Размещено на http://www.allbest.ru/

Медицинский центр Центрального Банка Российской Федерации

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Клинико-генетическое прогнозирование риска развития ишемической болезни сердца

14.00.05 - внутренние болезни

Клейменова Елена Борисовна

Москва - 2009

Работа выполнена в Медицинском центре Центрального Банка Российской Федерации

Научный консультант - заслуженный деятель науки РФ, академик РАН

доктор медицинских наук, профессор Г.И. Назаренко

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН А.И. Мартынов

Доктор медицинских наук, профессор академик РАМН Н.П. Бочков

Доктор медицинских наук, профессор В.Н. Дроздов

Ведущая организация - Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Росздрава

Защита диссертации состоится: «13» «ноября» 2009 г. на заседании диссертационного совета Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии (Д 850.002.01) по адресу: 111123, г. Москва, шоссе Энтузиастов д. 86, 1 корпус, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии.

Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор И.А. Комисаренко.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах, при этом на долю ишемической болезни сердца (ИБС) и инфаркта миокарда (ИМ) приходится примерно две трети случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний. По прогнозам в 2020 году - это будет ведущая причина смертности во всех странах мира (Thom T. et al., 2006). Ежегодно в России от ССЗ умирает более 1 млн. человек (700 человек на 100 тыс. населения).

Стратификация риска является ключевым компонентом всех клинических руководств и рекомендаций по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний (Grundy S.M et al., 2004). В клинической медицине принято учитывать факторы риска ИБС и фенотипические (клинические) проявления. Примером является алгоритм, предложенный в Фрамингемском исследовании. С помощью алгоритма хорошо выявляются пациенты с высоким риском, но часто неправильно интерпретируются пациенты со средним и низким риском (Foody J.M., 2006). Кроме того, расчет риска не является адекватным у пациентов с метаболическим синдромом, семейным анамнезом ИБС и у женщин. ИБС относят к многофакторным заболеваниям, развитие которых является результатом комплексного взаимодействия наследственной предрасположенности и факторов внешней среды. Так как наследственность является самостоятельным фактором риска заболевания, необходимость включения генетических маркеров в расчеты по прогнозированию риска развития ИБС в настоящее время становится очевидной. Генетические ассоциативные исследования и анализ генов кандидатов выявили ряд полиморфных вариантов генов, предрасполагающих к развитию ИБС (Casas J.P., 2006; Humphries S.E., 2007; Marin-Garcia J., 2007). Результаты этих исследований противоречивы, и отсутствует консенсус по их применению. Кроме того, существуют расовые и этнические различия полиморфизма генов, что объясняет актуальность исследования в российской популяции. Оценку результатов генетического исследования целесообразно проводить с учетом традиционных факторов риска, лабораторных биомаркеров, суррогатных маркеров заболевания, что позволяет улучшить прогностическую ценность результатов обследования (Morrow D.A. 2006; Raizada M.K 2005). Детальное изучение фенотипа и сопоставление результатов с генотипом необходимо для понимания патогенеза сосудистых катастроф (De Lemos J.A., 2008).

Основная проблема оценки риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) заключается в разрозненности и разнородности маркеров, используемых в качестве факторов риска. Имеется большое количество литературных данных по отдельным генам, участвующим в патогенезе ИБС. Также описаны фенотипические признаки, которые учитываются врачами-клиницистами при прогнозировании сердечно-сосудистых событий. Тем не менее, единого подхода, позволяющего анализировать относительно большое количество полиморфных ДНК маркеров в сочетании с наиболее важными фенотипическими характеристиками, в настоящее время не разработано, хотя это значительно повысило бы эффективность оценки индивидуального риска развития ИБС. Таким образом, современные алгоритмы недооценивают риск возникновения коронарных событий. Этим объясняется актуальность развития новых технологий адекватной оценки риска и его динамики для определения интенсивности вмешательств.

Цель работы: разработать технологию скрининга и прогнозирования коронарных событий на основе клинико-генетических данных.

Задачи исследования:

1. Разработать комплекс клинико-лабораторных и инструментальных обследований для оценки риска развития ИБС с использованием новых технологий.

2. Оценить клиническую значимость изучаемых генетических маркеров.

3. Изучить корреляцию между генотипом и фенотипом (традиционные факторы риска, лабораторные, инструментальные, генетические маркеры) у пациентов с ИБС.

4. Сопоставить диагностическую значимость различных биомаркеров для скрининга ИБС.

5. Сопоставить изученные генетические маркеры с результатами коронарографии.

6. Разработать модель прогноза коронарных событий для первичной профилактики ИБС.

7. Оценить возможности практического применения разработанной модели для принятия решений о проведении первичной профилактики ИБС.

Научная новизна

1. Установлена ассоциация 4 генетических маркеров (е4 аллель гена ApoE, 4G/4G генотип гена PAI-1, C аллель гена GPIIIa T196C и А аллель гена UCP2 G866A) с риском развития ИБС в российской популяции.

2. Показано влияние традиционных факторов риска на ассоциацию генетических маркеров с ИБС.

3. Впервые выполнена комплексная оценка и сопоставление результатов генетического исследования у пациентов с ИБС с результатами других методов диагностики (клинических, лабораторных, инструментальных) в российской популяции.

4. Установлена взаимосвязь изученных генетических маркеров с ангиографическими признаками ИБС.

5. На основе анализа результатов проведенного всестороннего обследования выявлен оптимальный комплекс диагностических маркеров для прогнозирования коронарных событий.

6. Впервые проведен сравнительный анализ генетических маркеров у пациентов с сердечно-сосудистыми событиями (инфаркт миокарда, инсульт).

7. Установлено, что максимальная эффективность прогностических моделей риска коронарных событий может быть достигнута за счет использования ансамбля предикторных признаков, включающих традиционные факторы риска, сывороточные маркеры, структурные маркеры атеросклероза и генетические маркеры.

8. Синтезирован алгоритм прогноза коронарных событий, который позволяет оценивать риск развития ИБС с точностью до 92%.

Практическая значимость Разработана новая технология оценки риска коронарных событий и его динамики с применением генетических и компьютерных технологий. Прогнозирование и стратификация риска является ключевым компонентом всех клинических руководств и рекомендаций по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Создан необходимый потенциал, обеспечивающий развитие новых профилактических стратегий и создания эффективной системы первичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Учитывая широкое распространение сердечно-сосудистых заболеваний, создание новых стратегий профилактики будет иметь значительный социальный и экономический эффект. Разработанная технология ляжет в основу последующих работ для прогнозирования социально-значимых заболеваний.

Реализация результатов исследования Выводы и практические рекомендации диссертационной работы, направленные на улучшение первичной профилактики ИБС, внедрены в практическую деятельность поликлиники и стационара Медицинского центра Банка России, поликлиник и здравпунктов региональных отделений Банка России. Подготовлены и опубликованы 3 учебно-методических пособия «Профилактическая медицина: Современные технологии», «Назначение генетических исследований (показания к исследованию, функциональное и клиническое значение полиморфизмов генов)», «Формирование групп риска сердечно-сосудистых заболеваний. Концепция, задачи, порядок, объем, регистрация результатов и преемственность». Разработанные методы исследования и прогнозирования внедрены в работу диспансерной службы и поликлиники Медицинского центра Банка России.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

В результате проведенного исследования выявлена комбинация аллелей риска ИБС в российской популяции г. Москвы (е4 аллель гена ApoE, 4G/4G генотип гена PAI-1, C аллель гена GPIIIa T196C и А аллель гена UCP2 G866A), потенциально пригодная для выявления генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям.

Традиционные факторы риска (гипертензия, сахарный диабет 2 типа, дислипидемия, курение) влияют на ассоциацию генетических маркеров с риском развития ИБС, что необходимо учитывать при стратификации риска.

Комбинированная оценка генотипа и промежуточных фенотипических проявлений ИБС (дополнительные лабораторные маркеры, структурные маркеры атеросклероза) позволяет значительно повысить прогностическую значимость оценки коронарного риска. Разработанный комплекс лабораторно-инструментальных обследований может быть рекомендован для уточнения риска развития ИБС в группе среднего риска (пациенты, у которых фатальный риск, т. е. возможность умереть от ССЗ у лиц без клинических проявлений в ближайшие 10 лет колеблется в пределах 1-4% в соответствии со шкалой SCORE).

Количественная оценка генетического риска с учетом промежуточных фенотипических проявлений заболевания является необходимым условием практического использования генетического тестирования.

Система «Распознавание» позволяет объединить результаты комплексного обследования в единую прогностическую модель риска ИБС, что может быть использовано для стратификации риска и поддержки принятия оптимальных решений о профилактике.

Создан необходимый потенциал, обеспечивающий развитие новых профилактических стратегий, который может быть использован для создания эффективной системы первичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. сердце ишемический коронарография

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции МЦ Центрального Банка РФ (27 февраля 2009).

Диссертационная работа апробирована на Ученом Совете Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии 5 мая 2009 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них - 9 в центральных рецензируемых изданиях, 3 учебно-методических пособия.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав (обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных наблюдений и их обсуждения), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 175 источников (отечественных и иностранных авторов). Работа иллюстрирована 31 рисунками и 28 таблицами.

Содержание диссертации

Материал и методы исследования

Обследован 131 пациент с ИБС: 85 (64,9%) мужчин и 46 (35,1%) женщин. Средний возраст составил 60,51±11,86 лет. Это пациенты, перенесшие острые коронарные события в анамнезе. Распределение пациентов по формам ИБС: инфаркт миокарда (76%), нестабильная стенокардия (24%). Среди них 13% перенесли стентирование и аорто-коронарное шунтирование. Диагноз инфаркта миокарда у всех подтвержден типичными ЭКГ данными, повышением уровня ферментов (КФК, тропонина Т), нарушениями локальной сократимости при ЭхоКГ. Диагноз ИБС у всех верифицирован при коронарографии (выявлен стеноз > 75% по крайней мере в одной из основных коронарных артерий). Лабораторные факторы риска ИБС оценивались ретроспективно по материалам компьютерной базы данных до установления диагноза ИБС.

Контрольная группа состояла из 194 человек: 114 (58,8%) мужчин и 80 (41,2%) женщин (средний возраст 57.95+10,6). В контрольную группу вошли пациенты, обратившиеся в Медицинский центр Банка России для проведения диспансерного обследования. У них отсутствовали в анамнезе ИБС, атеросклероз периферических сосудов, ишемический или геморрагический инсульт, а также другие тромбоэмболические или геморрагические осложнения. Для исключения безболевой ишемии миокарда пациентам выполнялись следующие исследования: ЭКГ, ЭхоКГ, ВЭМ.

У пациентов с ИБС и в контрольной группе оценивали следующие факторы риска: артериальная гипертензия (систолическое АД ? 140 мм рт ст и/или диастолическое АД ? 90 мм рт ст), гиперхолестеринемия (> 5,2 ммоль/л и/или прием гиполипидемического препарата), сахарный диабет (глюкоза натощак ? 7 ммоль/л, гемоглобин А1 ? 6,5% или прием сахароснижающего препарата), ожирение (индекс массы тела ? 30 кг/м²) и курение.

Обследовано 124 пациента, перенесших ишемический инсульт (38% атеротромботический, 27% кардиоэмболический и 35% лакунарный патогенетический вариант). Среди больных было 59 (47,6%) мужчин и 65 (52,4%) женщин. Средний возраст составил 65,48±11,56 лет. У 10 человек была комбинация сердечно-сосудистых осложнений: инфаркт миокарда + инсульт. Таким образом, группа пациентов, имеющих большие сердечно-сосудистые осложнения (инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, инсульт) составила 255 человек. Ведущим патогенетическим механизмом развития инфаркта, нестабильной стенокардии и различных вариантов ишемического инсульта является эндотелиальная дисфункция, что позволило объединить эти заболевания в одну группу. Все обследованные пациенты русские, проживающие в Москве.

Семейный анамнез расценивался, как отягощенный при наличии у родственников 1 степени родства инфарктов, инсультов, смерти от сердечно-сосудистых заболеваний в возрасте моложе 55 лет для мужчин и 65 лет для женщин или при наличии более 1 родственника с ИБС, особенно женского пола.

Выбор полиморфизмов генов: Для исследования было выбрано 27 генов-кандидатов, полиморфные варианты которых согласно международным базам данных ассоциируются с ИБС. Было изучено 29 полиморфных вариантов в 27 генах, представляющих собой точечные замены в последовательности генов, а также небольшие делеции или инсерции, располагающиеся в экзонах или промоторных участках ДНК, что предполагает изменение функции или экспрессии кодируемого белка. Изученные генетические маркеры имеют отношение к различным звеньям патогенеза ИБС:

· нарушения липидного обмена: ApoE(е2, е3, е4), ApоCIII(S1/S2), PON1(Gln192Arg);

· эндотелиальная дисфункция и воспаление: ecNOS(4/5), NOS1(n10/n14), TNF б(-238G>A,-308G>A), FGB(455G>A);

· артериальная гипертензия: AGT(М235T), ACE (I/D), AGTR1(1166A>C), AGTR2(3123 C>A), BKR2(-58 T>C), REN(19-83G>A), ADRB1(R389G), ADRB2(48A>G и 81C>G);

· тромбообразование и нарушение агрегации тромбоцитов: FV(R506Q), FII(20210G>A), PAI-1(4G/5G), PLAT(I/D), GPIIIa(196T>C), FGB(455G>A);

· гипергомоцистеинемия: MTHFR(677С>T), MTRR(66A>G);

· инсулинорезистентность: PPAR-б(2528G>C), PPAR-г(34C>G), PPAR-д (+294T>C), UCP2 (G866A), DQB1(201/302).

Забор венозной крови на генетическое исследование производили натощак в количестве 10 мл в стандартные одноразовые пробирки, содержащие EDTA. Образцы ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови. Генетические исследования выполнялись в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней Института Акушерства и гинекологии им Д.О.Отта (г. Санкт-Петербург). Полиморфизмы генов исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого термоциклера МС-2 с использованием термофильной ДНК-полимеразы и специфических олигопраймеров. Анализ полиморфизма длины полученных рестрикционных фрагментов осуществляли с помощью вертикального горизонтального электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле. Конечная детекция осуществлялась на приборе GelDoc фирмы Bio-Rad. Гибридизацию на микрочипах проводили с использованием флуоресцентно меченых образцов. Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью широкопольного люминесцентного микроскопа, снабженного камерой ПЗС и программным обеспечением Imageware ("Биочип-ИМБ". Россия), а также портативного анализатора биочипов «Чипдетектор-01 -«БЧ-ИМБ».

Биохимические и иммунологические исследования:

Забор крови осуществляли из вены натощак в стандартные одноразовые пробирки для биохимических исследований. У пациентов отсутствовали клинические признаки воспаления, что подтверждалось нормальными показателями СОЭ. Сывороточные маркеры не исследовались в остром периоде инфаркта миокарда и нестабильной стенокардии. Пациенты не принимали антикоагулянты. Исследование липидного профиля: включало определение содержание общего холестерина (ХС), липопротеинов высокой плотности (ХС ЛВП), липопротеинов очень низкой плотности (ХС ЛОНП), триглицеридов (ТГ) и липопротеина а (ЛПа), которые определяли в сыворотке крови турбодиметрическим методом на автоматическом анализаторе ADVIA 1650, Bayer. Уровень липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП) рассчитывался по стандартной формуле Фридвальда. Уровень гомоцистеина, фолиевой кислоты и витамина В12 в сыворотке определяли на автоматическом иммунохемилюминесцентном анализаторе Centaur, Bayer. Количественное определение высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP) проводили турбодиметрическим методом (на автоматическом анализаторе ADVIA 1650, Bayer). Для определения D-димера использовали фотометрическую регистрацию аглютинации латексных частиц на автоматическом анализаторе Sysmex CA-1500. Фибриноген определяли по скорости образования сгустка при добавлении избытка тромбина к разведенной плазме (метод Клауса) на автоматическом анализаторе Sysmex CA-1500.

Инструментальные исследования: Дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий выполнялось на приборе Logic 9, GE с использованием мультичастотного линейного ультразвукового датчика 10L. Измерения толщины КИМ проводились по стандартному протоколу на трех уровнях билатерально: в области бифуркации общей сонной артерии, на 1 см ниже бифуркации, а также на внутренней сонной артерии. Степень стеноза (%) оценивали при эксцентрических бляшках - по диаметру внутреннего просвета артерии, при полуциркулярных и циркулярных бляшках - по площади.

МСКТ сердца выполнялась на компьютерном томографе Light Speed, GE. Расчет кальциевого индекса проводился на рабочей станции AW 4.1, GE. Кальциноз диагностировался при выявлении участка размером, по крайней мере, 3 пикселя с усилением сигнала > 130 единиц по Hounsfield. Для количественной оценки использовалась шкала Agatston. Общий кальциевый индекс - сумма показателей, полученных при анализе 4 основных коронарных артерий. В норме этот индекс = 0.

ЭхоКГ выполнялась широкополосным фазированным датчиком на ультразвуковом приборе iE33, Philips, по стандартному протоколу. Гипертрофия левого желудочка оценивалась из парастернального доступа по длинной оси. Измерялась толщина межжелудочковой перегородки и задней стенки в средней трети левого желудочка в М-режиме в диастолу. Учитывалось максимальное значение. Наличие гипертрофии левого желудочка устанавливалось при толщине стенки > 11 мм.

Для оценки ангиографического фенотипа коронарные сосуды были разделены на 10 сегментов: ствол, проксимальные, медиальные и средние отделы передней нисходящей, правой коронарной и огибающей артерий. Тяжесть ИБС рассчитывалась с помощью коронарографического индекса (суммарный процент стенозов в 10 коронарных сегментах, Luke M. M., 2007). Учитывались следующие анатомические и морфологические ангиографические критерии:

· Стеноз ?50% считался значимым по диаметру (70% по площади).

· Проксимальным считалось поражение ветвей левой коронарной артерии, включая стенозы ствола и его бифуркацию;

· Диффузным считалось поражение более 2/3 левой или правой коронарных артерий (неровности стенки или стенозы);

· Морфологически оценивалась протяженность стеноза (протяженный>10мм), эктазия (диаметр сосуда + 25%) и кальцификация коронарных артерий (видимая в различных проекциях).

Морфологически ИБС подразделялась на одно-, двух- и трехсосудистое поражение.

Статистический анализ: Результаты представлены в виде среднего значения + стандартное отклонение. Качественные и количественные переменные сравнивались с помощью критерия ч² и дисперсионного анализа (ANOVA). Изучение функциональной зависимости между генетическими, лабораторными, инструментальными маркерами и клиническими исходами (ИБС, ИС, ССЗ) проводилось методом логистической регрессии с учетом пола, возраста, индекса массы тела (ИМТ), курения, артериальной гипертензии. Генотип оценивался в виде двух моделей: доминантной (комбинация вариантной гомозиготы и гетерозиготы по сравнению с нормальной гомозиготой) и рецессивной (вариантная гомозигота по сравнению с комбинацией нормальной гомозиготы с гетерозиготой). Для оценки взаимодействия генов между собой, а также генов и фенотипа мы рассчитывали индекс генетического риска (ИГР) (Horne B. D.,2006). Способность результатов обследования прогнозировать ИБС оценивалось с помощью характеристической кривой (A_ROC). Для сравнения различных моделей рассчитывалась площадь под кривой (AUC ROC). Для количественного сравнения AUC ROC рассчитывался индекс «z» (J. Hanley, 1983). Индекс «z» ?1,96 свидетельствует о том, что различия между площадями под характеристической кривой достоверны. Статистический анализ проводили при помощи компьютерных программ SPSS 12,0 for Windows (Chicago IL, USA) и SAS JMP7 by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.

Прогнозирование: Полученные данные подвергались анализу при помощи программной системы «РАСПОЗНАВАНИЕ» (Журавлев Ю.И. с соавт., 2006). Для решения задач прогноза в этой системе используются различные подходы и алгоритмы теории распознавания по прецедентам: статистические алгоритмы распознавания (метод k-ближайших соседей, линейный дискриминант Фишера), алгоритмы распознавания, основанные на построении разделяющих поверхностей (линейная машина, метод опорных векторов), логические методы распознавания (тестовый алгоритм, вычисление оценок по системам логических закономерностей, бинарные решающие деревья), распознавание коллективами алгоритмов. Анализ данных с использованием программной системы «РАСПОЗНАВАНИЕ» выполнен в вычислительном центре им. А.А. Дородницына РАН.

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнительная характеристика пациентов, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, и контрольной группы, выполненная с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) представлена в таблице 1. Среди пациентов, страдающих ИБС (ИМ+НС), было больше мужчин, больше курящих, чаще встречался диабет. Пациенты с инсультами (ИС) были старше, среди них преобладали женщины, было больше больных с ожирением и артериальной гипертензией. Однако было меньше курящих пациентов и страдающих сахарным диабетом. Не было достоверных различий в уровне холестерина между группами.

Таблица 1 Факторы риска у пациентов с сердечно-сосудистыми событиями

Показатели	ИМ+НС	ИС	ССС	Контроль	p**
Факторы риска
Число пациентов	131	124	255	194
пол ж /м, %	36,2/63,8	52,4/47,6	35,7/64,3	41,2/58,8	0,23
Возраст, годы	60,51±11,86	65,48±11,56*	62,4±11,68	57,95±10,6	0,0001
курение, %	48,1*	31,4	48,5*	24,2	0,0005
СД, %	23,4*	12,1	18,0	13,7	0,22
АГ, %	85,8*	96,8*	90,6*	62,9	0,0001
ожирение, %	33,3	44,6*	38,5	38,3	0,97
семейный анамнез, %	13,7 *	14,2*	13,9*	5,0	0,014
Лабораторные маркеры
ХС, ммоль/л	5,70+1,31	5,91±1,03	5,83±1,58	5,53±1,33	0,98
ХС ЛНП, ммоль/л	2,98±2,76	3,29±0,97*	3,07±2,37*	2,55±1,91	0,017
ХС ЛВП, ммоль/л	1,30±0,34*	1,27±0,37*	1,29±0,35*	1,60±0,47	0,0001
ТГ, ммоль/л	1,53±2,68	1,74±0,81*	1,61±1,24*	1,18±2,13	0,05
ОХС/ХС ЛВП	4,47±1,42*	4,51±0,93*	4,45±1,38*	3,77±1,10	0,0001
hsCRP	3,76 ± 2,02*	3,30 ± 2,93	3,51 ± 2,21*	2,26 ± 1,89	0,019
гомоцистеин	13,01 ± 5,23	13,73±4,44*	13,69±6,52*	11,42 ± 4,65	0,01
фибриноген	258,6±169,0	384,5±154,5*	298,7±173,9*	186,5±103,4	0,02

* - p<0,05 при сравнении с контрольной группой, p**- сравнение группы ССС (ИМ+НС+ИС) с контрольной группой.

Среди показателей липидного профиля наиболее показательно отношение ОХС/ХС ЛВП. Уровень гомоцистеина был значимо выше среди пациентов с инсультами. Уровень фибриногена был достоверно повышен у всех пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

10-летний риск возникновения ССЗ (по шкале Фрамингем) в группе здоровых составил в среднем 3,4+0,3%, в группе пациентов с сердечно-сосудистыми событиями - 11.6+0,6%. 10-летний риск фатальных сердечно-сосудистых осложнений (по шкале SCORE) в контрольной группе составил 4,69±0,48%, в группе с ССЗ - 11,27±0,79%. Мы сравнили прогностическую значимость общепринятых алгоритмов (Framingham, PROCAM, SCORE) на изучаемой выборке пациентов. Традиционные факторы риска ИБС оценивались ретроспективно по материалам компьютерной базы данных до развития коронарных событий. Среди пациентов с ИБС у 51 % риск заболевания, оцененный с помощью алгоритма PROCAM, оказался > 20 %, в то время как для алгоритма Фрамингем этот показатель составил всего 35%. При оценке фатального риска сердечно-сосудистых событий по таблице SCORE показатели риска ? 5% отмечались у 76,2% пациентов, от 1 до 4 % - у 23% и < 1% - у 0,8% (рис.1). Однако все три алгоритма (Framingham, PROCAM, SCORE) недооценили риск у 65%, 49% и 23,8% пациентов, соответственно. По нашим данным, наиболее адекватна оценка фатального риска по шкале SCORE. Анализ традиционных алгоритмов оценки коронарного риска с помощью построения дерева регрессии выявил, что оптимальная точка разделения пациентов с коронарными событиями и контрольной группы для шкалы SCORE составляет 3%, для алгоритма Framingham - 8%, для алгоритма PROCAM - 13%, что свидетельствует о недооценке тяжести заболевания преимущественно среди пациентов в группе среднего риска.

Рисунок 1

При анализе результатов генетического обследования е4 аллель гена ApoE, 4G/4G генотип гена PAI-1, C аллель гена GPIIIa T196C и А аллель UCP2 G866A статистически значимо ассоциировались с риском развития ИБС с поправкой на традиционные факторы риска. В таблице 2 представлено отношение шансов развития ИБС. Отношение шансов развития ИБС для полиморфных вариантов этих генов колеблется от 1,54 до 1,73, и составило в среднем 1,67, по нашим данным.

Таблица 2 Влияние генотипа на риск ИБС

ген	генотип	ИБС N=131/%	контроль N=159/%	ОШ*(ДИ*)	ч2*	р
ApoE е2,е3, е4	е 4 аллель	30/22,9	23/14,5	1,76(1,01-3,33)	4,01	0,03
PAI-1 4G/5G	4G/4G	44/33,5	36/22,6	1,73(1,02-2,50)	4,31	0,02
GPIIIa T196C	С аллель	44/33,5	37/23,3	1,66(1,00-2,79)	3,80	0,03
UCP2 G866A	А аллель	40/30,5	33/20,8	1,53(1,00-2,18)	3,75	0,04

ОШ*- отношение шансов, ДИ**-95% доверительный интервал ОШ

ч²***- критерий хи-квадрат (двусторонний тест Фишера).

Рисунок 2

Ассоциация генетических маркеров с ИБС различается в зависимости от факторов риска (артериальная гипертензия, сахарный диабет 2 типа, атерогенная дислипидемия, курение сигарет), что является подтверждением участия средовых факторов в фенотипической реализации генетической предрасположенности (рис.2). Необходимым условием интерпретации генетических исследований является изучение их взаимодействия с другими факторами риска. Мы обнаружили возрастание риска ИБС у курящих пациентов с полиморфными вариантами генов ApoE и PAI1 по сравнению с некурящими. Отношение шансов достоверно p<0,05возрастает c 1,17 до 1,45 у носителей е4 аллеля гена ApoE и с 1,59 до 1,88 у пациентов с 4G/4G генотипом PAI1. Наличие артериальной гипертензии у носителей А-аллеля гена UCP2 и D-аллеля гена ACE также ведет к возрастанию риска заболевания. ОШ развития ИБС у носителей D аллеля гена ACE и А аллеля UCP2 изменялось с 0,64 до 1,16 и с 1,53 до 2,38, соответственно (р<0,05) в зависимости от наличия артериальной гипертензии, что является проявлением «ген-среда» взаимодействия, и необходимо учитывать при стратификации риска.

Мы изучили полиморфные варианты генов, имеющие отношение к различным звеньям патогенеза ИБС. Взаимодействие между генами и факторами риска может играть решающую роль в патогенезе заболевания. Так как вклад отдельных генов в риск развития ИБС невелик, обычно не превышает 2, и в среднем составляет 1,2-1,4 (Arnett D.K. 2007), интерпретация результатов генетических исследований невозможна без учета факторов риска.

Мы изучили также диагностическую значимость генетических маркеров в комбинации с традиционными факторами риска для оценки риска развития сердечно-сосудистых осложнений.

Таблица 3 Генотип и риск сердечно-сосудистых событий

Ген	Генотип	ССС n=255/(%)	Контроль n=194/(%)	ОШ*	ДИ** 95%
MTHFR С677T	С/T	125 (49%)	102 (52,5%)	0,87	0,60-1,27
	T/T	26 (10,2%)	17 (8,8%)	1,19	0,63-2,26
ACE I/D	I/I	64 (25,0%)	44 (22,7%)	0,78	0.50-1,21
	D аллель	191 (74,9%)	150 (77,3%)	1,10	0,70-1,71
	D/D	53 (20,8%)	49 (25,3%)	0,82	0,53-1,28
ApoE	е2 аллель	37 (14,6%)	24 (12,4%)	1,21	0,69-2,09
	е2+е4 аллели	91 (35,8%)	57 (29,4%)	1,34	0,89-2,00
	е4 аллель	66 (25,9%)	25 (12,9%)	1,45	1,03-2,93

ОШ*- отношение шансов, ДИ** - 95% доверительный интервал ОШ

Пациенты с большими сердечно-сосудистыми осложнениями ССО (инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, ишемический инсульт) были объединены в одну группу. Были изучены полиморфные варианты в 3 генах: ApoE (е2, е3, е4), ACE (I/D), MTHFR(677С>T). При анализе результатов генетического обследования среди 3 изученных полиморфизмов только у е4 аллеля гена ApoE была выявлена независимая статистически значимая ассоциация с риском развития сердечно-сосудистых событий (табл.3).

Среди больных с инсультом не было выявлено статистически значимой ассоциации ни с одним из исследованных генетических маркеров. Однако комбинация е4 аллеля гена ApoE с гомозиготным полиморфизмом гена MTHFR(677ТT) и комбинация D аллеля гена ACE с гомозиготным полиморфизмом гена MTHFR(677ТT) достоверно ассоциировались с инсультом (p=0,04 и p=0,03, соответственно). Общность патогенеза этих сердечно-сосудистых катастроф определяет высокую перекрестную эффективность стратегий их профилактики.

Существенным аспектом нашего исследования является сопоставление генотипа с фенотипическими лабораторными маркерами, а также сравнительная и комбинированная оценка множественных биомаркеров для прогнозирования ИБС. При анализе влияния генотипа на показатели липидного профиля была выявлена ассоциация носительства е4 аллеля гена ApoE с ТГ (r=0,164,p<0,005), ХС (r=0,174,p<0,04) и ХС ЛНП (r=0,183,p<0,03). Мы провели анализ взаимосвязи ЛП (а) с семейным анамнезом ИБС и выявили, что среднее значение ЛП (а) составляет 26,24±2,37 мг/дл у пациентов без наследственной отягощенности и 35,44±2,99 мг/дл (p<0,04) у пациентов с наследственной отягощенностью. Кроме того, у пациентов без семейного анамнеза ИБС 81% показателей ЛП (а) было в норме (<40 мг/дл), у пациентов с семейным анамнезом только 60% находились в пределах нормальных значений.

Рисунок 3 Распределение пациентов в зависимости от уровня hsCRP

Среди воспалительных маркеров hs-CRP и D-димер были выше у пациентов с ИБС (p<0,05).

На рисунке 3 представлено распределение пациентов в зависимости от уровня hs-CRP у пациентов с ИБС и в группе контроля. Уровень hsCRP <1 мг/л, от 1 до 3 мг/л и >3 мг/л соотносят с низким, средним и высоким риском ИБС соответственно, согласно рекомендациям экспертной панели AHA/CDC (Pearson T.A., 2003).

Базовый уровень CRP, определяемый высокочувствительным методом (hsCRP), отражает вялотекущее воспаление в интиме сосуда и проспективно определяет риск развития сосудистых осложнений, дополняя прогностическую информацию, которую дают классические факторы риска. Мы не обнаружили корреляции между уровнем фибриногена и полиморфным вариантом гена FGB (455G>A), а также ассоциации А аллеля с ИБС, что в целом сопоставимо с результатами других исследований (Smith G.D., 2005).

Мы проанализировали влияние уровня фолиевой кислоты и витамина В12 в сыворотке на содержание гомоцистеина. Была выявлена слабая корреляция (r=-0,23, p<0,05) между уровнем гомоцистеина и содержанием фолиевой кислоты. Выявлена ассоциация между генотипом MTHFR(677С>T) и содержанием гомоцистеина в сыворотке (r=0,154,p<0,009). При сопоставлении генотипа с уровнем гомоцистеина статистически значимая ассоциация была выявлена у пациентов с гомозиготным полиморфизмом гена MTHFR(677ТT) (p=0,009). Гетерозиготный полиморфизм гена MTHFR(677СT) не ассоциировался с уровнем гомоцистеина (p=0,43). Кроме того выявлена слабая ассоциация уровня гомоцистеина с А аллелем гена UCP2 (G866A) r=0,134, p<0,02 и полиморфным вариантом гена PON1(Gln192Arg) r=0,128, p<0,03.

Среди дополнительных маркеров hs-CRP и D-димер были независимыми предикторами ИБС у обследованных пациентов. Добавление hs-CRP, ЛП (а) и D-димера к традиционным факторам риска значимо улучшает прогностическую значимость скрининга в отличие от фибриногена и гомоцистеина. C-реактивный белок в нашем исследовании оказался более сильным предиктором риска ИБС, чем ХС ЛНП.

Для количественной оценки диагностической ценности исследований рассчитывалась площадь под характеристической кривой (AUC ROC). AUC ROC для hs-CRP составила 62%, для ХС ЛНП - 54 %. Площадь под характеристической кривой (AUC ROC) для модели, включающей традиционные факторы риска и дополнительные лабораторные маркеры, составила 82 %. Добавление генетических маркеров (ApoE е2, е3, е4, PAI-1 4G/5G, GPIIIa T196C и UCP2 G866A) к описанной модели привело к возрастанию AUC ROC до 88 % (рис. 4).

При изучении генетических и лабораторных маркеров у пациентов с сахарным диабетом 2 типа после коррекции на традиционные факторы риска (пол, возраст, курение, АГ, ожирение, дислипидемия) методом логистической регрессии независимая ассоциация с СД 2-го типа отмечалась только для полиморфных вариантов двух генов (UCP2 и PPAR-г).

Факторы риска+лабораторные маркеры+генетические маркеры AUC ROC = 0,88

Факторы риска+лабораторные маркеры AUC ROC = 0,82

*Sensitivity - чувствительность, True positive - истинно положительный

**1-Specificity - 1-специфичность, False positive - ложно положительный

Рисунок 4 Характеристические кривые при различных моделях риска

На рисунке 5 представлена частота встречаемости ожирения (ИМТ>30) и повышения гликозилированного гемоглобина (НвА1>6,5) в зависимости от генотипа.

ИМТ<30+HbA1<6.5 ИМТ?30+HbA1<6.5

ИМТ<30+HbA1?6.5 ИМТ?30+HbA1

Рисунок 5

Обращает внимание общее возрастание частоты встречаемости фенотипических проявлений при комбинированном генотипе преимущественно за счет увеличения количества пациентов с повышенным уровнем НвА1. Не было выявлено существенных различий показателей инсулина и индекса HOMA в зависимости от генотипа.

Гены PPAR-г и UCP2 расположены на различных хромосомах, поэтому мы считали их эффект независимым. Для проведения 1 этапа расчета индекса генетического риска (ИГР) по методу, предложенному Horne B. D. с соавт, 2005, в качестве зависимых переменных анализировались глюкоза, НвА1, инсулин, индекс НОМА, ИМТ, ОТ, в качестве независимых переменных - генотипы риска (PP для гена PPAR-г и A аллель для гена UCP2). Из исследованных показателей только уровень глюкозы натощак и HbA1 независимо ассоциировались с генотипами риска с поправкой на традиционные факторы риска. Учитывая большую информативность HbA1 по сравнению с глюкозой в качестве промежуточного фенотипа был выбран НвА1.

На 2 этапе анализировалась взаимосвязь промежуточного фенотипа (HbA1 - независимая переменная) с клиническими исходами (СД 2 типа, ИБС - зависимые переменные). Анализ с помощью логит-регрессии подтвердил ассоциацию СД с HbA1 (B₁ коэффициент-0,458, p<0,0001) и с ИБС (B₁ коэффициент-0,375, p<0,036).

Рисунок 6

Ниже представлены расчеты индекса генетического риска:

ИГР_{общ СД} = (B _I / |B_max|) в _ij S _{j =} (0,458/0,458) x 0,141_GG+0,224_PP =0,365

На рисунке 6 представлена взаимосвязь между ИГР и частотой встречаемости СД. Возрастание ИГР приводит к увеличению частоты встречаемости СД. Анализ с помощью критерия ч² (9,59, p<0,002) подтвердил ассоциацию ИГР с СД, подтверждая различия между группами.

Не наблюдалась эта закономерность для ИБС, так как сахарный диабет - один из многих факторов риска заболевания. В нашем исследовании среди изученных аллелей риска генов, участвующих в метаболизме углеводов, только А аллель (UCP2) напрямую ассоциировался с ИБС. Анализ промежуточного фенотипа (HbA1) и изучение генетических ассоциаций с СД 2 типа выявил не менее важную роль второго гена PPAR-г, метаболически взаимосвязанного с UCP2. Комбинация генотипов риска UCP2 c PPAR-г также ассоциировалась с ИБС (p<0,03).

Мы продемонстрировали, что комбинация полиморфных вариантов этих генов увеличивает риск развития, как промежуточных фенотипических проявлений, так и клинических исходов. Учет фенотипических проявлений генетического риска - также путь к улучшению стратификации риска исходов. Ограничения изучения ИГР у пациентов с СД: мы изучали ограниченный спектр генов на небольшой группе пациентов. В нашем исследовании использовался один полиморфный вариант для каждого из изученных генов-кандидатов, участвующих в углеводном обмене, предполагая, что данный вариант является лучшим маркером риска.

Для исследования структурных маркеров атеросклероза пациентам проводились дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий, эхокардиография и многосрезовая компьютерная томография сердца. Изученная комбинация структурных маркеров атеросклероза имеет очень хорошие аналитические характеристики для прогнозирования коронарного риска (AUC ROC составляет 85 %), по нашим данным. Безусловно, клинические исходы являются наиболее ценным показателем любых исследований, однако их изучение требует много времени и средств. Маркеры атеросклероза предложены в качестве альтернативных конечных точек. Они позволяют сэкономить время и деньги, чтобы внедрить новые профилактические стратегии у пациентов в группе риска.

Рисунок 7 Построение дерева регрессии (рекурсивное разбиение).

С помощью статистической программы SAS JMP7 (построение дерева регрессии) мы приводим алгоритм скрининга ИБС с использованием структурных маркеров атеросклероза, рассчитанный по результатам нашего исследования (рис. 7). Оптимальные точки разделения и порядок проведения исследований оптимизирован с учетом статистической значимости показателей.

Толщина комплекса интима-медиа (КИМ) является промежуточным фенотипическим проявлением раннего атеросклероза. Учитывая простоту и неинвазивность исследования, этот показатель может использоваться в качестве скринингового маркера. На первом этапе проводится УЗДГ брахиоцефальных артерий. При выявлении атеросклеротических бляшек, стенозирующих просвет сосуда >25%, целесообразно выполнение МСКТ, <25% - ЭхоКГ. Оптимальная точка разделения - показатель кальциевого индекса (Са инд) = 79 при МСКТ, при ЭхоКГ - гипертрофия левого желудочка >13 мм.

Генотипы риска развития ИБС, совпадают с полиморфными вариантами генов, ассоциирующимися со структурными маркерами атеросклероза, лишь частично. При анализе результатов генетического обследования только е4 аллель гена ApoE ассоциируется как с риском развития коронарных событий, так и со структурными маркерами атеросклероза. Полиморфизм гена AGTR2 (3123 C>A) ассоциируется с меньшей толщиной КИМ, выраженностью стеноза брахиоцефальных артерий и гипертрофии левого желудочка, т.е. он обладает защитным действием.

Мы изучили гипотезу о том, что различные морфологические ангиографические признаки ИБС имеют генетическое происхождение. Результаты проведенного исследования демонстрируют ассоциацию ангиографических признаков с полиморфными вариантами различных генов (табл. 4).

Изученные полиморфные варианты генов, участвующих в липидном обмене, ассоциируются с количеством стенозов левой коронарной артерии и протяженными стенозами (PON1), а также с кальцинозом коронарных артерий (ApoСIII). Среди генов, принимающих участие в воспалении, отмечена ассоциация полиморфных вариантов гена TNF б с дистальной локализацией атеросклеротических бляшек и эктазией коронарных артерий, гена UCP2 - с коронарографическим индексом. Кроме того, А аллель гена UCP2 и генотип P12P гена PPAR-г ассоциируются с кальцинозом коронарных артерий.

Среди генов, принимающих участие в тромбообразовании, А аллель гена FV и С аллель гена GPIIIа ассоциируются с проксимальной локализацией стенозов. Кроме того, Лейденовская мутация гена FV(R506Q) чаще выявляется у пациентов с распространенным поражением коронарного русла (отмечена корреляция с количеством стенозов, диффузным поражением коронарных артерий). Изученный полиморфный вариант гена PLAT ассоциируется с поражением ствола и локализацией стенозов в области бифуркации.

Таблица 4 Ангиографические признаки ИБС и биомаркеры.

Ангиографические признаки	Биомаркеры
Распространенность
Количество сосудов, %	ЛП а (p<0,05), AGTR1(p<0,02)
Количество стенозов ЛКА*	F V(p<0,05), PON1(p<0,05)
Количество стенозов ПКА**	F V(p<0,04), BKR2(p<0,05)
Диффузное поражение ЛКА, %	TNF б(p<0,05), F V(p<0,02)
Диффузное поражение ПКА, %	гомоцистеин(p<0,03), F V(p<0,02), ACE(p<0,03), BKR2(p<0,004)
Локализация стенозов
ЛКА, %	ЛП а (p<0,02), AGTR1 (p<0,04), PLAT(p<0,006), REN(p<0,05)
Ствол, %	гомоцистеин(p<0,0001), REN(p<0,002), PLAT(p<0,005)
Проксимальная, %	hs-CRP (p<0,03), F V(p<0,001), GPIIIa(p<0,003), AGT(p<0,003)
Дистальная, %	hs-CRP(p<0,02), TNF б
Бифуркационная, %	AGTR2(p<0,02), ApоCIII(p<0,016), PLAT(p<0,04)
Количественная оценка тяжести
Коронарографический индекс	НвА1(p<0,05), UCP2(p<0,009) , BKR2(p<0,04)
Морфология поражений
Стеноз >10мм, %	TNF б(p<0,03), PON1 (p<0,02)
Эктазия коронарных артерий,%	TNF б (p<0,04)
Кальциноз коронарных артерий,%	ОХС (p<0,01), UCP2 (p<0,04), ApоCIII (p<0,03), AGTR2(p<0,04), PPAR-г(p<0,02)

ЛКА* левая коронарная артерия, ПКА** правая коронарная артерия

Таким образом, прогностически неблагоприятная локализация атеросклеротических бляшек в области ствола и проксимальных отделах левой коронарной артерии также генетически детерминирована. Возможно, это связано с различным онтогенетическим происхождением: проксимальные отделы коронарных артерий развиваются из стенок артериального ствола, а дистальные - из субэпикардиальных ветвей коронарных артерий.

Полиморфные варианты генов ренин-ангиотензиновой системы ассоциируются с распространенностью атеросклеротических изменений, выявляемых при коронарографии, проксимальной и бифуркационной локализации стенозов в системе левой коронарной артерии, а также с тяжестью коронарографических изменений (табл. 4).

Большинство генетических ассоциативных исследований используют дихотомический подход: есть или нет ИБС, независимо от морфологических особенностей заболевания. По нашим данным, это одна из немногих попыток сопоставить комплексный фенотип коронарного атеросклероза с результатами генетических и лабораторных исследований в Российской популяции.

Анализ данных методами теории распознавания.

Задача прогноза заключается в распознавании между двумя классами: класс образуют признаковые описания пациентов, у которых не было ИБС, класс - пациенты, страдающие ИБС (в последнем случае признаковые описания формировались до заболевания). Общая схема анализа полученных данных и прогноза состояла в следующем: на первом этапе применялся метод голосования по логическим закономерностям (ЛЗ) для заданной таблицы обучения.

Основная процедура: «Вычисляются ЛЗ классов и оценивается в режиме скользящего контроля точность прогноза методом ЛЗ. Вычисляются оценки информативности всех признаков и исключаются признаки наименее информативные». Основная процедура повторяется до достижения такой подсистемы признаков, сокращение которой ухудшает точность распознавания относительно исходной на заданный порог. Исходно анализировалось 89 показателей.

На первом этапе были выявлены признаки, которые продемонстрировали недостаточную информативность и отсутствие влияния на прогноз. В результате была сформирована таблица обучения, в которую вошли наиболее информативные показатели, представленные в таблице 5.

Таблица 5 Группы признаков и изучаемые показатели

Группы признаков	Изучаемые показатели
Традиционные факторы риска	Возраст, пол, семейный анамнез, курение, ИМТ, гипертония (АД сист, АД диаст), диабет, липидный профиль
Лабораторные маркеры	ЛП а, гомоцистеин, hsCRP, фибриноген, Д-димер, HbA1, мочевая кислота
Инструментальные маркеры	% стеноза брахиоцефальных артерий, степень гипертрофии левого желудочка при ЭхоКГ, кальциевый индекс при МСКТ
Генетические маркеры	ApoE4 е4 аллель, PAI 4G/4G, GPIIIa T 196C (Т/С+С/С), UCP2 G866A (A аллель), PON1 Gln192Arg (Gln/Arg+Arg/Arg), ApoCIII 3238 (G/G), ecNOS (4/4), ACE D аллель, FV R506Q (G/A+A/A), FII G 20210A (GA+AA), FGB G 455A (AA), MTHFR С 677T (TT), TNFб G 238A (G/A+A/A), PPAR-д T 294C (T/T+T/C), PPAR-б G 2528C (G/C+C/C), ГИ

При анализе генетических маркеров с помощью системы «РАСПОЗНАВАНИЕ» удалось выбрать генотип, оптимальный для прогнозирования.

Из дальнейшего рассмотрения исключались генотипы, которые имели близкие к нулевым оценки информативности, по мнению метода «логические закономерности» и не имели содержательного толкования.

На основании проведенного анализа для расчета генетического индекса (ГИ) из 29 полиморфных вариантов изученных генов были отобраны 15.

Для каждого пациента рассчитывался индивидуальный ГИ, представляющий собой суммарное количество имеющихся аллелей риска + семейный анамнез. Показатели индивидуального генетического индекса колебались от 0 (отсутствие аллелей риска ИБС и семейной отягощенности) до 8 полиморфных вариантов изученных генов (рис. 8).

Рисунок 8

Анализ, выполненный с помощью логистической регрессии, выявил независимую ассоциацию ГИ с ИБС с поправкой на традиционные факторы риска (p=0,0002). Отношение шансов составило 2,03, что превышает показатели для большинства отдельных генетических маркеров. Мы проанализировали роль генетических признаков в распознавании ИБС. Распознавание только по генетическим признакам дает в среднем 60% правильных ответов. Это показывает, что генетическая информация влияет на отделимость классов, но в малой степени. Это соответствует результатам, полученным методами традиционной статистики. Площадь под характеристической кривой для ГИ составила 62%. Таким образом, на сегодняшний день изученные генетические маркеры играют вспомогательную роль в прогнозировании коронарного риска.

Мы проанализировали влияние генетических маркеров на стратификацию риска. В результате построения дерева регрессии и рекурсивного разбиения пациентов мы выяснили, что оптимальная точка разделения (порог отсечения) пациентов ИБС и контрольной группы - ГИ ? 5.

...