59

Размещено на http://www.allbest.ru/

Клинико-диагностическое значение биохимических маркёров в диагностике сердечно-сосудистых заболеваний у беременных женщин

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Олемпиева Елена Владимировна

Саратов - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Микашинович Зоя Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Коршунов Геннадий Васильевич

доктор медицинских наук Терентьев Владимир Петрович

доктор медицинских наук Шараев Петр Низамиевич

Ведущая организация: научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отто Российской академии медицинских наук Санкт-Петербурга

Защита состоится "___" ______________ 2009 г в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.04 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул.Б. Казачья, 112.

С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава.

Автореферат разослан "____" ________________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Бородулин В. Б.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Широкая распространенность артериальной гипертонии среди взрослого населения привлекает серьезное внимание врачей разных специальностей [Шляхто Е.В. и соавт., 2004; Адаменко А.Н. и соавт., 2007; Люсов В.А. и соавт., 2007; Dickenson C. J., 1991; Marin R., 2000]. В целях повышения эффективности лечебных мероприятий были приняты следующие нормативные документы: Президиумом Совета при Президенте РФ в 2005 году был утверждён приоритетный национальный проект "Здоровье" (протокол №2 от 21 декабря 2005 г), направленный на снижение смертности от сосудистых катастроф, на снижение числа смертей новорождённых, поддержку направления "Материнства и детства" за счёт выделения дополнительных средств на обследование новорождённых и неонатальный скрининг. Необходимо указать, что Президентом РФ была утверждена концепция демографической политики РФ на период до 2025 года (указ Президента РФ от 9 октября 2007 г №1351), а, кроме того, 2008 год был объявлен Годом семьи (указ Президента РФ от 14 июня 2007 г № 761).

Артериальная гипертония и сегодня является наиболее актуальной проблемой клинической медицины. Сохранение высокой распространённости этого заболевания связано с несвоевременной диагностикой, недостаточно эффективным лечением и большой вероятностью неблагоприятного прогноза [Шехтман М. М., 1987; 1992; Алмазов В.А. и соавт., 1992; Шлык С.В., Багмет А.Д., 2000; Батюшин М. М., 2003; Бурцев В.И., 2005; Полятыкина Т.С. и соавт., 2005; Deeg P., 1983; Zuspan F. P., 1984; Girnd J., 1990; Busse R. et al., 2006; Grigoricheva E. A. et al., 2008].

У беременных среди экстрагенитальной патологии наибольшей распространённостью обладают сердечно-сосудистые заболевания (41,9%) и болезни почек (47,8%) [Рымашевский Н.В. и соавт., 1993]. По данным ВОЗ, с артериальной гипертензий связано 20 - 33% случаев материнской смертности, а также 25 - 33% преждевременных родов [Шехтман М. М., 1992].

Течение беременности у женщин с сердечно-сосудистыми заболеваниями является большой и длительной нагрузкой на поражённый орган, а в некоторых случаях может служить фактором риска, ведущим к ухудшению их состояния. Известно, что сама беременность нередко приводит к обострению и ухудшению течения гипертонической болезни, способствует развитию тяжёлых осложнений [Григорян Д.З., 1981; Быстрицкая Т.С., 1989; Елисеев О. М., 1994; Давидович И.М. и соавт., 2003; Luscher T., 1994].

Повышение артериального давления (АД) во время беременности может быть признаком ряда заболеваний: гипертонической болезни, обструкции почечных артерий, хронического гломерулонефрита или пиелонефрита, феохромацитомы, синдрома Конна, синдрома Иценко-Кушинга, позднего токсикоза беременных, а также диабетической нефропатии. Дифференциальная диагностика этих заболеваний при беременности представляет определённые трудности, кроме того, поздний токсикоз может наслаиваться на другие заболевания, сопровождающиеся повышением уровня АД [Елисеев О. М., 1987; Жемчужнова Н.Л., 1999]. Истинную частоту обнаружения ГБ при беременности из ранее перечисленных заболеваний указать трудно, так как диагностические критерии и статистические данные различных авторов весьма разноречивы.

Таким образом, вопросы раннего выявления сосудистой патологии у беременных представляется необходимым и своевременным. Среди множества методов лабораторно-инструментального анализа важно отобрать наиболее точные и достаточные для раннего выявления групп риска [Шепотиновский В.И. и соавт., 1992]. Эта цель может быть достигнута путём патогенетического обоснования индивидуальных особенностей течения беременности на фоне гипертензионного синдрома.

При этом многие авторы [Березовский В.А., 1981; Кулаков В.И., 1987; Рябов Г.А., 1988; Микашинович З.И., 1988; Хышиктуева Н.А. и соавт., 2000; Коколина В.Ф. и соавт., 2006; Robin E. D., 1980] указывают на то, что нет единых биохимических параметров гипоксии при гипертонической болезни, которые можно использовать для оценки тяжести этого состояния во время беременности и, которые были бы легко воспроизводимы в клинической практике.

Биохимические особенности развития гипертензионного синдрома у беременных женщин, его влияние на течение беременности остаются не выясненными и сегодня, что и определило основные направления научного поиска данного исследования.

Анализ биохимической индивидуальности на основе исследования особенностей кислородного обеспечения организма, антиоксидантного статуса, липидного обмена, показателей эндотелиальной дисфункции, а также особенностей функционирования калликреин-кининовой системы крови является актуальным и перспективным направлением в разработке методов качественной диагностики, обеспечивающих выявление сосудистой патологии в самые ранние сроки.

Цель работы - на основании анализа состояния важнейших биохимических систем крови отобрать информативные критерии ранней диагностики сердечно-сосудистых заболеваний у беременных женщин, разработать алгоритм лабораторной диагностики гипертонической болезни I стадии I степени.

Задачи исследования:

1. Оценить состояние газотранспортной функции крови у беременных и небеременных женщин с сердечно-сосудистой патологией.

2. Выявить особенности углеводного метаболизма эритроцитов крови у беременных и небеременных женщин с сердечно-сосудистой патологией.

диагностика гипертоническая болезнь беременная

3. Определить уровень активности ферментов антиоксидантной защиты крови у беременных и небеременных женщин с сердечно-сосудистой патологией.

4. Исследовать степень выраженности деструктивных изменений в крови у беременных и небеременных женщин с сердечно-сосудистой патологией.

5. Проанализировать особенности липопротеидного спектра сыворотки крови у беременных и небеременных женщин с сердечно-сосудистой патологией.

6. Оценить функционирование калликреин-кининовой системы, активность лейкоцитарной эластазы и установить их роль в повреждении сосудистой стенки при формировании сердечно-сосудистой патологии.

7. Отобрать информативные биохимические параметры для создания алгоритма лабораторной диагностики осложнённого течения беременности.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Разработана концепция лабораторной диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы на ранней стадии формирования гипертензионного синдрома у беременных и небеременных женщин.

На основе анализа взаимосвязи биохимических показателей разработан алгоритм лабораторной диагностики гипертонической болезни у беременных женщин.

Впервые предложены: коэффициент оксигенации для диагностики гипоксических состояний, а также оксипролиновый коэффициент для оценки степени деструкции компонентов соединительной ткани.

Впервые изучена роль лейкоцитарной эластазы в формировании гипертонуса сосудистой стенки и её вклад в развитие патогенетических механизмов данного патологического процесса.

Выявленные особенности изменения гомеостаза у беременных и небеременных женщин помогут использовать обнаруженные биохимические маркёры в практическом здравоохранении с целью ранней лабораторной диагностики, профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы и оценки эффективности проводимого лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. развитие беременности характеризуется гипоксией и реперфузионной эндогенной токсемией, более выраженной при осложнённом течении.

2. выраженный окислительный стресс у беременных с гипертонической болезнью способствует формированию эндотелиальной и митохондриальной дисфункции, что приводит к активации вазоконстрикторных реакций.

3. физиологическое и осложнённое течение беременности сопровождается повышением функционально-метаболической активности нейтрофилов, участвующих в процессах послеродовой инволюции и репарации матки.

4. разработанная модель лабораторной диагностики осложнённого течения беременности существенно повышает диагностическую значимость используемых биохимических параметров.

Внедрения результатов работы в практику:

1. Внедрение материалов диссертационного исследования в лечебно-диагностических целях на базах клиник терапевтического и акушерско-гинекологического профиля и кафедр РостГМУ

2. Патент на изобретение "Способ повышения неспецифической резистентности организма беременной женщины к родовому акту" (№2241465 от 10.12.2004).

3. Заявка на изобретение "Способ лечения фетоплацентарной недостаточности" (№2008152545 от 29.12.2008 г.).

4. Заявка на изобретение "Способ диагностики гипоксии" (№2009102685 от 27.01.2009 г.).

5. Заявка на изобретение "Способ диагностики ацидоза" (№2009109077 от 12.03.2009 г.).

6. Монография "Метаболические аспекты внутриутробной гипоксии плода при сердечно-сосудистой патологии у беременных".

Апробация работы:

Основные положения диссертации представлены на международной научной олимпиаде "Ломоносов-2006" (Москва, 2006 г.), всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины" (Тюмень, 2007 г.), научно-практической конференции "Актуальные проблемы охраны здоровья матери и ребёнка" (Краснодар, 2003 г.), международном конгрессе "Перспектива-2007" (Нальчик, 2007 г.), VII и VIII международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2006 и 2007 гг.), V национальной научно-практической конференции "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2007 г.), научно-практической конференции врачей ЮФО "Актуальные проблемы инфекционной патологии у детей" (Ростов-на-Дону, 2006 г.), IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2004 г.), межвузовской международной конференции "Обмен веществ при адаптации и повреждении" (Ростов-на-Дону, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 г. г.), международной конференции "Физиология и патология иммунной системы" (Москва, 2008 г.), 69 научно-практической конференции "Молодые учёные - здравоохранению региона" (Саратов, 2008), IV научно-практической конференции "Завадские чтения" (Ростов-на-Дону, 2009 г.), III международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2009 г.).

По теме диссертационного исследования опубликовано научных работ - 60, из которых 18 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. В соавторстве опубликована монография "Метаболические аспекты внутриутробной гипоксии плода при сердечно-сосудистой патологии у беременных" (тираж - 1000 экземпляров). Получен патент на изобретение "Способ повышения неспецифической резистентности организма беременной женщины к родовому акту" (№ 2241465 от 10.12.2004), заявки на изобретения "Способ лечения фетоплацентарной недостаточности", "Способ диагностики ацидоза" и "Способ диагностики гипоксии".

В завершённом виде диссертация апробирована на конференции КБУНК Ростовского государственного медицинского университета, ЦНИЛ Саратовского государственного медицинского университета.

Структура и объём работы:

Диссертация изложена на 322 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 46 рисунками, содержит 38 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), общей характеристики материала и методов биохимического исследования (глава 2), изложения полученных результатов (главы 3, 4, 5, 6,7), обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 546 источников, из них 359 отечественных и 187 иностранных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Для изучения направленности метаболических процессов в организме беременных при физиологическом и осложнённом течении беременности проведены исследования у 80 беременных при сроке гестации 38-42 недели, а также у 68 небеременных женщин репродуктивного возраста. По характеру течения основного заболевания, развития беременности, данных УЗИ и морфологического исследования плаценты были выделены следующие группы обследуемых.

Контрольную группу составили 33 практически здоровых женщин репродуктивного возраста без признаков сердечно-сосудистой патологии. Средний возраст составил 25,3 2,8 лет.

Первая клиническая группа представлена 30 беременными женщинами с физиологическим течением беременности. Их возраст составил в среднем 24,1 1,66 года. Все пациентки данной клинической группы не имели хронической сердечно-сосудистой и акушерской патологии.

Вторую клиническую группу составили 35 женщин репродуктивного возраста с верифицированной гипертонической болезнью I стадии I степени. Средний возраст пациенток составил 42,1 3,6 года. Длительность основного заболевания не превышала 5 - 6 лет.

Третью клиническую группу составили 50 беременных женщин с верифицированной гипертонической болезнью I стадии I степени. Их возраст составил в среднем 26,0 2,8 лет. Длительность основного заболевания не превышала 5 - 6 лет.

Биохимические методы исследования

В эритроцитах венозной крови определяли активность следующих ферментов: каталазы (КФ 1.11.1.6), супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1), глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9), глутатионредуктазы (КФ 1.6.5.2), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49), а также количество восстановленного глутатиона. В плазме крови определяли активность миелопероксидазы (КФ 1.11.1.7), цитохромоксидазы (КФ 1.9.3.1), а также количество внеэритроцитарного гемоглобина. В сыворотке крови определяли активность лейкоцитарной эластазы (КФ 3.4.21.37), концентрацию церулоплазмина, малонового диальдегида, молекулы средней массы, липопротеидный спектр, оксипролин, а также параметры калликреин-кининовой системы. Для определения активности ферментов в клетках крови использовали 20% гемолизат, приготовленный на бидистилированной воде.

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по методу Корнберга Л. в модификации Захарьина Ю.Л. (1967) спектрофотометрически по степени восстановления НАДФ в ферментативной реакции с глюкозо-6-фосфатом в присутствии ионов магния. Активность выражали в мкМоль/г Нв в час.

Активность каталазы определяли колориметрически на ФЭК КФК 2-МП при длине волны =400 нм [Королюк А. и соавт., 1988]. Активность каталазы рассчитывали, исходя из коэффициента миллимолярной экстинкции =22,2 Ч103 мл-1 сек-1, и выражали в мкКатал/л.

Определение концентрации восстановленного глутатиона проводили колориметрическим методом Ellman G. L. (1959) с 5,5-дитиобис (2-нитробензойной) кислотой (5,5-ДТНБК). Концентрацию восстановленного глутатиона в эритроцитах выражали в мкМоль/г Нв.

Активность глутатионпероксидазы определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу Моина В.М. (1986). Концентрацию восстановленного глутатиона до и после инкубации определяли спектрофотометрически при длине волны =412 нм. Активность данного фермента выражали в мкМоль/ г Нв.

Активность глутатионредуктазы определяли спектрофотометрически по скорости окисления НАДФ методом Юсуповой Л.Б. (1989) при длине волны л=340 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград). Активность фермента выражали в микромолях превращения НАДФ в 1 минуту.

Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах крови проводили по методу Misra H. P. и Fridovich J. (1972), описанному Саркисяном О.Г. (2000). Результат выражали в условных единицах на 1 г. Нв.

Определение активности миелопероксидазы (МПО) в плазме крови проводили по методу Klebanoff (1971), описанному Шафран М.Г. и Лызловой С.Н. (1975), результаты выражали в мкМоль/мг белка в минуту.

Выявление лейкоцитарной (гранулоцитарной) эластазы определяли по скорости гидролиза N-тетра-бутокси-карбонил-аланин-р-нитрофенилового эфира (ВОС-Аlа-ОNр) методом описанным Доценко В.Л. (1994). Результат выражали в нм БАНЭ/мин/мл.

Определение активности цитохромоксидазы (ЦХО) проводили спектрофотометрическим методом Кривченковой Р.С. (1977) в реакции с диметил-n-фенилендиамином при длине волны л=536 нм. Результат выражали в нМоль/мг белка в минуту.

Определение количества церулоплазмина (ЦП) сыворотки крови проводили модифицированным колориметрическим методом Ревина, описанному Колб В.Г. и соавторами (1982) при длине волны л=530 нм. Принцип метода основан на окислении n-фенилендиамина при участии ЦП. Содержание ЦП выражали в мг/л.

Определение малонового диальдегида по образованию в кислой среде триметинового комплекса, состоящего из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), оптическую плотность которого определяли колориметрически при длине волны л=540 нм. Количество МДА рассчитывали исходя из ₀ = 1,56 х 10⁵ М^-1 см^-1, и выражали в нМоль/мг белка.

Внеэритроцитарный гемоглобин (ВЭГ) плазмы крови определяли спектрофотометрическим методом на СФ-46 при длинах волн л=540 и л=680 нм, описанным Каракшевым А.В., Вечевым В.П. (1968), полученные результаты выражали в мМоль/л.

Молекулы средней массы (МСМ) сыворотки крови оценивали спектрофотометрическим методом Николаева А.А. и соавторов (1999) при длинах волн л=254 нм и л=280 нм. Содержание МСМ выражали в г/л.

Определение количества свободного и пептидносвязанного оксипролина сыворотки крови проводили спектрофотометрически по методу Кузнецовой М.П. и соавторов (1982) при длине волны л=550 нм по окислению оксипролина хлорамином Т с парадиметиламинобензальдегидом. Результат выражали в мкг/мл.

Содержание гемоглобина (Нв) крови определяли в гемолизате по методу, описанному Лугановой И.С., Блиновым М.Н. (1975), спектрофотометрически при длине волны л=540 нм в присутствии аммиачного раствора. Концентрацию гемоглобина выражали в г/л.

Количество эритроцитов в крови определяли путём подсчёта в камере Горяева по методу, описанному в руководстве под редакцией Базарова М.А., Морозовой В.Г. (1988), результат выражали в едЧ1012 /л.

2,3-дифосфоглицерат (2,3-ДФГ) определяли неэнзиматическим методом Dyse, Bessman в модификации Лугановой И.С., Блиновым М.Н. (1975), основанным на колориметрическом измерении содержания фосфатов в хлорнокислом экстракте после удаления кислоторастворимых нуклеотидов абсорбцией на активированном угле "Норит". Содержание 2,3-ДФГ рассчитывали по разнице величины общего и неорганического фосфата. Результаты выражали в мкМоль/мл плотного осадка эритроцитов.

Пировиноградную кислоту (ПВК) определяли по Фридеману и Хаугену в модификации Бабаскина П.М. (А.С. СССР №877436, 1981), результаты выражали в мкМоль/мл.

Содержание молочной кислоты определяли по реакции с параоксидифенилом, описанной Меньшиковым В.В. (1987), результат выражали в мМоль/л.

Определение окисленных липопротеидов сыворотки крови осуществляли по методу Yagi К., описанному Музя Г.И. (1999) после её предварительной инкубации в течение 1 часа при температуре 37С в присутствии 50 мкМоль сульфата меди. О степени окисляемости ЛП судили по последующему определению концентрации МДА колориметрическим способом при длине волны л=540 нм [Стальная И.Д., 1977]. Результат выражали в нмоль МДА на грамм белка.

Определение резистентности к окислению ЛПНП и ЛПОНП (гепариносаждённых -липопротеидов) сыворотки крови осуществляли методом Рагино Ю.И. и Душкину М.И. (1998) по предрасположенности гепариносаждённых -ЛП к окислению в присутствии ионов металлов переменной валентности при нормальных условиях. О резистентности к окислению судили по уровню концентрации МДА. Результат выражали в нмоль МДА на грамм белка.

Определение концентрации -липопротеидов сыворотки крови проводили по методу Бурштейна и Самой в присутствии 0,025 М раствора хлорида кальция. Результат выражали в г/л [Тодоров И., 1968; Bursntein M. еt al., 1958].

Определение активности калликреина, содержания калликреиногена (прекалликреина), общей аргинин-эстеразной активности, активности ингибиторов б₁-антитрипсина (б₁-протеиназного ингибитора) и б₂-макроглобулина проводили в сыворотке крови. Кровь помещали в силиконовую пробирку, и после образования сгустка центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут.

Общую аргинин-эстеразную активность (ОБАЭЭ) определяли спектрофотометрически по скорости гидролиза эфирной связи под действием протеиназ исследуемой сыворотки в молекуле синтетического субстрата (БАЭЭ) методом Frautschold, Werle (1961) в модификации Пасхиной Т.С., Яровой Г.Н. (1970). Эстеразную активность сыворотки крови выражали в милиэстеразных единицах на мл (мэе/мл). Одна единица соответствует гидролизу 1 мкмоль БАЭЭ в 1 мин.

Активность б₁-антитрипсина (б₁-ПИ) определяли спетрофотометрически по торможению аргинин-эстеразной активности трипсина разведённой в 50 раз сыворотки крови по методу Нартиковой В.Ф. и соавторов (1979). Активность б₁-антитрипсина выражали в условных ингибиторных единицах в мл сыворотки крови (ИЕ/мл).

Активность б₂-макроглобулина (б₂-МГ) определяли спектрофотометрическим методом Нартиковой В.Ф. и соавторов (1979) по сохраняющейся аргинин-эстеразной активности комплекса трипсин-б₂-макроглобулин, образующегося после взаимодействия избытка трипсина с сывороткой крови, разведённой в 10 раз и последующей инактивацией свободного (не связанного с б₂-макроглобулином) трипсина соевым ингибитором трипсина. Активность б₂-макроглобулина выражали в ИЕ/мл.

Определение активности калликреина и содержание прекалликреина проводили по методу Пасхиной Т.С. и Кринской А.В. (1974) спектрофотометрическим методом по скорости гидролиза этилового эфира N-бензоил-L-аргинина (БАЭЭ) при длине волны л=253 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград). Активность ферментов выражали в мед/мл (международная единица измерения активности калликреина и прекалликреина в системе СИ). За 1 мед принято количество фермента, которое расщепляет 1 мкмоль субстрата (БАЭЭ) за 1 минуту при 25°С.

Статистическую обработку полученных результатов проводили согласно общепринятым методам с определением средней арифметической, ошибки средней с использованием программы STADIA версия 6.0 [Кулайчев, 1996]. О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и опытных групп судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р0,05.

Результаты собственных исследований

1. Кислородзависимые процессы в эритроцитах беременных женщин при гипертонической болезни

Эффективность режима работы сердечно-сосудистой системы определяется функциональным состоянием крови, её способностью связывать необходимое количество кислорода в лёгких и отдавать его в тканевых капиллярах. Вследствие нарушения насосной функции сердца, развития гипоксии и значительного повышения нейрогуморальной активности, происходят сложные изменения на всех этапах транспорта кислорода, а особенно в состоянии центральной гемодинамики. В этом аспекте представляется актуальным изучение функционального состояния эритроцитарной системы беременных и небеременных женщин для поиска маркёров кислородного голодания при гипертонической болезни.

1.1. физиологическое течение беременности

Отсутствие прямых методов динамического контроля за состоянием газотранспортной функции крови женщин при физиологическом течении беременности, побуждает использовать косвенные показатели. В ходе проведённого исследования установлено, что физиологическое течение беременности сопровождается статистически достоверным ростом концентрации 2,3-ДФГ на 283,8% (р<0,005) относительно контрольной группы (рис.1), что свидетельствует о формировании модуляционного типа адаптации, направленного на оптимизацию процессов оксигенации органов и тканей беременных женщин при физиологическом течении беременности.

Рис. 1. Показатели газотранспортной функции крови, углеводного обмена и активность ЦХО у женщин при физиологическом течении беременности

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

2,3-ДФГ - 2,3-дифосфоглицерат, ЦХО - цитохромоксидаза, ПВК - пировиноградная кислота, лактат - молочная кислота, - статистически значимые отличия относительно контрольной группы.

У женщин с физиологическим течением беременности отмечается активация процессов аэробной направленности, что документируется статистически достоверным ростом концентрации ПВК на 87,7% (р<0,05) при параллельном статистически значимом снижении концентрации молочной кислоты на 49,3% (р<0,05). Объективным показателем интенсивности окислительно-восстановительных процессов является коэффициент лактат/пируват. Установлено, что данный показатель у женщин при физиологическом течении беременности статистически достоверно снижается на 72,9% (p<0,05) относительно контрольной группы. При этом нами была зарегистрирована в этой группе женщин тенденция к активации ЦХО плазмы крови.

Выявленный характер обменных процессов в красных клетках крови у данной группы пациенток является компенсаторно-приспособительным механизмом, направленным как для обеспечения адекватной работы основных энергопродуцирующих циклов, так и для кислородного обеспечения плода. Такая направленность обменных процессов эритроцитов представляется физиологически обоснованной, поскольку для родоразрешения требуются значительные энергетические ресурсы, как для непосредственного изгнания плода, так и для адекватного функционирования всех жизненно важных органов беременной женщины.

1.2. осложнённое течение беременности

Величина артериального давления оказывает существенное влияние на состояние кислородтранспортной функции крови. В ходе проведённого клинико-лабораторного исследования было выявлено, что у беременных женщин с начальными признаками гипертонической болезни на первый план в развитии компенсаторно-приспособительных реакций выходит модуляционный механизм. Отмечается статистически достоверный рост количества 2,3-ДФГ на 444,1% (р<0,001) относительно контрольной группы (значительно превышающий показатели женщин с физиологическим течением беременности и женщин репродуктивного возраста с ГБ), что свидетельствует о наличии у беременных с ГБ более выраженной гипоксии (рис.2). Установлено, что имеет место синхронный статистически достоверный рост концентрации как ПВК, так и лактата на 163,1% (р<0,001) и 56,5% (р<0,05) соответственно, что свидетельствует об активации анаэробного пути расщепления глюкозы. Возможно, выраженный рост концентрации ПВК можно считать компенсаторно-приспособительным механизмом, направленным на улучшение процессов микроциркуляции в условиях выраженной функциональной напряжённости модуляционного механизма. На этом фоне регистрируется достоверное снижение коэффициента лактат/пируват на 40,5% (р<0,05), что может указывать на приспособительное повышение уровня обмена углеводов для обеспечения биологической полноценности эритроцитов и адекватного кислородного снабжения организма.

Рис. 2. Показатели газотранспортной функции крови, углеводного обмена и активность ЦХО у беременных женщин при гипертонической болезни

Примечание: 2,3-ДФГ - 2,3-дифосфоглицерат, ЦХО - цитохромоксидаза, ПВК - пировиноградная кислота, лактат - молочная кислота, - статистически значимые отличия относительно контрольной группы.

По-видимому, рост концентрации лактата является результатом усиления гликолитической оксидоредукции, обеспечивающей протекание первой реакции окисления в ходе гликолиза при участии NAD-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, а, кроме того, обеспечивает последующее превращение продукта этой реакции 1,3-дифосфоглицерата в 2,3-дифосфоглицерат при участии дифосфоглицератмутазы. С другой стороны увеличение количества лактата может способствовать включению в процесс регуляции диссоциации оксигемоглобина эффекта Вериго-Бора, который сочетается с вазодилатирующим эффектом молочной кислоты.

Необходимо указать на кажущееся противоречие - активация анаэробного пути утилизации глюкозы на фоне статистически достоверного снижения коэффициента лактат/пируват. Очевидно, такие изменения возникают вследствие формирования хронической плацентарной недостаточности у беременных с осложнённым течением беременности, что сопровождается нарушением целостности структур и функций всего фетоплацентарного комплекса (в частности фетоплацентарного барьера), которые способствуют изменению трансплацентарного потока лактата от матери к плаценте и плоду. По-видимому, по изменению концентрации молочной кислоты в крови беременных можно судить о степени нарушений в фетоплацентарном комплексе при хронической плацентарной недостаточности.

С целью объективизации представлений о механизмах развития гипоксии у беременных с ГБ мы оценивали характер изменений активности ЦХО плазмы. Оказалось, что активность ЦХО статистически достоверно угнетается на 68% (р<0,05) относительно контрольной группы, тогда как при физиологическом течении беременности, напротив, отмечается тенденция к активации. Можно полагать, что угнетение активности ЦХО является "аварийным" механизмом, сберегающим молекулярный кислород для обеспечения протекания реакций биологического окисления вне цепи переноса электронов (ЦПЭ), а также для улучшения оксигенирования плода и плаценты в условиях стойкой гипоксии материнского организма.

Таким образом, развитие беременности при наличии неблагоприятного преморбитного фона (гипертоническая болезнь) способствует напряжению внутриклеточного метаболизма, сочетающегося с формированием модуляционного механизма адаптации, на фоне трансплацентарного перехода лактата от матери к плоду.

Полученные результаты являются теоретическим обоснованием для разработки новых лабораторных способов диагностики гипоксии по соотношению уровня 2,3-ДФГ: лактат/ПВК: ЦХО, названного нами коэффициентом оксигенации. Установлено, что в контрольной группе женщин данное соотношение равно 1: 5: 5. Физиологическое течение беременности характеризуется соотношением 2: 1: 5. Беременность, протекающая на фоне ГБ отличается от всех предыдущих групп соотношением 4: 2:

1. Такой характер изменений коэффициента свидетельствует о наличии ярко выраженной гипоксии. Причём только в этой группе женщин отмечается стойкое угнетение работы ЦПЭ, сопровождающееся энергодефицитом и может служить прогнозом эффективности родовой деятельности, что необходимо учитывать при осуществлении медикаментозной стимуляции родового акта. На основе выявленных особенностей функционирования дыхательной цепи переноса электронов у женщин с осложнённым течением беременности был разработан "Способ лечения фетоплацентарной недостаточности", заключающийся в назначении беременным женщинам цитофлавина (регистрационный номер Р № 003135/01 от 21.01.2004г), который стимулирует тканевой дыхание и энергопродукцию, за счёт восстановления функционирования ЦПЭ и ОПК.

Сравнительный анализ функционирования газотранспортной системы крови у беременных и небеременных женщин с гипертонической болезнью показал однонаправленные изменения, но выраженность этих изменений у беременных более значительна. Обращает на себя внимание, что у беременных женщин с ГБ отмечается "утечка" лактата от матери к плаценте и плоду, что обеспечивает реализацию эффекта Вериго-Бора у плода в условиях внутриутробной гипоксии.

Необходимо отметить, что значительное угнетение ЦХО у беременных неизбежно приведёт к "утечке" молекулярного кислорода и запуску процессов СРО. В этой связи необходима оценка эффективности работы АОЗ организма, чему посвящена следующая глава данного диссертационного исследования.

2. Состояние антиоксидантного статуса у беременных женщин при гипертонической болезни

Известно, что антиоксидантные системы препятствуют дестабилизации структурно-функционального состояния мембран клеток и обеспечивают протекание свободнорадикальных процессов на стационарном уровне. При анализе процессов ПОЛ и эффективности механизмов антиоксидантной защиты (АОЗ) имеют значения не столько абсолютные величины показателей, сколько соотношение между ними.

2.1 физиологическое течение беременности

В литературе имеются сведения о развитии выраженного системного окислительного стресса на протяжении всей физиологически протекающей беременности. При этом имеются разноречивые данные о том, как осуществляется перестройка активности АОЗ у женщин при физиологическом течении беременности [Рогов В. и соавт., 2003; Ризванова Е.В. и соавт., 2004; Сахалиева Г.С. и соавт., 2005].

В ходе исследования нами выявлено неоднозначное повышение активности ферментов первой и второй линии. Так, зарегистрировано значительное статистически достоверное увеличение активности СОД у женщин с физиологическим течением беременности на 173,5% (р<0,005) по сравнению с контрольной группой. Такие изменения являются косвенным свидетельством избыточной продукции супероксидного анион-радикала и подтверждают развитие свободнорадикальных процессов. При этом отмечается менее выраженное увеличение активности каталазы на 41,6% (р<0,05) относительно той же группы (рис.3).

Возможно, увеличение количества Н₂О₂ при физиологическом течении беременности способствует развитию компенсаторно-приспособительных реакций, обеспечивающих формирование эндотелий независимой вазодилатации и направлено на улучшение процессов циркуляции в маточно-плодовом круге кровообращения, так как перекись водорода является фактором гиперполяризации эндотелиоцитов.

Рис. 3. Активность СОД и каталазы эритроцитов у женщин при физиологическом течении беременности

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

СОД - супероксиддисмутаза, ГПО - глутатионпероксидаза, - статистически значимые отличия.

Оценивая направленность изменений активности ферментов второй линии антиоксидантной защиты, было установлено следующее. Активность ГПО у беременных женщин при физиологическом течении беременности с большой долей достоверности увеличивается на 716,8% (р<0,001), что свидетельствует о накоплении органических пероксидов. В ходе исследования зарегистрировано увеличение количества восстановленного глутатиона на 126,8% (р<0,005) относительно той же группы (рис.5). Активность ГР, обеспечивающая процесс восстановления окисленного глутатиона, при физиологическом течении беременности также увеличивается на 161,6% (р<0,05). Такие изменения в работе ферментов второй линии АОЗ позволяют считать, что ведущая роль в защите организма беременной женщины от оксидантного стресса принадлежит именно этой группе ферментов. Работа ГР тесно сопряжена с интенсивностью ПФП, а именно, с активностью гл-6-ФДГ. При этом отмечено, что активность гл-6-ФДГ у женщин с физиологическим течением беременности имеет лишь тенденцию к увеличению. Увеличение концентрации восстановленного глутатиона при высокой активности ГПО и менее выраженной активности ГР мы склонны считать результатом усиления его синтеза за счёт активации работы г-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы.

Рассчитав показатель защитной эффективности антиоксидантных ферментов СОД/ГПО, мы обнаружили, что у женщин с физиологическим течением беременности он оказался ниже значений контрольной группы на 66,4% (р<0,05), что свидетельствует о значительном вкладе в антиоксидантную защиту, прежде всего, второй линии АОЗ (рис.4). Следовательно, изменение активности глутатионзависимых ферментов эритроцитов у женщин с физиологическим течением беременности может служить биохимическим маркёром эффективности функционирования АОЗ организма при физиологическом течении беременности.

Рис.4. Активность глутатионзависимых ферментов, гл-6-ФДГ и концентрация GSH эритроцитов у женщин при физиологическом течении беременности

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

ГПО - глутатионпероксидаза, ГР - глутатионредуктаза, GSH - восстановленный глутатион, МПО - миелопероксидаза, ЦП - церулоплазмин, - статистически значимые отличия.

Установлено статистически значимое увеличение миелопероксидазной активности плазмы на 436,9% (р<0,001) относительно контрольной группы, что свидетельствует об усиленной продукции гипогалоидов, а также способствует избыточной продукции пероксинитрита. С другой стороны, такая значительная активность МПО плазмы свидетельствует о дегрануляции нейтрофильных лейкоцитов и, возможно, является результатом либо повышения микробиоцидного потенциала полиморфноядерных лейкоцитов, либо свидетельствует о выраженных деструктивных изменениях клеточных мембран лейкоцитов. Необходимо отметить, что беременность представляет собой "иммунологический парадокс", так как у беременных женщин выявляется ослабление антителообразующей функции, снижение реактивности клеточного и гуморального иммунитета по отношению к плоду как полуаллотрансплантанту [Симбирцев А.С., 1999]. Возможно, что в этой ситуации нейтрофилы берут на себя роль биохимического регулятора иммунных реакций при беременности в условиях функциональной недостаточности лимфоцитов.

Нельзя не сказать, что у беременных при физиологическом течении беременности отмечается выраженное статистически значимое увеличение концентрации церулоплазмина сыворотки на 232,6% (р<0,005). Принимая во внимание способность ЦП регулировать активность моноцитарно-макрофагальной системы в III триместре беременности за счёт увеличения продукции цитокинов [Амирова А.Р. и соавт., 2006; Segelmark V. et al., 1997], можно полагать, что ЦП является маркёром эффективности функционирования моноцитарно-макрофагальной системы.

2.2 осложнённое течение беременности

Выявлено, что у беременных женщин при гипертонической болезни отмечается дисрегуляция работы ферментов первой линии АОЗ, что проявляется выраженным статистически значимым ростом активности СОД эритроцитов на 276,1% (р<0,005) при отсутствии достоверных отличий в активности каталазы. Подобный характер свидетельствует об избыточной продукции как супероксидного анион-радикала, так и перекиси водорода, поскольку нарушается процесс её утилизации. Избыточная продукция перекиси водорода, по всей видимости, необходима для реализации вазодилатирующего эффекта, но в условиях выраженной активации МПО плазмы и менее значимого роста концентрации ЦП сыворотки крови в большей степени реализуются её цитотоксические эффекты. Данное заключение подтверждается выраженным достоверным ростом коэффициента СОД/каталаза на 256,5% (р<0,005) относительно той же группы (рис.5).

Избыточная продукция О₂^-способствует развитию вазокострикторных реакций, формирующихся из-за экспрессии активности зNOS, а также инактивации образовавшегося нитроксильного радикала за счёт пероксинитрита. Кроме того, О₂^-повышает синтез эндотелина I [Марков Х. М., 2005], что также вносит значительный вклад в развитие вазоконстрикторных реакций при осложнённом течении беременности.

Рис.5. Активность ферментов первой линии АОЗ у беременных женщин при гипертонической болезни

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

СОД - супероксиддисмутаза, ГПО - глутатионпероксидаза, - статистически значимые отличия

В ответ на избыточную продукцию АФК активируется глутатионзависимое ферментативное звено АОЗ эритроцитов крови беременных с ГБ. Так, активность ГПО превышает значения контрольной группы на 470,3% (р<0,001) на фоне выраженного роста активности ГР на 229,7% (р<0,05) при менее значимом увеличении концентрации восстановленного глутатиона на 71,8% (р<0,05) относительно той же группы (рис.6). Метаболическим синергистом работы глутатионзависимых ферментов, обеспечивающим регенерацию окисленного глутатиона, является гл-6-ФДГ, активность которой также превышает значения контрольной группы у данных пациенток на 108,2% (р<0,05). Очевидно, менее значимый рост концентрации восстановленного GSH является результатом функциональной напряжённости ферментов второй линии АОЗ вследствие ярко выраженной эндогенной интоксикации у беременных на фоне ГБ. Необходимо отметить тот факт, что только в данной группе отмечается статистически значимое увеличение активности МПО плазмы на 752,7% (р<0,001) относительно группы контроля.

Рис.6. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов, МПО плазмы и количество восстановленного глутатиона, ЦП у беременных женщин при гипертонической болезни

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

ГПО - глутатионпероксидаза, ГР - глутатионредуктаза, GSH - восстановленный глутатион, МПО - миелопероксидаза, ЦП - церулоплазмин, - статистически значимые отличия.

По-видимому, у пациенток данной клинической группы, имеет место максимальная активность нейтрофильных лейкоцитов, сопряжённая с их дегрануляцией, вследствие циркуляции лейкоцитов как в межворсинчатом пространстве ишимизированной плаценты, так и в коронарных сосудах при ГБ. Рост миелопероксидазной активности плазмы можно считать компенсаторно-приспособительным механизмом, обеспечивающий нейтрализацию избыточной продукции перекиси водорода. Однако не следует забывать, что, образующиеся гипогалогениты, обладают более выраженными цитотоксическими свойствами, нежели перекись водорода. Поэтому, в данном случае, такой механизм является дезадаптационным и направлен на формирование молекулярной основы структурной дестабилизации и способствует развитию осложнений.

Таким образом, физиологическое течение беременности протекает на фоне выраженного оксидантного стресса, формирующегося вследствие дисрегуляции внутриклеточных и внеклеточных систем антиоксидантной защиты. В частности, можно полагать, что имеет место избыточная продукция органических пероксидов и пероксинитрита. Такие изменения способствуют формированию компенсаторно-приспособительных реакций в виде значительной активации ГПО эритроцитов, МПО плазмы. При этом зарегистрирован одновременный рост концентрации ЦП сыворотки крови, что является ответной реакцией организма на избыточную продукцию как супероксидного анион-радикала, так и гипохлорита. Поскольку ЦП может проявлять СОД-подобную активность и ингибировать образование гипогалоидов.

Развитие беременности на фоне гипертонической болезни также сопровождается повышенной продукцией супероксидного анион-радикала и нарушением процессов утилизации перекиси водорода. При этом основной вклад в антирадикальную защиту вносят ферменты глутатионзависимого звена. Одновременное увеличение активности МПО говорит о повышении цитотоксичности перекиси водорода, а, значит, может служить одним из ведущих факторов повреждения цитоплазматических мембран, что сопряжено с ингибированием трансмембранного переноса ионов и может служить патогенетическим фактором развития и усугубления гипертензионного синдрома при беременности.

Сравнительный анализ функционирования АОЗ у беременных и небеременных женщин с ГБ установил, что имеет место синхронное изменение активности ферментов первой линии АОЗ. Причем второе звено АОЗ у беременных, в отличие от небеременных с ГБ, достоверно превышает показатели контрольной группы. Необходимо указать, что имеют место разнонаправленные изменения концентрации восстановленного глутатиона. Что касается активности МПО плазмы и концентрации ЦП сыворотки, то нами зарегистрированы более значительное увеличение у беременных с ГБ по сравнению с небеременными.

Полученные результаты позволяют на теоретической основе предложить в качестве медикаментозной коррекции выявленных нарушений метаболизма у беременных с осложнённым течением беременности комплекс микроэлементов и гепатопротекторов, что позволит увеличить синтез ЦП и снизить цитотоксичность перекиси водорода, а это, в свою очередь, обеспечит участие перекиси водорода в реализации вазодилатирующего эффекта.

3. Особенности спектра липопротеидов сыворотки крови, уровня МДА, МСМ и ВЭГ у беременных женщин при гипертонической болезни

Кроме клеточных и субклеточных мембран важной мишенью свободнорадикальной атаки при окислительном стрессе являются циркулирующие в крови липопротеины, поэтому изучение особенностей их метаболизма особенно актуально в условиях системного окислительного стресса при физиологическом и осложнённом течении беременности.

3.1 физиологическое течение беременности

Проведённые собственные исследования показали, что физиологическое течение беременности сопровождается изменением липопротеидного спектра сыворотки крови, сопровождающееся достоверным ростом общего количества в-ЛП сыворотки крови на 95,7% (р<0,05) относительно контрольной группы (рис.7).

Рис.7. Спектр липопротеидов сыворотки крови женщин при физиологическом течении беременности

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

в-ЛП - в-липопротеиды, СОМ - суммарная окислительная модификация, - статистически значимые отличия.

Необходимо отметить, что регистрируется одновременное снижение как окисленных, так и резистентных к окислению ЛП на 50,1% и 79,3% (р<0,05) соответственно. По-видимому, данное изменение свидетельствует об усилении процесса элиминации ЛП частиц из кровотока что, может косвенно указывать на активацию липидного метаболизма. Интегральный параметр, отражающий степень окислительной модификации ЛП-частиц, названный как "суммарная окислительная модификация липопротеидов сыворотки крови" (СОМ) введённый ранее [Микашинович З.И. и соавт, 2002; Олемпиева Е.В., 2004], также снижается на 62,9% (р<0,05) относительно контрольной группы.

Необходимо указать, что ЛП частицы могут подвергаться окислительной модификации как непосредственно АФК, так и другими компонентами, в частности металлами переменной валентности, которым отводится значительная роль в механизмах инициации свободнорадикальных процессов. Имеются данные, что действие только АФК в отсутствии металлов переменной валентности не могут приводить к окислительной модификации циркулирующих ЛП-частиц [Зенков Н.К. и соавт., 2003]. В этой связи представляет значительный интерес установления вклада в этот процесс ионов Сu ^+1/+2 и Fе ^+2/+3. Принимая во внимание данные о тенденции к увеличению концентрации ВЭГ у данной группы пациенток можно предположить, что вклад металл-индуцированного окисления ЛПНП незначителен. Судить об уровне протекания процессов липидной пероксидации можно не только по изменению активности ферментов АОЗ, но и по уровню ТБК-активных продуктов. Так, при физиологическом течении беременности отмечается лишь тенденция к росту концентрации МДА (рис.8).

Рис.8. Содержание МСМ, МДА и ВЭГ в крови женщин при физиологическом течении беременности

Примечание: значения контрольной группы приняты за 100%.

МСМ - молекулы средней массы, МДА - малоновый диальдегид, ВЭГ - внеэритроцитарный гемоглобин, - статистически значимые отличия.

Однако существует возможность окислительной модификации не только полиненасыщенных жирных кислот, входящих в структуру ЛП частиц, но и белкового компонента. В этой связи нами было проведено определение уровня молекул средней массы (МСМ) как общепризнанного критерия эндогенной интоксикации. Полученный фактический материал свидетельствует о том, что у женщин с физиологическим течением беременности отмечается значительная модификация белковых молекул. Так, уровень МСМ превышает значения контрольной группы на 40,5% (р<0,05). Доказано, что избыток низко - и среднемолекулярных соединений оказывает токсическое и мутагенное действие, образуясь в результате протеолиза, они способны усиливать СРО в организме [Ковтунова М.Е. и соавт., 2003]. Можно полагать, что при физиологическом течении беременности имеет место формирование реперфузионной эндогенной интоксикации, и определенный вклад в этот процесс вносит деструкция белковой части ЛП-частиц

...