Пренатальный биохимический скрининг - система, принципы, клинико-диагностические критерии, алгоритмы

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПРЕНАТАЛЬНЫЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ -- СИСТЕМА, ПРИНЦИПЫ, КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ, АЛГОРИТМЫ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Кащеева Татьяна Константиновна

Санкт-Петербург - 2009

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Профилактика рождения детей с наследственной и врожденной патологией является главной задачей службы пренатальной диагностики (ПД). При этом внимание сосредоточено на выявлении болезни Дауна как наиболее распространенной хромосомной патологии, совместимой не только с живорождением, но и приводящей к тяжелой инвалидизации в постнатальном периоде. Известно, что риск рождения ребенка с синдромом Дауна (СД) увеличивается с возрастом женщины. Однако 2/3 детей с синдромом Дауна рождаются у матерей моложе 35 лет, поскольку подавляющее число (92 % по итогам 2006 г.) родов приходится именно на эту группу беременных. В настоящее время эффективным методом формирования групп высокого риска для ПД хромосомных болезней является комплексный ультразвуковой (УЗ) и биохимический скрининг (БС) [Баранов В.С. и др., 2002; Юдина Е.В., Медведев М.В., 2002]. В зарубежной литературе достаточно полно освещены вопросы проведения и эффективности (как с медицинской, так и с экономической точки зрения) биохимического скрининга во втором триместре беременности [Benn Р., 2002]. Наибольшая эффективность скринирующих программ, основанных на статистическом анализе большого числа косвенных признаков патологии плода, достигается при максимальном охвате беременных, при так называемом тотальном (массовом) обследовании [Николаидес К., 2007]. Отдельные отечественные работы касаются биохимического скрининга во 2-м триместре [Золотухина Т.В. и др., 1994, 1998]. Однако массовый скрининг беременных с целью формирования группы высокого риска хромосомной патологии в городах РФ только начинает проводиться, и параметры распределения уровня маркерных белков сыворотки крови для дифференциации нормы и патологии среди беременных РФ неизвестны. Использование результатов БС беременных, находящихся в иных географических и социальных условиях, приводит к увеличению группы риска или к снижению чувствительности метода. Важным аспектом биохимического скрининга является то, что отклонения маркерных белков могут служить прогностическим признаком неблагоприятного течения беременности. Следовательно, массовый БС беременных в соответствующие сроки позволяет выявлять женщин группы высокого риска не только по хромосомным болезням у плода, но и по акушерской патологии [Гагарина А.В. и др., 2005; Crossley J.A. et al., 2006].

Результаты скрининговых исследований в 1 триместре беременности, хотя и обсуждаются в литературе более 10 лет, носят противоречивый характер и в разных зарубежных центрах их эффективность оценивается по-разному [Wald N.J. et al., 1997; Cuckle H., van Lith J.M., 1999]. В РФ массовый скрининг в 1 триместре беременности не проводится. Рекомендации, тактика и оптимальные условия проведения биохимического скрининга в 1 триместре и комбинированного биохимического и ультразвукового скрининга не разработаны. Нормативные значения и параметры распределений биохимических маркеров 1 триместра для беременных РФ и, в частности, Северо-Западного региона России отсутствуют [Некрасова Е.С. и др., 2003; 2005].

Таким образом, данные, имеющиеся в литературе, носят фрагментарный, иногда противоречивый характер, а рекомендации по организации и проведению биохимического скрининга не конкретизированы. До сих пор не разработана система массового биохимического скрининга, объединяющая усилия специалистов разного профиля в мониторинге беременных и решении проблемы профилактики врожденных пороков развития (ВПР), что и определяет актуальность исследования.

Цель исследования: разработать систему, принципы, клинико-диагностические критерии и алгоритмы пренатального биохимического скрининга, эффективного для выявления женщин группы высокого риска по рождению детей с ВПР и/или хромосомными болезнями, а также по осложненному течению беременности.

Задачи исследования:

1. Разработать клинико-диагностические критерии проведения пренатального биохимического скрининга при сроке 9-13 и 15-17 недель беременности.

2. Предложить алгоритмы обследования беременных с помощью разработанных критериев и показать их эффективность при формировании групп высокого риска врожденных пороков развития плода.

3. Разработать систему пренатального биохимического скрининга беременных с использованием автоматизированных программ расчета индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна.

4. Сравнить эффективность массового биохимического скрининга 1-го и 2-го триместров беременности и определить оптимальные алгоритмы взаимодействия ЛПУ первичного звена и специалистов медико-генетической службы при обследовании беременных, в зависимости от срока постановки пациентки на учет в женскую консультацию.

5. Провести клинические испытания разработанных отечественных тест-систем для определения маркерных сывороточных белков и определить параметры распределения их уровней для использования в пренатальном биохимическом скрининге.

6. Разработать и внедрить автоматизированную программу расчета риска синдрома Дауна у плода по результатам исследования биохимических маркеров при сроке 9-13 и/или 15-17 недель беременности и ультразвуковых маркеров в 11-13 недель с расчетом суммарного индивидуального риска.

7. Проанализировать корреляцию уровня сывороточных маркеров в скрининговые сроки с различными осложнениями течения беременности у пациенток с нормальным кариотипом плода.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые в массовом скрининге определены параметры распределения содержания альфа-фетопротеина (АФП) и хориального гонадотропина человека (ХГЧ) во 2-м триместре беременности в норме и при синдроме Дауна у плода для жительниц РФ. Разработаны собственные клинико-диагностические критерии биохимического скрининга на содержание АФП и ХГЧ с использованием оригинальной программы автоматизированного расчета риска. Впервые изучены параметры распределения уровня плазменного ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А) и свободной в-субъединицы ХГЧ (своб. в-ХГЧ) в крови беременных РФ в норме и при синдроме Дауна у плода. Показана эффективность использования комбинированного ультразвукового и биохимического скрининга при сроке 9-13 недель для выявления беременных высокого риска рождения детей с синдромом Дауна. Предложена автоматизированная программа расчета индивидуального риска, основанная на принципе использования имеющихся у беременной результатов скрининговых исследований в 1-м и 2-м триместрах беременности для определения суммарного риска рождения ребенка с синдромом Дауна. Предложена оригинальная формула расчета суммарного риска беременной по результатам скрининга в 1-м и 2-м триместрах. Разработан алгоритм поэтапного (контингентного) пренатального скрининга с уточнением индивидуального риска по результатам исследования АФП и ХГЧ у беременных с пограничными результатами комбинированного скрининга в 1-м триместре.

Практическая значимость. Разработана методика получения нормативных значений для тест-систем различных производителей и впервые получены медианы АФП, ХГЧ во 2-м триместре беременности для жительниц России с применением реагентов основных зарубежных поставщиков. Нормативные значения и параметры распределения исследованных сывороточных маркеров могут служить основой для внедрения биохимического скрининга с целью профилактики ДЗНТ и синдрома Дауна в практику работы медико-генетических консультаций и клинико-диагностических лабораторий РФ. Разработанные клинико-диагностические критерии и алгоритмы взаимодействия лечебно-профилактических учреждений первичного звена, медико-генетической службы и Федерального медико-генетического центра при проведении массового биохимического скрининга беременных могут применяться в различных по численности населения регионах. Предлагаются разные формы организации скрининга в зависимости от числа лабораторий, их оснащенности и удаленности от кабинета генетика и центра пренатальной диагностики. Предложенные упрощенная и автоматизированная методики расчета суммарного индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна могут применяться в соответствии с диагностическими возможностями лабораторий или центров медико-генетической службы.

Внедрение в практику. Результаты работы более десяти лет используются в практической деятельности лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург), Санкт-Петербургского городского диагностического центра (медико-генетического), а также в работе Медико-генетической консультации г. Петрозаводска. С помощью разработанных программных средств осуществляется массовый биохимический скрининг беременных гг. Норильска, Благовещенска, Тверской и Калининградской областей. Результаты работы используются также отдельными лабораториями и диагностическими центрами ряда других городов РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Проведение массового биохимического скрининга в 15-17 недель беременности позволяет эффективно сформировать группу женщин высокого риска по рождению детей с некоторыми пороками развития и/или синдромом Дауна у плода. Высокая чувствительность выявления синдрома Дауна (до 74%) определяется корректностью установления нормативных значений и параметров распределения уровня сывороточных маркеров для жительниц обследуемого региона.

2. Биохимический скрининг с расчетом индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна в 9-13 недель беременности в полтора раза повышает чувствительность выявления плодов с синдромом Дауна у беременных моложе 35 лет по сравнению со скринингом во 2-м триместре. Общая чувствительность комбинированного скрининга превышает 90% и определяется корректностью оценки сроков беременности, установления нормативных значений (медиан) и параметров распределения биохимических (РАРР-А, своб. в-ХГЧ) и ультразвуковых маркеров - толщины воротникового пространства (ТВП).

3. Взаимодействие специалистов УЗД, медико-генетической службы и стандартизация определения срока беременности и величины ТВП приобретает особое значение в 1-м триместре в связи со значительной корреляцией содержания биохимических маркеров и срока беременности.

4. Постоянный контроль девиации нормативных значений (медиан) биохимических маркеров, их корректировка при необходимости и анализ всех случаев пре- и постнатального выявления синдрома Дауна являются обязательными элементами системы мониторинга беременных и определяют качество биохимического скрининга.

Апробация работы и публикация материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 65 работ, среди них 2 главы в монографиях, 7 учебно-методических пособий и руководств для врачей и специалистов по лабораторной диагностике и 24 статьи, включая 9 статей в изданиях, определенных перечнем ВАК.

Результаты исследований доложены и обсуждены на расширенном заседании коллектива лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН, на 1 и 3 съездах медицинских генетиков России (Курск, 1994; Москва, 1997); на Международном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2001, 2003, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); на II Международном конгрессе «Невский радиологический форум-2005» (Санкт-Петербург, 2005); на научно-практической конференции по профилактике ВПР в Кемеровской области (Кемерово, 2005); на Всероссийской конференции с международным участием по пренатальному скринингу (Санкт-Петербург, 2006); на Всероссийской конференции по перинатальному скринингу и пренатальной диагностике (Санкт-Петербург, 2007); на 2-м Российском Форуме «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); на научном семинаре главных акушеров-гинекологов Тверской области (Тверь, 2008); на международном научно-практическом симпозиуме «Современные достижения в пренатальной диагностике» (Донецк, 2008); на научно-практической конференции «Профилактика врожденной и наследственной патологии у детей», посвященной 20-летию МГК ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» МЗ и СР Республики Карелия (Петрозаводск, 2008); на IV съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 2008); на 2-ой конференции по пренатальной диагностике PECO-EUCROMIC (Будапешт, 1997; Прага, 1999); на Международном семинаре по клинической генетике (Афины, 2004); на Международных Европейских и Всемирных съездах по генетике человека (Вена, 2001; Бирмингем, 2003; Мюнхен, 2004; Ницца, 2007; Барселона, 2008; Ванкувер, 2008); на 6, 7 и 8-м Международных конгрессах IDSSG (Лондон, 2003; Амстердам, 2006; Ванкувер, 2008).

Связь с темами НИР. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ГУ НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН (рег. № 0120.0 602510).

Личный вклад автора. Автором лично выполнены биохимические исследования содержания сывороточных маркеров в крови более 10 тысяч пациенток в 1 и 2-м триместрах; разработаны нормативные значения уровня шести сывороточных маркеров у беременных; собраны коллекции образцов крови пациенток с известными сроками и исходами беременности для установления нормативных значений маркеров; проведены клинические испытания отечественных реагентов; выполнена статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследований; разработаны алгоритмы пренатального биохимического скрининга беременных в 1-м и 2-м триместре; условия проведения биохимического скрининга в диагностических центрах, не входящих в медико-генетическую службу города; поставлены задачи по созданию и предложены алгоритмы автоматизированных программ расчета индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна для различных сочетаний биохимических и ультразвуковых маркеров, определенных до 18 недель беременности.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 101 таблицей и 30 рисунками. Список литературы содержит 355 наименований, в том числе 40 отечественных и 315 иностранных источников.

Содержание исследования

1. Материалы и методы

Для решения задач, поставленных в настоящей работе, использован весь арсенал методов, применяемых в пренатальной диагностике для отбора беременных женщин групп высокого риска врожденной и наследственной (хромосомной) патологии у детей и набор специальных лабораторных методов исследования. Последние включали следующие основные методы:

1. Биохимическое, иммунохимическое, иммунофлуоресцентное исследование эмбриональных маркерных сывороточных белков.

2. Методы ультразвуковой диагностики (ультразвуковая фетометрия).

3. Цитогенетические методы исследования биоптатов хориона и плаценты, полученных при помощи хорионбиопсии, плацентобиопсии, или образцов пуповинной крови, полученных с помощью кордоцентеза.

В работе применялись математические методы расчета риска рождения ребенка с болезнью Дауна и методы статистической обработки результатов.

Материалом для исследования служили образцы венозной крови 63463 беременных, взятые у пациенток в сроке 14 недель 0 дней - 20 недель 6 дней в женских консультациях и в НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН по направлению врача-генетика в рамках биохимического скрининга на наличие хромосомной патологии и врожденных пороков развития плода в 2000-2003 гг. 80 % исследований проводилось в биохимической лаборатории Санкт-Петербургского городского диагностического центра (медико-генетического). 20 % исследований крови беременных осуществлялось в лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН. Для установления медиан содержания сывороточных маркеров в 1 триместре беременности исследовались 5720 образцов венозной крови пациенток в сроке 8 недель 0 дней - 13 недель 6 дней беременности, наблюдавшихся в НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН в 2003-2007 гг., и 2748 образцов венозной крови пациенток, обследованных в рамках биохимического скрининга в 9-13 недель беременности в Санкт-Петербургском городском диагностическом центре (медико-генетическом).

Клинические исследования уровня сывороточных маркеров в образцах крови с использованием различных тест-систем осуществлялись в лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека НИИАГ им. Д.О.Отта в 2007-2008 гг. Использовались образцы свежей венозной крови, а также аликвоты образцов, измеренных в ходе пренатального биохимического скрининга, хранившиеся при -20°-70єС не более 6 месяцев и размороженные не более 2-х раз. Концентрацию АФП и ХГЧ определяли твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем «ИФА-АФП-1» и «ГонадотропинИФА-ХГЧ-1», производства ООО «Алкор Био» (Санкт-Петербург). Определение содержания инг А проводилось с помощью тест-систем Inhibin A ELISA DSL-10-28100, НЭ - с помощью тест-систем Estriol uncon ELISA DSL-10-3700 производства США, поставщик группа компаний «Биохиммак» (Москва). Определение АФП, общего ХГЧ, плазменного ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А) и свободной бета-субъединицы ХГЧ осуществляли также методом ИФА с помощью тест-систем ООО «Хема» (Москва). Определение содержания свободной бета-субъединицы хориального гонадотропина, НЭ и РАРР-А проводили твердофазным двухсайтовым иммунофлуоресцентным методом с применением непрямой сендвич-методики с использованием тест-систем DELFIA free-beta-HCG, DELFIA Unconjugated Estriol и DELFIA РАРР-А производства Wallac/Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Финляндия (поставщик фирма «Приборы», Москва). Определение концентрации своб. в-ХГЧ, РАРР-А и НЭ по стандартной калибровочной кривой проводили с использованием автоматической программы «MultiCalc». Уровни маркеров выражали в единицах МоМ путем деления измеренного значения на медиану для данного срока беременности. Для приготовления препаратов метафазных хромосом клеток плода использовали «прямой» метод, разработанный в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН [Кузнецова Т.В. и др., 2006]. Постнатальное кариотипирование детей с СД проводилось стандартным методом цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови новорожденных в цитогенетической лаборатории СПбДЦ(МГ) и НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН. Все фетометрические исследования проведены на ультразвуковых диагностических приборах фирмы «ALOKA» (Япония) модели SSD-2000, оснащенных всеми типами датчиков, используемых в акушерских исследованиях. Все измерения проводились в соответствии с положениями Приказа МЗ РФ № 457 от 28.12.2002 и рекомендациями Фонда фетальной медицины [Николаидес К., 2007].

Риск рождения ребенка с синдромом Дауна во 2-м триместре рассчитывался с помощью оригинальной программы «Программа мониторинга синдрома Дауна», разработанной в Санкт-Петербурге в 1999-2000 годах при поддержке ООО «Алкор Био» специалистами ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург) совместно со специалистами лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН и применяющейся в медико-генетической службе города с 2001 года. Во 2-м триместре к группе беременных высокого риска рождения детей с хромосомной патологией относили пациенток при риске более чем 1 на 360 (0,28 %) [Кащеева Т.К. и др., 2002]. В группу риска по наличию хромосомной патологии плода были включены и женщины, у которых отмечалось одновременное снижение содержания обоих сывороточных белков более чем в два раза относительно нормы.

Для расчета риска рождения ребенка с хромосомной патологией с учетом возраста матери, данных анамнеза, УЗИ и концентрации обоих сывороточных белков в 1 триместре использовалась программа «Life Cycle» (Wallac/Perkin Elmer Life & Analytical Science, Turku, Finland), поставщик ООО «Приборы» (Москва). К группе беременных высокого риска рождения детей с хромосомной патологией относили пациенток при риске более чем 1 на 250. В группу риска по наличию хромосомной патологии плода были включены также женщины, у которых отмечалось одновременное снижение обоих сывороточных белков более чем в два раза относительно нормы. Результаты исследования обработаны на IBM PC Pentium 4 при помощи программы SPSS 16. Сравнение различных данных проведено с использованием критерия Стъюдента, Колмогорова-Смирнова и Пирсона (2). Различия признаков считались достоверными при 95% уровне значимости (p<0,05). Взаимосвязи различных признаков определяли при помощи корреляционного анализа, оценку значимости которого проводили при помощи общепринятых таблиц. При анализе зависимости различных показателей использовали линейные и нелинейные методы множественного регрессионного анализа. Определение вклада каждого маркера в дифференциацию нормы и патологии проводили методом дискриминантного анализа.

2. Результаты исследования

1. Медианы содержания АФП и ХГЧ в крови жительниц Санкт-Петербурга в норме были уточнены по результатам исследования более 50 тысяч образцов крови пациенток при сроке 14-20 недель беременности. В таблицах 1 и 2 приведены параметры распределения относительной концентрации сывороточных маркеров во 2-м триместре беременности в норме. В 1999-2000 годах в ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН совместно c ООО «Мединформатика» (в настоящее время ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург)) была разработана и внедрена оригинальная компьютерная программа автоматического расчета риска болезни Дауна у плода («Программа мониторинга синдрома Дауна», ПМСД) по результатам скрининга уровня АФП и ХГЧ во 2-м триместре у беременных Санкт-Петербурга. Алгоритм обследования (рис. 1) основан на подсчете отношения правдоподобия, то есть вероятности, что результаты данной беременной принадлежат к нормальному распределению маркеров, а не к распределению для плодов с СД. Отношение правдоподобия вычисляется следующим образом: частоту встречаемости данного уровня маркера в распределении для плодов с СД делят на частоту встречаемости данного уровня в крови беременных с нормальным кариотипом плода. Распределение уровня сывороточного маркера в норме и распределение того же маркера при СД у плода характеризуются двумя параметрами: положением максимума распределения (медианой - М) и «шириной» распределения (стандартным отклонением - СО), разница между нормой и патологией определяется сдвигом медиан. Вычисление индивидуального риска возможно только после определения параметров распределений. Распределения уровня АФП (МоМ) и ХГЧ (МоМ) были предварительно построены для каждой недели беременности в используемом диапазоне сроков и после их логарифмической трансформации были определены параметры нормальных значений маркеров (рис. 2).

Таблица 1. Медианы содержания АФП и стандартное отклонение натурального логарифма АФП (МоМ) в крови беременных Санкт-Петербурга с 14 по 20-ю неделю беременности.

Таблица 2. Медианы содержания ХГЧ, коэффициенты корреляции и стандартное отклонение натурального логарифма ХГЧ (МоМ) в крови беременных СПб с 14 по 20-ю неделю беременности.

Ниже приведены величины стандартного отклонения (СО) для АФП и ХГЧ, полученные в нашем исследовании. Рядом указаны величины СО, применяемые в расчетах риска в Англии [Cuckle et al., 1995] (табл. 3). Ввиду однородности населения Санкт-Петербурга в 1997 году параметр «этническая принадлежность» не вводили. Во второй версии программы в 2008 году авторами введена возможность учета этнического фактора в связи с растущим числом обращений беременных иного происхождения (в основном азиатского). Из литературных данных следует, что у беременных других рас существуют смещения медиан сывороточных маркеров относительно европейских нормативных значений [Wald N.J. et al., 1998]. По мере исследования образцов крови беременных других этнических групп необходимо уточнять поправки и наличие смещения в среднем уровне сывороточных маркеров.

Показанием для применения инвазивной ПД с целью кариотипирования плода, являлся риск выше, чем 1:360 (0,28%). В нашем алгоритме был выбран пороговый риск, соответствующий риску рождения ребенка с СД у женщины, которая должна родить в 35 лет и 9 месяцев.

Рис. 1. Схема обследования беременных Санкт-Петербурга при сроке 15-18 недель на содержание АФП и ХГЧ.

Таблица 3. Среднее стандартное отклонение десятичного логарифма АФП и ХГЧ (в единицах МоМ) и коэффициенты корреляции, рассчитанные для нормальной беременности.

Как и следовало ожидать из сдвига распределений уровня маркеров в норме и патологии, при снижении порогового риска чувствительность возрастает (табл. 4), однако, одновременно возрастает и число ложноположительных результатов (ЛПР). Таким образом, с целью повышения чувствительности скрининга до 74% мы заведомо пошли на увеличение числа ЛПР до 6,7%.

Таблица 4. Выявляемость плодов с синдромом Дауна в зависимости от порогового риска при биохимическом скрининге в 15-18 недель беременности (N = 255)

Единственным способом оценки риска в массовом скрининге является автоматизированный расчет риска рождения ребенка с СД, учитывающий все факторы, изменяющие концентрацию маркеров в крови беременных. При создании программного средства применялись стандартные математические методы и полученные на первом этапе массового скрининга экспериментальные данные.

Статистическая обработка результатов показала, что согласно критерию Колмогорова-Смирнова распределение АФП (МоМ) в логарифмическом масштабе соответствует Гауссову закону со средним значением логарифма АФП, равным 0,000 и медианой, равной - 0,0135. Распределение ХГЧ так же соответствует нормальному закону, среднее значение логарифма ХГЧ равно 0,000 и медиана равна 0,001 (рис. 2). На рисунке 4 приведена динамика медиан АФП и ХГЧ при нормальном кариотипе плода по кварталам 2002-2003 годов по результатам нашего исследования для тест-систем производства ООО «Алкор Био» (Санкт-Петербург). Каждая точка соответствует исследованию более 6500 образцов крови в квартал (диапазон - от 6501 до 7706 образцов). Медиана АФП ведет себя достаточно стабильно: ее изменение ограничивается 2 - 5 %. В то же время медиана ХГЧ снизилась в 1 квартале 2003 года до 0,875 МоМ.

Рис. 2. Распределение содержания альфа-фетопротеина (СО = 0,408) (1) и хорионического гонадотропина (СО = 0,585) (2) в крови беременных Санкт-Петербурга при сроке 14-20 недель в зависимости от логарифма относительного уровня маркера в МоМ.

Рис. 3. Динамика медиан АФП и ХГЧ (в МоМ) по кварталам 2002-2003 гг.

Это означает, что часть беременных с нормальным уровнем ХГЧ были идентифицированы как имеющие повышенный уровень ХГЧ и, соответственно, больший риск СД. С другой стороны, во 2-3-ем квартале медиана повысилась на 5-12%, что привело к недооценке уровня ХГЧ. Такой размах колебаний медианы должен корректироваться специалистами экспертной лаборатории, контролирующей проведение биохимического скрининга.

При измерении уровня АФП и ХГЧ в крови жительниц Санкт-Петербурга с помощью пяти типов тест-систем было показано, что при сроке 14 и 19-20 недель медианы являются нестабильными и не могут использоваться для надежного расчета риска (рис. 4). Таким образом, следует сузить диапазон проведения биохимического скрининга сроками 15-18 недель. После установления отсутствия влияния трех циклов замораживания/оттаивания на уровень изучаемых сывороточных маркеров, мы применили для получения медиан следующий подход - определение содержания маркера проводилось как в свежих сыворотках, так и в одно- или двукратно замороженных образцах из собранной коллекции с известными сроками беременности. Такой подход в 3-4 раза сокращает время получения устойчивых нормативных значений (устойчивые медианы требуют набора до 300 образцов для каждой недели беременности). В диагностические сроки беременности (15-18 недель) медианы АФП, полученные на автоматическом анализаторе ARCHITECT I2000SR значительно отличаются от указанных в инструкции величин, что не позволяет использовать последние в расчете риска СД у плода.

Рис. 4. Медианы АФП (МЕ/мл) для различных типов тест-систем при сроке 14 - 20 недель беременности.

Производитель также не предоставляет результатов исследования медиан ХГЧ для пренатального скрининга, говоря о необходимости их самостоятельного изучения. Методами корреляционного анализа показано, что существует высокая корреляция между уровнем АФП и ХГЧ, измеренным с использованием ручных тест-систем ИФА («Алкор Био») и полученным с помощью реагентов для автоматического анализатора ARCHITECT I2000SR (r = 0,8981, r² = 0,8066; p < 0,0001 для АФП и r = 0,8910, r² = 0,7047; p < 0,0001 для ХГЧ) (рис. 5).

Рис. 5. Корреляция уровня материнского сывороточного АФП (МЕ/мл), определенного с помощью тест-систем ИФА-АФП-1 ООО «Алкор Био» и реагентов для автоматического анализатора ARCHITECT I2000SR при сроке 15-18 недель беременности (n =645).

2. Распределение содержания АФП и ХГЧ в крови беременных при синдроме Дауна у плода. За 1997-2007 годы уровни АФП и ХГЧ были определены в 255 образцах сыворотки крови пациенток с синдромом Дауна у плода. Патологический кариотип был в 172 случаях установлен пренатально по результатам инвазивной диагностики в лаборатории ПД НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН и в 38 случаях - в цитогенетической лаборатории СПбДЦ(МГ). В 98 случаях исследование крови матери проводилось в скрининговые сроки, но по разным причинам (отказ беременной от дальнейшего обследования, несвоевременная явка к специалистам по пренатальной диагностике и др.) патологический кариотип (трисомия 21) был выявлен постнатально. Медиана АФП в крови матери для 255 случаев трисомии 21 у плода составила 0,7 МоМ, ХГЧ - 2,19 МоМ. Распределение значений АФП и ХГЧ при СД в нашем исследовании не удовлетворяет критериям Гауссова распределения, поэтому для его нормализации применяют логарифмическую трансформацию данных. В таблице 5 приведены параметры распределения логарифма АФП и ХГЧ в единицах МоМ при СД у плода, показано, что в крови беременных Северо-Западного региона оно является Гауссовым (тест на нормальность положительный, критерий Колмогорова-Смирнова - более 0,05).

Таблица 5. Параметры распределения логарифма АФП (МоМ) и логарифма ХГЧ (МоМ) при СД у плода с 14 по 20 неделю беременности (n=255).

Мы не выявили зависимости между возрастом матери и отклонениями в уровне АФП и ХГЧ при СД у плода в 14-20 недель беременности. Анализ результатов показал, что во всех возрастных группах различия в отклонениях медиан АФП и ХГЧ при СД у плода во 2-м триместре беременности (табл.6) не являются достоверными (р > 0,5). Различия в отклонениях от нормы уровня АФП и ХГЧ (в МоМ) при сроках беременности от 14 до 20 недель в крови пациенток с СД у плода не являются достоверными (р > 0,1). Таким образом, все результаты исследования уровня АФП и ХГЧ в крови матерей детей с СД могут быть объединены в единый массив.

Таблица 6. Содержание АФП и ХГЧ во 2-м триместре в крови беременных различных возрастных групп при синдроме Дауна у плода.

Исследование 255 образцов крови беременных с синдромом Дауна у плода позволило определить параметры и расстояние между вершинами распределений уровня маркеров для жительниц России в норме и при синдроме Дауна, которое используется в расчете индивидуального риска беременных.

3. Содержание АФП и ХГЧ при других хромосомных аномалиях плода. В рамках биохимического скрининга 2-го триместра было определено содержание АФП и ХГЧ у 25 пациенток с синдромом Эдвардса (трисомия 18). Медиана уровня АФП при СЭ у плода составила 0,7 МоМ, а медиана ХГЧ - 0,3 МоМ. Поскольку СЭ у плода практически всегда сопровождается выраженной внутриутробной задержкой развития и МВПР, то беременным с пониженным в два и более раза содержанием обоих маркеров рекомендовали УЗИ 2-го уровня (в специализированном пренатальном центре). При выявлении хотя бы одного ультразвукового маркера хромосомной патологии или пороков развития плода пациентки направлялись на кариотипирование клеток плода для исключения СЭ.

Наибольшие отклонения уровня биохимических маркеров наблюдались при триплоидии. Триплоидия - хромосомное нарушение, при котором аномальный кариотип содержит дополнительный гаплоидный набор чаще - отцовских, реже - материнских хромосом. Во 2-м триместре беременности такой кариотип ассоциирован с задержкой внутриутробного развития, маловодием, пороками развития мозга, конечностей и др. При гистологическом исследовании обнаруживаются патологические изменения формы и структуры ворсин хориона и плаценты, характерные для частичного пузырного заноса. Следствием этого является и характерный патологический уровень ХГЧ, одного из основных продуктов плаценты. Медиана относительного содержания АФП и ХГЧ в крови беременных с триплоидией у плода составляет 1,39 МоМ и 0,18 МоМ, соответственно. Было установлено, что при триплоидии существует два варианта отклонений. Наблюдается, с одной стороны, повышенный уровень АФП и резко повышенный уровень ХГЧ, и с другой - крайне низкие значения ХГЧ при нормальном или сниженном уровне АФП. Было высказано предположение о том, что подобные различия можно объяснить материнским или отцовским происхождением добавочного гаплоидного набора [Spencer K. et al., 2003]. Проверка данного предположения осложняется малой выборкой результатов исследования маркеров при выявлении триплоидии во 2-м триместре - всего 15 случаев за 20 лет.

Наши исследования показали, что далеко не все хромосомные аномалии плода связаны с патологическими изменениями уровня сывороточных маркеров. Биохимический скрининг 2-го триместра эффективно формирует группу риска по СД, СЭ и триплоидии. Другие хромосомные аномалии выявляются с чувствительностью не более 30-40%. Наибольшее число отклонений биохимических маркеров встречается у беременных с так называемым ограниченным плацентарным мозаицизмом (ОПМ). По результатам инвазивной пренатальной диагностики с 2001 по 2006 год из 74 случаев выявления мозаичного кариотипа в плаценте был подтвержден мозаичный кариотип в крови плода (истинный мозаицизм) только в 2-х случаях (2,7%) [Кузнецова Т.В. и др., 2006]. Беременные с ОПМ вносят свой вклад в ложноположительные результаты биохимического скрининга.

4. Содержание неконъюгированного эстриола и ингибина А в крови беременных в норме. Повышение эффективности биохимического скрининга может достигаться за счет повышения точности методов исследования. Например, можно снижать амплитуду колебаний медиан, связанных с технологическим колебанием параметров тест-систем, использовать более точные современные технологии определения концентрации маркерных белков. Можно также ввести в исследования дополнительные маркеры сыворотки крови, учет которых приведет, с одной стороны, к повышению чувствительности скрининга, а с другой стороны - к снижению числа ложноположительных результатов. При этом необходимо учитывать и экономическую составляющую биохимического скрининга - введение каждого маркера в систему массового скрининга существенно удорожает проведение профилактических мероприятий. В 1997 году ввиду отсутствия доступных коммерческих тест-систем для определения неконъюгированного эстриола (НЭ) биохимический скрининг в Санкт-Петербурге был организован как двойной тест. По результатам проведения тройного теста в зарубежных странах оценка роли НЭ в выявлении плодов с СД неоднозначна. Сильная корреляция между АФП и НЭ, выявленная в ходе обследования, не позволяет рассчитывать на резкое увеличение чувствительности. Максимальное увеличение чувствительности скрининга при учете уровня НЭ достигало 4-5 %. Однако позднее, с появлением работ, демонстрирующих снижение ЛПР до 0,5-1% в биохимическом скрининге с использованием квадро-теста, интерес к исследованию НЭ вернулся вновь. Уровень НЭ и ингА для расчета медиан исследовали в сыворотке крови 348 беременных, наблюдавшихся в НИИАГ им. Д.О.Отта в сроке 14-18 недель в 2005-2007 годах. Из результатов, полученных в нашей работе, следует, что содержание ингА в крови пациенток с 15 по 18 неделю беременности практически не зависит от срока. Данные, таким образом, подтверждают выводы предыдущих исследователей о том, что учет уровня ингА в качестве дополнительного биохимического маркера не приводит к повышению числа ложноположительных результатов, связанных с неточным определением срока беременности. Корреляционный анализ (табл. 7) уровня сывороточных маркеров крови беременных при сроке 15-18 недель показал их слабую зависимость друг от друга. Полученные в нашей работе предварительные медианы НЭ и ингА и корреляции позволяют начать пилотные исследования для оценки эффективности квадро-теста в формировании группы беременных высокого риска по развитию преэклампсии.

Таблица 7. Коэффициенты корреляции содержания сывороточных маркеров в крови беременных при сроке 14-20 недель (n = 348).

4. Содержание биохимических маркеров в крови пациенток в 9-13 недель беременности в норме и при синдроме Дауна у плода. Измерение концентрации связанного с беременностью белка сыворотки крови А (РАРР-А) проводилось у 5855 беременных женщин при сроках беременности 8 недель 3 дня - 13 недель 6 дней. Была исследована зависимость концентрации РАРР-А от срока беременности. Распределение концентрации РАРР-А и своб. в-ХГЧ в 1-м триместре беременности в норме и при синдроме Дауна у плода представлены на рисунках 7 и 8.

Рис. 6. Распределение уровня РАРР-А в крови беременных с 9-й по 13-ю недели при нормальном кариотипе и при СД у плода в зависимости от логарифма относительного уровня (МоМ) (n = 5855 и n = 55).

Согласно критерию Колмогорова-Смирнова распределение абсолютных значений уровня РАРР-А не является нормальным. Критериям нормального распределения полностью соответствует распределение относительных величин маркера после логарифмической транформации.

Рис. 7. Распределение уровня своб. в-ХГЧ в крови беременных с 9-й по 13-ю недели при нормальном кариотипе и при СД у плода в зависимости от логарифма относительного уровня (МоМ) (n = 5855 и n = 55).

Ниже (рис. 8) приведены медианы РАРР-А в крови жительниц Петербурга в норме (1) и медианы производителя (2) (Wallac/Perkin Elmer).

Рис. 8. Динамика содержания РАРР-А в крови беременных в норме (1) при сроке 8 -13 недель и медианы производителя (2).

Всем беременным, обследованным в нашей работе, проводилось количественное измерение ТВП плода для оценки нормативных значений этого показателя у жительниц Санкт-Петербурга и его корреляции со сроком беременности. Для исключения дополнительных погрешностей, вносимых аппаратными сдвигами и связанных с индивидуальными особенностями оператора, все морфометрические исследования осуществлялись одним специалистом на одном оборудовании. На рисунке 10 представлены результаты анализа измерений ТВП у 1672 пациенток.

Рис. 9. Распределение величины ТВП плодов с нормальным кариотипом и с СД, измеренной у беременных Санкт-Петербурга в зависимости от логарифма относительного уровня (МоМ) (n = 1672 и n = 55).

«Сила» маркера определяется величиной сдвига вершины распределения в норме и при СД у плода, а число ложноположительных результатов - степенью перекрывания нормального и патологического распределений. Стандартное отклонение логарифма ультразвукового маркера - 0,515 (95% ДИ: 0,487-0,543) значительно ниже, чем у биохимических маркеров - 0,717 (95% ДИ: 0,569-0,864) и 0,663 (95% ДИ: 0,638-0,689). Эти результаты демонстрируют, почему при добавлении в расчет риска ТВП в качестве дополнительного маркера резко снижается число ЛПР (с 13,9% до 6,7%). Мы провели сравнение медиан ТВП, полученных при селективном комбинированном скрининге жительниц Санкт-Петербурга в НИИАГ им. Д.О.Отта и СПбДЦ(МГ), анализируя базы данных каждого центра за последние два года. Поквартальные колебания медиан ТВП (МоМ) в обоих случаях не превышали 3%, что говорит о высоком качестве ультразвукового скрининга в системе медико-генетической службы. В группе пациенток, обследованных в 9-13 недель беременности в рамках комбинированного ультразвукового и биохимического скрининга 1 триместра беременности, было выявлено 55 случаев СД у плода. При анализе отклонений содержания биохимических маркеров от нормы при трисомии 21 у плода в отличие от второго триместра была выявлена корреляция со сроком беременности. Наши исследования показали (табл. 8), что при СД отклонения содержания РАРР-А в крови матери в ранние сроки беременности выражены значительнее, чем в 13 недель беременности. Мы можем говорить только о тенденции, поскольку ввиду малого числа образцов различия не являются достоверными (р = 0,2732). Исследования в данном направлении необходимо продолжать для получения статистически достоверных результатов. Медиана

Таблица 8. Содержание РАРР-А и своб. в-ХГЧ в крови матери при СД у плода в зависимости от срока беременности (n = 55).

уровня РАРР-А при СД у плода составила 0,33 МоМ, своб. в-ХГ - 1,81 МоМ, а ТВП - 1,79 МоМ. Толщина воротникового пространства осталась неизвестной у восьми пациенток с СД у плода, в этих случаях указанная величина отсутствовала в протоколе УЗИ, либо УЗИ проводилось в неинформативные для измерения ТВП сроки. ТВП плода с СД увеличивается в 1,79 раза по сравнению с нормой, однако в 12 из 48 случаев (25%) нормальные значения ТВП снижали риск, рассчитанный по изменению уровня сывороточных маркеров. В трех из них комбинированный риск (0,36%; 0,189%; 0,154%) оказался ниже порогового (0,4%). Риск рождения ребенка с СД не был повышен при учете изменения только уровня биохимических маркеров в пяти случаях. Он составил 0,066; 0,253; 0,096; 0,306 и 0,123%.

Высокий риск по биохимическому скринингу (то есть только по результатам исследования сывороточных маркеров без учета ТВП) - более 1/250, наблюдался у 629 беременных. В обследуемой группе женщин при кариотипировании плода было выявлено 55 случаев трисомии 21. Анализ четырехпольных таблиц результатов биохимического скрининга в 1-м триместре показал, что чувствительность скрининга составила 90,9% (95% ДИ 80,07 - 96,98). Специфичность составила 89,8% (95% ДИ 88,95 - 90,54), выявлен 1 случай СД на 12-13 беременных из группы высокого риска, отрицательная предсказательная величина - 99,9%. Группа ложноположительных результатов составила 11%. Высокий риск по комбинированному (биохимическому и ультразвуковому) скринингу с учетом ТВП наблюдался только у 378 беременных. В работе проанализированы результаты обследования 5720 беременных с помощью двух биохимических и одного ультразвукового маркера. Чувствительность комбинированного скрининга составила 94,55% (95% ДИ 84,88 - 98,86), специфичность составила 94,25% (95% ДИ 93,62 - 94,84), выявлен 1 случай СД на 7-8 беременных из группы высокого риска, отрицательная предсказательная величина - 99,94%. Группа ложноположительных результатов составила 6,6 %. Важным моментом является значительно более высокая чувствительность скрининга СД в 1-м триместре среди беременных моложе 35 лет. Полученные нормативные значения в норме и при синдроме Дауна у плода, стандартные отклонения и коэффициенты корреляции легли в основу автоматизированной программы расчета риска по результатам комбинированного скрининга в 1-м триместре.

В группе обследованных в 1 триместре беременных в 11 случаях результатом пренатального кариотипирования материала плода явилось установление второго по частоте хромосомного нарушения - трисомии по 18 хромосоме (синдром Эдвардса). Медианы РАРР-А и своб. в-ХГЧ при СЭ у плода снижены и равны 0,2 МоМ. Уровень обоих маркеров был снижен до 0,5 МоМ и более всего у 89 пациенток (3,42 %). Согласно выбранному критерию (относительное снижение обоих маркеров до 0,5 МоМ) СЭ выявляется в 72,7% случаев.

6. Связь отклонений сывороточных маркеров и неблагоприятных исходов беременности. Патофизиологические механизмы изменения уровня материнского сывороточного АФП и ХГЧ при СД у плода находятся в стадии изучения. Необъяснимое повышение уровня АФП наблюдается у 1-3 % обследованных при скрининге пациенток. Повышенный уровень одного или обоих маркеров в ряде работ связывают с возникшими позднее осложнениями беременности. В крови 129 женщин с нормальным кариотипом плода после биохимического скрининга в 15-18 недель измеряли уровни АФП и ХГЧ каждые 4 недели. Группы были сформированы по уровню отклонений АФП или ХГЧ в скрининговые сроки. Следует отметить, что у 88,2% беременных, имевших повышенные уровни АФП в 15-18 недель, к 24-й неделе уровень АФП оставался повышенным, но затем сравнялся с остальными группами. Анализ динамики уровня АФП, в связи с ростом его содержания в группе сравнения и стабильностью среднего содержания АФП в крови беременных 2-й группы, показал, что достоверных различий в уровне АФП при сроке после 24 недель не наблюдалось. При сопоставлении исходов беременности обследуемых женщин было показано, что повышенное содержание АФП или ХГЧ в крови беременных в 15-18 недель является маркером раннего развития плацентарной недостаточности и последующей гипотрофии плода [Гагарина А.В. и др., 2002] . Корреляционный анализ показал прямую зависимость между уровнем ХГЧ у пациенток в 20 и 28 недель беременности и наличием у них в дальнейшем гипотрофии новорожденного (r=0,972; p<0,006 и r=0,836; p=0,038, соответственно). Опыт массового биохимического скрининга во 2-м триместре позволил нам предложить следующий алгоритм ведения беременных с измененными МСБ (рис. 10).

Рис. 10. Алгоритм ведения беременных с нормальным кариотипом плода и измененными значениями МСБ во 2-м триместре.

При изолированном повышении АФП или ХГЧ более 2-х МоМ во 2-м триместре беременности рекомендуется проведение допплерометрии при сроке 24 недели [Гагарина А.В. и др., 2002]. В 8-13 недель беременности также существует выраженная корреляция между низкими уровнями РАРР-А в крови матери и неблагоприятным исходом беременности. Содержание свободной в-субъединицы ХГЧ меньше связано с неблагоприятным прогнозом течения беременности. Низкие значения своб. в-ХГЧ, главным образом, ассоциированы с хромосомной патологией плода и составляют всего 0,24 МоМ при СЭ у плода и еще более снижены при триплоидии, но встречаются достаточно редко - всего в 1,9% (112 случаев).

7. Биохимический скрининг при многоплодной беременности и после применения методов вспомогательных репродуктивных технологий. При проведении массового биохимического скрининга во 2-м триместре в Санкт-Петербурге было исследовано 399 образцов крови беременных с двойней. Средний уровень АФП при двойне с нормальным кариотипом плода составил 2,15 МоМ (СО 0,5221; 95% ДИ: 1,669-2,635), а ХГЧ - 2,54 МоМ (СО 0,4251; 95% ДИ: 2,15 - 2,94). За 15 лет во 2-м триместре сывороточные маркеры были исследованы только в трех случаях СД у одного плода из двойни. В последние годы увеличилось число многоплодных беременностей после применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В группе беременных после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) выявлено снижение содержания маркеров, оно не достигает достоверного, но наблюдается тенденция к снижению уровня АФП и ХГЧ при беременности двойней после ЭКО. Содержание НЭ в крови матери при двойне не зависит от применения ВРТ.

В 1-м триместре при беременности двойней с нормальным кариотипом (n = 59) средний уровень РАРР-А составил 2,45 МоМ, а своб. в-ХГЧ - 2,32 МоМ, соответственно. За время исследований в 1-м триместре нами были получены данные о содержании СМ 1-го триместра в крови 18 беременных после ЭКО. Все случаи относятся к одноплодной беременности с нормальным кариотипом плода. Средний уровень РАРР-А составил 1,37 МоМ, а своб.в-ХГ - 1,53 МоМ. Ввиду малости выборки отклонения маркеров не являются достоверными. Группа обследованных пациенток является крайне неоднородной. Применявшиеся методы включали в себя метод ВРТ с применением донорской яйцеклетки, искусственной инсеминации и ИКСИ (внутриплазматический перенос сперматозоидов). Результаты исследования сывороточных маркеров у жительниц Санкт-Петербурга и данные литературы свидетельствуют о значительно меньшем влиянии применения ЭКО на уровень маркеров в 1-м триместре беременности по сравнению с отклонениями маркеров 2-го триместра. Требуется значительное увеличение выборки для получения статистически достоверных результатов. Применение в расчетах риска рождения ребенка с СД поправочных коэффициентов на число плодов без учета снижения медиан у беременных с использованием ВРТ не является корректным. Многообразие методов ВРТ не позволяет использовать в программах расчетов универсальную коррекцию медиан сывороточных маркеров. Таким образом, для профилактики СД у плода беременным после ЭКО рекомендуется проведение комбинированного скрининга в 1-м триместре.