена HBD-2 (Рис. 3).

Включение в комплексное лечение иммунотропного препарата Суперлимф вызывало нормализацию экспрессии гена TLR9 (3,7±0,56 lg). Полученные данные могут свидетельствовать об иммуномодулирующем действии Суперлимфа на уровне экспрессии гена TLR9 при вирусном кератите. Достоверных отличий в экспрессии гена HBD-2 в процессе лечения не установлено.



Рис. 3. Количественные уровни экспрессии генов TLR9 и HBD2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы здоровых детей, детей с герпесвирусным кератитом до и после лечения.

по оси абсцисс - клинические группы,

по оси ординат - lg(количество кДНК TLR9 или HBD-2) относительно в-актина,

* - показатель в исследуемой группе достоверно отличается от уровня показателя в контроле (р< 0,05),

** - показатель в исследуемой группе достоверно отличается от уровня показателя в группе с герпетическим древовидным кератитом после традиционного лечения (р< 0,05).

При применении цитокинотерапии Суперлимфом купирование отека роговицы произошло на 4,80,4 сутки, тогда как в контрольной группе - на 7,10,2 сутки. Полная эпителизация при комбинированной терапии произошла на 7,40,4 сутки, тогда как в контрольной группе - на 4 дня позже.

Полученные данные будут в дальнейшем использованы для разработки новых лекарственных средств на основе противомикробных пептидов, которые обладают не только прямым противовирусным и антибактериальным действием, но также участвуют в реакциях врожденного иммунитета и в процессе репарации. Новейшие технологии помогут значительно снизить процент послеоперационных осложнений при лечении патологических состояний глаз различных возрастных группах.

На основании полученных данных и данных литературы можно представить следующие маркеры развития преждевременных родов, реализации внутриутробного инфицирования и развития хронического простатита (Рис. 4).

Рис. 4. Маркеры развития преждевременных родов (а), внутриутробного инфицирования (б) и хронического простатита (в) * - данные литературы

Рис. 5. Роль TLR-опосредованных механизмов в развитии патологических состояний.

Обобщая полученные нами данные по исследованию системы TLR при различных патологических состояниях можно предложить следующую схему участия TLR-опосредованных механизмов в развитии патологии (Рис. 5).

В случае распознавания патогена Toll-подобными рецепторами включаются механизмы врожденного иммунитета, направленные на его элиминацию. Гиперэкспрессия TLRs не безопасна для организма, т.к. приводит к повышенной выработке провоспалительных цитокинов, оксида азота, вызывающих патологическое повреждение тканей. Так гиперэкспрессия TLR2 в клетках слизистой цервикального канала и плаценте приводят к преждевременным родам и внутриутробному инфицированию плода, гиперэкспрессия TLR9 в роговице при вирусном кератите вызывает глубокие повреждения в ткани роговицы, вызывающие снижение зрения. Ингибирование TLR-опосредованных механизмов, обусловленное снижением экспрессии генов этих рецепторов под действием патогенов, или полиморфизмом в генах рецепторов, сигнальных и эффекторных молекул, приводит к развитию хронических воспаления.

Новый взгляд на механизмы врожденного иммунитета и, в первую очередь, на систему распознающих рецепторов, противомикробных пептидов, открывает совершенно иные подходы к диагностике и лечению воспалительных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии. Представленный подход дает возможность создать комплекс диагностических и прогностических критериев. Разработка и внедрение в клиническую практику тестов для определения экспрессии генов TLR, цитокинов и противомикробных пептидов в качестве прогностических и диагностических критериев у больных с различными инфекционными патологиями. Индивидуальный подход к лечению инфекционных заболеваний, а также новые инновационные технологии (основанные на применении агонистов TLRs, растворимых рецепторов TLRs, микроРНК) позволят повысить эффективность терапии.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР-РВ для количественного определения экспрессии генов Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНО) и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP).

2. Впервые в качестве модели in vitro для изучения действия на экспрессию факторов врожденного иммунитета (Toll-подобных рецепторов, противомикробных пептидов, цитокинов) при воздействии различных лигандов TLRs использованы культуры клеток Vero и HeLa.

3. На модели герпетического кератита установлено, что вирус-индуцированная экспрессия Toll-подобного рецептора 9 связана с межлинейными различиями в строении гена TLR9 у мышей линий C57Bl/6 и BALB/c.

4. Установлено, что при беременности происходит активация факторов врожденного иммунитета, которая выражается в повышении уровня экспрессии генов TLR1, TLR2, TLR4 и дефенсина HBD-1 (в эпителиальных клетках цервикального канала), что свидетельствует об активации факторов врожденного иммунитета для обеспечения защиты организма матери и плода от патогенных микроорганизмов на уровне слизистых оболочек.

5. Выявлены диагностические критерии неразвивающейся беременности у женщин с гиперандрогенией. Показано, что при неразвивающейся беременности происходит снижение экспрессии гена TLR2 клетками цервикального канала и уменьшение продукции HNP1-3 в плазме периферической крови.

6. Впервые выявлены иммунологические маркеры, свидетельствующие о возможности развития преждевременных родов и внутриутробного инфицирования плода. Установлен дисбаланс в системе врожденного иммунитета, который выражается в гиперэкспрессии генов TLR1, TLR2, TLR4 и угнетении экспрессии гена НBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала. Увеличение экспрессии гена TLR2 более, чем в пять раз и снижение HBD-1 (клетками эпителия цервикального канала) можно рассматривать как показатели риска развития преждевременных родов.

7. Обоснована концепция TLR2-опосредованной активации апоптоза клеток плаценты, как возможного механизма развития преждевременных родов инфекционного генеза. Выявлена положительная корреляция экспрессии генов TLR2, каспазы 3 и каспазы 8 в плаценте женщин с преждевременными родами.

8. Выявлена ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в генах TLR2 (Arg753Gln), TLR9 (2848G/A) и DEFB-1 (G(-20)A и G(-52)A), с риском развития внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов и со срочными родами.

9. Установлена ассоциация между уровнями экспрессии гена HBD-1 и полиморфными маркерами G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A в нетранслируемой области гена DEFB1. Показано, что аллель A(-20) и генотип GG (-52) ассоциированы с увеличением уровня экспрессии дефенсина, а генотип GА (-52) - ассоциирован с пониженной экспрессией -дефенсина клетками цервикального канала.

10. Установлено, что снижение уровня экспрессии гена TLR2 клетках слизистой уретры и увеличение концентрации цитокина ИЛ-6 в семенной плазме могут служить прогностическими критериями течения хронического простатита, вызванного энтерококком или гемолитическим стрептококком.

11. Обосновано применение комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарата Суперлимф) в комбинированной терапии герпетического древовидного кератита у детей. Отмечена нормализация экспрессии гена TLR9 в клетках роговицы, повышение эффективности проводимой комплексной терапии и снижение числа осложнений при герпетической патологии.

12. Разработан подход к оценке TLR-опосредованных реакций системы врожденного иммунитета слизистых оболочек, основанный на поэтапном исследовании Toll-подобных рецепторов, адапторных и эффекторных молекул (цитокинов и противомикробных пептидов) на уровне полиморфизма гена, уровне экспрессии мРНК, уровне белка и уровне функционирования эффекторных молекул.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковальчук Л.В. Противовирусное действие препарата суперлимф и его фракции, содержащей противомикробные пептиды. / Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич О.А.*, Эбралидзе Л.К. // Тезисы докл. XI Нац. Конгресс «Человек и лекарство XI». - Москва - 2004. - С. 445.

2. Ковальчук Л.В. Опыт клинического применения комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов. / Ганковская Л.В., Долгина Е.Н., Аведова Т.А., Вирясов А.В., Баркевич О.А.* // Аллергология и иммунология. - 2004. - т.5. - №1. - С.43.

3. Ковальчук Л.В. Противогерпетический эффект комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов. / Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич О.А.*, Лотте В.Д. // Медицинская Иммунология. - 2004. - т.6. - №3-5. - С. 234.

4. Ганковская Л.В. Некоторые механизмы противогерпетического действия иммуномодулирующего препарата «Суперлимф». / Ковальчук Л. В., Лавров В.Ф., Лотте В.Д., Баркевич О.А.*, Долгина Е.Н. // Биопрепараты. - 2004. - № 4(16). - С. 18-22.

5. Ковальчук Л.В. Суперлимф - новый иммуномодулятор с прямым и опосредованным противогерпетическим действием. / Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Лотте В.Д., Баркевич О.А.* // Тезисы докл. XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство». - Москва - 2005. - С. 671.

6. Gankovskaya L.V. Mechanisms of antiviral innate immunity, approaches to immunotherapy. / Lavrov V.F., Barkevich O.A.* // J. of the association of pediatric allergitis and immunologists of Russia. - 2005. - v.6. - sup.1. - P.103.

7. Ганковской Л.В. Механизмы противогерпетического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов. / Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Лотте В.Д., Баркевич О.А.* // Иммунология Урала. - 2005. - №1(4). - С. 123-124.

8. Ковальчук Л.В. Подавление цитопатического действия вируса герпеса простого 1 типа комплексом природных цитокинов (препаратом Суперлимф) in vitro. / Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Эбралидзе Л.К., Баркевич О.А.* // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2005. - № 1. - С.57-60.

9. Ковальчук Л.В. Изучение механизмов противогерпетического действия препарата Суперлимф. / Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Лотте В.Д., Эбралидзе Л.К., Баркевич О.А.* // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней, сборник научных трудов (выпуск 7). - М. - 2005. - С. 237-24.

10. Ковальчук Л.В. Суперлимф - новый иммуномодулятор с прямым противовирусным действием. Опыт клинического применения в комплексном лечении герпетической инфекции. / Ганковская Л.В., Юдина С.М., Лавров В.Ф., Баркевич О.А.* // Российский иммунологический журнал. - 2005. - v.9. - sup. 2. - P.37-42.

11. Ганковская О.А. Экспрессия Toll-подобных рецепторов у беременных женщин больных генитальным герпесом. / Романовская В.В., Сомова О.Ю. // Тезисы докладов Международной конференции «Генетика в России и в мире». - Москва - 2006. - С.43.

12. Макаров О.В. Экспрессия TLR-4 клетками цервикального канала у беременных женщин при урогенитальной инфекции. / Ковальчук Л.В. Бахарева И.В., Ганковская О.А., Романовская В.В.// Вопросы практической педиатрии. - 2006. - т.1. - №4. - С.37.

13. Ганковская Л.В. Повышение выработки цитокинов (ИЛ-12, ФНО) и экспрессии гена TLR-9 мононуклеарными клетками беременных с урогенитальной инфекцией вирусного генеза. / Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская О.А., Гришук А.Ю. // Сб. тезисов докл. Всеросийской научно-практической конф. «Вакцинология 2006. Совершенств. Иммунобиол. средств профилактики, диагн. и лечения инфекц. болезней». - Москва - 2006. - С.33.

14. Ковальчук Л.В. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета (TOLL-подобные рецепторы) при урогенитальной инфекции у беременных. / Макаров О.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская Л.В., Ганковская О.А. // Сборник тезисов докладов V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии». - Оренбург - 2006. - С.47.

15. Ковальчук Л.В. Экспрессия TLR-4 клетками цервикального канала у беременных женщин при урогенитальной инфекции. / Бахарева И.В., Ганковская О.А. // Аллергология и иммунология в педиатрии. - 2006. - №2-3(9). - С. 74.

16. Ганковская Л.В. Экспрессия TLR-9 и выработка цитокинов мононуклеарными клетками больных генитальным герпесом. / Лавров В.Ф., Ганковская О.А. // Медицинская иммунология. - 2006. - т.8. - №2-3. - С. 255-256.

17. Лавров В.Ф. Индукция экспрессии TLR-9 мононуклеарными клетками больных генитальным герпесом. / Ковальчук Л.В., Ганковская О.А. // Российский иммунологический журнал. - 2006. - v.9. - sup.3. - P. 158.

18. Лавров В.Ф. Естественный иммунитет и герпетическая инфекция. / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Баркевич О.А.*, Кузин С.Н.// Вопросы вирусологии. - 2006. - №3. - С. 4-9.

19. Ганковская Л.В. Механизмы врожденного иммунитета к вирусу герпеса простого. / Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская О.А. // Аллергология и иммунология. - 2006. - 3. - С. 460-465.

20. Лавров В.Ф. Профилактика рецидивов герпетической инфекции с помощью комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (экспериментальное исследование). / Ганковская Л.В., Ганковская О.А. // Сборник научных трудов (выпуск 8) Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. - М. - 2006. - С.441-446.

21. Ганковская О.А. Анализ выработки цитокинов у беременных женщин с вирусной инфекцией. / Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Гришук А.Ю., Зверев В.В. // Биотехнология. - 2007. - С. 101.

22. Макаров О.В. Роль врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. / Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Тезисы докладов First International Seminar “Infections in Obstetris and Perinatology”. - Москва - 2007. - С.94.

23. Ганковская Л.В. Роль Toll-подобных рецепторов при патологии беременности. / Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Медицинская иммунология. - 2007. - т.9. - №2-3. - С.256-257.

24. Gankovskaya O.A. Herpes viral infection induces the expression of Toll-like receptors, pro-inflammatory сytokines and human b-defensin-1 in cervical epithelial cells. / Lavrov V.F., Koval'chuk L.V., Gankovskaya L.V., Bahareva I.V., Zverev V.V. // Acta Biochimica Polonica. - 2007. - v. 54. - sup 2. - P.45-46.

25. Ганковская Л.В. Экспрессия генов Toll-подобного рецептора-2 и -дефензина -1 человека при урогенитальной инфекции беременных. / Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. // РАЖ. - 2007. - №3. - С.261-262.

26. Макаров О.В. Toll-подобные рецепторы в инициации невынашивания беременности. / Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Вопросы практической педиатрии. - 2007. - т.2. - №5. - С.26.

27. Макаров О.В. Показатели врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза. / Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Материалы IХ Всероссийского научного форума "Мать и дитя". - Москва - 2007. - С.150 - 151.

28. Gankovskaya O.A. TLR and antimicrobial peptide genes expression during prenatal infection. / Romanovskaya V.V., Kusnecov P.A., Fenzeleva V.A., Kartashov D.D. // Тезисы докладов на «Conference for young scientists, PhD students and students n molecular biology and genetics». - Киев - 2007. - P. 165.

29. Gankovskaya O.A. Analyze of TLR genes expression and cytokines production during prenatal herpes virus infection. / Koval'chuk L.V., Lavrov V.F. // Тезисы докладов на 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology: Immunology and viral infection. - 2007. - P.16.

30. Макаров О.В. Toll-подобные рецепторы как маркеры осложнений беременности. / Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Аллергология и иммунология. - 2007. - т.8, №3. - С.236.

31. Ганковская Л.В. Вирус герпеса простого и Toll-подобные рецепторыю. / Ганковская О.А., Ковальчук Л.В. // Тезисы докладов на VI конференци иммунологов Урала. - Ижевск - 2007. - С.7-8.

32. Ганковская Л.В. Оценка уровней цитокинов у беременных женщин с вирусной инфекцией. / Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Гришук А.Ю., Gankovskaya O.A., Макаров О.В. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2007. - т.6. - №2. - С. 11-13.

33. Koval'chuk L.V. Herpes simplex virus: treatment with antimicrobial peptides. / Gankovskaya L.V., Gankovskaya O.A. Lavrov V.F. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2007. - 601. - P.369-76.

34. Козырева О.В. Опыт применения суперлимфа в лечении герпесвирусной инфекции. / Матушевская Е.В., Баркевич О.А.*, Ковальчук Л.В. // Клиническая дерматология и венерология. - 2007. - №1. - С.16-19.

35. Макаров О.В. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет. / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2007. - 172 С.

36. Gankovskaya O.A. Antiviral effects of complex of native cytokines and cationic antimicrobial peptides. // Allergy. - 2008. - sup.88. - v. 3. - P.200.

37. Gankovskaya O.A. A new role of receptors of innate immunity (TLR) in infection-associated preterm birth. / Koval'chuk L., Gankovskaya L., Makarov O. // Тез. докл.European congress of Reproductive immunology. - 2008.

38. Ганковская О.А. Изучение in vitro роли факторов врожденного иммунитета в защите от инфекции, вызванной Candida albicans. / Блинкова Л.П., Лавров В.Ф. // Тезисы докладов на втором съезде микологов России «Современная микология в России». - 2008. - С.485-486.

39. Ковальчук Л.В. Создание и введение в клиническую практику нового иммунотропного препарата на основе комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов. / Ганковская Л.В., Долгина Е.Н., Василенкова Л.В., Образцова Е.Н., Пчеленок С.В., Вирясов А.В., Аведова Т.А., Ганковская О.А. // Сборник тезисов Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - 2008. - С.55.

40. Ганковская Л.В. Новые механизмы TLR - опосредованной активации врожденного иммунитета в патологии беременности инфекционного генеза. / Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А., Карташов Д.Д., Акимова Е.А., Скрипник В.В. // Сборник тезисов Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - 2008. - С.30.

41. Лавров В.Ф. Изучение экспрессии генов Toll-подобных рецепторов и цитокинов при инфекции, вызванной Candida albicans in vitro. / Блинкова Л.П., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - т.2(11). - №2-3. - С.148.

42. Ганковская О.А. Анализ уровней экспрессии генов TLR9-сигнального пути при герпесвирусной инфекции во время беременности. / Сомова О.Ю., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - т.2(11). - №2-3. - С.286.

43. Ганковская Л.В. Анализ уровня экспрессии генов каспазы 3 и каспазы 8 в плаценте при преждевременных родах. / Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Акимова Е.А., Романовская В.В. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - т.2(11). - №2-3. - С.286.

44. Мазо Е.Б. Изменение показателей врожденного иммунитета у больных хроническим бактериальным простатитом и хроническим абактериальным простатитом/синдром хронической тазовой боли с наличием урогенитальной инфекции. / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Вирясов А.В., Ганковская О.А., Суренков Д.Н. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - т.2(11). - №2-3. - С.150-151.

45. Ганковская О.А. Изучение экспрессии генов сигнальных рецепторов врожденного иммунитета (TLR) и противомикробных пептидов в клетках слизистой при урогенитальной инфекции. / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В. // Тезисы докладов на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - 2008. - С. 238.

46. Ганковская О.А. Роль Toll-подобных рецепторов и дефенсинов в противомикробной защите урогенитального тракта женщин. / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Романовская В.В., Карташов Д.Д., Фензелева В.А.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - 1. - С.46-50.

47. Ганковская Л.В. Экспрессия противомикробных пептидов клетками слизистой цервикального канала и нейтрофилами периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией. / Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Лавров В.Ф., Ганковская О.А., Карташов Д.Д., Кузнецов П.А. // Вестник РГМУ. - 2008. - №5. - С. 26-29.

48. Макаров О.В. Toll-подобные рецепторы в генезе невынашивания беременности. / Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Акушерство и гинекология. - 2008. - №2. - С. 22-28.

49. Мазо Е.Б. Изменение показателей цитокинов и Toll- рецепторов у больных хроническим бактериальным простатитом и хроническим абактериальным простатитом/ синдромом хронической тазовой боли воспалительного характера с наличием внутриклеточной инфекции. / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Вирясов А.В., Ганковская О.А., Суренков Д.Н.// Фарматека: медицинский журнал. - 2008. - N 16. - С. 68-71.

50. Патент на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». Патентообладатели: Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Официальный Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.09.2008 г.

51. Ганковская О.А. Ассоциация полиморфизма гена сигнального рецептора врожденного иммунитета TLR9 с преждевременными родами инфекционного генеза. / Ганковская Л.В., Макаров О.В., Лавров В.Ф., Зверев В.В. // Медицинская иммунология. - 2009. - т.11. - №4-5. - С.406.

52. Ганковская Л.В. Анализ противомикробных пептидов человека в биологических жидкостях. / Карташов Д.Д., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А. // Тез. докл. X Междун. конгр. «Соврем. пробл. аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. - Казань - 2009. - С.354.

53. Ганковская Л.В. Исследование экспрессии генов TLR9 и BD-2 в клетках роговицы на модели вирусного кератита у мышей. / Черешнева М.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А. // Тезисы докладов на Научно-практической конференции с международным участием Российский общенац. офтальмологич. Форум. - Москва - 2009.

54. Ганковская О.А. Исследование экспрессии генов TLR9, NF-kB, ФНОб в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной инфекцией. / Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Сомова О.Ю., Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - 2. - С.61-65.

55. Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы, распознающие лиганды вируса герпеса. / Ганковская Л.В., Сомова О.Ю., Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - 2. - С.108-111.

56. Ганковская О.А. Изменение уровня экспрессии сигнальных рецепторов врожденного иммунитета при инфекции, вызванной Candida albicans in vitro и in vivo. / Зверев В.В., Лавров В.Ф., Блинкова Л.П., Ганковская Л.В., Кузнецов П.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - 3. - С.60-64.

57. Еричев В.П. Интерлейкин-17 и его возможное участие в репаративных процессах при глаукоме. / Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Дугина А.Е., Ганковская О.А. // Глаукома. - 2009. - 1. - C. 23-26.

58. Макаров О.В. Прогностическое значение компонентов врожденного иммунитета у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции. / Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. // Вестник РГМУ. - 2009. - №4. - C. 27-33.

59. Ганковская Л.В. Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности. / Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Романовская В.В., Ганковская О.А., Карташов Д.Д., Макаров О.В. // Вестник РГМУ. - 2009. - №4. - C. 34-37.

60. Лавров В.Ф. Перспективная модель для тестирования функций Toll-подобных рецепторов in vitro. / Ганковская О.А., Кривцов Г.Г., Парфенова Т.М., Попова В.С., Парастаев С.А., Витвицкий В.Н., Зверев В.В. // Ж. физиология и патология иммунной системы. - 2009. - т.13. - №12. - С.3-6.

61. Макаров О.В. Развитие преждевременных родов сопровождается снижением экспрессии гена В дефенсина 1 клетками слизистой цервикального канала. / Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская Л.В., Ганковская О.А. // Сборник Материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва - 2010. - С.176.

62. Воробьева Ю.А. Анализ экспрессии генов TLR9 и В-дефенсина-2 (HBD-2) в эпителиальных клетках конъюнктивы глаза больных вирусным кератитом, обоснование применения иммунотропной терапии. / Ганковская О.А., Бадинова Н.С. // Сборник Материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва - 2010. - С.395.

63. Ганковская О.А. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов TLR2 и TLR9 с преждевременными родами и внутриутробным инфицированием. // Медицинская иммунология. - 2010. - Т.12. - № 1-2. - С. 87-94.

64. Ганковская Л.В. Роль экспрессии генов Toll-подобного рецептора 2, каспаз и их ингибиторов в ткани плаценты в норме и при преждевременных родах инфекционного генеза. / Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская О.А., Акимова Е.А. // Российский иммунологический журнал. - 2010. - 4(13). - № 1. - С. 48-53.

65. Еричев В.П. Изменение некоторых иммунологических показателей слезной жидкости при избыточном рубцевании у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой после антиглаукомных операций. / Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Дугина А.Е., Ганковская О.А. // Вестник Офтальмологии - 2010. - 2. - С. 19-22.

66. Ганковская О.А. Взаимодействие вирусов и Toll-подобных рецепторов. / Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - 2. - С. 101-5.

67. Ковальчук Л.В. Иммунология. Практикум. / Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Сеславина Л.С., Соколова Е.В., Ганковская О.А., Никонова А.С., Левченко В.А. // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2010. - 174 С.

68. Положительное решение о выдачи патента на изобретение (Заявка №2009108294/15(011092), дата подачи заявки 10.03.2009)

* - Баркевич О.А. = Ганковская О.А.

Размещено на Allbest.ru

...