Аутоиммунные аспекты патогенеза и профилактики перинатальных осложнений при сахарном диабете у матери

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Аутоиммунные аспекты патогенеза и профилактики перинатальных осложнений при сахарном диабете у матери

14.03.03 - патологическая физиология

14.01.01 - акушерство и гинекология

доктора медицинских наук

Будыкина Татьяна Сергеевна

Москва, 2010

Работа выполнена в клиниках и лабораториях ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Сергей Георгиевич Морозов

доктор медицинских наук, профессор Василий Алексеевич Петрухин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Геннадий Васильевич Порядин

доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент РАМН Игорь Сергеевич Гущин

доктор медицинских наук, профессор Раиса Ивановна Шалина

Ведущее учреждение: ГОУВПО «Российский Университет Дружбы Народов

Защита диссертации состоится «_____» ___________ 2010 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при УРАМН Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан «____» ____________ 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Лариса Николаевна Скуратовская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема перинатальной патологии при сахарном диабете (СД) у матерей остается актуальной для врачей разных специальностей. Несмотря на достигаемую с помощью современных технологий нормогликемию во время беременности, перинатальная смертность остается высокой и составляет даже в передовых зарубежных клиниках от 23,0 до 48,0 промилей (Yang J., 2006). Перинатальные осложнения у матерей с СД и перинатальная заболеваемость у их новорожденных тоже остаются высокими, у 80% детей имеются перинатальные поражения ЦНС, которые у 20% из них в дальнейшем трансформируются в различные нозологические формы (Федорова М.В., Краснопольский В.И., Петрухин В.А., 2001; Lapolla A., 2007).

Мало изучен вопрос о влиянии различных изменений в системе гуморального аутоиммунитета на формирование органов и тканей плода, в частности, на метаболические процессы, на функциональное созревание клеток, в первую очередь центральной нервной системы, при СД у матерей (Клюшник Т.П., 1997; Морозов С.Г. и др., 2008; Di Mario U. et al., 1982; McKenzie J.M., Zakarija M., 1992). Практически отсутствуют работы, посвященные изучению естественных нейротропных аутоантител и их функциональных «противовесов» (антиидиотипических аутоантител) у новорожденных и детей более старшего возраста в норме и при СД у их матерей. Актуален вопрос об их роли в формировании перинатальной патологии, а также о влиянии аутоиммунных нарушений у матери на состояние здоровья ее новорожденного и детей других возрастных групп.

Доказана важнейшая роль иммунопатологических изменений в развитии как самого СД, так и его осложнений, затрагивающих, в частности, нервную систему (Балаболкин М.И., 1998; Bock, 1988; Melanitou E., 2005), однако до сих пор не решен вопрос об их участии в патогенезе перинатальных осложнений и неврологических нарушений у детей. Весьма актуальной остается разработка адекватных иммунокорригирующих лечебно-профилактических мероприятий в комплексе предгравидарной подготовки и в процессе гестации у женщин, страдающих СД. Все вышеизложенное явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования. Улучшение перинатальных исходов у женщин с СД путем раннего выявления и патогенетически обоснованной коррекции различных изменений в системе гуморального аутоиммунитета в ходе предгравидарной подготовки и в процессе беременности.

Задачи исследования:

1. Выявить патогенетические механизмы поражения нервной системы у новорожденных и детей старшего возраста у женщин с СД.

2. Доказать, что антиидиотипические антиинсулиновые антитела специфически взаимодействуют с рецепторами инсулина, и разработать иммуноферментную систему для определения антител к инсулину и его рецепторам.

3. Определить роль аутоантител к инсулину и его рецепторам, а также различных органонеспецифических аутоиммунных изменений в патогенезе осложнений беременности и перинатальной патологии при СД у матери.

4. Оценить значимость изменений органонеспецифических аутоантител и аутоантител к инсулину и его рецепторам в формировании фетоплацентарной недостаточности у беременных с СД.

5. Установить особенности показателей плодово-плацентарного кровотока у беременных с СД в зависимости от нарушений гуморального аутоиммунитета.

6. Выявить влияние изменений в содержании естественных нейротропных аутоантител и их антиидиотипов на формирование различной перинатальной патологии у новорожденного и неврологических нарушений у детей более старшего возраста при СД матери.

7. Разработать новые прогностические критерии тяжести состояния плода, новорожденного и детей более старшего возраста у беременных с СД.

8. Разработать и оценить эффективность разных патогенетически обоснованных методов неспецифической коррекции аутоиммунных нарушений у матерей с СД.

9. В эксперименте разработать и определить эффективность метода специфической десенсибилизации (низкодозовая антигенспецифическая иммуносупрессия) для коррекции повышенного уровня аутоантител к инсулину.

10. Разработать алгоритм диагностики и коррекции аутоиммунных изменений у женщин с СД на этапе планирования и в процессе беременности.

Научная новизна исследования. Впервые в клинической практике разработан прогноз тяжести состояния новорожденного еще на этапе его внутриутробного развития по содержанию антител к инсулину и его рецепторам у беременных с СД (Патент РФ №2208791).

Впервые в клинической практике для оценки степени тяжести поражения ЦНС в раннем неонатальном периоде и прогноза последующего психо-моторного развития ребенка использован метод определения нейротропных антител и их антиидиотипических антител (Патент РФ № 2178175).

Впервые определена роль аутоантител различной направленности в формировании фетоплацентарной недостаточности у беременных с СД.

Впервые в эксперименте использован новый способ специфической иммунокоррекции (низкодозовая антигенспецифическая иммуносупрессия) для нормализации повышенного уровня аутоантител к инсулину.

Доказано, что антиидиотипические антитела к инсулину способны связываться с инсулиновыми рецепторами, и могут рассматриваться как антитела к рецепторам инсулина.

Теоретическая и практическая значимость работы. Установлена роль органоспецифических и органонеспецифических антител в патогенезе акушерских, перинатальных осложнений у беременных с СД и поражения нервной системы у их новорожденных и детей старшего возраста.

Доказана специфичность взаимодействия антиидиотипических антител к антиинсулиновым антителам с рецепторами инсулина, локализующимися на поверхностных мембранах разных типов клеток, что позволяет их рассматривать как антитела к рецепторам инсулина.

Разработана диагностическая тест-система, позволяющая количественно оценивать уровень аутоантител к инсулину и его рецепторам (ЭЛИ-Диа-ТЕСТ, регистрационное удостоверение № 29/25050504/6349-04).

С помощью иммунноафинной хроматографии, ИФА и иммуноблотинга, а также анализа расчетных характеристик связывания антиинсулиновых антител (расчет параметров изотерм сорбции Ленгмюра) доказано, что поликлональные антитела к инсулину взвимодействуют с ФРН.

Впервые в эксперименте разработан метод специфической десенсибилизации (низкодозовая антигенспецифическая иммуносупрессия) для коррекции повышенного уровня аутоантител к инсулину и определена его эффективность.

Впервые установлено, что у беременных с СД в 76,7% случаев отмечаются стойкие изменения содержания аутоантител к инсулину и его рецепторам, в 23,3% - стойкие изменения в содержании различных органонеспецифических аутоантител. Данные нарушения не зависят от типа диабета и сохраняются на протяжении всего срока гестации, приводя в более чем 92% случаев к осложненному течению беременности и СД.

Впервые выявлено, что у 77,2% новорожденных матерей с СД имеется поражение ЦНС, которое сохраняется вплоть до школьного возраста, при этом выраженность симптомов зависит от уровня у них нейроспецифических аутоантител и их антиидиотипов. При легком поражений ЦНС отмечается их повышение, с утяжелением состояния отмечается снижение, с преобладанием антиидиотипических антител при средненяжелом поражении и антител первого порядка при тяжелом.

Доказано, что у всех новорожденных детей от матерей с СД, не имеющих нарушений со стороны ЦНС, отмечается повышенный уровень нейротропных аутоантител, по сравнению с контрольной группой, причем уровень антител и их антиидиотипов к ФРН высок во всех группах и не зависит от тяжести состояния ребенка, что может свидетельствовать о недостатке ФРН у новорожденных, матери которых страдают СД.

Впервые разработаны патогенетически обоснованные алгоритмы коррекции органоспецифических и органонеспецифических аутоиммунных нарушений на этапе планирования беременности и в процессе гестации у женщин с СД, включающие использование новых методов диагностики и неспецифической иммунокоррекции (ингаляций гепарина и применение Вобэнзима), что позволило улучшить пренатальный прогноз, снизив перинатальную смертность с 6,3% до 2,4%, патологию ЦНС у детей в катамнезе с 81,8% до 25,0%, увеличив количество здоровых детей с 5,3% до 50%.

Полученные данные легли в основу разработки и внедрения новых профилактических и реабилитационных подходов в перинатологии как для матерей с СД, так и для их новорожденных, пригодные для широкого применения в практической медицине.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антиидиотипические антитела к инсулину способны связываться с инсулиновыми рецепторами, локализующимися на поверхостных мембранах клеток, и могут рассматриваться как антитела к рецепторам инсулина.

2. С помощью иммунноафинной хроматографии, ИФА и иммуноблотинга, а также анализа расчетных характеристик связывания антиинсулиновых антител (расчет параметров изотерм сорбции Ленгмюра) доказано, что поликлональные антитела к инсулину взвимодействуют с ФРН.

3. У беременных с СД в 76,7% случаев отмечаются стойкие изменения содержания аутоантител к инсулину и его рецепторам, в 23,3% - стойкие изменения в содержании различных органонеспецифических аутоантител. Данные нарушения не зависят от типа диабета и сохраняются на протяжении всего срока гестации, приводя в более чем 92% случаев к осложненному течению беременности и СД.

4. ФПН у беременных с СД формируется в 100% случаев. Причем при гипореактивности как органоспецифических, так и органонеспецифических аутоантител в 90,1% наблюдений формируется фето-плацентарная недостаточность (ФПН) со снижением уровня плодово-плацентарных гормонов и гипотрофией плода. При гиперпродукции указанных аутоантител происходит формирование ФПН с повышением уровня плодово-плацентарных гормонов и макросомией плода.

5. Антитела к инсулину и его рецепторам у матери с СД являются повреждающими факторами для плода и новорожденного, чем выше их уровень, тем тяжелее его состояние.

6. У всех новорожденных детей, не имеющих нарушений со стороны ЦНС, отмечается повышенный уровень нейротропных аутоантител, по сравнению с контрольной группы (р=0,003). Уровень антител и их антиидиотипов к ФРН высок во всех группах и не зависит от тяжести состояния ребенка, что может свидетельствовать о недостатке ФРН у новорожденных, матери которых страдают СД.

7. Патогенетически обоснованные лечебно-профилактические мероприятия, проводимые в предгравидарный, гестационный периоды, включающие ингаляции гепарина и применение вобэнзима, приводят к нормализации патологического уровня органоспецифических и органонеспецифических аутоантител, что сопровождается снижением перинатальной смертности с 6,3% до 2,4%, патологии ЦНС у детей в катамнезе с 81,8% до 25,0%, что приводит к увеличению количества здоровых детей с 5,3% до 50,0%.

Внедрение результатов работы. Результаты настоящей работы внедрены и используются в практике акушерских клиник Московского областного НИИ акушерства и гинекологии, в Московском областном центре «Сахарный диабет и беременность», а также в работе ГКБ №29 им. Н.Э. Баумана г. Москвы. Материалы работы используются при чтении курса лекций по проблеме «Сахарный диабет, беременность и диабетическая фетопатия» на кафедре акушерства и гинекологии ФУВ в МОНИКИ.

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования были представлены и обсуждены на I Российском конгрессе диабетологов (Москва, 1998), IV Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье детей» (Москва, 1998), 13th Сongress of EAGO (Jerusalem, 1998), 28th Сongress of neurofisiolodgi (Los Angeles, Califor, 1998), The 6 International conference on Human Antibodies and Hybridoms (Эдинбург, 1999), на II Российском форуме “Мать и Дитя” (Москва, 2000), 9 и 10 конференциях «Неврология-Иммунология» (Санкт-Петербург, 2000, 2001), на 1-ом Московском международном симпозиуме «Иммунология и иммунопатология системы «Мать-Плод-Новорожденный» (Москва, 2001), на республиканской научно-практической конференции "Здоровый новорожденный: перинатальные проблемы и прогнозирование" (г. Екатеринбург, 2000), на 1-ой научной конференции «Медицина будущего» (Москва, 2002), на V, VI, VII , VIII, X, XIII Российских национальных конгрессах “Человек и лекарство” (Москва, 1998, 1999, 2000, 2001, 2003, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 63 научные работы (включая 12 работ в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ). Материалы работы использованы для составления 3 методических рекомендаций МЗ РФ и 2 пособий МЗ РФ для врачей. По материалам работы получено 2 патента РФ на изобретение. Материалы диссертации представлены в 6 главах монографии и практическом руководстве для врачей.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана на русском языке, изложена на 340 страницах комьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением описания объема клинических наблюдений и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключения с обсуждением результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 362 источника, из них 171 отечественных и 191 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 62 рисунками и 68 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Обследование, лечение, родоразрешение беременных с СД, а также наблюдение их новорожденных и детей старшего возраста проводилось на базе МОНИИАГ (директор - член-корр. РАМН, профессор В.И.Краснопольский). В проведении научных исследований принимали участие сотрудники отделения клинической и экпериментальной иммунологии ГКБ №29 им. Н.Э. Баумана г. Москвы (руководитель член-корр. РАМН, профессор С.Г. Морозов), сотрудник института прикладной математики РАН - д.ф-м. наук Ю.Б. Котов.

Экспериментальные исследования проведены на 34 крысах-самках линии Вистар массой 180-220 грамм и 5 пятимесячных кроликах (2 самца и 3 самки) породы «шиншилла» массой 2,5-3 кг с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (Guidelnes for the use of animals in neuroscience research, 1992). Иммунизация лабораторных животных проводилась эмульсией олигомерного инсулина в полном адъюванте Фрейнда. Однократно вводимая доза составляла 1,5 мг инсулина на одно животное.

В эксперименте, по коррекции аутоиммунного процесса, иммунизированных животных разделили на 2 группы: а) опытная группа - 14 крыс и б) группа контроля - 10 крыс. Животным опытной группы а) проводили ежедневные интраназальные аппликации раствора инсулина (50 мкл, 40 ЕД/мл) с помощью микрошприца; аппликации инсулина проводили на протяжении 2 мес. У животных обеих групп ежемесячно на протяжении 4 мес контролировался уровень антител к инсулину и его рецепторам с помощью ИФА.

Экспериментальные доказательства способности антител к инсулину связывать ФРН проведены с помощью иммуноаффинной хроматографии, ИФА и иммунноблотинга. Сравнительный анализ связывания антител с адсорбированными антигенами проводился путем нахождения параметров изотерм сорбции Ленгмюра (Сергеев П.В., Шимановский Н.Д., 1987) и Фрейндлиха-Зельдовича (Жуховицкий А.А., Шварцман Л.А., 1987).

Способность антиидиотипических антител к инсулину взаимодействовать с мембранными инсулиновыми рецепторами была определена методом ИФА с использованием свежевыделенной суспензии обогащенных инсулиновыми рецепторами клеточных мембран мозга крыс. Полученные результаты анализировали с точки зрения конкуренции между антиинсулиновыми антиидиотипическими антителами и инсулином за связывание с мембранными инсулиновыми рецепторами.

Всем пациенткам, новорожденным и детям более старшего возраста проведено обследование с использованием стандартных клинических, биохимических, функциональных методов исследования, используемых в акушерской, неонатологической и педиатрической практике. Наряду с этим применяли ряд специальных методов исследования.

Для оценки роли аутоантител различной направленности в патогенезе перинатальных осложнений у матерей с СД применено условное их разделение на органоспецифические по отношению к СД и органонеспецифические, направленные к различным межорганным антигенам.

Для оценки органоспецифической иммунореактивности проведено определение содержания идиотипических аутоантител к инсулину и антиидиотипических аутоантител к инсулину, которые рассматриваются как антитела к рецепторам инсулина, на разработанной нами и зарегистрированной в МЗ РФ тест-системе ЭЛИ-Диа-ТЕСТ, регистрационное удостоверение № 29/25050504/6349-04.

Для оценки органонеспецифической иммунореактивности проведено определение в сыворотке крови женщин детородного возраста регуляторных аутоантител (АТ1 типа) - к фракции анионных негистоновых белков хроматина и к фракции мембранных белков, изменения уровней к которым коррелируют с неблагоприятными исходами беременности (Набор ЭЛИ-П-Тест-1; ООО «Биофарм-тест»); и аутоантител (АТ2 типа) - к суммарным фосфолипидам (ФЛ), к коллагену, к хорионическому гонадотропину (ХГЧ) и к Fc-фрагменту IgG - ревматоидный фактор (РФ) (Набор ЭЛИ-П-Комплекс, регистрационное удостоверение № 29/25050504/6345-04).

Для оценки уровня естественных нейротропных аутоантител и их антиидиотипов к белкам S100, GFAP, ОБМ и ФРН в сыворотке крови использовали набор ИФА-НЕЙРО-АТ; ООО «Биофарм-тест».

Для оценки нервно-психического развития детей 1-3 лет жизни использовали методику «Гном», включающуюся бальную оценку заданий тестирующих сенсорную, двигательную, эмоционально-волевую, познавательную и поведенческую сферы (Бадалян Л.О., 1984). К практически здоровым относятся пациенты с оценкой 90-110 баллов; группа риска по возникновению патологии ЦНС - 80-89 баллов; менее 80 баллов - группа с патологией нервной системы, нуждающаяся в консультации у психоневролога.

Для объективной оценки роста и развития плода, гормональной функции ФПК использовалась перцинтильная оценка полученных показателей. Популяционные перцентильные кривые были разработаны в отделении перинатологии МОНИИАГ.

Для оценки гормональной функции ФПК были определены в сыворотке крови гормоны: плацентарный лактоген, прогестерон, эстриол, кортизол и эмбриональный белок - альфа-фетопротеин; исследования проводились с помощью стандартных радиоиммунологических наборов отечественного и зарубежного производства с применением автоматического компьютерного гамма-счетчика 1275 - MINIGAMMA фирмы LКВ (Швеция), оснащенного специализированными системами, осуществляющими построение калибровочной кривой и получение окончательных результатов исследования (И.П. Ларичева, 1983).

Ультразвуковые методы исследования проводился на аппаратах УЗИ «SSD-650» фирмы «Aloka Ko., Ltd» (Япония), «ACUSON - 128XP10», «ACUSON SEQUOIA-512» фирмы «Акусон корпорейшен» (США), работающих в реальном масштабе времени и оснащенных допплеровскими приставками. Определяли основные фетометрические параметры (бипариетальный размер головки, диаметр груди, диаметр живота плода), локализацию, толщину и стадию структурности плаценты, а также оценку количества околоплодных вод и качественный анализ кривых кровотока в магистральных сосудах плода (в артерии пуповины, грудном отделе нисходящей аорты плода, средней мозговой артерии) и в спиральных артериях матки с последующим определением систоло-диастолического соотношения (С/Д). Число УЗ-изменений у одной пациентки колебалось от 1 до 8.

Объем клинических наблюдений. Под нашим наблюдением находилось 399 беременных с СД в процессе гестации, 381 их новорожденный и 231 ребенок более старшего возраста в катамнезе.

Основная группа представлена 290 матерями и 272 их новорожденными детьми, из них 120 (41,3%) - женщины с СД первого типа (СД 1типа), 137 (48,2%) - пациентки с гестационным СД (ГСД) и 33 (11,5%) - с СД второго типа (СД 2типа).

Для выявления патогенетических механизмов, влияющих на перинатальные осложнения, все пациенты с разными типами СД были разделены на 4 группы в зависимости от характера сывороточной органоспецифической иммунореактивности.

1 группу составили 101 женщина, состояние аутоиммунитета которых характеризовалось повышенным (по сравнению с популяционной нормой) содержанием как антиинсулиновых (АТ-И), так и антирецепторных антител (АТ-Р).

Во 2 группу вошли 58 беременных, характеризующиеся изолированной гиперпродукцией антител к инсулину (АТ-И).

В 3 группу мы включили 38 пациенток с патологически высоким уровнем только антител к рецепторам инсулина (АТ-Р).

4 группу составили 49 женщин с аномально сниженным сывороточным содержанием обоих аутоантител.

Описывая влияние органонеспецифического иммунитета, 93 пациентки с разными типами СД разделены на 3 группы в зависимости от уровня органонеспецифических (по отношению к сахарному диабету) аутоантител.

В I А группу вошли 11 женщин, имеющих низкий уровень регуляторных аутоантител (АТ1 типа) и антител, маркеров аутоиммунных процессов (АТ2 типа);

II В группу составили 28 пациенток, у которых имелись разнонаправленные изменения изучаемых аутоантител;

В III С группу вошли 54 беременных, имеющих высокий уровень изучаемых аутоантител.

Деление 272 новорожденных и 290 матерей на 6 групп проводилось с учетом тяжести состояния новорожденного при рождении и в раннем неонатальном периоде, это было критерием оценки тяжести антенатальных повреждений плода.

Группу А составили 35 (12%) матерей и их детей, родившихся в удовлетворительном состоянии с неосложненным течением раннего неонатального периода.

Группу В включены 43 (14,8%) пациентки и их новорожденные с легкой степенью перинатального поражения ЦНС при рождении. В течение раннего неонатального периода у этих детей была положительная динамика состояния и все были выписаны домой.

В группу С вошли 34 (11,7%) матери и дети, состояние которых было расценено как среднетяжелое, что потребовало проведения лечебных мероприятий.

В группу Д вошли 134 (46,2%) матерей и их новорожденных с тяжелым состоянием в течение раннего неонатального периода, за счет перинатального поражения ЦНС, которым проводилась интенсивная терапия и в дальнейшем переведенные на вторые этапы выхаживания в отделения реанимации.

Группу Е, крайне неблагоприятную в отношении прогноза, составили 26 (9%) матерей и их новорожденные, погибшие постнатально.

Группу F составили 18 (6,3%) пациенток, беременность у которых закончилась антенатальными потерями (выкидышем, антенатальной гибелью или прерыванием по медицинским показаниям).

109 пар (мать и дитя) - группа сравнения, это пациентки с СД 1 типа, которые планировали беременность и в течение всего гестационного процесса в комплекс лечебных мероприятий была включена иммунокорригирующая терапия.

186 детей основной группы и 45 детей группы сравнения наблюдались совместно с врачом психоневрологом в катамнезе (в 3, 6, 9, 12 месяцев жизни, затем 1 раз в год), у которых оценку состояния здоровья проводили по периодам детства, разделив их на 4 возрастные группы: грудной возраст - 92 ребенка, преддошкольный - 53, дошкольный - 23 и 12 детей школьного возраста. 25 детей группы сравнения были грудного возраста и 20 - преддошкольного.

Контрольную группу составили 30 беременных женщин и рожениц без эндокринной и соматической патологии, их новорожденные и дети в катамнезе.

Распределение беременных по возрасту в исследуемых группах было практически однородным, однако, более 50% пациенток с СД 2типа и ГСД были старше 31 года.

Анамнез пациенток во всех группах характеризовался высокой частотой экстрагенитальных заболеваний. Для пациенток с СД 1типа характерны перенесенные ранее краснуха (26,7%) и эпидемический паротит (27,5%), а также сопутствующая аутоиммунная патология (2,5 % хронический аутоиммунный тиреоидит). Для пациенток с СД 2 типа - ожирение (41,1%), артериальная гипертензия (45,4%) и гипоталамический синдром (14,7%). У каждой второй пациентки с ГСД ожирение (51%), артериальная гипертензия (18,9%) и гипоталамический синдром (7,2%) (р < 0,05).

Гинекологический анамнез беременных с СД характеризовался высоким процентом нарушений менструальной функции (до 58,9%) , а также бесплодием первичным (17,4%) в группе сравнения и вторичным (26,9%) в основной группе.

Акушерский анамнез характеризовался высоким уровнем перинатальных потерь в группе сравнения (34,8%) и самопроизвольными выкидышами (43,4%) и неразвивающейся беременностью (34,2%) - в основной.

Статистическая обработка экспериментальных, клинических, лабораторных и инструментальных данных проводились на основе непараметрических критериев статистики (Уилкоксона-Манна-Уитни, Смирнова, Фишера, Хи-квадрат) с помощью специализированных компьютерных программ.

Результаты исследования и их обсуждение. Имеющиеся в широкой практике диагностические системы разных производителей для определения антител к инсулину основаны на использовании иммобилизованного нативного инсулина. В то же время, использование антиидиотипических аналогов взамен соответствующих нативных антигенов позволяет значительно повысить чувствительность выявления соответствующих антител и определять антитела к широкому спектру («мажорных» и «минорных») антигенных детерминант белковых молекул (С.Г. Морозов, 2006). Принимая во внимание, что вариабельные участки поликлональных антиидиотипов являются как бы «зеркальным отображением» и, соответственно, иммунохимическими аналогами эпитопов антигена, они презентируют не только легкодоступные основные (поверхостные) эпитопы молекулы антигена, но и эпитопы, связывание антител с которыми обычно стерически затруднено. Поэтому было принято решение использовать данных подход для определения антител к инсулину.

Тест-систем для определения антител к рецепторам инсулина нами не обнаружено, а изучение самих рецепторов проводится на моноцитах крови (в лизате клеток) и недостаточно информативно, т.к. в некоторых ситуациях имеет место первичная избыточная продукция антирецепторных антител, вызывающих нарушение функции инсулиновых рецепторов.

С помощью сравнительного ИФА, выполненного на планшетах с предварительно сорбированными: а) инсулином; б) F(ab)₂-фрагментами антиидиотипических антиинсулиновых антител класса IgG и в) F(ab)₂-фрагментами не иммунных IgG, была подтверждена специфичность связывания антиинсулиновых антител именно F(ab)₂-фрагментами антиидиотипических антиинсулиновых антител, но не с F(ab)₂-фрагментами неиммунных IgG. При этом оптическая плотность реакции в лунках с F(ab)₂-фрагментами антиидиотипических антиинсулиновых антител достоверно была выше (p<0,05), чем в лунках с сорбированным инсулином. Подобное повышение специфической чувствительности можно обьяснить тем, что использование поликлональных антиидиотипических антиинсулиновых антиител, мимикрирующих под разные эпитопные участки молекулы инсулина, позволяет сделать стерически доступными (открытыми для связывания антиинсулиновыми антителами) те эпитопы, которые оказываются скрытыми в нативных молекулах инсулина. Связывание антиинсулиновых антител на лунках, покрытых F(ab)₂-фрагментами неиммунных IgG практически отсутствовало.

Способность антиидиотипических антиинсулиновых антител взаимодействовать не только с антиинсулиновыми антителами, но и мембранными инсулиновыми рецепторами (для возможности их использования в тест-системе и для понимания их участия в патогенезе некоторых осложнений) была определена методом ИФА с использованием свежевыделенной суспензии обогащенных инсулиновыми рецепторами клеточных мембран мозга крыс. Было продемонстрировано, что антиидиотипические антиинсулиновые антитела класса IgG, но не неиммунные IgG титруются на обогащенных инсулиновыми рецепторами субклеточных фракциях. Раститровка отсутствовала в контрольных экспериментах, в лунки которых сорбировали сам инсулин или БСА. Специфичность связывания антиинсулиновых антиидиотипических антител именно с инсулиновыми рецепторами мембранных фракций подтверждалась и тем, что возрастающие концентрации инсулина дозазависимым образом ингибировали связывание антиинсулиновых антиидиотипических антител, тогда как БСА или же неиммунные IgG подобного конкурентного эффекта не проявляли. диабет нервный плацентарный беременный

Проведен расчет констант диссоциации между антиидиотипическими антиинсулиновыми антителами и инсулиновыми рецепторами в условиях in vitro. Соответствующие величины составили для АТ2, выделенных из сывороток крови больных СД:

К_{d AT2(из сыворотки больных СД)} = 1 - 2* 10^-6 М

Соответствующая расчетная константа диссоциации для антиидиотипических антиинсулиновых антител, выделенных из сывороток гипериммунных кроликов (иммунизированных инсулином) составила:

К_{d AT2(из гипериммунной кроличьей сыворотки)} = 1.5 - 2* 10^-8 М

Таким образом, полученные данные явились прямым подтверждением того, что антиидиотипические антиинсулиновые антитела можно рассматривать в качестве специфических антител, взаимодействующих с лиганд-связывающим (инсулинсвязывающим) сайтом мембранных инсулиновых рецепторов.

Для определения сывороточной иммунореактивности к инсулину, зависящее от содержания или аффинности соответствующих аутоантител класса IgG, а также иммунореактивности антиидиотипических антител, связывающих антиинсулиновые антитела и взаимодействующих с рецепторами инсулина нами была создана специализированная тест-система, основными компонентами которой являлись:

1) поликлональные антиидиотипические антитела к антиинсулиновым антителам, иммуноаффинно выделенные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных инсулином человека и истощенные на неиммунных IgG кролика. В данной работе антиинсулиновые антиидиотипические антитела применялись для выявления антиинсулиновых антител, направленных ко всему пулу эпитопов инсулина;

2) поликлональные антиинсулиновые антитела, иммуноаффинно выделенные из крови иммунизированных кроликов. Этот компонент применялся для оценки содержания специфических антиинсулиновых антиидиотипических антител, которые можно рассматривать как антитела к рецепторам инсулина.

Далее был изучен вопрос об иммунохимической гомологии инсулина и фактора роста нервов, т.к. функциональная гомология ФРН и инсулина была обнаружена еще в 1965 году Frazier, а о структурном сходстве этих двух белков споры ведутся (Weis J.S. et al.,1973; Argos P. 1976; Williams R., Gaber B., Gunning J., 1982). На основании результатов более поздних работ исследователи приходят к выводу о высокой гомологии вторичной структуры В-цепи инсулина и молекулы ФРН (Sabesan M.N., 1980). Активным центром инсулина является располагающаяся ближе к C концу B-цепи аминокислотная последовательность R G F F₂₅ Y (…ArgGlyPhePheTyr...). В С-концевом фрагменте молекулы ФРН присутствует последовательность, включающая несколько ароматических аминокислот KQ₅₀YFF (…ArgGlnPhePheGluThr…), очень напоминающая активный сайт инсулина.

С помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке с инсулином, иммобилизованном на СNBr-сефарозе из пулированных образцов сыворотки крови кроликов, иммунизированных инсулином, выделяли антитела к инсулину. Элюированные антитела к инсулину пропускали через колонку, содержащую иммобилизованный ФРН, отмывали и проводили элюцию ФРН-связывающих антиинсулиновых антител. Для оценки сравнительного содержания поликлональных антиинсулиновых антител, перекрестно связывающихся и несвязывающихся с ФРН, проводили ИФА и иммунноблотинг.Установлено, что 32-35% общего пула антиинсулиновых антител из сыворотки иммунизированных инсулином кроликов эффективно связывались с ФРН. С помощью иммуноблотинга было показано, что поликлональные антитела к инсулину взвимодействуют с ФРН.

Проведенный анализ расчетных характеристик связывания антиинсулиновых/ФРН+ АТ1 и антиинсулиновых/ФРН- АТ1 позволил выявить некоторые важные особенности этих субпопуляций антиинсулиновых антител (таблица 1).

Таблица 1. Константа диссоциации, характеризующая взаимодействие кроличьих антиинсулиновых антител с сорбированными на планшетах для ИФА инсулином и фактором роста нервов

	Взаимодействие с инсулином	Взаимодействие с ФРН
	Антиинсулиновые ФРН+АТ1	Антиинсулиновые ФРН-АТ1	Антиинсулиновые ФРН+АТ1	Антиинсулиновые ФРН-АТ1
Kd, нM	23,4+4,5	31,51+4,1	30+6,4	72,8+4,7

Представленные данные свидетельствуют о присутствии в молекулах инсулина и фактора роста нервов одного (или небольшого числа) общих эпитопов. Связывание антиинсулиновых антител с сорбированными инсулином и ФРН удовлетворительно описывается уравнением изотермы Ленгмюра, что указывает на наличие в обоих белках эпитопов с близкой или одинаковой аффинностью связывания антиинсулиновых антител.

Таким образом, можно сделать заключение, что антиинсулиновые антитела способны связывать не только собственно инсулин, но и такой важнейший нейротрофин, как ФРН, за счет наличия в структуре молекул инсулина и ФРН общих или близкородственных эпитопов. Это создает почву для формирования новых представлений о патогенезе многих осложнений, сопровождающих СД и диабетическую фетопатию, влекущее за собой нарушения роста и дифференцировки центральной и периферической нервной системы.

Трансплацентарно переносимые материнские антитела класса IgG не только играют роль факторов непосредственной внутриутробной иммуноагрессии, но и оказываются важны для специфической “настройки” иммунной системы будущего ребенка, проявляющейся в виде феномена эпигенетического иммунного импринтинга. Этим термином обозначается длительное запечатление (на месяцы и годы жизни) особенностей гуморального иммунного статуса матери, но не отца, в репертуарах синтезируемых и секретируемых cобственных антител ребенка [A.B.Poletaev, 1996].

Мы исследовали сыворотки пар мать-новорожденный (n = 275) и мать-ребенок 2-5-лет (n = 186), а также в 49 дополнительных семейных группах мать-отец-ребенок (дети больные детским церебральным параличем в возрасте 3-6 лет), на содержание спектра органоспецифических и органонеспецифических аутоантител, определяемых при выполнении данной работы. В таблице 2 представлены коэффициенты корреляции по некоторым антигенам в парах. При анализе сывороточного содержания аутоантител к перечисленным в таблице 2 антигенам отмечается выраженное сходство (т.е. однонаправленность отклонений) иммунореактивности у 51% пар мать-ребенок, у 30% сходство было частичным, а у 19% пар уровни иммунореактивности матери и ее новорожденного ребенка были мало сопоставимы (коэффициент корреляции - R от 0,54 до 0,88).

Таблица 2. Коэффициент корреляции в парах по ряду антигенов

	Коэффициент корреляции
Антигены	Мать-новорожденный	Мать-здоровый ребенок	Мать-больной ребенок	Отец-больной ребенок
ОБМ	0,54*	0,35*	0,35	0,15
АТ-И	0,79**	0,21	0,09	0,01
АТ-Р	0,61**	0,11	0,17	- 0,22
S-100	0,62**	0,19	0,66*	0,19
Коллаген	0,64**	0,24	0,24	0,23
АТ-И	0,88**	0,30*	0,77*	0,21
АТ-Р	0,78**	0,23	0,71*	0,18

Здесь и далее * звездочкой отмечены достоверно различающиеся результаты (р < 0.05), ** достоверно различающиеся результаты (р < 0.01)

При анализе особенностей иммунореактивности в парах мать-здоровый ребенок в возрасте 2-5 лет, выраженное сходство сохранялось приблизительно в 30% случаев. Сходство анти-S100 реактивности у матери и 3-6-летних детей, больных детским церебральным параличем, сохранялось более стойко в 77% случаев.

Таким образом, феномен переноса особенностей гуморального иммунного статуса от матери к ребенку (феномен иммунного импринтинга) является общим правилом, как для случаев клинической нормы, так и для патологии. Малая зависимость феномена от особенностей генного набора (получаемого ребенком от обоих родителей в равной мере), наглядно демонстрируется отсутствием сходства иммунореактивности к изучаемым антителам между сыворотками ребенка и отца (R от -0,22 до 0,23).

Теоретически модуляция антигенспецифического иммунного статуса потомства материнским организмом, может базироваться по крайней мере на трех принципиально разных механизмах: трансплацентарном переносе собственно материнских антител в кровоток плода; пренатальном примировании определенных клонов лимфоцитов ребенка материнскими антиидиотипическими антителами и трансплацентарном переходом лимфоидных клеток клеток памяти от матери и длительной (месяцы и годы) персистенцией и функционированием их в организме ребенка (Хлыстова З.С., 1987).

Рассмотренные варианты предполагаемых механизмов феномена иммунного импринтинга не являются взаимоисключающими и, возможно, дополняют друг друга в реальной системе мать-плод. Эти экспериментальные данные дают основания для разработки новых подходов к профилактике иммуннозависимых осложнений.

Предложена лабораторная модель специфической десенсибилизации (низкодозовой антигенспецифической иммуносупрессии) для профилактики и коррекции аутоиммунных нарушений путем интраназальнных аппликаций низкими дозами инсулина, которые приводят к стойкому и длительному снижению антител к инсулину, уменьшая аутоагрессию.

Еще в 1946 году в работах Chase на модели морских свинок, сенсибилизированных динитрохлорбензолом, было установлено, что скармливание животным специфического аллергена сопровождается выраженным снижением кожной реактивности на его аппликацию. В работе группы Harrison L.C. et al. (1996) из The Walter & Elisa Hall Institute of Medical Research (Melbourne, Australia) описывается метод экспериментальной профилактики развития СД 1типа у мышей линии NOD. Препарат инсулина в виде аэрозольной суспензии авторы распыляли на слизистую носа животных в субклинической стадии развития СД 1типа. Многократные повторные аппликации инсулина, блокировали возникновение клинически выраженного заболевания и предотвращали или резко снижали выраженность морфологических изменений в островковых бета-клетках поджелудочной железы животных. Повторные аппликации микроколичеств инсулина, очевидно, повышают активность специфических супрессорных Т-лимфоцитов, имеющих рецепторы класса гамма/дельта, которые, предположительно, и подавляют органоспецифические (антипанкреатические) патологические аутоиммунные процессы разной антигенной направленности (Weiner H.L., 1997).

Предварительно иммунизированных животных разделили на 2 группы: а) опытная группа - 14 крыс, которым проводили ежедневные интраназальные аппликации раствора инсулина (50 мкл, 40 ЕД/мл) с помощью микрошприца; аппликации инсулина проводили на протяжении 2 мес; и б) группа контроля - 10 крыс, использовавшихся для оценки хода естественного снижения сывороточных уровней антиинсулиновых и антирецепторных антител после прекращения иммунизации.

У животных обеих групп ежемесячно на протяжении 4 мес. определяли уровни антител к инсулину и его рецепторам и анализировали динамику изменений в их содержании.

В таблице 3 представлена сравнительная динамика изменений уровней антител к инсулину и его рецепторам у крыс опытной группы и группы контроля. Как видно из таблицы 3 у животных опытной группы, получающих специфическую десенсибилизацию, в динамике наблюдений отмечается достоверное снижение уровня антител к инсулину и его рецепторам, отличное от хода естественного снижения АТ-И и АТ-Р после прекращения иммунизации.

Таблица 3. Динамика уровня антител к инсулину и его рецепторам у экспериментальных животных

Уровень антител к инсулину (АТ1) и его рецепторам (АТ2) в УЕ, медиана и ее квартили
		После иммунизации	Спустя 1 мес.	Спустя 2 мес.	Спустя 3 мес.	Спустя 4 мес.
Опытная группа	АТ-И	92 + 18	82 + 25	37 + 11*	18 + 10*	13 + 4*
	АТ-Р	75+ 11	84+ 10	55 + 13*	33 + 12*	24+ 15*
Контрольная группа	АТ-И	97 + 21	72 + 18	68 + 12	61 + 18	57 + 10
	АТ-Р	98+ 13	84+ 15	73+ 9	69+ 16	55+ 12

Согласно теории «иммунной сети», регуляция иммунного ответа осуществляется за счет взаимодействия идиотипических и антиидиотипических структур, формируемых в организме. Так, пролиферация клона В-клеток и продукция ими антител - так называемых «первых» или идиотипических антител приводит к стимуляции клонов В-клеток, продуцирующих антиидиотипические антитела или антитела «второго» порядка, которые, в свою очередь, регулируют продукцию «первых» (Jerne N.K., 1974).

Таким образом, снижение уровня антител к рецепторам инсулина у животных опытной группы, очевидно, связано со снижением у них антител к инсулину. Результаты данного эксперимента говорят как об эффективности интраназальной десенсибилизирующей терапии, так и раскрывают перспективы новых подходов специфической иммунокоррекции аутоиммунных нарушений при СД за счет специфического нормализующего воздействия на патогенетическое аутоиммунное звено.

У всех пациенток СД имелись нарушения органоспецифического и органонеспецифического иммунитета. Причем 76,7 % пациенток имели постоянное, стойкое изменение органоспецифического аутоиммунитета разной степени выраженности, а у 23,3% пациенток с СД имелись постоянные нарушения органонеспецифического аутоиммунитета, что позволило их разделить на группы.

Выделенные четыре варианта аномальной продукции АТ-И и АТ-Р аутоантител отличаются от литературных данных, согласно которым, нарушения изучаемых показателей у беременных с разными типами СД проявляются только в виде патологической активации синтеза АТ-И и АТ-Р, причем, в подавляющем большинстве случаев, речь идет об изолированной гиперпродукции АТ-И, встречающихся с частотой от 75% до 92% (Зубков В.Н., 1987; Дедов И.И., 2007).

Выделенные 3 группы нарушений органонеспецифического иммунитета, с иммунологической точки зрения, позволяет первую группу рассматривать как группу с выраженной иммуносупрессией гуморального звена иммунитета, а третью - как группу с выраженной аутоиммунной агрессией. Это дает возможность дифференцированного подхода к терапии иммунологических нарушений. Вторая группа - группа разнонаправленных нарушений служит «моделью» пациенток, получающих различную иммунокорригирующую терапию, т.к. прежде чем прийти в норму иммунные показатели могут иметь разнонаправленные изменения.

Выявленные в работе органоспецифические и органонеспецифические нарушения аутоиммуннитета (несмотря на индивидуальную вариабельность изучаемых показателей), сохраняют свои характеристики на протяжении всего гестационного периода, что свидетельствует об отсутствии влияния беременности на продукцию изучаемых аутоантител. Аналогичного мнения в отношении АТ-И придерживается и Т.В.Себко (1991).

Мы рассмотрели особенности течения разных типов диабета в зависимости от уровня органоспецифической иммунореактивности.

Анализ корреляций характера нарушений аутоиммунного гомеостаза и особенностей диабетического анамнеза в определенной степени отражает патогенетическую последовательность событий с точки зрения аутоиммунной природы развития СД 1 типа. По данным литературы (Colman P.G. et all., 1998), патологический уровень АТ к инсулину нередко выявляется за месяцы и годы до манифестации болезни. Последствием гиперпродукции АТ-И служит их способность к индукции синтеза антиидиотипических/антирецепторных (АТ-Р) антител (А.Б.Полетаев и др., 1998; Elias D. et al., 1987). В наших исследованиях самый «маленький» стаж диабета был зарегистрирован во 2-ой группе, а наибольшая продолжительность болезни, сопровождающаяся тяжелым течением - у пациенток 1 и 3 групп.

При изолированном повышении АТ-И мы выявили следующие характерные особенности основного заболевания: компенсированное (либо субкомпенсированное) его течение на протяжении практически всего срока гестации, во 2 и 3 триместре p<0,01; развитие легких гипогликемических состояний (купирующихся приемом углеводов) в первом (p<0,05) и третьем триместрах беременности; более высокая (p<0,008) частота прогрессирования диабетической полинейропатии.

При изолированной гиперпродукции АТ-Р картина основного заболевания характеризовалась: самым высоким уровнем гликемии на протяжении практически всей беременности (p<0,002); значительным (в среднем на 96-105% от исходного уровня) ростом инсулинопотребности, начиная с 15-16 нед. гестации и максимумом в 28-30 нед. (p<0,004); развитием тяжелых гипогликемических состояний во втором и начале 3 триместра (p<0,05).

При наличии сочетанной гиперпродукции изучаемых антител характерными признаками СД являются: субкомпенсированное течение заболевания, начиная с 6-8 нед., и на протяжении 2 и 3 триместров беременности с периодическими эпизодами декомпенсации (в 20-24 нед. и 30-35 нед.); частые (p<0,05) и выраженные эпизоды гипогликемии в 1-ом (у 72,2% пациенток) и в конце 3-го триместра гестации (у 77,8%); менее выраженное (по сравнению с 3-ей группой) возрастание инсулинопотребности (примерно на 50%), начиная с 20-21 нед. гестации, с максимумом в 31-32 нед.

У беременных со сниженной иммунореактивностью как АТ-И, так и АТ-Р отличительной особенностью являлось практически полное отсутствие динамики в изменении инсулинопотребности на протяжении всего гестационного процесса (p<0,002).

Анализ особенностей гестационного процесса в зависимости от уровня сывороточной иммунореактивности органоспецифических и огранонеспецифических аутоантител достоверных различий между разным типам СД не выявил, что дало возможность провести анализ без учета типа у 246 пациенток.

У 85,8% пациенток, имеющих нарушения органоспецифического иммунитета, развился гестоз. Причем, самая высокая частота и тяжесть акушерских осложнений наблюдалась в 3 группе (при изолированном повышении АТ-Р). У 100% больных этой группы развился гестоз, причем у 44,4% тяжелый и у 50% - среднетяжелый, что достоверно чаще тяжелых (p<0,00003) или средне-тяжелых (p<0,0001) его форм по сравнению с другими группами. У 88,9% пациенток имело место раннее присоединение многоводия, которое носило более выраженный характер.

У женщин 2 группы (с повышенным уровнем только АТ-И) достоверно чаще (p<0,04) отмечалось присоединение легких форм гестоза (63,3%), лишь в 16,7% наблюдений имел место гестоз средней степени тяжести, совсем отсутствовали тяжелые его формы, у 20% пациенток беременность протекала без указанного осложнения. В данной группе самая низкая частота многоводия - 43,3%.

У пациенток 1 группы в 66,7% случаев отмечались среднетяжелые формы гестоза и лишь у 11,1% - тяжелые, что достоверно ниже чем в 3 группе (р<0,0003).

В 4 группе (гипореактивная по АТ-И и АТ-Р) главной проблемой являлось присоединение гнойно-воспалительных осложнений (у 39,2%) (инфекции мочевыводящих путей, кольпиты, бессимптомная бактериурия, гестационный пиелонефрит, обострение хронического пиелонефрита), (р<0,05), кроме того, у них же была отмечена достаточно высокая частота присоединения вирусно-бактериальных урогенитальных инфекций (герпетической, цитомегаловирусной, хламидийной и др.).

Изучены особенности течения беременности у больных СД, имеющих разные типы нарушения органонеспецифического иммунитета. У данных пациенток наиболее частым осложнением было многоводие в 40,9% наблюдений, причем в группе III С у 81,8% и в группе II В у 50%, что значительно чаще, чем в I А (27,8%) (p<0,005).

У 69,9% пациенток отмечалось присоединение гестоза, причем тяжелых его форм в наших наблюдениях не отмечалось. Гестоз легкой степени тяжести имел место в 55,9% наблюдений, в исследуемых группах он встречался практически с одинаковой частотой. Гестоз средней степени тяжести отмечен в 14% наблюдений, и он был характерен (p<0,01) для больных, имеющих значительное снижение уровня органонеспецифического иммунитета - в этой группе он имел место в 36,4% случаях, тогда как в I А и II В группах встречался в 11,1% и 10,7% случаях соответственно.

...