Патогенетические механизмы алкогольной и опийной зависимости как основа ее объективной диагностики и контроля лечения

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы. Формирование алкогольной и наркотической зависимости, абстинентного синдрома и толерантности к психоактивным веществам обусловлено нарушением функционирования различных биохимических и физиологических процессов, многие из которых можно рассматривать как первичные патогенетические факторы развития заболевания (Koob G.F. 2003; Шабанов П.Д., 2003, 2008). К таким факторам можно отнести усиленное образование в печени ацетальдегида из этанола при его избыточном поступлении в организм (Шабанов П.Д., Калишевич С.Ю., 1998), повреждающее воздействие токсических веществ (алкоголь, наркотики, летучие токсические вещества, высокие дозы лекарственных препаратов) на мембраны клеток мозга и образование в ткани мозга алкалоидов с морфиноподобным действием (Lieber, 1994), торможение синтеза РНК и белков мозга (Rezvani A. et al., 1999), изменение функциональной активности нейромедиаторных систем мозга (Анохина И.П., 2002; Ван Ри Ж.М., 2002; Иванец Н.Н., 2007; Шабанов П.Д., 2008) и т.д.

Нейробиологические исследования в последние годы затрагивают молекулярные, клеточные и поведенческие аспекты действия алкоголя и опиатов на головной мозг. Доказано, что даже небольшие дозы алкоголя и опиатов изменяют специфическую активность регуляторных белков мембран, участвующих в передаче нервного импульса в ряде нейромедиаторных систем, таких как моноаминоксидаза, ГАМК-, глицин-, глутаматергических, в последнем случае в их эффект вовлекаются NMDA-рецепторы (Беспалов Ф.Ю., Звартау Э.Э., 2000; Анохина И.П. и др., 2001; Драволина О.А. и др., 2002; Востриков В.В. и др., 2008). Вышеперечисленные нейромедиаторные системы так же активно задействованы в формировании и поддержании патологической зависимости и развитии толерантности.

Анализ результатов нейрохимических исследований позволяет сделать вывод о принципиальном единстве центральных механизмов зависимости от этанола и опиатов (Шабанов П.Д., Штакельберг О.Ю., 2000; Шабанов П.Д., 2008). Значительная роль в патогенезе, как алкоголизма, так и опийной наркомании отводится различным нарушениям именно нейрохимических процессов (Koob G.F. et al., 2003, 2008). Изучение воздействия наркотических средств и алкоголя на организм животных (крысы, морские свинки, мыши, обезьяны) и человека показали, что значительную роль в развитии физической зависимости, абстинентном синдроме и толерантности играют нейрорецепторы (Чернобровкина Т.В. и др., 2007; Шабанов П.Д., 2008). Учитывая, что изменения нейромедиации является основным звеном формирования алкогольной и опийной зависимости, можно предположить, что именно в этой системе и на этом уровне следует вести поиск нарушений нейрохимической медиации.

Функционирование мозговых систем, участвующих в формировании систем подкрепления (награды) традиционно представляется в виде взаимодействия трех основных нейромедиаторных составляющих: дофаминергической, опиоидергической (Анохина И.П., 2008; Шабанов П.Д., 2008) и ГАМК-ергической (Koob G.F. et al., 2003, 2008). В последние годы отмечается роль еще одной нейромедиаторной системы - глутаматергической (Беспалов А.Ю., 2003; Востриков В.В., 2004). Наиболее часто анализируется роль дофамина, который рассматривается в качестве универсального проводника подкрепляющих свойств алкоголя, опиатов и других безусловно подкрепляющих стимулов (Анохина И.П. и др., 2007; Шабанов П.Д., 2002, 2008). Так, было установлено, что мю-опиоидные рецепторы участвуют в процессах развития физической зависимости и толерантности к алкоголю, морфину и героину у крыс, мышей и к изменению поведения - снижениию потребления этих веществ. Посредством ингибиторных G-белков активация опиоидных рецепторов приводит к переходу NMDA-подтипа глутаматных рецепторов в более активное состояние (Драволина О.А. и др., 2002, 2008).

Несмотря на интенсивные исследования в области поиска нейрохимических и молекулярных коррелят действия наркотических средств, до сих пор нет достаточно простых, объективных и легко воспроизводимых тестов для оценки состояния пациента в той или иной стадии заболевания алкогольной или наркотической зависимостью, основанных на знании основных патогенетических звеньев формирования и поддежания зависимости.

Цель исследования: выяснение основных патогенетических звеньев развития зависимости от алкоголя и опиатов для ее объективной диагностики и контроля лечения (поддержания ремиссии) у человека.

Задачи исследования:

Изучение изменений медиаторного обмена (уровень ГАМК, активность МАО-В, уровень аутоантител к глутаматным рецепторам) у больных алкогольной зависимостью.

Динамическое исследование нарушений медиаторного обмена (уровень ГАМК, активность МАО-В, уровень аутоантител к глутаматным рецепторам) у больных алкогольной зависимостью в период абстиненции и становления ремиссии (до года).

Изучение изменений активности этанолокисляющих ферментов (акогольдегидрогеназа и альдегиддегидрогеназа) и других ферментов печени и мозга (гамма-глутамилтранспептидаза, креатинкиназа) у больных алкогольной зависимостью в период алкогольной интоксикации, абстиненции и разные сроки ремиссии (более 2 лет).

Изучение изменений обмена липидов (триглицериды, холестерин, холестерин липопротеидов высокой и низкой плотности) у больных алкогольной зависимостью в период абстиненции и разные сроки ремиссии (более 2 лет).

Изучение изменений медиаторного обмена (уровень ГАМК, активность МАО-В, уровень аутоантител к глутаматным и мю-опиоидным рецепторам) у больных опиийной зависимостью в период абстиненции и разные сроки ремиссии (до 4 лет).

Научная новизна работы заключается в комплексном сравнительном исследовании состояния нейромедиаторных (дофамин-, ГАМК- и глутаматергической), этанолокисляющих (активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназ) и энергостабилизирующих (активность креатинкиназы) систем у больных алкоголизмом и нейромедиаторных систем (дофамин-, ГАМК-, глутамат- и опиоидергической) у больных опийной наркоманией в период абстиненции и становления ремиссии. Данный подход позволил выявить наиболее характерные общие и частные патобиохимические изменения в работе нейромедиаторных систем при алкоголизме и опийной наркомании. В частности, общим для больных алкоголизмом и опийной наркоманией является снижение содержания ГАМК в крови, зависимое от сроков воздержания от наркогена. В то же время у больных алкоголизмом регистрируются умеренные колебания активности МАО-В и уровней аутоантител к NMDA-рецепторам и их субъединице NR2A в сыворотке крови, тогда как у больных опийной наркоманией уровень аутоантител к NMDA- и мю-опиоидным MDOR-рецепторам стабильно повышен. Наиболее диагностически значимым маркером объективной диагностики алкогольной зависимости являются повышенная активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) и изменение изоферментного спектра креатинкиназы в сторону повышения мозговой (ВВ-) и сердечной (МВ-) изоформ фермента. При остром воздействии алкоголя и алкогольном абстинентном синдроме вышеуказанные изменения более выражены, чем в процессе формирования ремиссии. Тем не менее, выявленные патобиохимические изменения сохраняются у зависимых пациентов в течение нескольких лет воздержания от наркогена (алкоголя, опиатов). Принципиальным достижением работы является установленная тесная связь между состоянием нейромедиации, уровнем аутоантител, активностью этанолокисляющих и энергостабилизирующих ферментов, а также нарушениями спектра липидов в крови наркологических больных в процессе становления ремиссии. Работа вошла в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ №07-04-00549а) и Российского гуманитарного научного фонда (РГНФ №07-06-00346а).

Научно-практическая значимость. Поиск патобиохимических маркеров хронического употребления алкоголя и опиатов позволяет сделать весьма неутешительный вывод о том, что ни один биохимический тест, взятый в отдельности, не является достаточно надежным для диагностики алкоголизма и опийной наркомании. Вместе с тем одновременное использование нескольких биохимических показателей может служить достаточно надежным критерием для объективной диагностики зависимости и котроля ее течения. Полученные данные о взаимосвязи состояния нейромедиаторных (дофамин-, ГАМК- и глутаматергической), этанолокисляющих (активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназ) и энергостабилизирующих (активность креатинкиназы) систем у больных алкоголизмом и нейромедиаторных систем (дофамин-, ГАМК-, глутамат- и опиоидергической) у больных опийной наркоманией в период абстиненции и становления ремиссии, меняющихся в зависимости от состояния пациента и времени воздержания от употребления алкоголя, позволили разработать принципы лабораторной биохимической диагностики данных состояний на основании исследования указанных показателей. Доказано, что данные биохимические показатели весьма стабильны и сохраняют направленность своих изменений в течение нескольких лет. При этом выявляются как общие для больных алкоголизмом и опийной наркоманией изменения (устойчивое снижение содержания ГАМК в крови, зависимое от сроков воздержания от наркогена), так и частные (специальные) патобиохимические перестройки. Найдено, что наиболее диагностически значимым маркером объективной диагностики алкогольной зависимости являются повышенная активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) и изменение изоферментного спектра креатинкиназы в сторону повышения мозговой (ВВ-) и сердечной (МВ-) изоформ фермента в крови. Вышеуказанные изменения более выражены в период абстиненции, чем в процессе формирования ремиссии. У больных опийной наркоманией в период абстинентного синдрома и период становления ремиссии наиболее значимыми диагностическими признаками является повышение уровня аутоантител к NMDA- и мю-опиоидным (MDOR) рецепторам. Последний показатель наиболее устойчив для данной категории пациентов и сохраняется повышенным вплоть до 4 лет ремиссии. Таким образом, предложены новые принципы диагностики алкогольной (определение активности алкогольдегидрогеназы и изоферментного спектра креатинкиназы) и опийной (определение аутоантител к опиоидным рецепторам мозга в сыворотке крови пациентов) зависимости. Данные принципы не только облегчат объективную диагностику состояния зависимости от этанола и опиатов, но и позволят корректно проводить контроль лечения (ремиссии) на основании относительно простых и надежных лабораторных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У больных алкогольной и опийной зависимостью выявляются достаточно устойчивые и повторяющиеся патобиохимические признаки заболевания в форме изменения активности состояния нейромедиаторных (дофамин-, ГАМК- и глутаматергической), этанолокисляющих (активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназ) и энергостабилизирующих (активность креатинкиназы) систем. Общим для больных алкоголизмом и опийной наркоманией является снижение содержания ГАМК в крови, зависимое от сроков воздержания от наркогена. В то же время у больных алкоголизмом регистрируются умеренные колебания активности МАО-В и уровней аутоантител к NMDA-рецепторам и их субъединице NR2A в сыворотке крови, тогда как у больных опийной наркоманией уровень аутоантител к NMDA- и мю-опиоидным MDOR-рецепторам стабильно повышен.

2. Степень патобиохимических изменений у больных алкоголизмом зависит от состояния пациента и времени воздержания от употребления алкоголя. При остром воздействии алкоголя и алкогольном абстинентном синдроме вышеуказанные изменения более выражены, чем в процессе формирования и стабилизации ремиссии.

3. Наиболее значимыми патобиохимическими маркерами для объективной диагностики алкогольной зависимости являются повышенная активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) и изменение изоферментного спектра креатинкиназы крови в сторону повышения мозговой (ВВ-) и сердечной (МВ-) изоформ фермента. Между давностью алкоголизма и повышением активности АДГ в крови выявляется прямо пропорциональная зависимость. Между степенью тяжести алкогольного абстинентного синдрома и активностью креатинкиназы крови также выявляется прямо пропорциональная зависимость.

4. Актуализация влечения к алкоголю в период клинической ремиссии у больных алкоголизмом сопровождается более высокими значениями активности печеночных ферментов (АДГ, гамма-глутамилтранспептидаза) и холестерина липопротеидов высокой плотности, чем у больных без актуализации. Эти показатели сохраняются в период до 2 лет ремиссии.

5. У больных опийной наркоманией наиболее значимыми патобиохимическими маркерами для объективной диагностики зависимости является повышенные уровени аутоантител к NMDA-подтипу глутаматных и мю-опиоидным MDOR-рецепторам.

6. В процессе становления клинической ремиссии и ее стабилизации аутоиммунные изменения в системе функционирования мю-опиоидных MDOR-рецепторов сохраняются, что создает предпосылки для лабораторного использования этих показателей как биохимических маркеров состояния пациента и контроля его лечения.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр патофизиологии и фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова МО РФ, кафедры наркологии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ, кафедры психиатрии Актюбинской медицинской академии (Казахстан), внедрены в практику работы Ленинградского, Новгородского и Актюбинского областных наркологических диспансеров.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на научной конференции «Нейрохимия. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), региональном конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии ECNP (Москва, 2005), VII Всероссийской научной конференции «Нейроэндокринология-2005» (Санкт-Петербург, 2005), 15-й научно-практической конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2005), XIV съезде психиатров России (Москва, 2005), IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П.Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2005), 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), 5-м международном конгрессе патофизиологов (Пекин, 2006), 23-м конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии ECNP (Стамбул, 2009).

По теме диссертации опубликованы 42 работы, включая 28 статей, из них 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 13 тезисов в сборниках научно-практических работ, 1 монография.

Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии, патофизиологии и НИЛ военной психофармакотерапии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова.

1. Методы исследования

Общая структура исследования. В исследование было включено 590 больных с наркологической патологией: 443 больных алкоголизмом и 147 злоупотребляющих опиатами, госпитализированных в клиники Актюбинского и Ленинградского областных наркологических диспансеров в 2000-2008 гг. В исследование были включены пациенты мужского пола в возрасте от 18 до 44 лет. Контрольную группу составили 122 здоровых испытуемых, мужчин в возрасте 30-35 лет, не употребляющих транквилизаторов, наркотических и седативных средств, не злоупотребляющих алкоголем и опиатами и не имеющих в анамнезе черепно-мозговых травм (ЧМТ). Исследование одобрено комитетом по этике Актюбинской медицинской академии (Республика Казахстан).

Исследования проводили в острый период (состояние абстиненции) и в период ремиссии. В группы больных алкоголизмом и наркоманией были включены пациенты с алкогольным (ААС) и опийным (ОАС) абстинентным синдромом средней степени тяжести. Состояние ремиссии констатировали на основании отсутствия в крови и моче алкоголя или опиатов, катамнестических данных и бесед с родственниками. Также в группу исследуемых включали пациентов, направленных на обследование в связи с призывом в ряды Вооруженных сил РФ (направление военкомата), на период обследования не получавшие лечения.

Методы клинического обследования больных алкоголизмом и опийной наркоманией. Для постановки клинического диагноза у больных анализировали анамнестические сведения (анамнез жизни, перенесенные и сопутствующие заболевания, наркологический анамнез) и результаты объективного осмотра (неврологический и соматический статусы, осмотр терапевта и невропатолога). Всем больным проводили стандартное клинико-лабораторное обследование: клинический и биохимический (активность аланин- и аспартатаминотрасфераз, содержание мочевины, С-реактивного белка) анализы крови, общий анализ мочи и кала. Данные перенесенного гепатита подтверждались выявлением носительства австралийского антигена (HBsAg). Для исключения острой патологии сердечно-сосудистой системы регистрировали ЭКГ. Больным алкоголизмом проводили психологическое обследование по тесту мотиваций потребления алкоголя (МПА). Для стандартизации оценки анамнестических данных, состояния больного и результатов обследования применяли «Карту осмотра наркологического больного». Здесь же указывали на день исследования показатели гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), активность моноаминоксидазы типа В (МАО-В), уровень титра аутоантител к глутаматным (GLU) и опиатным (MDOR) рецепторам, активность алкогольдегидрогеназы (АДГ), креатинкиназы (КК), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ), липидного спектра крови. Исследование соматического состояния, биохимических показателей и уровня титра аутоантител проводили на 1-й, 5-й, 10-й, 20-й и 30-й дни после поступления и у пациентов в состоянии ремиссии. Указанные параметры регистрировали непосредственно перед забором анализа крови из локтевой вены утром, натощак.

Из исследования исключали пациентов с психотическими заболеваниями, не связанными с наркологической патологией, и пациентов с острым соматическим состоянием (острый инфаркт миокарда, инсульт, острое состояние после черепно-мозговой травмы, грипп, острая респираторно-вирусная инфекция и т.п.).

Характеристика групп больных алкоголизмом. В процессе обследования на основании наркологического анамнеза и психологического тестового обследования (тест мотивации потребления алкоголя), устанавливали диагноз и стадию заболевания. В группы исследования методом случайной выборки отбирали больных II стадией алкоголизма (со сформировавшейся алкогольной зависимостью по МКБ-10), которые были разделены на несколько подгрупп: 1) общая (сводная) группа больных алкоголизмом; 2) больные алкоголизмом в ремиссии: а) имеющие в анамнезе психозы; б) имеющие в анамнезе судорожные припадки; 3) больные алкоголизмом в остром состоянии (ААС); 4) больные алкоголизмом в остром состоянии с психотическими проявлениями.

Группы больных статистически достоверно не различались между собой по возрасту, длительности заболевания и алкогольных эксцессов (запоев), длительности светлых промежутков, давностью формирования абстинентного синдрома и толерантности. С первого дня поступления все больные в состоянии ААС получали стандартную детоксикационную терапию.

Характеристика групп больных опийной наркоманией. В процессе обследования больные методом случайной выборки были разделены на несколько групп в зависимости от степени выраженности заболевания, способа употребления наркотического препарата и вида потребляемого наркотика: 1) злоупотребление опиатами без явлений физической зависимости; 2) наркозависимые с сочетанным употреблением разных опиатов (героин, ацетилированная маковая соломка внутривенно); 3) наркозависимые с чередованием употребления разных опиатов (героин или ацетилированная маковая соломка внутривенно). Указанное разделение на группы предполагало дополнительную биохимическую характеристику пациентов по уровню аутоантител к глутаматным и опиатным рецепторам. С первого дня поступления все больные в состоянии ААС получали стандартную детоксикационную терапию.

Сроки забора материала на исследование. Для исследования биохимических показателей крови у пациентов натощак забирали около 5 мл крови из вены, центрифугировали при комнатной температуре и получали сыворотку, которую хранили при температуре -20оС - -70оС до времени анализа.

Биохимические методы исследования обмена нейромедиаторов, уровня аутоантител к рецепторам, активности этанолокисляющих и энергостабилизирующих систем в крови.

Методика определения содержания ГАМК в крови. Определение концентрации ГАМК проводили на спектрофлюориметре «Люминал» при использовании волн 380 и 450 нм на основании оценки концентрации образования флуоресцентного продукта между ГАМК и нингидрином при щелочном рН в присутствии глутаминовой кислоты (Sutton J., Simmonds H., 1974).

Методика определения активности моноаминоксидазы тромбоцитов. Для определения моноаминоксидазной активности тромбоцитов (МАО-В) сначала выделяли взвесь тромбоцитов (Балуда В.П. и др., 1980). Определение активности МАО-В тромбоцитов проводили по методу О.Н. Волошиной и Т.А. Москвитиной (1985).

Методика исследования влияния этанола на активность моноаминоксидазы тромбоцитов больных алкоголизмом in vitro. Тромбоциты выделяли традиционным методом (Балуда В.П. и др., 1980). Раствор 400 мМ этанола готовили на основе фосфатного буфера с рН=7,4. Активность фермента определяли спектрофотометрическим методом с использованием в качестве специфического субстрата 0,045 М раствора солянокислого бензиламина (Москвитина Т.А., Волошина О.Н. 1985) и выражали в нмолях на 1 мг белка в час. Содержание белка в тромбоцитах определяли по методу О.Н. Лоури (1951).

Определение уровня аутоантител к NMDA-рецепторам методом твердофазного иммуноферментного анализа. Уровень аутоантител к глутаматным рецепторам определяли с помощью набора «ЭПИТЕСТ» (Россия) согласно инструкции. Набор реагентов теста предназначен для полуколичественного иммуноферментного определения содержания аутоантител к синтетическому фрагменту глутаматсвязывающего белка (ГМБ) головного мозга человека в сыворотке крови. Сорбция синтетического фрагмента ГМБ на поверхности полистиролового планшета позволяет избирательно извлекать аутоантитела из сыворотки крови. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью вторых антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой. Уровень аутоантител к ГМБ оценивается по изменению окраски субстратной смеси, регистрируемой с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 492 нм.

Определение уровня аутоантител к опиоидным рецепторам методом твердофазного иммуноферментного анализа. Принцип работы набора «НАРКОТЕСТ» (Россия) состоит в выявлении аутоантител к синтетическому фрагменту мю-опиатных рецепторов (MDOR) головного мозга человека. Сорбция синтетического фрагмента MDOR на поверхности полистиролового планшета позволяет избирательно извлекать аутоантитела из сыворотки крови или ликвора сходно с тем, как описано выше для «ЭПИТЕСТА». Уровень аутоантител к MDOR оценивается по изменению окраски субстратной смеси, регистрируемой с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 490 нм.

Определение активности ферментов обмена этанола (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) в сыворотке крови больных алкоголизмом. С целью выяснения диагностического значения ферментов обмена этанола алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АлДГ), креатинкиназы и обмена липидов был исследован 326 больных алкоголизмом II стадии (со сформированной алкогольной зависимостью по МКБ-10), мужчин в возрасте 18-66 лет, госпитализированных в наркологические стационары Санкт-Петербурга и Актюбинска (Республика Казахстан), и 94 здоровых добровольцев, проходивших плановые обследования в терапевтическом стационаре. Пациентов распределяли по группам в соответствии с различными сроками воздержания от алкоголя. Часть больных со сроками ремиссии более одного месяца на основании клинического обследования была подразделена на две подгруппы: с актуализацией и без актуализации влечения к алкоголю.

Цель наших исследований состояла в том, чтобы с помощью высокочувствительного метода определения активности АДГ изучить влияние хронического злоупотребления алкоголем и острой алкогольной интоксикации на активность АДГ в сыворотке крови людей и оценить возможность применения алкогольдегидрогеназного теста (Усатенко М. С., Шабанов П. Д., 1998) для диагностики алкоголизма. Активность АДГ в сыворотке крови значительно ниже, чем в печени. До недавнего времени считалось, что активность АДГ в сыворотке крови здоровых людей не определяется. Однако нами был модифицирован высокочувствительный метод определения активности АДГ, с помощью которого была измерена активность фермента в сыворотке крови всех обследованных ими здоровых людей и изучена динамика его активности в крови больных алкоголизмом.

Принцип метода основан на способности АДГ катализировать две последовательные реакции: 1) окисление бутанола с участием НАД; 2) восстановление n-нитрозодиметиланилина (НДМА) посредством НАДН2, образовавшимся в ходе первой реакции. НДМА, имеющий в растворе интенсивную желтую окраску, при восстановлении обесцвечивается. Об активности АДГ судят по скорости обесцвечивания НДМА, которую регистрируют на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Определение активности АДГ каждой сыворотки проводили дважды, а в случае расхождения результатов измерения более чем на 10% - три раза и вычисляли среднюю величину изменения оптической плотности за 1 минуту.

Расчет активности АДГ производили по формуле:

А = 320,5 х ДЕ440,

где

А - активность фермента, выраженная в единицах и рассчитанная на 1 л сыворотки крови. За единицу (Е) фермента принято то его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля НАД в минуту при указанных условиях инкубации;

ДЕ440 - изменение оптической плотности инкубационной среды при 440 нм за 1 минуту;

320,5 - коэффициент расчета активности, выраженной в микромолях прореагировавшего субстрата (НАД) при указанных условиях инкубации.

Было найдено, что активность АДГ достоверно определяется у всех обследованных лиц контрольной группы (89 здоровых добровольца) и равняется в среднем 1,19 ± 0,07 Е/л. Эти результаты соответствуют другим исследованиям, в которых было найдено, что активность АДГ сыворотки крови обследованных ими людей колеблется в пределах 0,05-4 Е/л при 25?С (Шабанов П.Д., 2002, 2003).

Отдельную серию исследований составило изучение влияния высоких доз этанола (острой алкогольной интоксикации) на АДГ крови. Динамику активности АДГ изучали на мужчинах, поступивших в медицинский вытрезвитель в состоянии алкогольного опьянения, и на не злоупотреблявших алкоголем добровольцах, которые в течение 30 мин приняли 500-600 мл 40% раствора этанола (2,0-2,5 г/кг). Активность АДГ сыворотки крови у лиц, поступивших в вытрезвитель, измеряли сразу после поступления и через 12 ч, у добровольцев -- перед приемом алкоголя и через 1; 1,5; 6; 12 и 22 ч после его приема. На основании результатов клинического анализа всех обследованных, находившихся в состоянии опьянения средней и тяжелой степени, разделяли на 3 группы. В 1-ю группу вошли больные алкоголизмом (n=38), во 2-ю - лица, злоупотреблявшие алкоголем, у которых не было обнаружено признаков алкогольной болезни (n=21), а в 3-ю - 12 человек, употреблявших алкогольные напитки эпизодически, в том числе добровольцы.

Определение активности изоферментов креатинкиназы в сыворотке крови больных алкоголизмом. Изоферменты креатинкиназы (КК) ММ-, МВ- и ВВ-типа являются тонким и объективным показателем поражения нервной ткани и миокарда (Чуваев И.В., 1993). ММ-КК содержится преимущественно в скелетных мышцах, МВ-КК -- в сердце и ВВ-КК -- в нервной ткани.

Определение общей активности КК производили колориметрическим методом (Чуваев И. В., 1993). Чувствительность метода составила 0,005-0,05 МЕ фермента в пробе. Разделение изоферментов КК осуществляли с помощью колоночной хроматографии на сефадексе ДЭАЕ А-50. Элюцию изоферментов КК проводили ступенчатым методом, используя три буфера, которые содержали 100 мМ NaCl, 200 мМ NaCl и 400 мМ NaCl. В каждой фракции проводили определение активности КК. Определение белка проводили микробиуретовым методом.

В первой серии исследований определяли изоферментные спектры КК в сыворотке крови 40 больных алкоголизмом с наличием алкогольного абстинентного синдрома. Последний дифференцировали по степени тяжести как умеренный (I), средней тяжести (II) и выраженный (III). Разделение изоферментов КК осуществляли методом колоночной хроматографии на сефадексе ДЭАЕ А-50. Контролем служили сыворотки крови 15 здоровых добровольцев.

Методы статистического анализа. Результаты клинических исследований обрабатывались методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Анализ результатов проводили на PC Intel Pentium II 600 мГц. Для статистической обработки результатов использовался стандартный пакет программ STATISTICA for Windows (Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 1998).

2. Результаты собственных исследований

Изучение основных патофизиологических звеньев и биохимических маркеров алкогольной зависимости.

Изучение содержания ГАМК, активности МАО-В и уровня аутоантител к NMDA-рецепторам у больных алкоголизмом. В первой серии исследований оценивали биохимические показатели крови больных алкоголизмом в острой стадии заболевания (алкогольный абстинентный синдром) и при ремиссии. Данные представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что в наибольшей степени меняется содержание ГАМК в крови. В острый период ААС и в период становления ремиссии содержание нейромедиатора уменьшается на 50-30%, восстанавливаясь до контрольных значений лишь к 40-45 дню. Другие исследованные показатели при этом существенно не меняются. Наиболее стабильными были уровни аутоантител к глутаматным рецепторам и их субъединице NR2A. В активности МАО-В отмечена лишь тенденция (недостоверная статистически) к снижению активности фермента в первую неделю ААС.

нейромедиаторный алкогольный абстиненция

Таблица 1. Содержание ГАМК, активность МАО-В и уровень аутоантител к NMDA-рецепторам у больных алкоголизмом в разные сроки алкогольного абстинентного синдрома и периода становления ремиссии

Примечание. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 по отношению к контрольной группе (здоровые добровольцы).

Если у больных в период ААС развивался острый психоз, проявлявшийся главным образом галлюцинаторным синдромом, то уровень ГАМК снижался существенно (как правило, более чем в 2 раза, а на 3-й день - более чем в 3 раза), оставаясь сниженным в течение всего периода наблюдения (1,5 мес). Активность МАО-В менялась незначительно (табл. 2) с общей тенденцией к снижению.

Только на 30-й день регистрировали умеренное повышение активности фермента. Уровни аутоантител к NMDA-рецепторам не менялись. При этом уровни к субъединице NR2A глутаматного рецептора умеренно снижались, что указывает на их меньшую стабильность при хронической алкогольной интоксикации, сопровождающейся галлюцинозом.

Таким образом, в целом картина изменений при алкоголизме, осложненном острым психозом, совпадает с таковой ААС, однако степень этих изменений более выжанена у психотических больных.

Таблица 2. Содержание ГАМК, активность МАО-В и уровень аутоантител к NMDA-рецепторам у больных алкоголизмом в период острого алкогольного психоза

Примечание. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 по отношению к контрольной группе (здоровые добровольцы).

В период становления ремиссии (в наших исследованиях этот период изучали от 1 до 13 мес) отмечали более мозаичное изменение исследованных показателей. Так, наиболее лабильным показателем остается содержание ГАМК, которое в течение всего периода наблюдений (более 1 года) у больных алкоголизмом было пониженным. Степень этого понижения составляла от 15 до 40% от уровня здоровых добровольцев (табл. 3).

Приблизительно в диапазоне 10-25% колебалась активность МАО-В, что указывает на относительно стабильный характер этого показателя. Напротив, уровень аутоантител к NMDA-рецепторам несколько повышался (с 0,49*0,02 у здоровых испытуемых до 0,56*0,05 у больных алкоголизмом, n=117, р<0,001).

При этом в процессе становления ремиссии регистрировали как повышение (по основным исследуемым срокам), так и умеренное снижение (5,5 мес, 10,5-13 мес) показателя, то есть динамика изменений была разнонаправленной. В противоположность этому, средний уровень аутоантител к субъединице NR2A глутаматного рецептора не менялся, хотя в определенные периоды становления ремиссии (2,5 мес, 3,5-5 мес и особенно 12,5-13 мес) уровень аутоантител был существенно ниже, чем в контроле, в другие же периоды (3 мес, 5,5-7 мес, 9-12 мес) он повышался.

Таблица 3. Содержание ГАМК, активность МАО-В и уровень аутоантител к NMDA-рецепторам у больных алкоголизмом в период становления ремиссии

Примечание. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 по отношению к контрольной группе (здоровые добровольцы).

У этих пациентов в процессе формирования ремиссии (2-5 мес) было отмечено уже наблюдавшееся нами явление снижения содержания ГАМК в крови. Уровень ГАМК при этом снижался вдвое у пациентов с острым психозом в анамнезе и в 2,5 раза с судорожными припадками в анамнезе. При этом, если другие показатели в группе больных с психозом не менялись, то у пациентов с припадками в анамнезе уровень аутоантител к NMDA-рецепторам повышался почти вдвое. Это соответствует результатам и других исследователей (Дамбинова С.А. и др., 2002), которые регистрировали повышение активности глутаматергической системы у лиц, страдающих эпилепсией или иными судорожными припадками.

Таблица 4. Содержание ГАМК, активность МАО-В и уровень аутоантител к NMDA-рецепторам у больных алкоголизмом, перенесших в анамнезе алкогольный психоз или приступы судорожных припадков, в период формирования ремиссии

Примечание. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 по отношению к контрольной группе (здоровые добровольцы).

Весьма любопытные данные были получены при изучении больных алкоголизмом, перенесших в анамнезе алкогольный психоз или приступы судорожных припадков (табл. 4).

У этих пациентов в процессе формирования ремиссии (2-5 мес) было отмечено уже наблюдавшееся нами явление снижения содержания ГАМК в крови. Уровень ГАМК при этом снижался вдвое у пациентов с острым психозом в анамнезе и в 2,5 раза с судорожными припадками в анамнезе. При этом если другие показатели в группе больных с психозом не менялись, то у пациентов с припадками в анамнезе уровень аутоантител к NMDA-рецепторам повышался почти вдвое.

Таким образом, у больных алкоголизмом отмечены достаточно устойчивые и повторяющиеся биохимические признаки заболевания: это снижение содержания ГАМК, умеренные колебания активности МАО-В и уровней аутоантител к NMDA-рецепторам и их субъединице NR2A в сыворотке крови. При этом степень изменений зависит от состояния пациента и времени воздержания от употребления алкоголя. При ААС изменения более выражены, чем в процессе формирования ремиссии. Перенесенный острый психоз или судорожные припадки более значимо сказываются на изменении исследованных показателей. И, наконец, в процессе становления ремиссии, охватывающем около 1 года, изменения в системе ГАМК, МАО-В, а аутоантител к глутаматным рецепторам сохраняются, что создает предпосылки для лабораторного использования этих показателей как биохимических маркеров состояния пациента.

Изучение активности алкогольдегидрогеназы сыворотки крови у больных алкоголизмом. Цель данного раздела исследований состояла в том, чтобы с помощью высокочувствительного метода определения активности алкогольдегидрогеназы (АДГ) изучить влияние хронического злоупотребления алкоголем и острой алкогольной интоксикации на активность АДГ в сыворотке крови людей и оценить возможность применения алкогольдегидрогеназного теста (Усатенко М. С., Шабанов П. Д., 1998) для диагностики алкоголизма. Активность АДГ в сыворотке крови значительно ниже, чем в печени. До недавнего времени считалось, что активность АДГ в сыворотке крови здоровых людей не определяется. Однако нами был модифицирован высокочувствительный метод определения активности АДГ, с помощью которого была измерена активность фермента в сыворотке крови всех обследованных ими здоровых людей и изучена динамика его активности в крови больных алкоголизмом.

Принцип метода основан на способности АДГ катализировать две последовательные реакции: 1) окисление бутанола с участием НАД; 2) восстановление n-нитрозодиметиланилина (НДМА) посредством НАДН2, образовавшимся в ходе первой реакции. НДМА, имеющий в растворе интенсивную желтую окраску, при восстановлении обесцвечивается. Об активности АДГ судят по скорости обесцвечивания НДМА, которую регистрируют на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Определение активности АДГ каждой сыворотки проводили дважды, а в случае расхождения результатов измерения более чем на 10% -- 3 раза и вычисляли среднюю величину изменения оптической плотности за 1 минуту.

Было найдено, что активность АДГ достоверно определяется у всех обследованных лиц контрольной группы (89 здоровых добровольцев) и равняется в среднем 1,19 ± 0,07 Е/л (табл. 5). Эти результаты соответствуют другим исследованиям, в которых было найдено, что активность АДГ сыворотки крови обследованных ими людей колеблется в пределах 0,05-4 Е/л при 25?С.

Из таблицы следует, что в сыворотке крови больных алкоголизмом активность АДГ значительно выше, чем в контрольной группе. С увеличением длительности заболевания активность АДГ в сыворотке крови возрастает, то есть между длительностью злоупотребления алкоголем и повышением активности АДГ существует прямая зависимость. Этот результат находится в соответствии с данными других авторов, которые отмечают, что наиболее часто АДГ в сыворотке крови выявлялась при злоупотреблении алкоголем в течение 10-20 лет.

Таблица 5. Активность АДГ сыворотки крови у больных с различными сроками давности алкоголизма

Примечание. *р < 0,05; **р < 0,01 по отношению к контролю.

Таким образом, наличие прямой зависимости между давностью алкоголизма и повышением активности АДГ в крови позволяет использовать алкогольдегидрогеназный тест в качестве самостоятельного дополнительного критерия для диагностики алкоголизма.

Изучение активности алкогольдегидрогеназы сыворотки крови при острой алкогольной интоксикации. Влияние высоких доз этанола (острой алкогольной интоксикации) на АДГ крови изучали на мужчинах, поступивших в медицинский вытрезвитель в состоянии алкогольного опьянения, и на не злоупотреблявших алкоголем добровольцах, которые в течение 30 мин приняли 500-600 мл 40% раствора этанола (2,0-2,5 г/кг). Активность АДГ сыворотки крови у лиц, поступивших в вытрезвитель, измеряли сразу после поступления и через 12 ч, у добровольцев -- перед приемом алкоголя и через 1; 1,5; 6; 12 и 22 ч после его приема. На основании результатов клинического анализа всех обследованных, находившихся в состоянии опьянения средней и тяжелой степени, разделяли на 3 группы. В первую группу вошли больные хроническим алкоголизмом (38), во вторую -- злоупотреблявшие алкоголем лица, у которых не было обнаружено признаков алкогольной болезни (21), а в третью -- 12 человек, употреблявших алкогольные напитки эпизодически, в том числе добровольцы.

Из табл. 6 видно, что в период алкогольного опьянения активность АДГ была самой высокой у больных хроническим алкоголизмом, самой низкой -- у лиц, не злоупотреблявших алкоголем. Через 12 ч у больных хроническим алкоголизмом активность АДГ снизилась на 20%, у лиц, злоупотреблявших алкоголем в форме пьянства, -- на 21%, а при случайном опьянении и у добровольцев снижение АДГ было незначительным.

Таблица 6. Действие высоких доз этанола на активность АДГ крови

Примечание. *р < 0,01 по отношению к группе, употреблявших этанол эпизодически.

У больных алкоголизмом, находившихся на лечении в наркологическом стационаре, через 3-5 дней воздержания от алкоголя активность АДГ снижалась в среднем на 40%. В дальнейшем снижение активности АДГ происходило значительно медленнее (рис. 1).

Таким образом, у мужчин, не злоупотреблявших алкоголем, острая алкогольная интоксикация не вызывает существенных сдвигов активности АДГ в крови и алкогольдегидрогеназный тест не информативен при определении острой интоксикации алкоголем таких пациентов.

У злоупотреблявших алкоголем и больных алкоголизмом активность АДГ в крови в период алкогольного опьянения повышается и затем значительно снижается за 3-5 суток воздержания от спиртных напитков. Для диагностики острой алкогольной интоксикации у таких лиц следует провести два или три последовательных анализа активности АДГ в течение 3-5 суток. Снижение активности АДГ за этот срок на 25-50% указывает на острую алкогольную интоксикацию, которая, вероятно, была за 1-2 дня до первого анализа.

Использование алкогольдегидрогеназного теста для диагностики алкогольной зависимости. Самую многочисленную группу исследованных пациентов в наших исследованиях составили больные с алкогольным абстинентным синдромом. В эту группу были включены пациенты, находившиеся в стационаре в течение 1-20 дней с момента поступления. У этих пациентов активность АДГ была в среднем в 3 раза выше контрольной величины. Наиболее значительное повышение активности АДГ в сыворотке крови наблюдали в течение первых двух суток после окончания запоя. В последующие 3-5 суток воздержания от алкоголя происходил значительный спад активности АДГ с 4,46 до 2,71 Е/л. При дальнейшем воздержании от алкоголя активность АДГ продолжала постепенно снижаться. Однако даже при длительных ремиссиях, сроком до 1 года, активность АДГ превышала контрольный уровень.

Рис. 1. Активность АДГ и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови больных алкоголизмом через разные сроки воздержания от алкоголя По оси ординат - активность ферментов (Е/л, ммоль/л), по оси абсцисс - группы пациентов. *р < 0,05; **р < 0,01 по отношению к контролю (здоровые добровольцы)

Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), также как активность АДГ, была максимальной в первые два дня развития абстинентного синдрома. В этот срок она в среднем была равной 0,75 ± 0,07 мМ/ч/л. В процессе стабилизации ремиссии активность АЛТ в крови постепенно снижалась. В целом динамика активности АЛТ была сходной с динамикой АДГ. Однако изменения активности АДГ были выражены более значительно. Кроме того, активность АДГ при длительной ремиссии оставалась значительно повышенной, тогда как активность АЛТ устанавливалась на нормальном уровне при воздержании от алкоголя сроком от 11 дней до 1 месяца.

Наличие прямой зависимости между давностью алкоголизма и повышением активности АДГ в крови позволяет предложить алкогольдегидрогеназный тест в качестве дополнительного критерия для диагностики алкоголизма. В табл. 7 приведены данные в отношении лиц, у которых в анамнезе отсутствуют заболевания печени неалкогольной этиологии.

Следует отметить, что наиболее низкие значения активности АДГ у больных алкоголизмом могут перекрываться наиболее высокими значениями активности фермента у лиц, не злоупотребляющих алкоголем. Этот факт предполагает использование метода определения активности АДГ только как вспомогательного теста при диагностике алкоголизма. В то же время необходимо подчеркнуть, что, по данным литературы, до настоящего времени алкогольдегидрогеназный тест, как правило, не использовался для выявления и оценки степени тяжести алкоголизма (Chan, 1990; Lieber, 1994).

Таблица 7. Использование алкогольдегидрогеназного теста в качестве дополнительного критерия при диагностике алкоголизма

Выше отмечалось, что у мужчин, не злоупотребляющих алкоголем, острая алкогольная интоксикация не вызывает существенных сдвигов активности АДГ в плазме крови. У крыс однократное введение этанола (5,3 г/кг внутрибрюшинно) значительно понижает активность АДГ сыворотки крови в течение первых 3 ч после введения. Затем активность АДГ возрастает, достигая максимальных значений через 16 ч, полого снижаясь и достигая контрольных величин в последующее время (Усатенко М.С., Шабанов П.Д., 1998). Волнообразная динамика активности АДГ наблюдается и после однократного введения этанола кроликам (3,2 г/кг внутрижелудочно): снижение ее в 2 раза через 1 ч, затем повышение с максимумом через 12 ч и вновь постепенное снижение до величин, близких к исходным. Введение кроликам внутрижелудочно равных объемов воды (40-50 мл) не вызывало значительных изменений активности АДГ (Шабанов П.Д., 2002).

Средние величины активности АДГ в сыворотке крови человека, крысы и кролика равны 1,19 ± 0,07; 4,32 ± 0,71 и 110,0 ± 16,0 Е/л, то есть у крысы и кролика она соответственно в 4 и 100 раз выше, чем у человека. Было сделано предположение, что резкое снижение активности фермента в крови животных в первые часы после введения этанола обусловлено непосредственным ингибирующим действием последнего на АДГ. Однако добавление к сыворотке крови человека и крысы in vitro этанола в концентрациях от 0,5 до 10 мг/мл не влияло на активность АДГ. Возможно, неодинаковое действие высоких доз этанола на АДГ крови человека и животных связано с разным составом множественных молекулярных форм АДГ.

Выше указывалось, что в сыворотке крови больных алкоголизмом активность АДГ значительно выше контроля. С увеличением давности алкоголизма активность АДГ возрастала. Для решения вопроса о возможном влиянии на результаты исследования возрастных изменений активности АДГ необходимо было изучить активность АДГ в сыворотке крови здоровых людей разного возраста. У здоровых мужчин, не злоупотреблявших алкоголем, в различные возрастные периоды активность АДГ сыворотки крови не менялась.

Очевидно, что возрастание активности АДГ у больных алкоголизмом происходит именно в результате хронической интоксикации алкоголем. Было сделано допущение, что повышение активности АДГ в крови больных алкоголизмом может быть обусловлено: 1) индукцией этанолом синтеза АДГ в печени и/или 2) нарушением структурной целостности гепатоцитов, вызванной хронической алкогольной интоксикацией и усилением переноса АДГ из печени в ток крови. В пользу второго предположения свидетельствует наличие прямой зависимости между изменениями активности аланинаминотрансферазы и АДГ в сыворотке крови больных алкоголизмом.

Для проверки указанных предположений были проведены опыты на крысах, длительно (в течение 15 месяцев) получавших 15%_ный раствор этанола в качестве единственного источника жидкости. Активность АДГ в печени крыс, потреблявших этанол, составляла 5,2 ± 0,4 Е/л против 6,4 ± 0,4 Е/л в контроле (р < 0,05). В то же время активность АДГ сыворотки крови у алкоголизированных крыс была почти в 2 раза выше, то есть 22,9 ± 3,6 Е/л против 12,6 ± 0,9 Е/л в контроле (р < 0,01). Через 7 дней после отмены этанола активность АДГ в печени вновь возрастала до 6,2 ± 0,4, а в сыворотке крови снижалась до 9,4 ± 1,5 Е/л, приближаясь в обеих тканях к контрольным величинам.

Таким образом, при длительной алкогольной интоксикации этанол, вероятно, не индуцирует синтез АДГ в гепатоцитах. Этот результат подтверждает, что причиной повышения содержания АДГ в крови было усиление переноса фермента из печени в ток крови. Следует отметить, что в этом отношении АДГ не отличается от других гепатоспецифических ферментов.

Изучение содержания липидов и активности ферментов в крови больных алкоголизмом в острый период болезни и при ремиссии. В работах И.В. Бокий и соавторов (1985), М.С. Усатенко и П.Д. Шабанова (1998) было отмечено, что у больных с алкогольным абстинентным синдромом наблюдались значительные изменения в содержании липидов, а именно: триглицеридов (ТГ) и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). Несомненный интерес для диагностики алкоголизма имеет определение отношения концентраций холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП) и общего холестерина (ХС). Этот коэффициент более точно отражает нарушение обмена липопротеидов, чем показатели общего ХС и ХС-ЛПВП в отдельности. Поэтому одной из задач настоящего исследования явилось изучение активности ферментов печени (АДГ, ГГТ, АЛТ) и концентрации липидов в крови больных алкоголизмом с различными сроками воздержания от приема спиртных напитков при актуализации влечения или отсутствии признаков усиления влечения к алкоголю.