Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование с 1 мМ Н2О2 и ингибитором ML3403; г - культивирование с 1 мМ Н2О2 и ингибитором SP600125; д - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями; е - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro c ML3403; ж - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro c SP600125

Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что ингибирование МАР-киназ р38 и JNK препятствует реализации программированной клеточной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Полученные данные могут служить доказательством того, что в условиях окислительного стресса мононуклеарных лейкоцитов МАР-киназы JNK и р38 выступают в качестве проапоптогенных регуляторных молекул. Это предположение согласуется с приводящимися в литературе сведениями о защитной роли ингибиторов р38 и JNK в случае сердечной дисфункции и апоптоза кардиомиоцитов, индуцированного ишемией [Meldrum D.R. et al., 1998; Barancik M. et al., 2000; Schneider S. et al., 2001]. Так, апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией и доксорубицином в культуре, снижался при ингибировании р38 МАРК [Zhu W. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. V.L.Gabai et al. [2000] показали, что ингибирование JNK в Н9с2 миоцитах блокировало апоптоз, вызванный окислительным стрессом.

При обсуждении результатов, полученных в экспериментах с ингибиторами МАР-киназ, возникают следующие вопросы: каковы молекулярные механизмы проапоптогенного эффекта МАР-киназ в условиях изменения редокс-статуса клетки; сопряжена ли данная функция JNK и р38 с увеличением содержания в мононуклеарных лейкоцитах их активных (фосфорилированных) форм, которые могут оказывать воздействие на другие мишени - элементы сигнальной системы (факторы транскрипции, белки-регуляторы апоптоза); чем может быть обусловлено это увеличение - изменением общего содержания киназ при окислительном стрессе за счет увеличения их экспрессии, либо только активацией процесса фосфорилирования?

Результаты проведенной методом вестерн-блоттинга оценки содержания в мононуклеарных лейкоцитах общих и фосфорилированных форм JNK и р38 показали, что при окислительном стрессе, индуцированном добавлением 1мМ Н2О2 в культуру клеток, полученных у здоровых доноров, общее содержание JNK (JNK1 и JNK2) и р38 не изменялось по сравнению с контролем. Аналогичные результаты были получены и в клинике острого воспаления - общий уровень JNK и р38 в мононуклеарных лейкоцитах в этом случае соответствовал норме. Вместе с тем содержание фосфорилированных форм МАР-киназ (р-JNK и р-р38) увеличивалось по отношению к контролю при инкубации мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1мМ Н2О2, и в клетках крови у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (рис. 4, 5). Полученные данные свидетельствуют о том, что при окислительном стрессе увеличение уровня р-JNK и р-р38 обусловлено АФК-зависимой активацией процесса фосфорилирования и не связано с изменением активности экспрессии данных ферментов в клетке.

АФК могут влиять на активность JNK и р38 посредством различных реакций [Brumell J.H., 1996; Турпанов К.Т., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. В частности, АФК активируют белки MAPK Kinase Kinase (в частности, белок ASK1- Apoptosis signal-regulating kinase 1, активирующий как JNK, так и р38), которые запускают сигнальный каскад [Tobiume K. et al., 2001; Matsuzawa A., Ichijo H., 2005]. JNK удерживается в неактивной форме глутатион-S-трансферазой класса Pi (GSTPi). Под действием Н2О2 происходит диссоциация этого комплекса и активация киназы JNK [Mathers J. et al., 2004; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Гидроксиноненаль - конечный продукт перекисного окисления липидов - образует аддукт с JNK, вызывая ее активацию [Дубинина Е.Е., 2001]. АФК инактивируют фосфатазы, отщепляющие фосфатные группы от специфических ферментов, вызывая тем самым их инактивацию [Klein J.A, Ackerman S.L., 2003; Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Повышенный уровень АФК часто коррелирует с активацией фосфорилирования JNK и р38 [Baines C.P. et al., 2005; Gautam D.K. et al., 2005; Teraishi F. et al., 2005; Cho S.D. et al., 2006], что подтверждается результатами настоящего исследования.

Рис. 4. Содержание общих и фосфо-форм р38 МАРК в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе (содержание белка р38 в интактной культуре здоровых доноров принято за 100%)

При окислительном стрессе МАР-киназы опосредованно влияют на реализацию программы апоптоза, участвуя в регуляции продукции ряда цитокинов. В указанном аспекте нами было рассмотрено влияние JNK и р38 на продукцию IL-8 и IL-10 мононуклеарными лейкоцитами при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. С одной стороны, продукция IL-8, обусловленная NF-кB-зависимой индукцией промотора гена IL-8, может служить косвенным признаком активации данного транскрипционного фактора, предположительно участвующего в апоптозе; IL-10 интересовал нас в силу своего антиапоптогенного действия. С другой стороны, данные цитокины обладают про- и антивоспалительным эффектами (IL-8 и IL-10 соответственно), что еще более обосновывает целесообразность оценки их продукции в случае острого воспаления.

Рис. 5. Содержание общих и фосфо-форм JNK1/2 в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении (содержание JNK1/2 в интактной культуре у здоровых доноров принято за 100%)

Как свидетельствует проведенное исследование, содержание провоспалительного цитокина IL-8 в супернатантах исследованных культур мононуклеаров превышает контрольные значения в случае окислительного стресса in vitro и при остром воспалении. Редокс-чувствительная киназа JNK (в отличие от р38) влияет на продукцию IL-8, что подтверждается экспериментом с использованием селективного ингибитора SP600125; ингибитор р38 МАРК ML3403 не обладает таким эффектом (рис. 6).

Представленные результаты вполне согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми ингибитор JNK SP600125 блокирует экспрессию мРНК IL-8 и уменьшает продукцию данного цитокина различными клетками (эндотелиоциты, альвеолоциты А549, бронхиальные эпителиоциты человека) [Li L.F. et al., 2003; Saatian B. et al., 2006]. Для экспрессии воспалительных медиаторов -- цитокинов, металлопротеиназ и адгезивных молекул - необходима активация JNK в присутствии АФК [Kathleen A., Johnson G. L., 2002; Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004].

Регуляция IL-8 МАР-киназами отличается в зависимости от природы стимулов [Shapiro L., Dinarello C.A., 1995; Li L.F. et al., 2003; Kim M.S. et al., 2005; Harimaya A. et al., 2007] и типа клетки [Hashimoto S. et al., 1999; Li J. et al., 2002; Oudin S., Pugin J., 2002; Li L.F. et al., 2003; Aydin M. et al., 2007]. Окислительный стресс, вызванный экзогенной Н2О2, индуцирует синтез IL-8 в эпителиальных и эндотелиальных клетках [Lakshminarayanan V. et al., 1997; Shimada T. et al., 1999]. Этот факт подтверждают и результаты проведенного нами эксперимента. После культивирования мононуклеарных лейкоцитов крови, полученной у здоровых доноров, с 1 мМ Н2О2 определялось, как было показано выше, повышенное содержание IL-8 в супернатантах клеток (рис. 6).

Рис. 6. Содержание IL-8 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов при ингибировании МАР-киназ р38 и JNK в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении

Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором JNK SP600125; г - культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором р38 ML3403; д - интактная культура клеток у больных острым аппендицитом; е - интактная культура клеток у больных внебольничной пневмонией; ж - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором JNK SP600125; з - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором р38 ML3403

Роль р38 МАР-киназы в регуляции синтеза IL-8 неоднозначна. Так, по данным ряда авторов, ингибитор р38 МАРК (SB 203580) значительно снижает продукцию данного цитокина, опосредуя свое действие через NF-kB [Kim M.S. et al., 2005; Saatian B. et al., 2006; Harimaya A. et al., 2007]. Напротив, L.F. Li et al. (2003) показали, что ингибирование р38 МАРК не вызывает снижение экспрессии и секреции IL-8, предположив, что регуляция данных процессов осуществляется через активацию АР-1, NF-kB, зависящую от JNK и NIK (NF-kB-inducing kinase).

Еще одним важным цитокином, продуцируемым мононуклеарными лейкоцитами крови при острых воспалительных заболеваниях, сопровождающихся окислительным стрессом, является интерлейкин-10. Известно, что IL-10 способен подавлять апоптоз [Go N.F. et al., 1990]. Имеются многочисленные сведения о способности этого цитокина ингибировать апоптоз В-лимфоцитов, активированных Т-клеток [Pawelec G. et al., 1996; Cohen S.B. et al., 1997; Рубцова И.Е. и соавт., 2004].

Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют об отсутствии изменений содержания IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов как в случае окислительного стресса in vitro так и при острых воспалительных заболеваниях.

Для выяснения роли р38 и JNK МАР-киназ в регуляции синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса мы использовали их селективные ингибиторы (ML3403 и SP600125, соответственно). В результате настоящего исследования было показано, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма ни р38, ни JNK не влияют на продукцию IL-10 мононуклеарами. Отсутствие изменений синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса и при ингибировании МАР-киназ наводит на мысль об отсутствии участия обозначенных редокс-сигнальных систем в продукции данного цитокина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что роль киназ JNK и р38 в регуляции апоптоза и продукции клетками IL-8 и IL-10 в условиях острого воспаления весьма неоднозначна. Факт возрастания продукции IL-8 может свидетельствовать об активации в условиях воспалительного процесса JNK транскрипционных факторов (в частности, NF-kB). Последний в ряде случаев может выполнять как про-, так и антиапоптогенную функцию. Отсутствие возрастания продукции антиапоптотического цитокина IL-10 может являться одним из условий для активации летальной программы клеток. Кроме того, в рассмотренных условиях имеет место отчетливый дисбаланс между продукцией про- и антивоспалительных цитокинов (IL-8 и IL-10, соответственно) в пользу первых.

В целом, рассмотренные в данной главе результаты исследования свидетельствуют об участии МАР-киназ JNK и р38 в реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе в условиях in vitro и в клинике острого воспаления. Регуляторное влияние данных МАР-киназ может быть опосредовано другими редокс-чувствительными элементами внутриклеточных систем сигнальной трансдукции, в частности транскрипционными факторами. Среди последних важнейшую роль в инициации/блокировании летальной программы клеток играют р53 и NF-kB, влияющие на баланс про- и антиапоптогенных белков-регуляторов.

УЧАСТИЕ РЕДОКС-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Известно, что АФК влияют на жизнеспособность клетки, изменяя экспрессию генов за счет транскрипционных факторов, которые связываются с регионами генов-мишеней и изменяют их транскрипцию. Находясь в цитоплазме в неактивном состоянии, данные факторы не могут влиять на генетическую информацию. Сигнальное событие (непосредственное воздействие АФК, фосфорилирование киназами и др.) приводит к транслокации белковых субъединиц транскрипционного фактора в ядро [Wenger R.H., 2000].

Одним из важнейших редокс-регулируемых транскрипционных факторов является р53. Под контролем p53 находится огромное число генов, белковые продукты которых в ответ на различные стрессорные воздействия индуцируют апоптоз, клеточное старение или арест деления клетки [Моргункова А. А., 2005]. Другим транскрипционным фактором, активирующимся в условиях окислительного стресса, является NF-kB. Данный протеин играет существенную роль в регуляции иммунного ответа, воспалительной реакции, а также в контроле клеточного деления и апоптоза [Pahl H.L., 1999; Bonizzi G., Karin M., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006].

Механизмы взаимодействия транскрипционных факторов NF-kB и р53 относятся к числу наиболее противоречивых вопросов в оценке влияния генотоксического стресса на жизнедеятельность клетки. Несмотря на накопленный к настоящему времени фактический материал о роли NF-kB и р53 в жизнедеятельности клетки, существуют значительные пробелы в оценке исходов активации данных транскрипционных факторов в зависимости от природы индуцирующего сигнала и сопутствующих условий стимуляции. Неоднозначность влияния данных транскрипционных факторов на реализацию апоптоза затрудняет понимание их участия в возникновении нарушений летальной программы клеток при окислительном стрессе. Данное обстоятельство явилось предпосылкой для проведения нами исследования роли NF-kB и р53 в реализации прогаммированной гибели при дисбалансе окислительного метаболизма.

Методом вестерн-блоттинга нами было зарегистрировано появление р53 в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров, после воздействия на клетки перекиси водорода в концентрации 1мМ; примечательно, что данный белок отсутствовал в контроле и в клетках, полученных у больных пневмонией. По данным литературы, р53 имеет короткий период полужизни и, в зависимости от типа клеток и природы стрессового сигнала, инактивируется в течение 6-20 мин MDM2 убиквитин-лигазой [Dornan D. et al., 2004]. Отсутствие р53 в мононуклеарах, выделенных из периферической крови у больных внебольничной пневмонией, несмотря на высокий уровень внутриклеточной продукции АФК, может быть обусловлено, на наш взгляд, образованием комплекса р53-MDM2 в результате более продолжительного, по сравнению с экспериментальной моделью, нарушения окислительного баланса в организме.

Результаты исследования свидетельствуют, что при культивировании мононуклеарных лейкоцитов с селективными ингибиторами JNK и р38 в условиях эксприментального окислительного стресса имеет место снижение содержания фосфо-формы белка р53 (рис. 7). Следует заметить, что применение как ингибитора JNK (SP600125), так и р38 (ML3403) предотвращало запуск апоптогенной программы, индуцированной окислительным стрессом. Таким образом, полученные данные подтверждают факт участия редокс-чувствительных киназ JNK и р38 в р53-опосредованном апоптозе. С позиции р53 могут быть объяснены выявленные нами особенности реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе.

Известно, что р53 необходим для реализации митохондриального пути апоптоза [Juin P. еt al., 2002; Moll U.M. et al., 2005]. Он способствует снижению трансмембранного митохондриального потенциала и выходу цитохрома с в цитоплазму, так как связывает антиапоптотические протеины Bcl-2 и Bcl-XL [Prives C., Hall P.A., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. Как свидетельствуют данные литературы, р53 способен осуществлять транскрипционный контроль апоптотических протеинов семейства Bcl-2 (мультидоменный Bax, только-BH3 протеины: PUMA, Noxa, Bid) [Nakano K., Vousden K.H., 2001; Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002].

Рис. 7. Содержание фосфо-формы р53 в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров в условиях окислительного стресса при ингибировании МАР-киназ р38 и JNK (уровень фосфо-формы р53 в культуре мононуклеарных лейкоцитов в условиях инкубирования с 1мМ Н2О2 принят за 100%)

Транскрипционный фактор NF-kB сформирован из нескольких субъединиц (чаще всего из р50/RelA(p65) частиц) [Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. Анализ содержания р65 субъединицы в мононуклеарных лейкоцитах показал, что данный белок появляется в клетках, полученных у здоровых доноров, после воздействия на них 1 мМ Н2О2 и присутствует в мононуклеарных лейкоцитах, выделенных из крови у больных внебольничной пневмонией. Индукция NF-kB происходит при высвобождении р65 частицы из комплекса с ингибитором за счет фосфорилирования последнего IkB-киназным комплексом. Подобный «классический» вариант активации наблюдается при воздействии воспалительных цитокинов, таких как TNF-б и IL-1, под влиянием бактериальной инфекции и липополисахаридов [Haddad J., 2002]. Также активация NF-kB может быть опосредована каскадом TNFб-TNFR1-TRADD-RIP-NIK-киназа-NF-kB и атипичными индукторами (УФ-излучение, гипоксия/реоксигенация, перекись водорода, лекарственные вещества) [Mukhopadhyay A. et al., 2000; Bui N.T. et al., 2001; Bonizzi G., Karin M., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. В нашем случае при добавлении экзогенной перекиси водорода в культуру клеток, полученных у здоровых доноров и больных острым воспалением, в мононуклеарных лейкоцитах происходило появление активной формы NF-kB. Полученные результаты позволяют предполагать доминирующую роль АФК в индукции данного транскрипционного фактора при дисбалансе окислительного метаболизма. Возможно, активирующие сигналы при остром воспалении (TNF-б, бактериальные липополисахариды), наряду с АФК, приводят к высвобождению NF-kB из комплекса с ингибитором. Однако показано, что р65 субъединица вызывает индукцию генетической транскрипции IkB частицы, которая может связаться с NF-kB и вернуть его в неактивное состояние [Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Viatour P. et al., 2005]. Подобная негативная регуляция функции NF-kB может объяснять одинаковый уровень данного транскрипционного фактора в клетках при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении.

Таким образом, в нашей работе продемонстрирована редокс-зависимая активация NF-kB - фактора, ответственного за выживание клеток и пролиферацию [Kucharczak J. et al., 2003; Perkins N.D., 2004], и р53, индуцирующего апоптоз [Schmitt C.A. et al., 2002; Soussi T., 2005; Levine A. et.al., 2006], на что указывало появление р53 и незаингибированной формы NF-kB в мононуклеарных лейкоцитах крови под действием 1 мМ перекиси водорода. Однако, как свидетельствуют полученные ранее данные, результирующим вектором актвации р53 и NF-kB является повышение апоптотической реакции клеток, что свидетельствует о неэффективности антисуицидальной регуляции NF-kB. Показано, что указанные транскрипционные факторы конкурируют между собой за один пул генов-коактиваторов, поэтому недостаток транскрипционной активности NF-kB связывают с ее повышением для р53 [Mattson M.P., Meffert M.K., 2006].

В литературе существует ряд гипотез, объясняющих отсутствие антиапоптотического эффекта активации NF-kB. Так, по данным N.D. Perkins, T.D. Gilmore [2006], функция NF-kB из антиапоптотической может трансформироваться в проапоптотическую в зависимости от природы индуцирующего сигнала. Существует другая гипотеза, объясняющая проапототическую роль NF-kB под действием ряда стимулов (например, УФ-излучение, доксорубицин). Показано, что высвобождение RelA субъединицы из комплекса с ингибитором является лишь первым этапом функционирования NF-kB. Вторая фаза заключается в перемещении транскрипционного фактора из цитоплазмы в ядро, при котором может происходить модификация NF-kB, приводящая к изменению его транскрипционного потенциала [Chen L.F., Greene W.C., 2004]. Однако итоговый результат транскрипционной активности NF-kB и р53 определяется во многом особенностями ответа генов-мишеней [Ho W.C. et al., 2005]. В связи с этим следующим шагом нашего исследования явилась оценка экспрессии м-РНК и содержания белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе.

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Среди генов, являющихся мишенями NF-kB и р53, важную роль в регуляции летальной программы клеток играют гены, кодирующие белки семейства Bcl-2 с про- и антиапоптотической функцией. Баланс системы этих белков определяет исход индукции программированной гибели. Данное соотношение может определяться как активацией экспрессии соответствующих генов, так и посттрансляционной модификацией протеинов [Wenger R.H., 2000; Chen L. et al., 2005]. Чтобы выяснить, вовлечены ли указанные механизмы в дизрегуляцию апоптоза клеток при окислительном стрессе, нами было проведено исследование, результаты которого отражены в данной главе.

Про- и антиапоптогенные белки регулируют реализацию программы апоптоза, а модуляция баланса различных активирующих и ингибирующих взаимодействий данных протеинов играет определяющую роль в судьбе клетки. В связи с этим при изучении молекулярных механизмов регуляции летальной программы в условиях окислительного стресса особый интерес для нас представляло исследование экспрессии и содержания про- и антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad). Мы исходили из предпосылок, что взаимодействие данных протеинов определяется состоянием редокс-зависимых сигнальных систем клеток, включающих в том числе МАР-киназы и факторы транскрипции NF-kB и р53. Если МАР-киназы могут непосредственно фосфорилировать белки-регуляторы апоптоза, действуя на посттрансляционном уровне, то транскрипционные факторы изменяют экспрессию соответствующих генов-мишеней. Исходя из данного предположения, в нашем исследовании определялись экспрессия м-РНК и содержание белков в мононуклеарных лейкоцитах при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. Кроме того, для оценки роли редокс-чувствительных МАР-киназных систем сигнальной трансдукции в механизмах нарушения баланса про- и антиапоптогенных белков при окислительном стрессе, было исследовано содержание Bcl-2 и Вах в мононуклеарных лейкоцитах, инкубированных с селективными ингибиторами SP600125 и ML3403.

Полученные методом ПЦР в реальном времени данные свидетельствуют о повышении по сравнению с контролем (p<0,05) уровня экспрессии мРНК гена bcl-XL в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении (табл. 2).

Таблица 2

Уровень экспрессии мРНК (усл.ед.) генов bcl-2, bcl-XL и bax в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров, при экспериментальном окислительном стрессе и у больных внебольничной пневмонией (Me(Q1-Q3))

Примечание:

p1 - достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре мононуклеарных лейкоцитов; p2 - по сравнению с окислительным стрессом in vitro.

Известно, что ген bcl-XL кодирует антиапоптотический белок семейства Bcl-2 и является мишенью NF-kB [Kucharczak J. et al., 2003]. В связи с этим логично было бы ожидать, что активация NF-kB приводит к индукции антисуицидальных генов-мишеней. Вместе с тем, как свидетельствуют представленные выше данные, несмотря на адекватную стимуляцию NF-kB-зависимого антиапоптотического ответа, мононуклеарные лейкоциты вступают на путь программированнной гибели в условиях увеличения внутриклеточной АФК-продукции. При этом исследование содержания Bcl-XL в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров (интактная культура, экспериментальный окислительный стресс) и у пациентов с острым воспалением не выявило различий (рис. 8). Полученные данные, вероятно, правомерно объяснить посттрансляционной модификацией Bcl-XL, приводящей к изменению его нативной структуры и функции. В частности, возможна модификация указанного белка в результате фосфорилирования или взаимодействия с регуляторными ВН3-протеинами [Willis S.N. et al., 2005].

Анализ уровня экспрессии мРНК гена bcl-2 и содержания антиапоптотического белка Bcl-2 в мононуклеарных лейкоцитах не выявил каких-либо достоверно значимых различий по сравнению с контролем в случае воздействия Н2О2 на клетки здоровых доноров и в случае острого воспаления.

А В

С

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис .8. Содержание Вах (А), Bcl-2 (В) и Bcl -XL (С) в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении (содержание белков в интактной культуре здоровых доноров принято за 100%)

Описанные результаты исследования являются косвенным доказательством отсутствия редокс-чувствительного механизма регуляции активности Bcl-2 или подавления функции данного белка при дисбалансе окислительного метаболизма. Для того, чтобы проверить данное предположение, мы оценивали внутриклеточное содержание Bcl-2 при окислительном стрессе в присутствии ингибиторов МАР-киназ SP600125 и ML3403. Оказалось, что уровень белка Bcl-2 в мононуклеарных лейкоцитах крови, полученной у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, возрастал как при действии ингибитора SP600125, так и ML3403. Это свидетельствовало в пользу того, что МАРК-опосредованные редокс-чувствительные механизмы препятствуют увеличению содержания антиапоптотического Bcl-2 в клетках при окислительном стрессе.

Исходя из полученных данных, отсутствие адекватного увеличения содержания в клетках антисуицидальных белков Bcl-XL и Bcl-2 в ответ на апоптогенный стимул при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении может быть причиной зарегистрированного нами повышения количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов.

Следующим этапом нашего исследования было изучение содержания и экспрессии генов проапоптотических белков в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе. Оценка уровня мРНК гена bах продемонстрировала статистически достоверное возрастание содержания мРНК гена bах относительно контрольного значения (p<0,05) в мононуклеарных лейкоцитах у больных с острым воспалением, а также в условиях экспериментального окислительного стресса. Вместе с тем, значимые различия экспрессии мРНК bах при окислительном стрессе in vitro и внебольничной пневмонии (р>0,05) отсутствовали.

Известно, что ген bах является мишенью транскрипционного фактора р53 [Sax J.K. et al., 2002]. С нашей точки зрения, увеличение экспрессии указанного гена свидетельствует об эффективной трансактивационной функции р53 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Отсутствие различий экспрессии bax при окислительном стрессе in vitro и в случае острого воспаления позволяет предположить схожий механизм активации р53 в обеих ситуациях, несмотря на отсутствие белка р53 (за счет образования комплекса р53-MDM2) в клетках, полученных у больных внебольничной пневмонией.

Анализ внутриклеточного содержания проапоптотического протеина Вах, проведенный методом вестерн-блоттинга, показал, что в мононуклеарных клетках крови у пациентов с острым воспалением величина исследованного параметра превышала контрольные значения. Инкубация мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1 мМ перекисью водорода приводила к возрастанию уровня Вах по сравнению с нормой, который, однако, не отличался от соответствующего параметра в группе больных острым воспалением. Добавление в культуральную среду ингибиторов МАР-киназ SP600125 и ML3403 снижало содержание белка Bax в мононуклеарных лейкоцитах у больных с острым воспалением. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении редокс-чувствительных механизмов в регуляцию содержания проапототического белка Bax при окислительном стрессе.

Поскольку важную роль в регуляции взаимоотношений между анти- и проапоптотическими белками семейства Bcl-2 играет группа ВН3-только протеинов (Bad, Bim, tBid, PUMA, Noxa и др.), нами также была проведена оценка экспрессии мРНК гена bad и содержания белка Bad в мононуклеарных лейкоцитах в условиях окислительного стресса. Данный белок, а также мРНК гена bad, не были выявлены в мононуклеарных лейкоцитах у здоровых доноров (интактные культуры), при индукции окислительного стресса перекисью водорода и в случае острого воспаления. Полученные данные указывают на отсутствие активации транскрипции гена bad при окислительном стрессе.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о повышении экспрессии мРНК генов как анти-, так и проапоптотических белков (Bcl-XL и Вах, соответственно) в мононуклеарных лейкоцитах у здоровых доноров (при добавлении в культуральную среду 1 мМ перекиси водорода) и у больных с внебольничной пневмонией. При этом изменения уровня мРНК гена bcl-2, обладающего антисуицидальной активностью, отсутствовали во всех случаях, а экспрессия мРНК гена bad в нашем иследовании обнаружена не была. Поскольку ген bcl-xL является мишенью ядерного фактора NF-kB, а ген bах - транскрипционного фактора р53, нами было высказано предположение, что в условиях окислительного стресса происходит активация данных транскрипционных факторов, выполняющих анти- и проапоптотические функции, соответственно. Проведенное нами исследование содержания белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 свидетельствует о возрастании содержания проапоптотического протеина Вах в мононуклеарных лейкоцитах крови как в случае экспериментального окислительного стресса, так и при остром воспалении. Отсутствие изменений внутриклеточного уровня антиапоптотических Bcl-XL и Bcl-2 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма может обусловливаться как посттрансляционными модификациями данных белков, так и регулирующим влиянием МАР-киназных каскадов (в случае Bcl-2) (рис. 9).

В целом, в ходе проведенного нами исследования оценены редокс-чувствительные элементы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма важную роль в реализации летальной программы клеток играют МАР- киназы JNK и p38.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. Роль элементов внутриклеточной сигнальной трансдукции в механизмах дизрегуляции апоптоза при окислительном стрессе (по данным литературы и результатам собственных исследований (выделено))

Активация факторов транскрипции NF-кB и p53 (за счет их фосфорилирования МАР-киназами и/или воздействия АФК) приводит к изменению уровня экспрессии генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза семейства Bcl-2. Последние играют решающую роль в выборе клеточного ответа при окислительном стрессе. Данные протеины могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, под влиянием вышестоящих компонентов редокс-чувствительных сигнальных систем, а также окислительной модификации. Наряду с этим, АФК выступают в роли вторичных мессенджеров, опосредующих активацию ключевых белков-регуляторов апоптоза.

Идентифицированные нами редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем, участвующих в модуляции программы апоптоза при окислительном стрессе, могут выступать в качестве мишеней для терапевтической коррекции нарушений летальной программы. Полученные данные в дальнейшем послужат основой для разработки способов управления программированной гибелью клетки при патологиях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма, с применением молекул, опосредованно регулирующих функцию про- и антиапоптогенных сигнальных систем. Это позволит повысить эффективность существующих методов патогенетической терапии большого числа социально-значимых заболеваний, характеризующихся дизрегуляцией клеточной гибели.

ВЫВОДЫ

1. В условиях экспериментального окислительного стресса, индуцированного воздействием на мононуклеарные лейкоциты крови 1 мМ Н2О2, увеличение числа апоптотически измененных клеток сопряжено с активацией митохондриального и TNFб-опосредованного рецепторного путей запуска летальной программы клеток.

2. В процессе реализации летальной программы мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе in vitro участвуют редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).

3. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма в мононуклеарных лейкоцитах активация апоптогенной системы сигнальной трансдукции, осуществляемой с участием редокс-чувствительных МАР-киназ JNK и р38, сопряжена с увеличением уровня их фосфо-форм.

4. При окислительном стрессе in vitro селективное ингибирование редокс-чувствительной киназы JNK SP600125 приводит к снижению продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-8. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма МАР-киназы р38 и JNK не участвуют в регуляции продукции IL-10.

5. Активация фактора транскрипции р53 в условиях окислительного стресса в клетках обусловлена его фосфорилированием МАР-киназами и/или непосредственным эффектом АФК.

6. При окислительном стрессе in vitro в мононуклеарных лейкоцитах увеличивается содержание проапоптотического белка Вах, не изменяется содержание антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL, проапоптотический белок Bad в клетках отсутствует.

7. Механизмы изменения экспрессии генов bcl-XL и bax при окислительном стрессе связаны с активацией транскрипционных факторов р53 и NF-kB.

8. При остром воспалителительном процессе (острый аппендицит, внебольничная пневмония), сопровождающемся нарушениями окислительного метаболизма, молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза сопряжены с активацией МАР-киназ, факторов транскрипции, нарушением баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.

9. Редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38, JNK, факторы транскрипции и белки семейства Bcl-2) являются молекулярными мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы при окислительном стрессе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Состояние митохондриального пути апоптоза лимфоцитов крови при хронических вирусных гепатитах / О.Б. Жукова, Л.С. Литвинова, В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, Н.Ю. Часовских // Тезисы докладов 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины».- Астрахань, 5-10 мая 2006.- Астрахань.- 2006.- С. 126.

2. Цитокины и противовирусный иммунитет / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, В.В. Белоконь, А.П. Зима, О.Б. Жукова, И.О. Наследникова, Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Н.Ю. Часовских // Успехи физиологических наук. - 2006. - Т. 37, № 4. - С. 34-44.

3. Влияние рекомбинантных форм интерлейкинов-5, -3 и эотаксина на апоптоз эозинофильных гранулоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, С.Б. Ткаченко, Ю.В. Колобовникова, О.Б. Жукова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, Е.Н. Кнутарева, Т.Т. Радзивил, Н.Ю. Часовских // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 4. - С. 370-373.

4. Модуляция программируемой гибели лимфоцитов периферической крови при хронической вирусной инфекции / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Т.Т. Радзивил, Л.С. Литвинова, Н.Ю. Часовских // Цитология. - 2007. - Т. 49, № 1. - С. 26-31.

5. Изменение реакции лимфоцитов крови на апоптозмодулирующие факторы при вирусной инфекции / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Т.Т. Радзивил, Л.С. Литвинова, Н.Ю. Часовских // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - Т. 128, № 6. - С.44 - 48.

6. Стресс-активируемая протеинкиназа JNK - молекулярная мишень для коррекции дизрегуляции апоптоза при патологических состояниях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения, больных в многопрофильном лечебном учреждении» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007.- Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение). - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 497.

7. Ингибиторование митоген-активированных протеинкиназ p38 и JNK как молекулярный механизм коррекции нарушений программированной гибели клеток при воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др.// Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения, больных в многопрофильном лечебном учреждении» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007.- Вестник российской военно-медицинской академии (приложение). - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 497-498.

8. Часовских, Н.Ю. Влияние окислительного стресса на реализацию апопототической программы мононуклеаров периферической крови в условиях in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова // Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 139.

9. Часовских, Н.Ю. Роль протеинкиназ Р38 и JNK (С-Jun NH2-terminal kinases) в дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова / Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург - 2007. - С. 140.

10. Часовских, Н.Ю. TNFR-1 опосредованный и митохондриальный пути запуска апоптотической программы в условиях окислительного стресса in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова // Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 141.

11. Митохондриальный, TNF- и р53-опосредованные пути реализации апоптотической программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова и др. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» - г. Абакан, 17-19 мая 2007. - Абакан, 2007.- С. 29 - 30.

12. Часовских, Н.Ю. Молекулярные механизмы реализации апоптотической программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» г. Томск, 17-18 мая 2007.- Томск, 2007.- С. 208-209.

13. Кайгородова, Е.В. Роль митоген-активируемых протеинкиназ JNK(С-Jun NH2-terminal kinases) и р38 в регуляции апоптоза мононуклеаров периферической крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Е.В. Кайгородова, Н.Ю. Часовских // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» Томск, 17-18 мая 2007.- Томск. - 2007.- С.182-183.

14. Дизрегуляция летальной программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Ю.В. Стариков и др. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - г. Новосибирск, 7-9 ноября 2007. - Медико-фармацевтический журнал. - Новосибирск, 2007. - С.85.

15. Роль протеинкиназ JNK и р38 в реализации программы апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro / Н. Ю.Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» - Новосибирск, 7 - 9 ноября 2007. - Медико-фармацевтический журнал. - 2007. - С.84 - 85.

16. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Н.Ю. Часовских и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - №3.- С. 251-254.

17. Роль митогенактивированных протеинкиназ JNK и р38 в регуляции апоптоза мононуклеаров крови в условиях окислительного стресса in vitro / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Часовских и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - №5.- С. 505-509.

18. Редокс-зависимая регуляция апоптоза: адаптивная роль активных форм апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Часовских и др. // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. - 2008. - Т. 94, № 6. - С. 710-718.

19. Часовских, Н.Ю./ Роль протеинкиназ JNK и р38 в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - № 3. - С.38-42.

20. Регуляторная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов / Е.А. Степовая, Т.В. Жаворонок, Ю.В. Стариков, В.А. Бычков, Н.Ю. Часовских и др.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - № 12. - С. 646-650.

21. Часовских, Н.Ю. Апоптоз и окислительный стресс / Н.Ю. Часовских, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2009. - 148 с.

22. Белки семейства Вcl-2 участвуют в редокс-зависимой дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при воспалении / Н.Ю. Часовских, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Иммунология. - 2009. - Т. 30, № 2. - С. 98-101.

23. Роль факторов транскрипции р53 и NF-кB в редокс-зависимой дизре-гуляции апоптоза / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Н.Ю. Часовских и др. // Вестник РАМН. - 2009. - № 4. - С. 3-10.

24. Роль редокс-зависимых сигнальных систем в регуляции апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Часовских и др. // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 4. - С. 329-334.

25. Митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38 являются редокс-зависимыми молекулярными мишенями нарушения апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Е.В. Кайгородова, Н.Ю. Часовских, Е.Г.Старикова // Успехи физиологических наук. - 2009. - Т. 40, № 2. - С. 3-11.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат

УФ-излучение - ультрафиолетовое излучение

ANT - транслокатор адениловых нуклеотидов

IkB - ингибитор kappa B

VDAC - порин-вольтаж зависимый канал

Размещено на Allbest.ru